CN102448308B - 用于增加端粒酶活性的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于增加细胞中端粒酶活性的方法和组合物。所述组合物包括药物制剂。所述方法和组合物适用于通过患者细胞或组织中端粒酶活性的增加来治疗经受治疗的疾病。它们还适用于提高培养中细胞的复制能力，如在离体细胞疗法中，以及适用于提高干细胞与祖细胞的增殖。

Description

用于增加端粒酶活性的组合物和方法
对在先申请的引用
本申请要求2009年5月18日提交的美国临时专利申请第61/179,305号的权益，所述临时专利申请以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及用于增加细胞中端粒酶活性的方法和组合物。
发明背景
端粒酶是催化端粒重复序列添加到端粒的末端的一种核糖核蛋白。端粒是在染色体末端加帽的重复序列长串，认为它们可以稳定染色体。人体中，端粒通常长7-10kb并且包含序列-TTAGGG-的多个重复序列。端粒酶在大多数成体细胞中不被表达，并且端粒长度随连续复制轮数增加而减少。在一定轮数的复制之后，端粒的逐次缩短导致细胞进入端粒危机阶段，而这又导致细胞衰老。某些疾病与端粒的快速缺失从而导致细胞过早衰老有关。已经显示，编码人体细胞中人端粒酶蛋白的基因的表达可赋予永生化表型，这可能是通过绕过细胞的自然衰老途径实现的。此外，已经显示，在具有短端粒的老化细胞中端粒酶基因的表达可产生端粒长度的增加，并恢复通常与年轻细胞有关的表型。
与肿瘤细胞和某些干细胞相比而言，体细胞几乎不具有端粒酶活性并且在至少一些染色体的端粒末端缩短到临界长度时停止分裂，从而导致程序性细胞衰老(细胞死亡)。由于低端粒酶活性会加强体细胞中端粒重复序列的缺失(从而导致衰老)，所以端粒酶活性的诱导(其具有将端粒重复序列的阵列添加到端粒的作用)由此赋予非永生化体细胞增加的复制能力，并赋予衰老细胞增殖和在受损组织修复后立即适当地离开细胞周期的能力。
举例来说，Bodnar Science 279(5349)：349-52(1998年1月16))；White，PCT国际专利申请公开第WO 2000/08135号(2000年2月))；Hannon等人PCT国际专利申请公开第WO 99/35243号(1999年7月)和PCT国际专利申请公开第WO 2000/031238号(2000年6月))；Franzese等人Lifescience 69(13)1509-20(2001)，和Yudoh等人J.Bone and Mineral Res.16(8)：1453-1464(2001)中研究了治疗学上增加端粒酶活性的方法。在这些报导中，一般利用编码人端粒酶的蛋白质组分的基因hTERT的过表达，或者利用介导端粒酶的组装的蛋白质(例如，热休克蛋白)的表达来增加端粒酶活性(White，PCT第WO2000/08135号)。Franzese等人报导，规定用于HIV感染治疗的蛋白酶抑制剂沙奎那韦(Saquinavir)可增加外周血单核细胞中的端粒酶活性；Vasa等人Circ Res.87(7)540-2(2000)中描述了通过施用一氧化氮(NO)前体进行的端粒酶的激活，以及由此产生的内皮细胞衰老的延迟。
已经报导，黄芪苷家族的各种皂苷具有各种生物效应，包括增加端粒酶活性，Harley等人PCT国际专利申请公开第WO2005/000245号。开发一种作为有效的端粒酶激活剂的化合物将是有益的。
发明概述
本文描述的发明大体上涉及用于增加细胞中端粒酶活性的化合物和方法以及用于这些方法中的组合物。这些方法和组合物可以在细胞培养中的细胞上施用，即，在体外(in vitro)或离体(ex vivo)，或者在体内(in vivo)的细胞上施用，诸如在受试者组织中生长的细胞，所述受试者包括人受试者和非人哺乳动物。
先前已经报导，黄芪苷家族的各种皂苷具有各种生物效应，包括增加端粒酶活性，Harley等人PCT国际专利申请公开第WO2005/000245号。然而，本发明人已经发现，其中所述的包括环黄芪醇(cycloastragenol)在内的天然化合物在口服施用给某些哺乳动物物种时，其生物利用度非常有限。尚不清楚有限的生物利用度是归结于哺乳动物对化合物的低摄取，还是归结于化合物在某些哺乳动物物种中的高代谢，或者是归结于两者的组合。这种低生物利用度意味着先前描述的化合物在某些哺乳动物物种中作为口服端粒酶激活剂而言，其有效性相当低。
可以确定对新化合物存在需要，这些新化合物会是强效的端粒酶激活剂，还在许多哺乳动物物种中以口服方式具有可利用性，并且在代表性哺乳动物物种中具有改进的半衰期。本文描述的化合物拥有这些所需性质。
在具体实施方案中，组合物包含如下所述的式I化合物和其药用盐。本发明的多方面包括这些化合物用于药物应用中的制剂，特别是在细胞中增加的端粒酶活性被显示或被预计是有益的应用中。还提供将化合物和其制剂用于这些应用的方法，包括在已经确定对细胞或组织中增加的端粒酶活性的需要或其优势之后，应用或施用这些制剂的方法。
本发明在一方面包括式I的化合物：
其中X1选自酮基(＝O)、羟基(-OH)和
其中X2选自酮基(＝O)、羟基(-OH)和
其中X3选自酮基(＝O)、羟基(-OH)和
其中X1、X2或X3中的至少一个分别是
其中R1或R2独立地选自-CH(CH3)2和-CH(CH3)CH2CH3；
和其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)R1，其中R1选自由-CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3组成的群组。在另一实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)R2，其中R2选自由-CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3组成的群组。
在一个实施方案中，X1、X2或X3中的至少一个是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2。在另一实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2。
在一个实施方案中，X1或X2中的至少一个是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3。在另一实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3。
在式I的选定实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X2和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X1和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X3是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X1和X2独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X3是OH。在其他实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X2和X3均是OH。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X1和X3均是OH。
在式I的选定实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X2和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X1和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X3是OH。在其他实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X2和X3均是OH。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X1和X3均是OH。
在式I的一些实施方案中，药学上可接受的盐是盐酸盐。
预期氨基酸取代基是L型或天然的立体异构体。
式I的示范性化合物包括本文中命名为以下的那些化合物：2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为4)；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为7)；2-(L)-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸-3b-乙酰氧基-16b-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基酯(本文中指定为12)；2-(L)，3-二甲基-戊酸-6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为14)；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-3-氧代-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6α-基酯(本文中指定为30)；2-(L)-氨基-3-甲基-戊酸-6α-(2-氨基-3-甲基-戊酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为32)；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，3β，6α-二羟基-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-16β-基酯(本文中指定为36)，和其药学上可接受的盐。
式I的示范性化合物包括本文中命名为以下的那些化合物：2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；2-(L)-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸-3b-乙酰氧基-16b-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基酯盐酸盐；2-(L)，3-二甲基-戊酸-6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-3-氧代-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6α-基酯盐酸盐；2-(L)-氨基-3-甲基-戊酸-6α-(2-氨基-3-甲基-戊酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；或2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，3β，6α-二羟基-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-16β-基酯盐酸盐。
上述式I的化合物在溶剂中调配时，其有效产生在角质形成细胞或PBMCs中的端粒酶活性水平(在TRAP试验中测定)高于用所述溶剂处理的所述细胞中水平(在本文所述的TRAP试验中测定)的至少50％、至少70％、至少80％或至少90％。在其他实施方案中，化合物有效产生在角质形成细胞或PBMCs中的端粒酶活性水平(在TRAP试验中测定)高于用所述溶剂处理的所述细胞中水平(在本文所述的TRAP试验中测定)的至少100％。
本发明在一方面包括增加细胞或组织中端粒酶活性的方法。所述方法包括使细胞或组织与分离的式I化合物接触。方法可以进一步包括鉴定其中需要端粒酶活性增加的细胞或组织的预备步骤。
使分离的式I化合物与细胞或组织接触的方法可以包括在所述接触之前，鉴定其中需要端粒酶活性增加的细胞或组织。通过增加细胞或组织中的端粒酶活性待实现的益处包括，例如，所述细胞或所述组织内细胞的复制能力和/或生命期的提高。
所述方法可以包括鉴定、确定或诊断受试者的病况使得增加受试者的细胞或组织中的端粒酶活性是所需的，以及向受试者施用所述化合物。受试者是哺乳动物受试者，诸如，如狗、猫、小鼠、大鼠、猴等家养动物或人受试者或患者。
供预防或治疗的所述病况或疾病可以包括，例如，病毒性和机会性感染，包括HIV；各种退行性疾病，诸如神经退行性疾病、骨骼或关节以及结缔组织的退行性疾病、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变；心血管疾病，包括中央或周边血管疾病；克罗恩氏病(Crohn’s disease)和其他免疫病况；肝病，包括纤维化和硬化；肺病，包括肺纤维化、哮喘、肺气肿和COPD；造血系统病症(包括贫血症、血小板减少症、中性白细胞减少症和其他细胞减少症)；慢性炎症性胃肠疾病，诸如巴特氏食道症(Barrett′s esophagus)；与干细胞或祖细胞群中增殖能力丧失有关的任何病症。这些病况可以包括骨髓衰竭综合症、再生障碍性贫血、骨髓增生异常性贫血或骨髓增生异常综合症。所述病况还包括皮肤和它的附属器的伤口或其他急性或慢性病况，例如，烧伤、擦伤、切口、移植物、由传染因子引起的损伤、慢性静脉曲张性溃疡、糖尿病性溃疡、压迫性或褥疮性溃疡、粘膜溃疡、瘢痕瘤形成、毛发或色素脱失，以及皮肤和它的附属器的其他结构畸变。所述病况还包括癌症和癌症前期病况，在这些病况中低端粒酶或缩短的端粒与基因组不稳定性或突变率增加或肿瘤抑制功能丧失有关，因而受试者具有肿瘤起始、肿瘤进展或肿瘤复发的增加的风险。
本发明提供通过增加患者细胞或组织中的端粒酶活性来预防或治疗患者中的病况(诸如上文提到的那些病况)的方法，所述方法包括向需要所述预防或治疗的患者施用分离的如上文所定义的式I化合物。可以通过各种途径施用组合物，例如，口服、局部、非经肠、皮下、吸入和静脉的途径。
在另一实施方案中，本发明提供治疗表皮的急性或慢性病况的方法，其包括使表皮细胞与分离的如上文所定义的式I化合物的局部制剂接触。
使制剂与之接触的细胞还可以包括进行离体接触的外植体细胞，例如对于细胞疗法，或者培养中的其他细胞。相应地，本发明提供一种在体外或离体提高细胞的复制能力和功能性能力改善的方法，其包括使所述细胞与有效量的组合物接触，所述组合物包含如上文所定义的式I化合物，包括如上文所定义的化合物的选定实施方案。一般来说，细胞是哺乳动物细胞；在选定的实施方案中，细胞是干细胞诸如骨髓干细胞或祖细胞；骨髓基质细胞；来自皮肤和包括肠、肝脏和胰腺在内的其他组织的表皮和上皮干细胞；胰岛前体细胞；神经球细胞；肾上腺皮质细胞；肌卫星细胞；间充质干细胞和祖细胞，包括成骨细胞前体；视网膜色素上皮细胞；内皮前体细胞；周细胞；和能够克隆性扩增的免疫细胞，包括记忆和天然T(CD4和CD8)和B细胞。
在另一实施方案中，本发明提供一种提高来自活体供体或尸体的组织到活体患者的移植的方法，其包括使移植组织与分离的如上文所定义的式I化合物接触。在另一实施方案中，本发明提供一种提高来自供体的组织到活体患者的移植的方法，其包括在组织的移植之前、与其同时或者在之后一段时间，向患者施用分离的如上文所定义的式I化合物。移植的组织可以是实体组织，诸如肾、心脏、肺等，或者是造血组织，诸如但不限于血细胞，诸如白细胞、淋巴细胞或可以来源于骨髓的造血前体细胞。
在一个实施方案中，本发明提供一种药物组合物，其在药学上可接受的媒介物中包含如上文所定义的式I化合物。
在另一实施方案中，本发明提供一种分离的如上文所定义的式I化合物的局部药物制剂。上文还定义了化合物的选定实施方案。所述局部制剂通常包含选自由乳化剂、载体(例如，脂质体)、增稠剂和润肤剂组成的群组的一种或多种组分。所述组合物可以用于治疗表皮的伤口或其他急性或慢性病况。
提供分离的如上文所定义的式I化合物，包括如上文所述的选定实施方案在药剂的制造中的用途，所述药剂是用于预防或治疗疾病或病况。提供分离的如上文所定义的式I化合物，包括如上文所述的选定实施方案在药剂的制造中的用途，所述药剂是用于通过增加细胞或组织中的端粒酶活性来预防或治疗经受预防或治疗的疾病。提供分离的如上文所定义的式I化合物，包括如上文所述的选定实施方案的用途，其是用于预防或治疗疾病或病况。提供分离的如上文所定义的式I化合物，包括如上文所述的选定实施方案的用途，其是用于通过增加细胞或组织中的端粒酶活性来预防或治疗经受预防或治疗的疾病。所述用途可以进一步包含鉴定其中需要端粒酶活性增加的细胞或组织的预备步骤。通过增加细胞或组织中的端粒酶活性待实现的益处包括，例如，所述细胞或所述组织内细胞的复制能力和/或生命期的提高以及功能性能力的提高。
所述用途可以包括鉴定、确定或诊断受试者的病况或疾病使得增加受试者的细胞或组织中的端粒酶活性是所需的。所述病况可以包括，例如，病毒性和机会性感染，包括HIV；各种退行性疾病，诸如神经退行性疾病、骨骼或关节以及结缔组织的退行性疾病、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变；心血管疾病，包括中央或周边血管疾病；克罗恩氏病和其他免疫病况；肝病，包括纤维化和硬化；肺病，包括肺纤维化、哮喘、肺气肿和COPD；造血系统病症(包括贫血症、血小板减少症、中性白细胞减少症和其他细胞减少症)；慢性炎症性胃肠疾病，诸如巴特氏食道症；与干细胞或祖细胞群中增殖能力丧失有关的任何病症。这些病况可以包括骨髓衰竭综合症、再生障碍性贫血、骨髓增生异常性贫血或骨髓增生异常综合症。所述病况还包括皮肤和它的附属器的伤口或其他急性或慢性病况，例如，烧伤、擦伤、切口、移植物、由传染因子引起的损伤、慢性静脉曲张性溃疡、糖尿病性溃疡、压迫性或褥疮性溃疡、粘膜溃疡、瘢痕瘤形成、毛发或色素脱失，以及皮肤和它的附属器的其他结构畸变。所述病况还包括癌症和癌症前期病况，在这些病况中低端粒酶或缩短的端粒与基因组不稳定性或突变率增加或肿瘤抑制功能丧失有关，因而受试者具有肿瘤起始、肿瘤进展或肿瘤复发的增加的风险。
