CN112457362B - 一种卤代四环三萜衍生物及其制备与应用 - Google Patents

一种卤代四环三萜衍生物及其制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种卤代四环三萜衍生物及其制备与应用。以下列结构通式A表示其中，R1为卤素，R2为H，所述卤素选自氟、氯、溴或碘；或R1和R2分别为氟。本发明衍生物经药代动力学研究，在大鼠全血中稳定，雄性大鼠单次灌胃给药后绝对生物利用度15.6％；雌性大鼠单次灌胃给药后绝对生物利用度28.4％，平均生物利用度22％。化合物1和2在人和大鼠肝微粒体均比较稳定，化合物2显著增加心衰小鼠的射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、显著改善每分心输出量CO而不增加心率(HR)，和依那普利及LCG696相比效果更优。本发明衍生物可用于制备治疗心血管疾病药物，有较好的临床前景和社会效益。本发明提供了制备方法。

Description

一种卤代四环三萜衍生物及其制备与应用
技术领域
本发明涉及天然产物四环三萜衍生物及其制备与应用，具体涉及一种卤代四环三萜衍生物及其制备与应用。
背景技术
心脑血管疾病是心脏血管和脑血管疾病的统称，其病因通常由于高脂血症、血液黏稠、动脉粥样硬化、高血压等所导致的心脏、大脑及全身组织发生的缺血性或出血性疾病。心脑血管疾病是一种严重威胁人类，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，具有高患病率、高致残率和高死亡率的特点，即使应用目前最先进、完善的治疗手段，仍可有50％以上的脑血管意外幸存者生活不能完全自理。全世界每年死于心脑血管疾病的人数高达1500万人，居各种死因首位，因而，针对心脑血管疾病的治疗药物已经成为迫切的需求。
心脑血管疾病的治疗用药主要为西药，包括抗血栓药和神经保护剂等。虽然也有一些中成药，但是临床上未见有疗效好、毒性低、结构明确的中药提取的小分子化合物作为活性成分使用。来源于天然药物的天然产物的结构改造，是迄今为止新药开发的最有效途径之一，而对天然化合物的结构修饰，是基于保持药物的基本骨架构型，仅对其中的某些官能团进行化学修饰，从而达到改善化合物理化性质、增加成药性或增效减毒等目的。
心力衰竭(heart failure)简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段。其中绝大多数的心力衰竭都是以左心衰竭开始的，即首先表现为肺循环淤血。心衰是多种心血管系统疾病的最终转归，其机制主要与心肌舒缩功能减弱、心肌肥厚与纤维化、神经-内分泌系统激活、心肌细胞减少与凋亡等有关。
羊毛酯醇类的四环三萜皂苷，是临床用于治疗冠心病、心衰、高血压等心脑血管疾病的天然产物。具有广泛的心血管药理作用，包括降压，强心，保护心肌细胞和血管内皮，改善血液流变学，改善慢性心衰患者左心室构型，并可上调血管和心肌相关基因表达等。其作用机制与诱导NO释放、抗脂质过氧化、清除氧自由基、抗凋亡、改善能量代谢、减轻钙超载等多方面有关。因此，该类化合物很有潜力被开发为心脑血管用药(血管病学进展，2011，32(1)，132-136)。但该类化合物口服后吸收比较差,在小鼠模型中其绝对生物利用度低，在2个不同的试验中分别为3.66％和2.2％(European Journal of of Drug Metabolism andPharmacokinetics,2005,30(4):269-273；Basic Clin Pharmacol Toxicol,2004,95(6):295-298)。Caco-2细胞的体外研究提示,该类化合物低吸收率主要是由于其高分子量、低亲脂性和旁细胞运输的特点(European Journal of Drug Metabolism andPharmacokinetics,2006,31(1):5-10.)。该类化合物的苷元也具有类似的药理活性，其亲脂性比对应的糖苷高，透膜吸收能力较强，但其代谢稳定性较差，在人和鼠的肝微粒体中代谢半衰期分别为8.4±1.5分钟和12.0±4.2分钟，代谢清除较快(DrugMetab.Pharmacokinet.2010，25(5):477–486)，限制了其开发应用。因而，提高该类化合物的成药性研究对其进一步开发利用具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，研究设计四环三萜类衍生物及其药物活性，提供用于治疗心脑血管疾病的药物。
本发明提供了一种卤代四环三萜类衍生物，以下列结构通式A表示
其中，R1为卤素，所述卤素选自氟、氯、溴或碘，R2为H；
或R1和R2分别为氟。所述卤素选自氟、氯、溴或碘。
优选的，本发明提供的卤代四环三萜类衍生物，所述衍生物为(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-9-卤代-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇)，化合物1，以下列结构式表示：
更优选的，本发明提供的卤代四环三萜类衍生物，所述衍生物为2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-9,9-二氟-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇)，化合物2，以下列结构式表示：
本发明的另一目的是提供了所述卤代四环三萜类衍生物的制备方法，以下列反应式表示：
具体的，该制备方法包括下列步骤：
a、3-位羟基氧化：((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9-三醇)(化合物3)的3-位羟基采用三氧化硫吡啶/二甲基亚砜氧化(Parikh–Doering氧化、镉试剂氧化、Pfitzner–Moffatt氧化或斯文氧化(swern氧化)进行氧化得到(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-4,7-二羟基-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-9H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-9-酮(化合物4)；
b、羟基保护：(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-4,7-二羟基-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-9H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-9-酮)(化合物4))的羟基采用酰基保护，得到((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5a，8,8-四甲基-9-氧代四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物5)；
c、双氟代：((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5a，8,8-四甲基-9-氧代四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯(化合物5)，采用三氟化硫或其衍生物和催化剂进行双氟代，得到(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9,9-二氟-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物6)；