类似地，涵盖分离的如上文所定义的式I化合物，包括如上文所述的选定实施方案在药剂的制造中的用途，所述药剂是用于治疗表皮的慢性或急性病况。另一实施方案是关于分离的如上文所定义的式I化合物，包括如上文所述的选定实施方案的用途，其是用于治疗表皮的慢性或急性病况。
在结合附图阅读下面本发明的详细描述之后，本发明的这些和其他目的和特点将变得更加清楚明了。
附图简述
图1显示在一剂化合物4C3-(L)-缬氨酰基-环黄芪醇之后，如TRAP试验中测定的，小鼠外周血单核细胞(PBMC)中端粒酶活性的增加。
图2显示在一剂化合物4C3-(L)-缬氨酰基-环黄芪醇之后，如TRAP试验中测定的，小鼠胡须中端粒酶活性的增加。
发明详述
I.定义
除非另外说明，否则本文中所使用的以下术语具有下面给出的含义。
下面显示用于本文所述化合物的命名法的总体碳原子编号方案。
因此C3-(L)缬氨酰基环黄芪醇指代(L)缬氨酸经由酯键附接到化合物结构的碳3。
“C1-5烷基”指代含有碳和氢的完全饱和、无环单价基团，其可以是分支的或线性的，具有1到5个碳原子。烷基的实例有甲基、乙基、正丙基、正丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基。
“酮基”表示＝O。
“羟基”表示-OH。
术语“氨基酸”包含呈D或L形式的天然氨基酸(例如，Ala、Arg、Asn、Asp、Cys、Glu、Gln、Gly、His、Hyl、Hyp、Ile、Leu、Lys、Met、Phe、Pro、Ser、Thr、Trp、Tyr和Val)以及非天然氨基酸的残基。本术语还包含带有常规氨基保护基(例如，乙酰基或苄氧羰基)的天然和非天然氨基酸。本领域的技术人员已知其他适合的氨基保护基(例如，参见T.W.Green，Protecting Groups in Organic Synthesis；ThirdEdition，Wiley New York 1999)。除非另外说明，否则氨基酸取代基经由酯键联来通过它们的羧基附接到环黄芪醇。因此，C3-(L)缬氨酰基环黄芪醇是C3-(L)缬氨酰基环黄芪醇酯。
术语“异构体”包括但不限于光学异构体和类似物、结构异构体和类似物、构象异构体和类似物等等。
本领域的技术人员将了解，具有手性中心的本发明化合物可以呈光学活性和外消旋形式存在并分离。一些化合物可能展现多形性。应理解，本发明涵盖本发明化合物的拥有本文所述的适用性质的任何外消旋、光学活性、多形性或立体异构形式或其混合物，本领域中众所周知如何制备光学活性形式(例如，通过利用重结晶技术对外消旋形式的拆分、通过由化学活性起始材料的合成、通过手性合成，或通过使用手性固定相的色谱分离)以及如何使用本文所描述的测试来确定化合物增加端粒酶活性的能力。在一个实施方案中，氨基酸呈天然的(L)形式。
本发明包括本发明化合物的“药学上可接受的盐”，在一个实施方案中，可以产生本发明的化合物来形成碱金属盐和形成游离酸或游离碱的自由基加成盐(free addition salt)。本发明化合物的适合的药学上可接受的酸加成盐可以由无机酸或由有机酸制备。在一个实施方案中，无机酸的实例有盐酸、氢溴酸、氢碘酸、硝酸、碳酸、硫酸和磷酸。在一个实施方案中，有机酸可以选自脂肪族、环脂肪族、芳香族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类别的有机酸，其实例有甲酸、乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、葡糖酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、葡糖醛酸、马来酸、富马酸、丙酮酸、天冬氨酸、谷氨酸、苯甲酸、氨茴酸、草酸、甲磺酸、水杨酸、硬脂酸和半乳糖醛酸。在一个实施方案中，本发明化合物的适合的药学上可接受的碱加成盐包括由铝、钙、锂、镁、钾、钠和锌制成的金属盐，或由N，N’-二苄基乙二胺、胆碱、氯普鲁卡因、乙醇胺、乙二胺和普鲁卡因制成的有机盐。这些盐都可以利用常规方式由相应的化合物制备。在其他实施方案中，可以通过用无机碱(例如氢氧化钠)处理来制备药学上可接受的盐。在另一实施方案中，可以用脂肪族和芳香族羧酸来制备化合物的酯，例如，乙酸和苯甲酸酯。
“干细胞”指代普通谱系的相对未分化细胞，这些细胞保留在出生后始终分裂和循环的能力，从而提供可以进一步分化并成为特化的细胞(例如，皮肤基底层中或造血组织中的干细胞，诸如骨髓中的原发细胞，其中各种类型的血细胞都来源于所述原发细胞)。
提及化合物时，“有效增加细胞中的端粒酶活性”意思是含有浓度为10μM或10μM以下的化合物的组合物有效产生在角质形成细胞或成纤维细胞中的端粒酶活性水平(在端粒酶活性试验中测定，例如本文所述的TRAP试验)是由不含所述化合物的类似制剂所产生水平(在TRAP试验中测定)的至少1.5倍(即，至少高50％)。在一些实施方案中，化合物在10μM或10μM以下的浓度下，有效产生所述细胞中的端粒酶活性水平(在本文所述的TRAP试验中测定)是由不含所述化合物的类似制剂所产生水平的至少2倍(即，至少高100％)。
“受试者”是哺乳动物。受试者可以是家养哺乳动物，例如，狗、猫、小鼠、大鼠、猴等。受试者或患者可以是人。
提及向患者施用化合物时，“有效量”指代有效增加患者的细胞或组织中的端粒酶活性使得实现所需的治疗结果的量。提及在体外或离体细胞的治疗时，“有效量”指代有效增加细胞中的端粒酶活性从而增加细胞的复制能力和/或生命期的量。
在本文中表示为％(w/v)的浓度中，100％(w/v)对应于1g溶质/ml溶剂。例如，0.1％(w/v)＝1mg/ml。
“分离的化合物的制剂”指代通过将分离的化合物与一种或多种其他成分(可以是活性或非活性成分)合并产生所述制剂的制剂。措辞“分离的化合物”指代已经利用涉及一个或多个化学合成步骤的方法产生(在调配之前)从而得到纯度不小于80％(w/w)的化合物的制备物的化合物。
II.用于增加端粒酶活性的方法和组合物
根据本发明，提供用于增加细胞中端粒酶活性的组合物和方法。
已经发现，本发明的化合物能够增加细胞中的端粒酶活性，并且在以静脉内方式或口服方式施用给哺乳动物时都轻易具有生物可利用性。
根据所述方法，使细胞或组织与本文所公开的分离的式I化合物接触，相对于不存在所述化合物时细胞或组织中的端粒酶活性水平，所述化合物的量有效增加细胞或组织中的端粒酶活性。所述方法还可以包括鉴定其中需要端粒酶活性增加的细胞或组织的预备步骤。
本发明在一方面包括式I的化合物：
其中X1选自酮基(＝O)、羟基(-OH)和
其中X2选自酮基(＝O)、羟基(-OH)和
其中X3选自酮基(＝O)、羟基(-OH)和
其中X1、X2或X3中的至少一个分别是
其中R1或R2独立地选自-CH(CH3)2和-CH(CH3)CH2CH3；
和其药学上可接受的盐。
在一个实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)R1，其中R1选自由-CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3组成的群组。在另一实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)R2，其中R2选自由-CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3组成的群组。
在一个实施方案中，X1、X2或X3中的至少一个是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2。在另一实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2。
在一个实施方案中，X1或X2中的至少一个是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3。在另一实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3。
在式I的选定实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X2和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X1和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X3是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X1和X2独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X3是OH。在其他实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X2和X3均是OH。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X1和X3均是OH。
在式I的选定实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X2和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X1和X3独立地选自羟基和酮基。在其他实施方案中，X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X3是OH。在其他实施方案中，X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X2和X3均是OH。在其他实施方案中，X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X1和X3均是OH。
在式I的一些实施方案中，药学上可接受的盐是盐酸盐。
式I的示范性化合物包括本文中命名为以下的那些化合物：2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为4)；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为7)；2-(L)-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸3b-乙酰氧基-16b-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基酯(本文中指定为12)；2-(L)，3-二甲基-戊酸6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为14)；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-3-氧代-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6α-基酯(本文中指定为30)；2-(L)-氨基-3-甲基-戊酸6α-(2-氨基-3-甲基-戊酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯(本文中指定为32)；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，3β，6α-二羟基-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-16β-基酯(本文中指定为36)，和其药学上可接受的盐。
式I的示范性化合物包括本文中命名为以下的那些化合物：2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；2-(L)-叔丁氧羰基氨基-3-甲基-丁酸3b-乙酰氧基-16b-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基酯盐酸盐；2-(L)，3-二甲基-戊酸6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-3-氧代-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6α-基酯盐酸盐；2-(L)-氨基-3-甲基-戊酸6α-(2-氨基-3-甲基-戊酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；或2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，3β，6α-二羟基-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-16β-基酯盐酸盐。
在一个实施方案中，化合物选自式I的下列化合物：
和其药学上可接受的盐。
式I的示范性化合物包括以下表中的化合物，参考式I：
上述式I的化合物在溶剂中调配时，其有效产生在角质形成细胞或成纤维细胞中的端粒酶活性水平(在TRAP试验中测定)高于用所述溶剂处理的所述细胞中水平(在本文所述的TRAP试验中测定)的至少50％、至少70％、至少80％或至少90％。在其他实施方案中，化合物有效产生在角质形成细胞或成纤维细胞中的端粒酶活性水平(在TRAP试验中测定)高于用所述溶剂处理的所述细胞中水平(在本文所述的TRAP试验中测定)的至少100％。
本发明还提供包含一种或多种式I化合物的药物组合物。
在另一方面，本发明提供一种增加细胞或组织中的端粒酶的方法，这种方法通过使细胞或组织与分离的式I化合物接触来进行。此外，所述方法可以包括鉴定其中需要端粒酶活性增加的细胞或组织的步骤。
III.式I化合物的来源和合成
式的化合物可以如下合成。
可以从黄芪(Astragalus membranaceus)根分离黄芪苷I-VII，例如，如A.Kadota等人，JP Kokai第62012791A2号(1987)中所描述。如其中所报导，将根组织(8kg)(可以在商业上从各种有益草本来源获得)与MeOH一起回流，把浓缩提取物(200g)重新溶解于MeOH中并使用CHCl3/MeOH/H2O混合物作为洗脱剂，利用硅胶柱色谱法分馏。使用类似的溶剂混合物，通过硅胶反相色谱法来整理各馏分，得到下列近似量的分离的化合物：乙酰黄芪苷I(0.2g)、黄芪苷I(3.5g)、异黄芪苷I(0.3g)、黄芪苷II(2.3g)、黄芪苷III(1.0g)、黄芪苷IV(0.8g)、黄芪苷V(0.1g)、黄芪苷VI(0.3g)和黄芪苷VII(0.1g)。还参见Kitagawa等人，Chem.Pharm.Bull.31(2)：698-708(1983b)。
环黄芪醇(2)可以通过以下步骤制备：用甲醇HCl处理黄芪苷IV(1)，接着中和步骤，标准整理，和利用色谱法的纯化，如在以下实验部分中所描述(实施例1)。也可以利用黄芪的丁醇提取物的氧化降解(用氧气和钠元素处理)来获得环黄芪醇，如P-H Wang等人，J.Chinese Chem.Soc.49：103-6(2002)中所描述。
式I的各种实施方案(例如具有不同程度的酯化作用、烷化作用或酰化作用或者酮基的化合物)的制备可以根据已知的有机合成方法，使用天然的和/或商业上可获得的起始材料(诸如环黄芪醇)来制备，需要时分离产物。在以下实验部分中给出几个实施例。
IV.生物活性的测定
A.TRAP试验的方案
可以使用端粒重复序列扩增法(TRAP；Telomeric RepeatAmplification Protocol)试验测定化合物增加细胞中端粒酶活性的能力，所述TRAP试验在本领域中是已知的(例如，Kim等人，美国专利第5,629,154号；Harley等人，美国专利第5,891,639号)。本文所使用的“在TRAP试验中测定的端粒酶活性”指代根据以下方案在角质形成细胞或成纤维细胞中测定的端粒酶活性。通常将该活性与在所述细胞的对照试验中类似测定的活性进行比较(例如，端粒酶活性比在溶剂对照中观察到的高50％)。
适合用于所述试验中的细胞系，正常人外周血单核细胞(PBMCs)或人表皮角质形成细胞(新生儿)(HEKs)可以从商业来源(诸如俄勒冈州(OR)波特兰(Portland)的Cascade Biologics或比利时Seneffe的4CBiotech)或从美国模式培养物集存库(ATCC；American type culturecollection)获得。在ATCC网页上可以找到的ATCC正常人成纤维细胞细胞系包括，例如，CCL135、CCL137和CCL151。
举例来说，将新生儿人表皮角质形成细胞(HEKs)以近似5000个细胞/孔接种到96孔微量滴定板中的生长培养基中(例如，由CascadeBiologic公司供应的Epi-Life培养基(Epi-Life Medium)+角质形成细胞生长添加剂(Keratinocyte Growth Supplement))，并孵育一天。在一定浓度范围内向选定孔中添加处于适合溶剂(诸如95％乙醇或DMSO)中的测试组合物，并再孵育24+/-1小时。
首先在10％DMSO中把待测试的化合物调配为10X所需终浓度。将调配化合物与DMSO对照一起添加到96孔培养物，以提供化合物的各种浓度。所有孔中的DMSO终浓度可以为1％。对于其他细胞类型或者在其他情形下，可能需要更高或更低的DMSO浓度。
可以与端粒酶TRAP测试并行执行细胞毒性试验，这通过以下步骤进行：制备用相同化合物处理的两次重复细胞培养板，并使用诸如阿尔玛蓝(Alamar Blue)等代谢反应性染料(metabolism responsive dye)评估与测试化合物一起孵育开始和结束时的细胞数。
如果未客观地测定测试化合物的细胞毒性，那么可以首先在显微镜下观察处理细胞的形态，以确认不存在可见的不规则生长的迹象。
为执行TRAP试验，从孔中去除培养基，并在PBS(不含Ca和Mg)中冲洗细胞两次。在冰上冷冻培养皿，添加Nonidet P40细胞裂解缓冲液(近似100μl/孔)并通过上上下下吸取几次来磨碎。在冰上孵育细胞1小时。
或者，可以在24小时+/-1小时，去除生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次以尽可能多的去除培养基，由此收集细胞。接着添加50μL的M-Per缓冲液(Pierce Cat#78503 & 78501)并在冰上孵育1小时+/-15分钟，使细胞裂解。任选地，以2000RPM离心培养板5分钟。从培养板的每个孔小心收集裂解液并转移到新鲜的V形底的储存96孔板，留下单层细胞完好。
或者，可以通过向5.0mL无DNase、无RNase的H2O中添加3.0mLP40、1.0mL CHAPS裂解缓冲液(见下文)和1.0mL 10XTRAP缓冲液(见下文)来制备细胞裂解溶液。(无DNase、无RNase的水可以利用焦碳酸二乙酯(DEPC；diethylpyrocarbonate)处理来产生或者从诸如Sigma等供货商购买)。
CHAPS裂解缓冲液
a就在使用裂解缓冲液之前添加CHAPS清洗剂。此外，就在提取步骤之前向裂解缓冲液添加4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸盐)(AEBSF；4-(2-aminoethyl)-benzenesulfonyl fluoride HCl)。
使用TRAP试验测定细胞裂解液中端粒酶活性的水平。
10X TRAP缓冲液
合并以下材料产生PCR预混液(master PCR Mix)。
a基于40μl PCR混合液加上10μl细胞裂解液的终体积＝50μl。
PCR混合液包括以下组分：Cy5-TS引物，一种具有序列5′-AATCCG TCG AGC AGA GTT-3’(SEQ ID NO：1)的5’-Cy5标记的寡核苷酸，是端粒酶底物。取决于培养基中的端粒酶活性，向底物添加端粒重复序列(具有序列(AGGGTT)n，形成端粒酶延伸产物，也称作端粒酶产物。具有序列5’-GCG CGG CTT ACC CTT ACC CTT ACC CTAACC-3’(SEQ ID NO：2)的ACX引物是与所述端粒酶延伸产物杂交的锚定反向引物(anchored return primer)。
向在反应管中的PCR混合液添加细胞裂解液样品(例如，5μL)，并在台式PCR仪中以下列循环设定进行端粒延伸和PCR扩增：30℃30分钟，以下3步反应重复28个循环：94℃/30sec、60℃/30sec和72℃/1min，接着是72℃/4min并保持在4℃。
添加含有例如溴酚蓝和二甲苯蓝的负载染料，并使样品经受在1x TBE中的10-15％非变性PAGE，直到溴酚蓝跑出凝胶。观察TRAP反应产物，例如通过使用荧光成像仪来检测CY5标记的端粒酶产物(最大激发在650nm；最大发射在670nm)。
利用对每个凝胶泳道捕获的高于背景的总像素量(total pixelvol.)(DNA梯状条带)测定端粒酶活性。可以使用来自Molecular Probes的RibogreenR RNA Quantitation Kit(目录号R-11490)，按照商业上建议的条件，利用0.8-200ng/mL的RNA标准范围、RG染料的1∶200稀释度、样品的100-250x稀释度，测定总RNA(ng/mL)，由此将活性标准化。
总像素量/RNA＝标准化的相对端粒酶活性
细胞数(用于评估细胞毒性)与阿尔玛蓝读数成正比。
或者，为定量的目的，可以添加一组内部标准和引物。以较小控制量添加TSU2内部标准，一种具有序列5’-AAT CCG TCG AGCAGA GTT AAA AGG CCG AGA AGC GAT-3’；SEQ ID NO：3)的寡核苷酸，是TS引物序列的延伸。具有序列5’-ATC GCT TCT CGG CCTTTT(SEQ ID NO：4)的U2引物是设计成与内部标准的3′区域杂交的反向引物。
扩增后TSU2内部标准的最终量一般是每50 1反应混合物5-10pmol。这一内部对照得出特异性36聚体PCR扩增产物，该产物在凝胶上呈现为在第一端粒添加产物(即，向TS寡核苷酸添加一个端粒，接着用ACX反向引物扩增的产物)下面的明显不同的条带。可以使用这一内部对照条带来标准化来自不同样品的PCR扩增产物。
根据下式来确定试验中产生的端粒酶产物分子的相对数(TM)：
TM＝(TTRAP Products-TBKD1)/(TInt Std-TBKD2)
其中：TTRAP Products是凝胶上对所有端粒酶产物测定的总强度，TBKD1是在空白泳道中对相当于端粒酶产物所涵盖大小的面积测定的背景强度，TInt Std是关于内部标准条带的强度，以及TBKD2是在空白泳道中对相当于内部标准条带所涵盖大小的面积测定的背景强度。所得数是对于给定孵育时间所产生的端粒酶产物的分子数，为了确定TM，本文中将所述给定孵育时间指定为30分钟。
如上文所述的式I化合物在1μm或1μm以下的浓度下，能够产生成纤维细胞或角质形成细胞中端粒酶活性水平比溶剂对照中所见的高至少50％。对于一些应用来说，更强效的活性可能是适当的，诸如在10μM或10μM以下的浓度下，产生端粒酶活性比溶剂对照中所见的所述活性的水平至少高约75％、100％或500％的化合物。
评价以上的式I化合物在各种浓度中增加端粒酶活性的效力。根据上文所述的方案，在HEKneoP细胞(新生儿角质形成细胞)中执行试验。浓度通常是在DMSO中的大约0.001μM到10μM的范围内。
表2中显示化合物增加端粒酶活性的能力。
B.伤口愈合试验的方案
可以使用式I化合物来促进伤口、烧伤、擦伤或表皮的其他急性或慢性病况的愈合，如下文进一步讨论。本文所使用的“在划痕试验中测定的伤口愈合活性”指代根据以下方案在角质形成细胞或成纤维细胞中测定的、表示为下式中显示的WH值的活性。
将细胞接种到烧瓶中(每烧瓶5x105个细胞)并于湿盒中在5％CO2、37℃下培养两天。为形成“伤口”，轻轻拖动2ml塑料吸管来“划伤”细胞表面。理想伤口大约为2-3mm宽和50mm长(沿着组织培养瓶的长轴)。用含有媒介物(DMSO；对照样品)或在多种浓度下的测试组合物的培养基再次处理细胞。鉴定伤口面积，在烧瓶上标注，在细胞的3-4天连续培养期间用摄影法记载细胞的外观。
相对于媒介物处理或其他对照细胞，对于化合物处理样品，随时间测定伤口的宽度，由此确定伤口闭合的量。从第1天(刚划伤后)、第2天、第3天和第4天为每个样品拍的照片取得测定值。由下式计算伤口愈合的百分比(也表达为“伤口愈合活性”)：
WH＝100-[100xWn/W0]，
其中Wn是第n天伤口的宽度，W0是第一天伤口的宽度(即，刚划伤后)。
V.治疗适应症和治疗方法
本发明提供用于增加细胞中端粒酶活性的方法，所述方法通过使细胞或组织与上文第II部分中所公开的分离的式I化合物的制剂接触来进行，所述制剂的量有效增加细胞中的端粒酶活性。所述方法可以包括鉴定其中需要端粒酶活性增加的细胞或组织的预备步骤。细胞可以是在培养中，即在体外或离体，或是在受试者或患者的体内。
从细胞或组织中端粒酶活性的增加待实现的益处包括，例如，所接触细胞的复制能力和/或生命期的提高以及细胞的功能性能力的改善(即，细胞的正常分化功能的表达改善)。所述方法可以进一步包括诊断受试者或患者中的病况，其中患者的细胞或组织中端粒酶活性的增加是所需的；例如，诊断通过细胞或组织中端粒酶活性的增加而经受治疗的疾病。相应地，本发明提供通过增加患者的细胞或组织中的端粒酶活性来治疗患者中病况的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用有效量的如上文第II部分中公开的式I化合物。“有效量”指代有效增加患者细胞或组织中端粒酶活性使得实现治疗结果的量。
供治疗或预防的所述病况或疾病可以包括，例如，与细胞衰老或与不存在端粒酶时增加的细胞增殖速率(其导致加速的端粒重复序列缺失)有关的病况。“增加的增殖速率”意指相比于所述细胞类型的正常细胞，或者相比于所述细胞类型的其他个体内的正常细胞，较高的细胞分裂速率。那些细胞组在异常早的龄期的衰老最终会导致疾病(见West等人，美国专利第6,007,989号)。
存在其中某些细胞类型中端粒酶活性的增加会有益处的各种疾病状态。相应地，本发明提供通过增加患者细胞中的端粒酶活性来治疗患者中选自下述内容的病况或疾病的方法，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用有效量的如上文所述的式I化合物。在一些情况下，所述病况还可以通过离体细胞疗法来经受治疗，如下文进一步所描述，采用相关的细胞类型(在括号中指明)。
(a)阿兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和中风(中枢神经系统的细胞，包括神经元，胶质细胞，例如星形细胞；内皮细胞；成纤维细胞)，
(b)年龄相关性皮肤疾病，诸如真皮萎缩与变薄、弹性组织离解和皮肤皱折、皮脂腺过度增生或增生不全、老年性雀斑和其他色素沉着异常、头发变白和头发脱失或稀疏，或慢性皮肤溃疡(成纤维细胞、皮脂腺细胞、黑素细胞、角质形成细胞、郎格罕氏细胞、微血管内皮细胞、毛囊细胞)，
(c)退行性关节疾病(关节软骨的细胞，诸如软骨细胞以及空隙(lacunal)和滑液成纤维细胞)，
(d)骨骼系统的骨质疏松症和其他退行性病况(骨骼系统的细胞，诸如成骨细胞、骨髓基质或间充质细胞、骨祖细胞)，
(e)年龄或压力相关性血管系统疾病，包括动脉硬化症、钙化、血栓形成和动脉瘤(心血管系统的细胞，包括内皮细胞、平滑肌细胞和外膜成纤维细胞)，
(f)年龄相关性黄斑变性(眼睛的细胞，诸如色素上皮细胞和血管内皮细胞)，
(g)AIDS(HIV限制的CD8+细胞)；
(h)年龄和压力相关性免疫系统受损，包括组织更新受损，其随自然老化、癌症、癌症疗法、急性或慢性感染，或者随引起细胞更新加速的遗传病症而发生，和相关的贫血症以及其他退行性病况(免疫系统的其他细胞，包括淋巴、骨髓和红细胞谱系中的细胞，诸如B和T淋巴细胞、单核细胞、循环和特化的组织巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞，和它们各自的祖细胞)；和
(i)肺纤维化或肝硬化或肝纤维化；
(j)慢性炎症性胃肠疾病，诸如巴特氏食道症；和
(k)骨髓衰竭综合症、再生障碍性贫血、骨髓增生异常性贫血或骨髓增生异常综合症。
除以上提到的细胞类型外，其中端粒酶活性的增加会在治疗上有益的其他细胞类型包括但不限于肝脏、内分泌与外分泌腺、平滑的肌肉组织或骨骼的肌肉组织的细胞。
举个例子，在感染HIV的个体情况下，CD8+细胞更新增加，因为这些细胞试图控制感染HIV的CD4+细胞的水平。在AIDS(以上第(g)项)中，认为疾病是由HIV限制的CD8+细胞的早期衰老所引起。所述细胞的老化并非简单归结于每次细胞倍增时端粒序列的异常损失量，而是除此之外，还归结于细胞的复制速率增加，使得端粒损耗高于该组细胞的正常损耗。因此，本发明提供治疗感染HIV的受试者，更具体来说，降低感染HIV的受试者中HIV限制的CD8+细胞早期衰老的方法，所述方法通过向需要所述治疗的受试者施用有效量的如上文第II部分中所公开的式I化合物来进行。
端粒酶活性的增加可以有益于非分裂细胞以及增殖细胞，例如，在与对因压力造成的细胞死亡的易感性增加相关的病况中，诸如心脏衰竭中或中风中的局部缺血(例如，参见Oh and Schneider，J Mol CellCardiol 34(7)：717-24；Mattson，Exp Gerontol.35(4)：489-502)。因此，本发明提供通过增加受试者细胞中的端粒酶活性，来降低受试者中压力或DNA损伤诱导的细胞死亡的方法，所述受试者诸如在组织中经历因心脏衰竭或中风造成的局部缺血病况的受试者，所述方法包括向需要所述治疗的受试者施用有效量的如上文第II部分中所公开的式I化合物。如上文提到，所述方法可以包括诊断受试者中所指明病况的预备步骤。
在另一方面，所述组合物可以用于治疗以下个体：在该患者中一种或多种细胞类型是限制性的，并且其寿命可以通过延长这些细胞继续复制或抵抗压力诱导的细胞死亡的能力而得到延长。这样一组细胞的一个例子是在唐氏综合症患者中存在的淋巴细胞。因此，本发明提供提高唐氏综合症患者中存在的淋巴细胞的复制能力和/或生命期的方法，这是通过增加患者的所述细胞中的端粒酶活性来实现的，所述方法包括向所述患者施用有效量的如上文第II部分中所公开的式I化合物。所述组合物还可以用来改善对正常老化期间发生的压力诱导的细胞死亡的抵抗。
在本发明的另一方面，增加端粒酶活性有效预防肺纤维化或促进肺纤维化的痊愈。已经确定，短端粒是特发性肺纤维化或是隐源性肝硬化的标志(Alder等人，PNAS(2008)105(35)13051-13056)。本发明的化合物可以用来治疗肺纤维化或肝硬化。
在另一方面，本发明提供一种提高来自活体供体或尸体的组织到活体患者或受试者的移植的方法，其包括使移植组织与如上文所定义的分离的式I化合物接触。在另一方面，本发明提供一种提高组织到活体患者或受试者的移植的方法，其包括在组织移植到患者中之前、与其同时或者在之后一段时间，向患者施用分离的如上文所定义的式I化合物。移植的组织可以是实体组织，诸如肾、心脏、肺等，或者是造血组织，诸如但不限于血细胞，诸如白细胞、淋巴细胞或可以来源于骨髓的造血前体细胞。
在本发明的另一方面，增加端粒酶活性有效促进伤口、烧伤、擦伤或表皮的其他急性或慢性病况的愈合。因此，本发明提供治疗表皮的急性或慢性病况的方法，所述方法通过向需要所述治疗的患者(通常向受影响的面积)施用有效量的如上文第II部分中所公开的分离的式I化合物制剂来进行。
本文所使用的“表皮的急性或慢性病况”包括诸如在外伤、烧伤、擦伤、外科切口、移植供体位点中遭受的损伤或由传染因子引起的损伤等急性病况，和诸如慢性静脉曲张性溃疡、糖尿病性溃疡、压迫性溃疡、褥疮以及粘膜表面的溃疡或疮等慢性病况。还包括由持续性炎症状态或感染或由遗传缺陷引起的皮肤或上皮表面损伤(诸如瘢痕瘤形成和凝血功能异常)。例如，参见PCT专利公开第WO 02/91999号。
端粒酶活性增加在所述治疗中的所需作用包括在治疗位点的细胞增殖或迁移、表面的上皮化、伤口(如果存在)的闭合，或正常生理功能的恢复。治疗位点的“上皮化”或“再上皮化”意指在该位点作为所应用疗法的结果的上皮细胞的密度增加。
所述方法还可以用来提高嫁接细胞的生长。端粒酶活性增加在所述治疗中的所需作用包括治疗位点的覆盖、嫁接细胞的存活、没有免疫排斥、伤口(如果存在)的闭合，或正常生理功能的恢复。嫁接细胞可以参与伤口闭合，这通过直接参与愈合过程(例如，成为愈合组织的一部分)，或者通过覆盖伤口由此提供促进由宿主细胞的愈合的环境来实现。
本发明还涵盖皮肤的操纵和皮肤表面中任何所感受到的缺陷的修复。
在另一方面，本发明的方法和组合物可以用来通过增加细胞中的端粒酶活性，提高培养中(例如，在离体或体外细胞疗法中或在单克隆抗体产生中)细胞的复制能力和/或延长其生命期。增加端粒酶活性通过减慢端粒重复序列缺失和/或改善细胞增殖期间对压力诱导的细胞死亡的抵抗，来增加所述细胞的复制能力。
在离体应用的情况下，向从受试者获得的外植体细胞添加有效量的如上文所述的式I化合物。0“有效量”指代有效增加细胞中的端粒酶活性从而增加细胞的复制能力和/或生命期的量。
外植体细胞可以包括，例如，干细胞，诸如骨髓干细胞(美国专利第6,007,989号)，骨髓基质细胞(Simonsen等人，Nat Biotechnol20(6)：592-6，2002)，或肾上腺皮质细胞(Thomas等人，Nat Biotechnol18(1)：39-42，2000)。诸如上文第(a)-(g)项中所提到那些的疾病状况也可以经受离体细胞疗法。实例包括使用肌卫星细胞治疗肌肉萎缩症、使用成骨细胞治疗骨质疏松症、使用视网膜色素上皮细胞治疗年龄相关性黄斑变性、使用软骨细胞治疗骨关节炎等等。
例如，认识到功能性CD8+细胞在AIDS患者中对于控制受感染CD4+细胞的扩增是有限的，这允许设想出一种治疗方案，此方案中，在首先检测出AIDS的早期阶段从感染HIV的个体去除HIV限制的CD8+细胞，储存在库中，接着在该个体不再有必需的CD8+细胞可用的晚期阶段，重新引入个体中。因此，可以利用涉及在适当时间点连续施用该个体的有限性细胞的方案来延长个体的寿命。这些适当时间点可以通过以下步骤确定：追随CD8+细胞衰老，或者测定所述CD8+细胞内端粒的长度，作为那些细胞将变得衰老时的指示。根据本发明，可以在减慢端粒重复序列缺失的试剂，即如上文第II部分中所公开的式I化合物的存在下，在数目上扩增所储存的细胞。
相应地，本发明提供离体细胞疗法的方法，所述方法包括从受试者获得细胞群，和离体扩增细胞群，其中用如上文第II部分中所公开的式I化合物处理细胞群，所述化合物的量有效增加端粒酶活性并因而提高细胞群的复制能力和/或生命期。所述方法一般包括利用离体细胞疗法诊断受试者中经受治疗的病况，诸如上文所提到的那些。
在另一实施方案中，本发明提供一种干细胞增殖的方法，其中用如上文第II部分中所公开的式I化合物处理干细胞群，所述化合物的量有效增加端粒酶活性并因而提高细胞群的复制能力和/或生命期。
VI.制剂和施用方法
本发明涵盖制备适用于增加细胞中端粒酶活性和/或促进伤口愈合的药物组合物的方法。相应地，将第II部分中所述的分离的式I化合物与药物赋形剂以及任选地与其他医用试剂、佐剂等等组合，后者可以包括活性与非活性成分。所述组合物可以采用固体、半固体、冻干粉或液体剂型的形式，诸如(例如)片剂、胶囊、粉剂、持续释放制剂、溶液、混悬液、乳液、栓剂、乳剂、膏剂、洗剂、气溶胶等等。可以在适用于简单施用精确剂量的单位剂型中提供所述制剂。
分离的式I化合物还可以调配为口服施用。对于口服药物制剂，适合的赋形剂包括药物级的载体，诸如甘露醇、乳糖、葡萄糖、蔗糖、淀粉、纤维素、明胶、硬脂酸镁、糖精钠和/或碳酸镁。为用于口服液体制剂，所述组合物可以制备为溶液、混悬液、乳液或糖浆，以适合在含水载体中水合的固体或液体形式提供，所述含水载体诸如(例如)含水盐水、含水葡萄糖、甘油或乙醇、聚乙二醇、聚乙二醇硬脂酸酯15(macrogol-15hydroxystearate)，或例如水或生理盐水。如果需要，那么组合物还可以含有少量无毒的辅助物质，诸如湿润剂、乳化剂或缓冲剂。
为用于伤口愈合或者表皮的其他急性或慢性病况的治疗，式I的化合物可以调配为局部施用。用于局部应用的媒介物可以呈各种形式中的一种，例如，洗剂、乳剂、凝胶、膏剂、棒剂(stick)、喷雾剂或糊剂。这些产品形式可以根据众所周知的方法调配。它们可以包含各种类型的载体，包括，但不限于，溶液、气溶胶、乳剂、凝胶和脂质体。例如，载体可以调配为乳剂，具有水包油或油包水基质。适合在乳剂中采用的疏水性(油性)组分包括例如植物油、动物脂肪与油、合成烃和酯及其醇，包括聚酯，以及有机聚硅氧烷油。所述乳剂还可以包括乳化剂和/或表面活性剂，例如非离子型表面活性剂，诸如本领域中众所周知的，用以在连续相中分散和悬浮非连续相。
局部制剂通常含有选自结构化剂、增稠剂或胶凝剂以及润肤剂或润滑剂的一种或多种组分。经常采用的结构化剂包括长链醇，诸如硬脂醇，以及甘油醚或酯和低聚环氧乙烷(oligo(ethylene oxide))醚或其酯。增稠剂和胶凝剂包括例如丙烯酸或甲基丙烯酸和其酯的聚合物、聚丙烯酰胺以及天然的增稠剂，诸如琼脂、角叉菜胶、明胶和瓜尔胶。润肤剂的实例包括甘油三酯、脂肪酸酯和酰胺，蜡诸如蜂蜡、鲸蜡或巴西棕榈蜡(carnauba wax)，磷脂诸如卵磷脂，以及固醇和其脂肪酸酯。局部制剂可以进一步包含本领域中已知的其他组分，例如收敛剂、香精、颜料、透皮增强剂、遮光剂等等。
药物组合物还可以调配为以非经肠、经皮方式或通过吸入来施用。供非经肠施用的可注射组合物通常含有在诸如无菌生理盐水等适合的静脉内(IV)溶液中的活性化合物。组合物还可以调配为在脂质或磷脂中的混悬液、脂质体混悬液或含水乳剂。
为通过吸入施用，可以将活性化合物调配为固体或液体气溶胶粒子。制剂还可以包含推进剂和/或分散剂，诸如乳糖，用以促进气溶胶的形成。为经皮施用，可以把活性化合物包括进经皮贴片中，所述经皮贴片允许化合物缓慢传递到选定的皮肤区域，并且还可以包含穿透增强物质，诸如脂肪族醇或甘油。
用于制备所述制剂的方法在本领域中是已知的或者对本领域的技术人员显而易见；例如，参见Remington’s Pharmaceutical Sciences(19th Ed.，Williams & Wilkins，1995)。待施用的组合物将含有一定数量的选定化合物，所述数量是用于增加靶细胞或组织中端粒酶活性的药学上安全而有效的量。
药物组合物含有至少0.1％(w/v)如上文所述的式I化合物，高于0.1％、多达约10％、多达约5％以及多达约1％(w/v)。适合浓度的选择取决于诸如活性剂的所需剂量、频率和传递方法等因素。
为治疗受试者或患者，诸如哺乳动物或人患者，基于诸如受试者的体重与总体健康状况、所治疗的病况、症状严重程度等因素来确定剂量。通过确定剂量和浓度来产生所需的益处而同时避免任何非所需的副作用。本发明化合物的典型剂量在1mg/kg/天-50mg/kg/天、1mg/kg/天-25mg/kg/天、1mg/kg/天-20mg/kg/天、4mg/kg/天-15mg/kg/天的范围内。对于人患者，本发明化合物的典型剂量在约1mg/天到1,500mg/天的范围内，约1mg/天-500mg/天。例如，在具体实施方案中，本文中指定为4的化合物的施用水平为至少1mg/kg/天或至少5mg/kg/天。
式I化合物的施用可以每隔一天一次、每天一次、每天两次或者频率更高。施用可以是一次、1-20天、5-10天或连续进行，只要是预防或治疗所预防或治疗的疾病或病况所必需的。
提供下列实施例，意在说明而非限制。
实施例
实施例1.黄芪苷IV(1)向17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋 喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β，6α，16β-三 醇[环黄芪醇](2)的转化
向黄芪苷IV(1)(5.00g，mmol)中添加“HCl-MeOH 10”(TCIAmerica)(500mL)，在室温搅拌混合物7天。在20℃减压浓缩反应混合物到约一半体积(不加热)。将混合物分配到碳酸氢钠水溶液与乙酸乙酯中。再次用乙酸乙酯萃取水层。合并有机层，用饱和氯化钠洗涤，在无水硫酸钠上干燥，并减压浓缩。利用柱色谱法(20∶1～14∶1氯仿/甲醇)纯化残余物。将纯化的材料溶于乙醇中以便用乙醇替换残留溶剂，减压去除溶剂得到2(2.1g，64％)。
1H NMR(CDCl3)δ(ppm)0.34(d，J＝4.7Hz，1H)，0.48(d，J＝4.3Hz，1H)，0.92(s，3H)，0.93(s，3H)，1.0-1.8(m，13H)，1.11(s，3H)，1.19(s，3H)，1.22(s，6H)，1.27(s，3H)，1.9-2.0(m，4H)，2.30(d，J＝7.8Hz，1H)，2.54(q，J＝11.8Hz，1H)，3.27(m，1H)，3.50(m，1H)，3.72(t，J＝7.4Hz，1H)，4.65(q，J＝7.4Hz，1H)。ESI-MS m/z正491(M+H)+，负549(M+AcO)-。TLC(Merck，Kieselgel 60)Rf＝0.33(6∶1氯仿/甲醇)
实施例2.2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲 基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10] 环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3-(L)-缬氨酰基-环黄芪醇](4)的制备
3的制备：将Boc-(L)-缬氨酸-OH(18g，81.63mmol)(加州Torrance的Bachem)溶于150ml二氯甲烷(DCM)中。向其中添加15g(81.63mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加12.8ml(81.63mmol)的1，3二异丙基碳化二亚胺(DIC)。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)接着先后向此混合物中添加10g(20.41mmol)的(2)和10g(81.63mmol)二甲氨基吡啶(DMAP)，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用H2O(2次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1N NaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到7.0g(50％)目标产物3和随之6.0g，(33％)bis产物。
3的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.52(1H，bs)，0.90-1.38(m，30H)，1.39-1.45(s，m 12H)，1.59-1.63(m，5H)，1.76-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.16-2.20(m，1H)，2.30-2.35(d，1H)，2.49-2.54(q，1H)，3.45-3.57(t，1H)，3.71-3.76(t，1H)，4.19-4.21(m，1H)，4.53-4.61(m，1H)，4.69-4.71(q，1H)，5.0-5.2(d，1H.MS(M+H)690。
4的制备：向1g(1.45mmol)的3中添加1.8ml的4.0M HCl/二噁烷，搅拌4小时。蒸发溶剂，在10ml冷乙醚中沉淀产物，过滤固体。接着在高真空下干燥固体过夜，得到800mg(88％)目标产物4 2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯.盐酸盐，呈白色粉末。
4的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.36(bs，1H)，0.49(bs，1H)，0.80-1.39(m，29H)，1.44-1.60(m，3H)，1.61-1.70(m，2H)，1.81-1.89(m，4H)，2.19-2.30(m，2H)，2.41-2.60(m，2H)，3.29-3.41(m，2H)，3.58-3.61(t，1H)，3.81-3.83(m，1H)，4.18-4.39(bs，4H)，4.49-4.51(q，2H)，4.54-4.59(m，1H)，8.40-8.58(bs，2H).MS(M+H)590。
实施例3.2-(D)-氨基-3-甲基-丁酸-6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲 基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10] 环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3-(D)-缬氨酰基-环黄芪醇](5)的制备
使用实施例2的程序，利用Boc-(D)缬氨酸-OH(加州Torrance的Bachem)(18g，81.63mmol)制备化合物5。
5的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.30(bs，1H)，0.50(bs，1H)，0.80-1.39(m，29H)，1.46-1.58(m，3H)，1.61-1.70(m，2H)，1.79-1.89(m，4H)，2.16-2.32(m，2H)，2.38-2.54(m，2H)，3.29-3.41(m，2H)，3.58-3.61(t，1H)，3.81-3.83(m，1H)，4.13-4.24(bs，4H)，4.50-4.52(q，2H)，4.54-4.59(m，1H)，8.43-8.60(bs，2H).MS(M+H)590。
实施例4：2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β- 羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四 甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3，C6-(L，L)-双缬 氨酰基-环黄芪醇]-7的制备
6的制备：将Boc-(L)缬氨酸-OH(10g，46.08mmol)溶于80ml的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中。向其中添加8.5g(46.08mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加7.2ml(46.08mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加3.2g(6.60mmol)的(2)和5.5g(45mmol)的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，依次用H2O(6次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1N NaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到4.8g(83％)目标产物6。
6的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.60(1H，bs)，0.80-1.0(m，24H)，1.15(s，s 6H)，1.20(s，s 6H)，1.31(s，6H)，1.35(s，s 4H)1.41(s，s18H)，1.56-1.60(m，4H)，1.79-1.83(m，3H)，3.71-3.76(t，1H)，4.08-4.21(m，2H)，4.58-4.60(m，1H)，4.61-4.70(q，1H)，4.72-4.80(m，1H)，4.82-4.84(d，1H)，4.9-5.0(d，1H).MS(M+H)889。
7的制备：向4.5g(5.06mmol)的6中添加13ml的4.0M HCl/二噁烷，搅拌4小时。蒸发溶剂，在40ml冷乙醚中沉淀产物，过滤出固体。接着在高真空下干燥固体过夜，得到3.1g(91％)呈白色粉末的目标产物7。7的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.24(bs，1H)，0.59(bs，1H)，0.80-1.20(m，35H)，1.41-1.85(m，12H)，2.10-2.22(m，2H)，2.32-2.42(m，4H)，2.19-2.30(m，2H)，3.59-3.62(m，1H)，3.81-3.83(m，2H)，4.40-4.53(m，1H)，4.60-4.71(m，1H)，4.81-4.9(m，1H)，8.40-8.70(d，4H).MS(M+H)689。
实施例5：2-(D)-氨基-3-甲基-丁酸-6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β- 羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四 甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3，C6-(D，D)-双缬 氨酰基-环黄芪醇]8的制备
使用实施例4的相同程序和Boc-(D)缬氨酸-OH(加州Torrance的Bachem)制备化合物8。
8的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.26(bs，1H)，0.60(bs，1H)，0.78-1.23(m，35H)，1.39-1.80(m，12H)，2.10-2.22(m，2H)，2.19-2.30(m，2H)2.35-2.40(m，4H)，3.60-3.62(m，1H)，3.80-3.85(m，2H)，4.42-4.53(m，1H)，4.58-4.70(m，1H)，4.81-4.9(m，1H)，8.40-8.70(d，4H).MS(M+H)689。
实施例6.2-(L)-叔丁氧羰氨基-3-甲基-丁酸-3b-乙酰氧基-16b-羟基 -17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基- 十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基酯盐酸盐[C6-(L)-缬氨酰基-环黄 芪醇]12的制备
9的制备：向5g(10.22mmol)的2中添加40ml的CHCl3和2.1ml(26mmol)吡啶。在冰浴中冷却反应混合物，向其中缓慢添加2.5ml(26mmol)乙酸酐。添加完成后，在4℃搅拌反应24小时。TLC显示对应于9、单乙酰化和双乙酰化产物的三个斑点。用100ml的DCM稀释反应混合物，并依次用以下各物洗涤：饱和NaHCO3水溶液(2次)、1M HCl(1次)、H2O(1次)和盐水(1次)。分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，并真空蒸发。利用快速色谱法，使用含2％MeOH的DCM纯化粗品，得到2.3g(42％)呈白色固体的9。9的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.49(1H，bs)，0.90-1.25(m，32H)，1.39-1.45(m2H)，1.50-1.60(m，2H)，1.70-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.18-2.20(s，3H)，2.30-2.35(d，1H)，3.45-3.57(m，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.49-4.59(m，1H)，4.69-4.72(m，1H)，.MS(M+H)533。
10的制备：将1.08g(5.0mmol)的Boc-(L)-缬氨酸溶于5ml的DCM中。向其中添加920mg(5.0mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加0.78ml(5.0mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟。接着先后向此混合物中添加532mg(1.0mmol)的9和490mg(4.0mmol)的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用饱和NaHCO3(3次)、0.1N HCl(1次)、H2O(3次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。向残余物添加20ml的Et2O，抽吸过滤白色沉淀。再重复一次此操作，蒸发滤液，使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到590mg(81％)的10。
10的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.35(1H，bs)，0.53(1H，bs)，0.75-1.30(m，38H)，1.45(s 9H)，1.50-1.60(m，2H)，1.70-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.18-2.20(s，3H)，2.30-2.35(d，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.13-4.19(m，1H)，4.40-4.41(m，1H)，4.51-4.53(m，1H)，4.60-4.63(m，1H)，4.69-4.72(m，1H)，.4.81-4.83(m，1H).MS(M+H)731。
11的制备：将500mg(0.68mmol)的10溶于5.0ml无水MeOH中，向其中添加2.8ml的0.5M MeONa/MeOH。在室温搅拌反应24小时。滴加1M HCl/MeOH来小心中和反应(用pH计监测)，真空蒸发溶剂。将残余物溶于30ml的DCM中，依次用饱和NaHCO3(1次)、H2O(1次)、盐水(1次)洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。使用快速色谱法纯化粗产物，得到403mg(86％)呈白色固体的11。粗品不进行任何纯化带入下一步骤。11的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.39(1H，bs)，0.58(1H，bs)，0.86-1.35(m，38H)，1.47(s 9H)，1.53-1.61(m，2H)，1.70-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.30-2.35(d，1H)，3.19-3.22(m，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.13-4.19(m，1H)，4.40-4.41(m，1H)，4.60-4.63(m，1H)，4.69-4.72(m，1H)，.4.81-4.83(m，1H).MS(M+H)690。
12的制备：向400mg(0.58mmol)的10中添加0.73ml的4.0MHCl/二噁烷，搅拌4小时。接着真空蒸发溶剂，用5mL冷乙醚洗涤残余物。过滤出固体，在高真空干燥过夜，得到290mg(80％)呈白色固体的12。
12的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.30(bs，1H)，0.45(bs，1H)，0.80-1.19(m，29H)，1.47-1.58(m，3H)，1.61-1.70(m，2H)，1.81-1.89(m，4H)，2.19-2.30(m，2H)，2.43-2.60(m，2H)，3.03-3.05(m，1H)，3.56-3.60(t，1H)，3.73-3.75(m，1H)，3.80-4.09(bs，4H)，4.40-4.51(m，1H)，4.71-4.79(m，1H)，8.40-8.58(bs，2H).MS(M+H)590。
实施例7.2-(L)，3-二甲基-戊酸-6α，16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基- 乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环 戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3-(L)-异亮氨酰基-环黄芪醇]14的制备
13的制备：将Boc-(L)异亮氨酸-OH(加州Torrance的Bachem)(1.9g.8.16mmol)溶于25ml的DCM中。向其中添加1.5g(8.16mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加1.3ml(8.16mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加1.0g(2.04mmol)的2和976mg(8.0mmol)的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用H2O(2次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1N NaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到943mg(67％)目标产物13和随之330mg的bis产物。
13的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.52(1H，bs)，0.93-1.28(m，33H)，1.39-1.45(s，m 12H)，1.59-1.63(m，5H)，1.76-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.16-2.20(m，1H)，2.30-2.35(d，1H)，2.49-2.54(q，1H)，3.45-3.57(m，1H)，3.71-3.76(t，1H)，4.19-4.21(dd，1H)，4.53-4.61(m，1H)，4.69-4.71(q，1H)，5.0-5.2(d，1H.MS(M+H)704。
14的制备：向700mg(1.0mmol)的11中添加1.25ml的4.0M HCl/二噁烷，搅拌4小时。蒸发溶剂，在10ml冷乙醚中沉淀产物，过滤固体。接着在高真空下干燥固体过夜，得到512mg(80％)呈白色粉末的目标产物12。12的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.36(bs，1H)，0.49(bs，1H)，0.80-1.39(m，32H)，1.44-1.60(m，3H)，1.61-1.70(m，2H)，1.81-1.89(m，4H)，2.19-2.30(m，2H)，2.41-2.60(m，2H)，3.29-3.41(m，1H)，3.58-3.61(t，1H)，3.86-3.90(m，1H)，4.18-4.39(bs，4H)，4.51-4.53(m，2H)，4.54-4.59(m，1H)，8.40-8.58(bs，2H).MS(M+H)604。
实施例8：2-(L)-氨基-己酸-6a，16b-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙 基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a] 菲-3b-基酯盐酸盐[C3-(L)-鸟氨酰基-环黄芪醇]16a、2(L)，5-二氨基- 戊酸-3b，16b-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2- 基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基酯盐酸盐 [C6-(L)-鸟氨酰基-环黄芪醇]16b和2(L)，5-二氨基-戊酸-3b，6a-二羟基 -17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基- 十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-16b-基酯盐酸盐[C16-(L)-鸟氨酰基-环 黄芪醇]16c的混合物的制备
15a、15b、15c的制备：将(Boc)2-(L)鸟氨酸-OH(4.5g，13.6mmol)(加州Torrance的Bachem)溶于15ml的DCM中。向其中添加2.5g(13.6mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加2.2ml(13.6mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加700mg(1.43mmol)的2和1.6g(13.6mmol)的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用H2O(2次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1N NaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。接着向残余物添加25ml乙醚，沉淀出脲。蒸发滤液，使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到690mg(60％)产物15a、15b、15c的混合物，以及120mg(8％)的C3、C6bis产物。
1HNMR显示主要量的15a和15b产物，含2％位置异构体15c。混合物(15a、15b和15c)的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.52(1H，bs)，0.90-1.38(m，26H)，1.39-1.45(s，m 27H)，1.59-1.63(m，5H)，1.76-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.16-2.20(m，1H)，2.30-2.35(d，1H)，2.49-2.54(q，1H)，3.10-3.19(m，6H)，3.19-3.22(m，1H)，3.45-3.57(t，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.19-4.21(m，1H)，4.22-4.30(m，1H)，4.52-4.60(m，1H)，4.61-4.65(m，1H)，4.79-4.81(m，1H)，4.95-5.01(m，1H)，5.13-5.21(m，1H)，5.38-5.41(m，1H).MS(M+H)804
16a、16b、16c的制备向200mg(0.25mmol)15a、15b、15c的混合物添加10ml的1.0M HCl/乙醚，搅拌16小时。过滤白色固体，用10ml的Et2O(4次)洗涤。接着在高真空下干燥固体过夜，得到160mg(95％)呈白色粉末的目标产物16a、16b、16c。1HNMR显示主要量的16a和16b产物，含2％的C-16(16c)位置异构体。
混合物(16a、16b和16c)的1HNMR：(D2O)δppm：0.26(1H，bs)，0.52(1H，bs)，0.90-1.18(m，26H)，1.49-1.74(m，5H)，1.83-2.10(m，2H)，2.20-2.31(m，4H)，2.81-2.92(m，2H)，3.19-3.20(m，1H)，3.39-3.42(m，1H)，3.62-3.71(m，1H)，3.88-4.00(m，1H)，4.08-4.12(m，1H)，4.52-4.57(m，1H)，4.61-4.65(m，1H)，4.79-4.81(m，1H).MS(M+H)：605。
实施例9：2-(L)-氨基-戊二酸1-{6a，16b-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基- 乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环 戊[a]菲-3b-基}酯盐酸盐[C3(L0-谷氨酸酯-环黄芪醇]18a、2-(L)-氨基 -戊二酸1-{3b，16b-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋 喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基}酯盐酸 盐[C6(L)-谷氨酸酯-环黄芪醇]18b、2-(L)-氨基-戊二酸1-{3b，6a-二羟 基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲 基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-16b-基}酯盐酸盐[C16(L)-谷氨酸酯- 环黄芪醇]18c的混合物的制备
17a、17b、17c的制备：将Boc-(L)-谷氨酸(加州Torrance的Bachem)(O-tBu)-OH(4.5g，14.82mmol)溶于15ml的DCM中。向其中添加2.73g(14.82mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加2.3ml(14.82mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加765mg(1.56mmol)环黄芪醇2和1.8g(14.82mmol)的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用H2O(2次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1N NaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。接着向残余物添加50ml乙醚，沉淀出脲。蒸发滤液，使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到714mg(60％)产物17a、17b、17c的不可分离混合物，以及140mg(9％)的bis产物(C3、C6)。1HNMR显示主要量的17a和17b产物，含2％位置异构体(17c)。
混合物(17a、17b和17c)的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.29(1H，bs)，0.56(1H，bs)，0.90-1.20(m，26H)，1.30-1.40(s，m 25H)，1.48-1.65(m，3H)，1.82-1.92(m，2H)，2.16-2.22(m，2H)，2.42-2.50(m，2H)，3.20-3.40(m，1H)，3.55-3.61(m，1H)，3.82-3.96(m，1H)，4.42-4.50(m，1H)，4.62-4.71(m，1H)，4.79-4.81(m，1H)，4.95-5.01(m，1H)，5.13-5.21(m，1H)，5.38-5.41(m，1H).MS(M+H)776。
18a、18b、18c的制备：向260mg(0.34mmol)17a、17b、17c的混合物添加10ml的1.0M HCl/乙醚，搅拌16小时。过滤白色固体，用10ml的Et2O(4次)洗涤。接着在高真空下干燥固体过夜，得到210mg(95％)呈白色粉末的目标产物18。1HNMR显示主要量的C-3(18a)和C-6(18b)产物，含小于2％的C-16(18c)位置异构体。混合物(18a、18b和18c)的1HNMR：(D2O)δppm：0.26(1H，bs)，0.49(1H，bs)，0.90-1.18(m，26H)，1.49-1.74(m，4H)，1.83-2.10(m，2H)，2.20-2.31(m，4H)，2.39-2.50(m，4H)，2.81-2.92(m，2H)，3.29-3.30(m，1H)，3.39-3.42(m，1H)，3.62-3.71(m，1H)，3.88-4.02(m，3H)，4.52-4.57(m，1H)，4.61-4.65(m，1H)，4.79-4.81(m，1H).MS(M+H)：620。
实施例10：2-(L)-氨基-3-苯基-丙酸-6a，16b-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲 基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10] 环戊[a]菲-3a-基酯盐酸盐[C3-(L)-苯丙氨酰基-环黄芪醇]20a、2-(L)- 氨基-3-苯基-丙酸-3b，16b-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基- 四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-6a-基 酯盐酸盐[C6-(L)-苯丙氨酰基-环黄芪醇]20b的混合物的制备
19a、19b的制备：将Boc-(L)-苯丙氨酸-OH(加州Torrance的Bachem)(5.0g，18.84mmol)溶于30ml的DCM中。向其中添加3.5g(18.84mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加2.9ml(1.9mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加1.0g(1.56mmol)环黄芪醇2和1.8g(15mmol)的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用H2O(2次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1N NaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。接着向残余物添加50ml乙醚，沉淀出脲。蒸发滤液，使用快速色谱法，利用含1％-2％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到950mg(68％)产物的不可分离混合物(C-3和C-6)，以及290mg 30％的bis产物(C3和C6)。1HNMR显示主要量的C-3(19a)和C-6产物(19b)。
混合物(19a和19b)的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.32(1H，bs)，0.60(1H，bs)，0.70-1.20(m，14H)，1.30-1.40(s，m 12H)，1.48-1.65(m，2H)，1.76-1.92(m，4H)，2.22-2.32(m，1H)，2.52-2.58(m，1H)，2.86-2.91(m，1H)，3.0-3.18(m，1H)，3.20-3.24(m，1H)，3.55-3.61(m，1H)，3.72-3.80(m，1H)，4.0-4.10(m，1H)，4.42-4.58(m，2H)，4.61-4.63(m，1H)，4.77-4.78(m，1H)，4.81-4.90(m，1H)，7.08-7.25(m，5H).MS(M+H)738。
20a、20b的混合物的制备：向330mg(0.45mmol)19a和19b的混合物添加10ml的1.0M HCl/乙醚，搅拌8小时。过滤白色固体，用10ml的冷Et2O(3次)洗涤。接着在高真空下干燥固体过夜，得到260mg(86％)呈白色粉末的目标产物20a和20b。
混合物(20a和20b)的1HNMR：(DMSOd6)δppm：0.22(1H，bs)，0.55(1H，bs)，0.70-1.10(m，24H)，1.20-1.30(m，3H)，1.42-1.55(m，2H)，1.61-1.80(m，2H)，1.87-1.89(m，2H)，2.19-2.20(d，1H)，2.42-2.50(m，1H)，2.92-3.10(m，2H)，3.20-3.21(m，2H)，3.30-3.34(m，1H)，3.55-3.61(m，1H)，3.78-3.88(m，1H)，4.12-4.20(m，2H)，4.42-4.45(m，1H)，4.48-4.53(m，1H)，4.80-4.82(m，1H)，7.08-7.25(m，5H)，8.62-8.80(bs，3H).MS(M+H)638
实施例11.3-甲基-2-(L)-甲氨基-丁酸-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲 基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-6α-甲氧基-4，4，13，14-四甲基-十四氢 -环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3-(L)-缬氨酰基-C6-甲氧基-环 黄芪醇](22)的制备
由中间体3起始，按照以下程序制备此类似物。
21的制备：将280mg(0.41mmol)的3溶于1.5mL的NMP中，向其中添加33mg(0.82mmol)的NaH(60％油分散液)。搅拌反应10分钟，之后添加80μL硫酸二甲酯，在环境温度搅拌16小时。反应混合物用25mL的DCM稀释，用H2O(4x5mL)和盐水(1x5mL)洗涤，在Na2SO4上干燥，过滤。减压浓缩滤液。使用快速色谱法，利用含1％-3％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化粗品，得到170mg(58％)的21。
21的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.52(1H，bs)，0.90-1.38(m，30H)，1.39-1.45(s，m 12H)，1.59-1.63(m，5H)，1.76-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.16-2.20(m，1H)，2.30-2.35(d，1H)，2.49-2.54(q，1H)，2.70-2.73(s，s，3H)，3.20-3.22(s，s 3H)，3.26-3.28(t，1H)，3.70-3.75(t，1H)，4.19-4.21(m，1H)，4.53-4.61(m，1H)，4.70-4.73(q，1H).MS(M+H)718。
22的制备：向150mg(0.21mmol)的21添加8ml的1.0M HCl/乙醚，搅拌24小时。过滤白色固体，用乙醚洗涤(2x5ml)。接着在高真空下干燥固体过夜，得到115mg(85％)呈白色粉末的目标产物22。
22的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.35(bs，1H)，0.48(bs，1H)，0.81-1.40(m，29H)，1.45-1.60(m，3H)，1.61-1.70(m，2H)，1.81-1.89(m，4H)，2.19-2.30(m，2H)，2.41-2.70(m，5H)，3.0-3.18(m，3H)3.20-3.28(m，2H)，3.58-3.61(t，1H)，3.81-3.83(m，1H)，4.0-4.12(bs，4H)，4.49-4.51(m，1H)，4.62-4.70(m，1H)，9.20-9.42(bs，2H).MS(M+H)618。
实施例12.2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α，16β-二甲氧基-17-[5-(1-甲氧 基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢-环 丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3-(L)-缬氨酰基-C6，C16-二甲氧 基-环黄芪醇]27的制备
23的制备：将5.0g(10.2mmol)的2溶于吡啶(50ml)中，冷却到0℃。添加苯甲酰氯(2.35ml，20.4mmol)，在室温搅拌反应混合物24小时。反应混合物用200ml乙醚稀释，用饱和NaHCO3(2次)、H2O(2次)和盐水(1x)洗涤。在MgSO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。利用柱色谱法，使用含1％-2％MeOH的DCM纯化粗品，得到1.6g(26％)呈白色固体的23。
23的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(bs，1H)，0.55(bs，1H)，0.90-2.0(m，37H)，1.70-1.82(m，2H)，2.30-2.35(m，1H)，2.50-2.6(m，1H)，3.45-3.57(m，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.69-4.72(m，1H)，.4.79-4.81(m，1H)，7.41(t，2H)，7.52(t，1H)，8.03(d，2H).MS(M+H)595。
24的制备：将600mg(1.01mmol)的23溶于THF(10ml)中，添加NaH(323mg，8.08mmol)，搅拌反应混合物20分钟。添加硫酸二甲酯(509mg，4.04mmol)，在室温搅拌反应混合物16小时。反应混合物用100ml乙醚稀释，用H2O骤冷，依次用H2O(2次)和盐水(1次)洗涤，在MgSO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。利用柱色谱法，使用含1％-2％MeOH的DCM纯化粗品，得到460mg(72％)呈白色固体的24。
24的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.30(bs，1H)，0.53(bs，1H)，0.90-2.0(m，37H)，2.40-2.45(m，2H)，2.92-2.96(m，1H)，3.10-3.14(s，3H)，3.22-3.24(s，3H)，3.80-3.82(m，1H)，3.9-4.10(m，1H)，4.69-4.79(m，1H)，7.43(t，2H)，7.52(t，1H)，8.04(d，2H).MS(M+H)637。
25的制备：将460mg(0.72mmol)的24溶于DCM(10ml)中，向其中添加10ml 0.5M NaOMe的MeOH溶液，在40℃搅拌反应混合物48小时。用饱和NaHCO3溶液骤冷反应混合物，接着减压蒸发溶剂。利用柱色谱法，使用含1％-2％MeOH的DCM纯化粗品，得到210mg(55％)呈白色固体的25。
25的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.24(bs，1H)，0.49(bs，1H)，0.90-2.0(m，37H)，2.40-2.45(m，2H)，2.92-2.96(m，1H)，3.10-3.14(s，3H)，3.22-3.24(s，3H)，3.26-3.28(m，1H)，3.80-3.82(m，1H)，3.9-4.10(m，1H).MS(M+H)533。
26的制备：将Boc-Val-OH(685mg，3.16mmol)溶于3ml的DCM中。向其中添加581mg(3.16mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加0.49ml(3.16mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物10分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加210mg(0.395mmol)的25和385mg(3.16mmol)的DMAP，在室温搅拌反应48小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用H2O(2次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1N NaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。接着向残余物添加10ml乙醚，沉淀出脲。蒸发滤液，使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到277mg(96％)目标产物26。
26的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.23(bs，1H)，0.49(bs，1H)，0.90-2.0(m，52H)，2.20-2.25(m，1H)，2.32-2.45(m，1H)，2.92-3.0(m，1H)，3.08-3.10(s，3H)，3.19-3.20(s，3H)，3.22-3.25(s，3H)，3.82-3.84(m，1H)，3.90-3.92(m，1H)，4.10-4.21(m，1H)，4.50-4.58(m，1H)，4.91-5.01(m，1H).MS(M+H)732。
27的制备：向100mg(0.14mmol)的26添加8ml的1.0M HCl/乙醚，搅拌8小时。过滤白色固体，用乙醚洗涤(2x5ml)。接着在高真空下干燥固体过夜，得到65mg(70％)呈白色粉末的目标产物27。
27的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.20(bs，1H)，0.38(bs，1H)，0.75-1.90(m，43H)，2.10-2.15(m，1H)，2.20-2.25(m，1H)，2.82-2.88(m，1H)，2.93-3.03(s，3H)，3.19-3.20(s，3H)，3.22-3.25(s，3H)，3.70-3.79(m，1H)，3.90-3.92(m，1H)，4.10-4.21(m，1H)，4.50-4.58(m，1H)，8.14-8.24(bs，3H).MS(M+H)632。
实施例13：2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙 基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-3-氧代-十四氢-环丙[9，10] 环戊[a]菲-6α-基酯盐酸盐[C6-(L)-缬氨酰基-环黄芪酮](30)的制备： 3-(L)缬氨酰基-环黄芪酮的制备
28的制备：向DMSO(6.4g，4当量，100mL DCM)在-60℃到-70℃的搅拌溶液中添加草酰氯(5.2g，在10mL的DCM中)，搅拌10分钟。经10分钟时间添加化合物2(10g，在200mL的DCM中)，搅拌反应混合物30分钟，之后添加三乙胺(10.3g，经5min)。在-60℃到-70℃搅拌反应1-2小时直到反应完成。利用柱色谱法纯化粗产物28。用石油醚∶乙酸乙酯＝4∶1洗脱，得到8g单氧化产物。
28的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(bs，1H)，0.58(bs，1H)，0.80-1.32(m，25H)，1.50-2.20(m，12H)，2.30-2.70(m，4H)，2.50-2.6(m，1H)，3.45-3.52(m，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.69-4.72(m，1H)，MS(M+H)489。
29的制备：将Boc-(L)Val-OH(0.54g)溶于15ml的DCM中。向此溶液中添加0.45g五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加0.4ml的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加0.3g化合物28和0.3g的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，用0.1N NaOH水溶液(2次)、H2O(3次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。包含化合物29的残余物未进行纯化而带入下一脱保护步骤。
30的制备：用含HCl的乙酸乙酯处理以上粗产物12小时。接着用水萃取分离产物，一经干燥提供HCl盐粗品，利用制备型HPLC，使用石油醚与乙酸乙酯混合物进行纯化。汇集纯馏分，得到120mg终产物30。
30的1HNMR：(DMSOd6)δppm：0.40(bs，1H)，0.80(bs，1H)，0.80-1.32(m，29H)，1.50-2.20(m，12H)，2.30-2.32(m，2H)，2.40-2.45(m，2H)，3.60-3.62(m，1H)，3.93-4.01(m，1H)，4.49-4.51(m，1H)，4.79-4.81(m，1H).MS(M+H)588。
实施例14：2-(L)-氨基-3-甲基-戊酸-6α-(2-氨基-3-甲基-戊酰氧基)-16β- 羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四 甲基-十四氢-环丙[9，10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐[C3，C6-(L，L)-双-异 亮氨酸-环黄芪醇]-32的制备
31的制备：将Boc-(L)-Ile-OH(4.6g，20mmol)溶于25ml的N-甲基吡咯烷酮(NMP)中。向其中添加3.7g(20mmol)五氟苯酚。在冰浴中冷却反应，之后缓慢添加3.1ml(20mmol)的DIC。添加完成后，在室温搅拌反应混合物30分钟，此时反应混合物变浑浊(二异丙基碳化二亚胺-脲沉淀)。接着先后向此混合物中添加1.0g(2.04mmol)的2和1.7g(14mmol)的DMAP，在室温搅拌反应24小时。将反应混合物转移到分液漏斗中，依次用H2O(6次)、1％HCl水溶液(2次)、0.1NNaOH水溶液(2次)、饱和NaHCO3(3次)、H2O(1次)和盐水(1次)洗涤，分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发溶剂。使用快速色谱法，利用含2％-5％MeOH的DCM的溶剂梯度纯化残余物，得到1.4g(80％)目标产物31。
31的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.60(1H，bs)，0.80-1.0(m，24H)，1.13(s，s 6H)，1.20(s，s 6H)，1.32(s，6H)，1.35(s，s4H)1.41(s，s 18H)，1.55-1.60(m，6H)，1.79-1.83(m，3H)，3.71-3.75(t，1H)，4.08-4.20(m，2H)，4.58-4.60(m，1H)，4.61-4.71(q，1H)，4.72-4.80(m，1H)，4.82-4.84(d，1H)，4.9-5.0(d，1H).MS(M+H)915。
32的制备：向含1.5g(1.6mmol)31的4ml无水Et2O中添加3.5ml 4.0M HCl/二噁烷，搅拌4小时。蒸发溶剂，利用三次40ml冷乙醚沉淀产物，过滤出固体。接着在高真空下干燥固体过夜，得到3.1g(91％)呈白色粉末的目标产物32。32的1HNMR(DMSOd6)δppm：0.22(bs，1H)，0.57(bs，1H)，0.80-1.20(m，35H)，1.41-1.80(m，14H)，2.10-2.21(m，2H)，2.34-2.42(m，4H)，2.20-2.30(m，2H)，3.59-3.62(m，1H)，3.81-3.83(m，2H)，4.42-4.53(m，1H)，4.61-4.71(m，1H)，4.81-4.9(m，1H)，8.40-8.70(d，4H).MS(M+H)717。
实施例15：2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸，3β，6α-二羟基-16β-羟基-17-[5-(1- 羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4，4，13，14-四甲基-十四氢- 环丙[9，10]环戊[a]菲-16β-基酯盐酸盐[C16-(L)-缬氨酰基-环黄芪 醇]-36的制备
33的制备：向4g(8.2mmol)的2添加100ml吡啶，在冰浴中冷却。向其中先后缓慢添加77ml(820mmol)乙酸酐和100mg(0.81mol)DMAP。搅拌反应混合物16小时。在冰浴中冷却反应混合物，用3％HCl水溶液骤冷，用200ml DCM稀释，依次用以下各物洗涤：饱和NaHCO3水溶液(2次)、H2O(3次)和盐水(1x)。分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，并真空蒸发。利用快速色谱法，使用含1％MeOH的DCM纯化粗品，得到4.2g(89％)呈白色固体的33。33的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.49(1H，bs)，0.90-1.25(m，32H)，1.39-1.45(m 2H)，1.50-1.60(m，2H)，1.70-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.18-2.20(s，s 6H)，2.30-2.35(d，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.49-4.59(m，1H)，4.69-4.72(m，2H)，.MS(M+H)575。
34的制备：将1.54g(2.7mmol)33溶于8.0ml NMP中。向澄清溶液中添加800mg(8.3mmol)叔丁醇钾，搅拌45分钟。向其中先后添加3.0g(8.9mmol)Boc-Val-ONp和245mg(2mmol)DMAP，搅拌24小时。反应混合物用100ml DCM稀释，依次用以下各物洗涤：H2O(4次)、1％HCl水溶液(1次)、饱和NaHCO3水溶液(2次)、H2O(3次)和盐水(1x)。分离有机层，在Na2SO4上干燥，过滤，并真空蒸发。利用快速色谱法，使用石油醚/乙酸乙酯纯化粗品，得到1.0g(48％)呈白色固体的34。34的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.49(1H，bs)，0.90-1.25(m，38H)，1.39-1.45(m，s 11H)，1.50-1.60(m，2H)，1.70-1.82(m，2H)，1.96-2.01(m，4H)，2.18-2.20(s，s 6H)，2.30-2.35(d，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.13-4.18(m，1H)，4.49-4.59(m，1H)，4.62-4.72(m，1H)，5.12-5.17(m，1H)，5.38-5.42(m，1H).MS(M+Na+)796
35的制备：向700mg(0.91mmol)34添加20ml 0.5MMeOH/MeONa溶液，搅拌16小时。在冰浴中冷却反应，用1％HCl水溶液骤冷到pH 5。减压蒸发甲醇，向水层添加饱和NaHCO3水溶液，用DCM萃取(4次)，合并的有机层在Na2SO4上干燥，过滤，真空蒸发。利用快速色谱法，使用2％到3％MeOH/DCM的梯度纯化粗品，得到360mg(58％)呈白色固体的35。35的1HNMR：(CDCl3)δppm：0.38(1H，bs)，0.49(1H，bs)，0.90-1.25(m，38H)，1.39-1.45(m，s11H)，1.50-1.60(m，2H)，1.70-1.82(m，2H)，2.10-2.20(m，2H)，2.30-2.35(d，1H)，3.20-3.25(m，1H)，3.41-3.50(m，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.13-4.18(m，1H)，5.12-5.17(m，1H)，5.38-5.42(m，1H).MS(M+Na+)712
36的制备：向350mg(0.51mmol)35添加10ml 1.0M HCl/Et2O溶液，搅拌5小时。减压蒸发溶剂，残余物用10ml无水Et2O洗涤(3次)，真空过滤。在高真空下干燥白色固体，得到250mg(78％)呈白色固体的36。36的1HNMR：(DMSO-d6)δppm：0.38(1H，bs)，0.49(1H，bs)，0.80-1.25(m，29H)，1.39-1.83(m，4H)，2.10-2.20(m，2H)，2.30-2.40(m，4H)，3.18-3.21(m，1H)，3.38-3.40(m，1H)，3.71-3.76(m，1H)，4.13-4.17(m，1H)，5.40-5.42(m，1H)，8.38-8.53(bs，3H).MS(M+H)590
生物实施例1：角质形成细胞/端粒酶重复序列扩增法(TRAP)试验
可以使用端粒重复序列扩增法(TRAP)试验测定化合物增加细胞中端粒酶活性的能力，所述TRAP试验在本领域中是已知的(例如，Kim等人，美国专利第5,629,154号；Harley等人，美国专利第5,891,639号)。通常将该活性与在所述细胞的对照试验中类似测定的活性进行比较(例如，端粒酶活性比在溶剂对照中观察到的高50％)。
适合用于所述试验中的细胞系，正常人成纤维细胞(NHF)或正常人角质形成细胞(HEK)可以从商业来源(诸如俄勒冈州(OR)波特兰(Portland)的Cascade Biologics或比利时Seneffe的4C Biotech)或从美国模式培养物集存库(ATCC)获得。在ATCC网页上可以找到的ATCC正常人成纤维细胞细胞系包括，例如，CCL135、CCL137和CCL151。
将来自三个个别供体的人表皮角质形成细胞(新生儿HEK)(俄勒冈州波特兰的Cascade Biologics)汇集在一起，并产生工作细胞库(Work Cell Bank)。在添加人角质形成细胞生长添加剂(HKGS；HumanKeratinocyte Growth Supplement)(Cascade，目录号S-001-5)的EpiLife培养基(Cascade Biologics，目录号M-EPI-500，俄勒冈州波特兰)中培养细胞。处理前24小时将HEKneo-P细胞接种在96孔板中：细胞用胰酶消化，由中和缓冲液(俄勒冈州波特兰的Cascade Biologics)中和消化液，形成细胞悬浮液。细胞以5000个细胞/100uL/孔接种于生长培养基中，在37℃、5％CO2/95％空气下，于加湿的组织培养箱中孵育板。当细胞达到75-80％汇合(confluence)时，接种密度应当在2.5x103/cm2左右。
在10％DMSO中以所需浓度调配待测试的化合物。向96孔培养物中随11μL 10％DMSO的对照一起，添加11μL在0.01μM到10μM浓度内的调配化合物。也包括未处理对照(NT)。在24小时+/-1小时，去除生长培养基并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤一次以尽可能多的去除培养基，由此收集细胞。添加50μL的M-Per缓冲液(Pierce目录号78503 & 78501)并在冰上孵育1小时+/-15分钟，使细胞裂解。任选地，以2000RPM离心培养板5分钟。从板的每个孔小心收集裂解液并转移到新鲜的V形底的储存96孔板，留下单层细胞完好。
通过制备用相同化合物处理的两次重复细胞培养板，来与细胞裂解并行执行细胞毒性试验。与化合物一起孵育24小时+/-1小时后，向两次重复板添加11μL 1x阿尔玛蓝，在37℃孵育板。在1小时和3小时，用荧光酶标仪在530nm的激发波长和590nm的发射波长下读取板。细胞活力(细胞毒性)与阿尔玛蓝读数成正比。
10X TRAP缓冲液：
引物：
Cy5-TS引物(AAT CCG TCG AGC AGA GTT)5′端标记的(SEQID NO：1)
ACX引物(GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC)(SEQID NO：2)
Taq聚合酶是AmpliTaq DNA聚合酶(Applied Biosystems，目录号N8080171)和dNTP(Invitrogen，目录号R72501)。
表1.TRAP试验配置
PCR混合液包含以下组分：Cy5-TS引物，一种具有序列5′-AATCCG TCG AGC AGA GTT-3’(SEQ ID NO：1)的5’-Cy5标记的寡核苷酸，是端粒酶底物。取决于培养基的端粒酶活性，向底物添加端粒重复序列(具有序列..AGGGTT..，形成端粒酶延伸产物，也称作端粒酶产物或TRAP产物。具有序列5’-GCG CGG CTT ACC CTT ACC CTTACC CTA ACC-3’(SEQ ID NO：2)的ACX引物是与所述端粒酶延伸产物杂交的锚定反向引物。
向在反应管中的PCR混合液添加细胞裂解液样品(5μL-10μL)，并在以下温度下持续指明的时间孵育混合物，由此进行端粒延伸/扩增：30℃30min；接着3步PCR反应的28个循环：94℃/30秒、60℃/30秒、72℃/1分钟，之后72℃/4分钟，并保持在4℃。PCR反应产物随时可进行跑聚丙烯酰胺凝胶电泳。
向反应混合物添加含有例如溴酚蓝和二甲苯蓝的负载染料，并使样品经受在1xTBE中的10-15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。观察TRAP反应产物，例如通过使用荧光成像仪来检测CY5标记的端粒酶产物(最大激发在650nm；最大发射在670nm)。
利用对每个凝胶泳道捕获的高于背景的总像素量(DNA梯状条带)测定端粒酶活性。使用来自Molecular Probes的RibogreenR RNAQuantitation Kit(目录号R-11490)，按照商业上建议的条件，利用0.8-200ng/mL的RNA标准范围、RG染料的1∶2000稀释度、样品的100-250x稀释度，测定总RNA(ng/mL)，由此将活性标准化。
总像素量/RNA＝标准化的相对端粒酶活性
细胞活力(细胞毒性)与阿尔玛蓝读数(AB reading)成正比。
结果如表2中所示。
表2
+在全剂量曲线的峰值处，端粒酶激活是媒介物对照的2倍或2倍以上。
生物实施例2：外周血单核细胞/端粒酶重复序列扩增法(TRAP)试验
PBMC分离。在肝素钠真空采血系统中收集血液，汇集到单个的50mL聚丙烯管中。血液用1X PBS进行1∶1稀释，通过倒转彻底混合。25mL稀释血在12mLLympholyte-H(Cedarlane Laboratories)上方成层，在室温以800g离心20分钟。使用吸管，小心去除在Lympholyte-H的界面处的淋巴细胞层，转移到新的50mL管中。转移的细胞用1X PBS进行1∶1稀释，以800g离心10分钟，使淋巴细胞成团。用“完全”培养基洗涤淋巴细胞2次，所述培养基由RPMI(Sigma，目录号R8758)并添加10％热灭活FBS和10mM Hepes组成。
培养条件。使用台盼蓝拒染法(Trypan Blue exclusion)对细胞计数，并重新悬浮于添加了50单位hIL-2/mL的完全培养基中，使得细胞的终浓度是1x106/mL。向细胞悬浮液中，以1∶2的比率(微珠∶细胞)添加来自T细胞激活/扩增试剂盒(Miltenyi，目录号130-091-441)的CD2/3/28抗体涂布的微珠。使细胞在烧瓶中生长，每2-3天一次更换一半的培养基(和随之20单位hIL-2/mL)。至少一周一次，对细胞计数并调整培养基水平以将细胞保持在5x105/mL左右。
类似物的调配。在纯的培养级DMSO中以1mM的浓度调配类似物。从此原液，在完全RPMI培养基中将类似物稀释到100μM。一部分100uM制剂在含有10％DMSO的完全RPMI培养基中稀释到10μM。另外，在完全RPMI培养基中稀释DMSO得到10％溶液(这相当于类似物稀释液中DMSO的量)，由此调配媒介物对照。
用类似物处理。培养10-14天后，对细胞计数并以1x106/mL的浓度重新悬浮于条件培养基中。将0.5mL的此细胞悬浮液接种到24孔板的孔中。类似物在新鲜的完全RPMI培养基中进行1∶50稀释，以便得到2μM(从100μM原液)和0.2μM(从10μM原液)的浓度。另外，在新鲜的完全RPMI培养基中对媒介物对照(含10％DMSO的RPMI培养基)进行1∶50稀释。含有0.5mL细胞悬浮液(应为5x105/孔)的每孔接收0.5mL稀释的类似物或DMSO媒介物对照。因此，类似物的终浓度是1μM和0.1μM，而所有孔中DMSO的终浓度(包括媒介物对照)是0.1％。
细胞收集和细胞裂解液的制备。向培养中添加类似物和DMSO媒介物对照24小时后，从孔中取出细胞，添加到微量离心管中。以14,000rpm离心细胞2分钟，吸出培养基，之后重新悬浮于0.5mL冷1X PBS中。再次离心细胞2分钟，并吸出PBS。将细胞团块重新悬浮于100μL哺乳动物蛋白提取试剂(M-PER)中，在冰上孵育30分钟。孵育之后，在4℃以14,000rpm离心悬浮液20分钟。旋转之后，转移80μL裂解液到预冷的微量离心管中，小心不要转移任何细胞碎片。细胞裂解液的终浓度是5000细胞/μL。
TRAP反应和凝胶。使用1步式TRAP PCR反应分析样品。执行反应之前，将样品在M-PER缓冲液中进行1∶5稀释(1000细胞/μL)。每一反应使用以下混合物：37.5μL H20、5μL 10x TRAP缓冲液(含BSA)、1μL 2.5mM dNTP、1μL 0.1mg/mL ACX引物、0.1μL0.5mg/mL Cy5标记的TS引物、0.4μL 5U/μL Taq聚合酶，和5μL稀释样品(50μL总反应)。PCR反应如下进行：30℃/30分钟，以下的28个循环：94℃/30秒、60℃/30秒和72℃/1分钟，之后72℃/4分钟。在12.5％聚丙烯酰胺凝胶上分离PCR产物并使用STORM磷相仪(phosphorimager)来分析。
生物实施例3：向小鼠施用化合物以及血浆水平和组织中端粒酶活性 的分析
测定在雄性C57BL/6小鼠中单次静脉内、口服、腹膜内或皮下施用之后，化合物的血浆水平。收集血浆样品，用来测定化合物和代谢物的血浆浓度。此外，收集组织样品，包括胡须样品和外周血单核细胞(PBMC)细胞，用于端粒酶活性分析。
把C57BL16小鼠分成治疗组。让小鼠在研究的整个存活部分期间自由摄取SLAC-MO1#W080208(中国上海的上海实验动物中心(Shanghai Laboratories Animal Center))，除了在口服给药之前的禁食过夜期。水可自由饮用。
设定动物房的环境控制，维持温度在23℃±2℃、湿度在50％-70％以及12小时光/12小时暗的循环。为适应研究程序，可以临时中断12小时的暗循环。在最初剂量施用之前，使动物适应研究程序1-7天。
本研究中所使用动物的选择是基于落在平均体重±20％范围内的体重、总体健康状况和对笼饲(caging)的适应性。动物在整个研究过程期间自由取用食物和水，除了在口服给药之前的禁食过夜期。
如表3中所示经由尾静脉以静脉内方式、口服、以皮下或腹膜内方式施用剂量。剂量施用当天取得体重。基于给药当天取得的个体体重确定剂量体积。
在给药后的不同时间点，麻醉后经由心脏穿刺或经由眼球后穿刺收集血液样品(大约300μL)，到含有K2-EDTA抗凝血剂和1mg/mlNaF的管中。将血液储存在冰上，随后经由离心(8000rpm，6分钟)分离血浆。将血浆储存在20℃直到进行LC-MS/MS分析。
通过吸入二氧化碳然后放血来进行安乐死。30小时时在一些动物中收集胡须和外周血单核细胞(PBMC)，加工后储存在-80℃。
使用K2EDTA作为抗凝血剂从血液收集PBMCs。收集后，轻轻倒转管8-10次来混合。以12000rpm将管离心30秒使细胞成团，去除上清液，所得PBMC团块在干冰/甲醇中快速冷冻并储存在-80℃。如生物实施例2中所指明来加工细胞。图1显示用化合物4处理后随时间在PBMCs中的端粒酶活性。
拔下单根或一组胡须，将10-20根胡须/动物置于200μL M-Per缓冲液(Pierce目录号：78503/78501/78505，浸没小囊)中。拔下1小时内在干冰/甲醇中冷冻样品。图2显示用化合物4处理后随时间在胡须中的端粒酶活性。
经确定，式I的单氨基酸取代化合物在施用于小鼠时，显示向环黄芪醇的部分转化，而二氨基酸取代化合物显示向单取代化合物的极小量转化。
位置异构体混合物，即C3-(L)-鸟氨酰基-环黄芪醇、C6-(L)-鸟氨酰基-环黄芪醇、C16-(L)-鸟氨酰基-环黄芪醇(16a、16b、16c混合物)和C3-(L)-谷氨酸酯-环黄芪醇、C6-(L)-谷氨酸酯-环黄芪醇、L-谷氨酸酯-C16-环黄芪醇(18a、18b、18c混合物)，在小鼠中没有生物可利用性。
表3中显示化合物的生物利用度。
表3.小鼠中的研究和生物利用度
生物实施例4：向雄性大鼠施用化合物以及血浆水平和组织中端粒酶 活性的分析
测定在颈动脉插管的雄性Sprague Dawley大鼠中单次静脉内和口服施用之后化合物的血浆水平。收集血浆样品，用来测定化合物和代谢物的血浆浓度。此外，收集组织样品，包括胡须样品和PBMC细胞，用于端粒酶活性分析。
根据表6把颈动脉插管的雄性Sprague Dawley大鼠分成治疗组。让大鼠在研究的整个存活部分期间自由摄取SLAC-MO1#YY080208(中国上海的上海实验动物中心)，除了在口服给药之前的禁食过夜期。水可自由饮用。
设定动物房的环境控制，维持温度在23℃±2℃、湿度在50％-70％以及12小时光/12小时暗的循环。为适应研究程序，可以临时中断12小时的暗循环。在最初剂量施用之前，使动物适应研究程序1-7天。
本研究中所使用动物的选择是基于落在平均体重±20％范围内的体重、总体健康状况和对笼饲的适应性。动物在整个研究过程期间自由取用食物和水，除了在口服给药之前的禁食隔夜期。
将化合物溶于2％EtOH/98％水中，得到分别用于静脉内和口服施用的2.5mg/ml和1mg/ml的终浓度。各化合物的浓度由HPLC分析确认。
如表4中所示经由尾静脉静脉内施用和口服施用的剂量。剂量施用当天取得体重。基于给药当天取得的个体体重确定剂量体积。
在适当的时间点，经由动脉插管收集血液样品(大约250μL)，到含有K2-EDTA抗凝血剂和1mg/ml NaF的管中。将血液储存在冰上，随后经由离心(8000rpm，6分钟)分离血浆。将血浆储存在20℃直到进行LC-MS/MS分析。
组织样品：在给药后30分钟，利用止血钳在一些动物中收集胡须样品，并把10-20根胡须/动物置于含有200uL M-Per缓冲液(Pierce目录号78503/78501/78505)的1.5mL eppendorf管中。拔下1小时内在干冰/甲醇中冷冻样品。
经确定，式I的单氨基酸取代化合物在施用于大鼠时，显示向环黄芪醇的部分转化，而二氨基酸取代化合物显示向单取代化合物的极小量转化。
计算生物利用度百分比。
表4.大鼠中的研究和生物利用度
生物实施例5：向雄性Beagle犬施用化合物以及血浆水平和组织中端 粒酶活性的分析
测定在雄性Beagle犬中单次静脉内和口服施用之后化合物的血浆水平。收集血浆样品，用来测定化合物和代谢物的血浆浓度。此外，收集组织样品，包括胡须样品和PBMC细胞，用于端粒酶活性分析。
根据表5把雄性Beagle犬分成治疗组。让犬在研究的整个存活部分期间自由摄取SLAC-MO1#080701(中国上海的上海实验动物中心)，除了在口服给药之前的禁食过夜期。水可自由饮用。
设定动物房的环境控制，维持温度在23℃±2℃、湿度在50％-70％以及12小时光/12小时暗的循环。为适应研究程序，可以临时中断12小时的暗循环。在最初剂量施用之前，使动物适应研究程序1-7天。
本研究中所使用动物的选择是基于落在平均体重±20％范围内的体重、总体健康状况和对笼饲的适应性。动物在整个研究过程期间自由取用食物和水，除了在口服给药之前的禁食隔夜期。
将化合物溶于2％EtOH/98％水或者5％PEG400、5％solutolHS-15(BASF，TX)90％水的溶液中，得到分别用于静脉内和口服施用的2.5mg/ml和1mg/ml的终浓度。各化合物的浓度由HPLC分析确认。
经由左股静脉以静脉内方式施用剂量，接着一星期后口服给药。剂量施用当天取得体重。基于给药当天取得的个体体重确定剂量体积。
在适当的时间点，经由右股静脉收集血液样品(大约250μL)，到含有K2-EDTA抗凝血剂和1mg/ml NaF的管中。将血液储存在冰上，随后经由离心(8000rpm，6分钟)分离血浆。将血浆储存在20℃直到进行LC-MS/MS分析。
计算生物利用度百分比，显示于表5中。
表5.犬中的研究和生物利用度
生物实施例6：骨髓造血干细胞/祖细胞端粒酶和细胞增殖的上调
从47岁的健康供体获得人骨髓源性CD34+造血祖细胞。
i)在短期液体人细胞培养中的化合物4的端粒酶激活
使人骨髓源性CD34+造血祖细胞在化合物4(1uM、100nM、10nM)、媒介物(1％DMSO)或无任何物质的存在下，于Iscove’s ModifiedDulbecco’s Medium(IMDM)(Invitrogen，CA)+10％胎牛血清(FBS)中生长3天。在100nM化合物4样品中端粒酶活性相对于媒介物对照，增加～60-70％(利用传统凝胶-TRAP试验评估)。
表6.huCD34+细胞的端粒酶活性：(媒介物对照的倍数)
端粒酶活性增加
1uM化合物4 1.3倍
100nM化合物4 1.8倍
10nM化合物4 1.4倍
ii)在化合物4处理的人细胞培养物中(处理14天)集落形成单位数目的增加
在化合物4(100nM)、媒介物(0.1％DMSO)或无任何物质的存在下，将人CD34+造血祖细胞(47岁健康供体)接种到标准集落形成试验中。14天后，列出造血集落(CFU-E、BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM)。含有化合物4的板比单独媒介物的集落形成单位多17％。(总集落计数为：未处理，106.5；媒介物处理，103.5；化合物4-处理，121.5)
表7.huCD34+细胞的集落形成：
获得小鼠骨髓源性系贫(lineage-depleted)细胞(富含造血干细胞和祖细胞但非纯的群体)。
i)化合物4处理的来自正常野生型小鼠HSC的小鼠骨髓源性细胞培养物中(处理12天)集落形成单位数目的增加
在化合物4(100nM和500nM)、媒介物(0.1％DMSO)或无任何物质的存在下，将来自两个单独小鼠的野生型小鼠系贫骨髓细胞接种到标准集落形成试验中。12天后，列出造血集落(BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM)。
在小鼠1中，总集落计数为：未处理，136；媒介物处理，122；100nM化合物4，161；500nM化合物4，162。
在小鼠2中，总集落计数为：未处理，107；媒介物处理，117；100nM化合物4，121；500nM化合物4，129。
表8.小鼠细胞的集落形成：
在施用化合物4的情况下，观察总集落计数的增加。
ii)在来自mTERT杂合子小鼠和野生型对照(来自相同母体)的小鼠骨髓源性系贫细胞中，在短期液体培养中的化合物4的端粒酶激活
使来自mTERT杂合子和野生型小鼠的系贫骨髓细胞在化合物4(1uM、100nM或10nM)、媒介物(0.1％DMSO)或无任何物质的存在下，在含有干细胞因子(Kitl)、IL-3和IL-11的IMDM+15％FBS中生长三天。相对于媒介物处理对照，用100nM和1uM化合物4处理时野生型细胞中的端粒酶活性增加40％-50％。
相对于媒介物处理对照，用1uM化合物4处理时mTERT杂合子细胞中的端粒酶活性增加50％。
iii)在化合物4处理的mTERT杂合子小鼠细胞培养物中(处理12天)集落形成单位数目的增加
在化合物4(100nM和500nM)、媒介物(0.1％DMSO)或无任何物质的存在下，将mTERT杂合子小鼠系贫骨髓细胞接种到标准集落形成试验中。12天后，列出造血集落(BFU-E、CFU-GM和CFU-GEMM)。总集落单位为：未处理：67；媒介物处理：64；100nM化合物4：68；和500nM化合物4：77。
表9.化合物4在来自mTERT+/-小鼠的系贫骨髓细胞中提升集落形成单位。
生物实施例7：向BALB/c小鼠施用化合物4对Matrigel栓中端粒酶 活性和毛细血管密度以及骨髓干细胞/祖细胞中端粒酶活性的影响
以10mg/kg/天PO(BID)给予BALB/c小鼠(2-3个月)含化合物4的2％乙醇。小鼠预给药1天(第-1天)。第0天在腹部皮下注射MatrigelTM(加州的BDBiosciences)，第12天收集MatrigelTM栓。
使用TRAP试验分析一半栓中的端粒酶活性(RBC细胞缓冲液提取，接着是M-PER提取)。用化合物4处理后在MatrigelTM栓中观察到端粒酶活性增加到1.9倍(p＜0.2)n＝5/组。
用化合物4处理后在MatrigelTM栓中总RNA(反映细胞数)增加到1.6倍(p＜0.2)n＝5/组。
另一半MatrigelTM栓用于组织学和CD31免疫染色来分析毛细血管密度(CD31是内衬于毛细血管的内皮细胞的标志物)。用化合物4处理后观察到(CD-31免疫染色)中毛细血管密度增加到1.3倍(p＜0.5)n＝5/组。
ii)收集骨髓细胞
使用系贫磁性分选技术(Miltenyi MACS柱)从处理小鼠纯化骨髓干细胞和祖细胞。在用化合物4处理过的骨髓干细胞和祖细胞中观察到端粒酶活性(由TRAP试验测定)相对于对照品增加到1.3倍到1.5倍(p＜0.1)n＝3/组。
生物实施例8：向C57BL/6老化TERT (+/-)小鼠施用化合物4对 Matrigel TM 栓中端粒酶活性和毛细血管密度以及骨髓干细胞/祖细胞 的端粒酶活性和数目的影响
以10mg/kg/天PO(BID)给予C57BL/6背景上的老化Tert(+/-)小鼠(8-9个月)含化合物4的2％乙醇。小鼠预给药1天(第-1天)。第0天在腹部皮下注射MatrigelTM，第12天收集栓。
分析一半栓中的端粒酶活性和血红蛋白含量(是血管形成的指示)(RBC细胞缓冲液提取，接着是M-PER提取)。加工另一半栓用于组织学。
对于用化合物4处理的小鼠，通过2个重复TRAP实验测定，MatrigelTM栓的端粒酶活性增加到1.8倍(p＜0.02)或2.6倍(p＜0.01)n＝15/组。
对于用化合物4处理的小鼠，MatrigelTM栓的血红蛋白水平增加到1.2倍(p＜0.2)n＝15/组。
用化合物4处理后在MatrigelTM栓中总RNA(反映细胞数)增加到1.5倍(p＜0.1)n＝15/组。
使用系贫磁性分选技术(Miltenyi MACS柱)纯化骨髓干细胞和祖细胞。在用化合物4处理的小鼠中，通过2个重复TRAP实验测定，显示骨髓的端粒酶活性增加到1.3倍(p＜0.18)或1.9倍(p＜0.03)n＝6/组。
在用化合物4处理的小鼠中纯化的骨髓干细胞/祖细胞的数目增加到1.5倍(p＜0.1)n＝6/组。
生物实施例9：施用化合物4和化合物7对人脑周细胞的影响
在溶于水中的0.5μM化合物7中培养在PD 10的人脑周细胞(27岁女性供体)总计30小时。分析端粒酶活性和管形成。
脑周细胞首先在含0.5μM化合物7的T-75烧瓶中培养24小时，然后分在涂布有Matrigel的24孔板上以便促进管形成(进行三次重复)。培养基中再次包括0.5μM化合物7。6小时后，固定样品并使用显微镜对分支点计数，5个视场/孔，3个孔/条件。化合物7处理的周细胞中的分支点是对照品的1.9倍(p＜0.15)。
如上制备细胞并处理，但不用Matrigel涂布24孔板。6小时后，收集细胞用于TRAP分析(M-PER提取)。在化合物7处理的周细胞中观察到端粒酶活性增加到2.8倍。
接种在PD 10的人脑周细胞(27岁女性供体)，在接种24小时后用在0.1％DMSO中的0.1μM和0.5μM化合物4处理。将细胞与药物一起孵育30小时，收集用于TRAP分析(M-PER提取)。在分别用0.1uM和0.5uM化合物4处理的情况下，观察到端粒酶活性增加到1.8倍和1.9倍。测试两次重复样品。
生物实施例10：施用化合物4和12对人小气道上皮细胞的影响
使用人小气道上皮细胞(SAECs)和气道源性成纤维细胞(包括胎儿肺成纤维细胞细胞系IMR-90)进行体外实验来测试化合物对端粒酶活性的影响。
在24孔板中接种SAECs和气道源性成纤维细胞细胞系IMR-90。在培养基中0.2％乙醇的终浓度中用1μM或0.1μM化合物12将它们处理48小时。细胞用PBS洗涤并用M-Per裂解缓冲液裂解。执行凝胶TRAP试验来评价端粒酶活性。发现，化合物12选择性地将上皮细胞来源的细胞(SAEC)中的端粒酶活性上调到2-4倍，但对成纤维细胞来源的细胞IMR-90无作用。重复实验确认这些发现。在类似研究中化合物4具有与化合物12类似的性质和效能。
在连续培养中在0.004％乙醇的终浓度中用0.1μM化合物4连续处理SAECs 60天。化合物4将SAECs的长期复制能力增加约2个群体倍增数(在计算的细胞术中增加到4倍)。肺成纤维细胞中，在用化合物4的长期培养中未见到作用。
使人SAECs或人成纤维细胞在培养基中1％DMSO的终浓度中不同浓度的化合物4存在下生长。3天后，收集细胞并使用阿尔玛蓝增殖试验测定增殖作用。SAECs显示在短期培养实验中增殖增加约50％。在肺成纤维细胞中的化合物4处理对短期增殖未见到作用。在用化合物4处理仅3天的SAECs中衰老标志物p16和p21显著减少，而在成纤维细胞中这些标志物的减少极小。
在24孔板中接种SAECs，并在培养基中0.2％乙醇的终浓度中用1μM和0.1μM的化合物12处理。24小时后，更换培养基并再次用化合物12处理细胞。此外，一部分细胞用博来霉素(10ug/ml)和TGFβ(10ng/ml)处理。第二次处理48小时后，洗涤细胞，用M-Per裂解缓冲液裂解。运行凝胶TRAP试验来评价细胞中的端粒酶活性。在使用TGFβ和博来霉素处理的SAECs的体外纤维化模型中，成肌纤维细胞/纤维化生物标志物α平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin；aSMA)增加，而上皮生物标志物E-钙粘蛋白(E-cadherin；E-CAD)的表达减少。TGFβ和博来霉素都抑制SAEC端粒酶活性，而化合物4的添加针对培养中这些化合物的作用，在部分程度上恢复或保护端粒酶活性。
虽然本发明已经参考具体实施方案和应用进行了描述，但本领域的技术人员应理解本文中所公开的本发明的应用和方法的范围。

Claims (26)

1.一种式I的化合物和其药学上可接受的盐：
其中X1选自酮基、羟基和
其中X2选自酮基、羟基和
其中X3选自酮基、羟基和
其中X1、X2和X3中的至少一个分别是
和
其中R1或R2独立地选自-CH(CH3)2和-CH(CH3)CH2CH3。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中X1是其中R1选自由-CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3组成的组。
3.根据权利要求1所述的化合物，其中X2是其中R2选自由-CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3组成的组。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中X3是
5.根据权利要求1所述的化合物，其中X1、X2或X3中的至少一个是
6.根据权利要求1所述的化合物，其中X1和X2都是
7.根据权利要求1所述的化合物，其中X1或X2中的至少一个是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3。
8.根据权利要求1所述的化合物，其中X1和X2都是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3。
9.根据权利要求1所述的化合物，其中X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X2和X3均是OH。
10.根据权利要求1所述的化合物，其中X1是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X2和X3均是-OH。
11.根据权利要求1所述的化合物，其中X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)2并且X1和X3均是OH。
12.根据权利要求1所述的化合物，其中X2是-OC(O)CH(NH2)CH(CH3)CH2CH3并且X1和X3均是OH。
13.一种化合物，选自由以下组成的组：
和
和其药学上可接受的盐。
14.根据权利要求13所述的化合物，其中所述药学上可接受的盐是盐酸盐。
15.一种化合物，选自由以下组成的组：
2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α,16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-3β-基酯；
2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-3β-基酯；
2-(L)-叔丁氧羰氨基-3-甲基-丁酸-3b-乙酰氧基-16b-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-6a-基酯；
2-(L),3-二甲基-戊酸-6α,16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-3β-基酯,
2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸,16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-3-氧代-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-6α-基酯；
2-(L)-氨基-3-甲基-戊酸-6α-(2-氨基-3-甲基-戊酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-3β-基酯；
2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸,3β,6α-二羟基-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-16β-基酯；
和其药学上可接受的盐。
16.根据权利要求15所述的化合物，其中所述药学上可接受的盐是盐酸盐。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中所述化合物选自由以下组成的组：
2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α,16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；
2-(L)-氨基-3-甲基-丁酸-6α-(2-氨基-3-甲基-丁酰氧基)-16β-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐；
2-(L)-叔丁氧羰氨基-3-甲基-丁酸-3b-乙酰氧基-16b-羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-6a-基酯盐酸盐；和
2-(L),3-二甲基-戊酸-6α,16β-二羟基-17-[5-(1-羟基-1-甲基-乙基)-2-甲基-四氢呋喃-2-基]-4,4,13,14-四甲基-十四氢-环丙[9,10]环戊[a]菲-3β-基酯盐酸盐。
18.一种分离的根据权利要求1-17中任一权利要求所述的化合物在制备用于增加细胞或组织中端粒酶活性的组合物中的用途。
19.根据权利要求18所述的用途，其中所述细胞或组织被鉴定为需要增加的端粒酶活性。
20.一种药物组合物，其在药学上可接受的媒介物中包含根据权利要求1-17中任一权利要求所述的化合物。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述化合物以至少0.1%(w/v)的浓度存在于所述组合物中。
22.药物组合物，其包含根据权利要求1-17中任一权利要求所述的化合物的局部制剂。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述局部制剂包含选自由乳化剂、增稠剂、载体和润肤剂组成的组的一种或多种组分。
24.一种根据权利要求1-17中任一权利要求所述的化合物在制备用于体外或离体提高细胞的复制能力的组合物中的用途，所述化合物的量有效增加所述细胞中的端粒酶活性。
25.根据权利要求24所述的用途，其中所述细胞是从患者获得的外植体细胞。
26.根据权利要求1-17中任一权利要求所述的化合物在制备治疗其中某些细胞类型中端粒酶活性的增加会有益处的疾病的药物中的用途，其中所述疾病包括：阿兹海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病、中风、年龄相关性皮肤疾病、退行性关节疾病、骨骼系统的骨质疏松症和其他退行性病况、年龄或压力相关性血管系统疾病、年龄相关性黄斑变性、AIDS、年龄和压力相关性免疫系统受损、肺纤维化、肝硬化、肝纤维化、慢性炎症性胃肠疾病、骨髓衰竭综合症、再生障碍性贫血、骨髓增生异常性贫血及骨髓增生异常综合症。
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