d、脱保护：((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9,9-二氟-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物6)，采用还原剂或者碱脱保护得到2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-9,9-二氟-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇)(化合物2)；
e、单卤代：((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-羟基-2α，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物7)采用卤代试剂或者appel(埃佩尔)反应卤代得到(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-卤代-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物8)；所述卤代试剂中的卤素选自氟、氯、溴或碘；
f、脱保护基：((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-卤代-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物8)采用还原剂或者碱脱保护基得到(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-9-氟卤代-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇)(化合物1)。
更详细的，本发明方法中，步骤a所述Parikh–Doering(帕瑞克-多林)氧化：采用三氧化硫吡啶复合物/二甲基亚砜/三乙胺体系，溶剂选自二甲基亚砜、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿，优选二甲基亚砜或二氯甲烷；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9-三醇)(化合物3)与三氧化硫吡啶的摩尔比1:1-1:15，优选1:4；反应温度-20℃-100℃，优选0℃-30℃，特别优选5℃-20℃；
所述镉试剂选自琼斯氧化剂、氯铬酸吡啶盐或二氯铬酸吡啶盐；反应的溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿，优选二氯甲烷；所述((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9-三醇)(化合物3)与氧化剂的摩尔比为1:1-1:15，优选1:2；反应温度-10℃-100℃，优选10℃-60℃，特别优选15℃-25℃；
所述Pfitzner–Moffatt(普菲茨纳-莫法特)氧化采用碳二亚胺/二甲基亚砜/酸体系，碳二亚胺选自二环己基亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，酸选自正磷酸，二氯乙酸和吡啶的强酸盐(如吡啶盐酸盐、吡啶三氟乙酸盐等)，溶剂自二甲基亚砜、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿，优选二甲基亚砜或二氯甲烷；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9-三醇)(化合物3)与碳二亚胺的摩尔比1:1-1:15，优选1:3；反应温度-20℃-100℃，优选0℃-30℃，特别优选5℃-20℃；
所述斯文氧化采用二甲亚砜/有机碱(如三乙胺)/草酰氯或酸酐体系，所述有机碱选自三乙胺或二异丙基乙胺，所述酸酐选自醋酐或三氟乙酸酐，溶剂选自二甲基亚砜、甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿，优选二氯甲烷；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9三醇)(化合物3)与草酰氯或酸酐的摩尔比1:1-1:15，优选1:3；反应温度-120℃--60℃，优选-80℃-0℃；
步骤b所述的羟基保护基选自乙酰基，丙酰基或三甲基乙酰基，优选乙酰基。溶剂为非质子溶剂，选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、丙酮或N,N-二甲基甲酰胺，优选N,N-二甲基甲酰胺或甲苯；所述碱为有机碱或无机碱；有机碱选自二乙胺、三乙胺、吡啶、哌啶、咪唑、N，N-二异丙基乙胺、4-吡咯烷基吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、4-二甲氨基吡啶或1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷，优选N,N-二异丙基乙胺或4-吡咯烷基吡啶；无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钾、碳酸氢钠、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠或磷酸钾，优选碳酸氢钠；所述((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-4,7-二羟基-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-9H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-9-酮)(化合物4)与酰基保护试剂的摩尔比1:1-1:15，优选1:5；反应温度-10℃-160℃，优选20℃-120℃，特别优选80℃-120℃；
步骤c所述三氟化硫或其衍生物选自三氟化硫、二乙胺基三氟化硫、三氟化硫吗啉、二甲氨基三氟化硫、4-叔丁基-2,6-二甲基苯基三氟化硫(Fluolead)、二乙胺基三氟化硫氟硼酸盐(XtalFluor-E)、三氟化硫吗啉氟硼酸盐(XtalFluor-M)或双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫，优选二乙胺基三氟化硫或双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫；所述催化剂选自甲醇，乙醇，异丙醇，正丁醇或氢氟酸盐如氢氟酸吡啶，氢氟酸三乙胺或氢氟酸二乙胺，优选乙醇或氢氟酸吡啶；反应的溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿，优选甲苯；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5a，8,8-四甲基-9-氧代四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物5)与三氟化硫或其衍生物的摩尔比1:1-1:15，优选1:3；反应温度-50℃-150℃，优选20℃-70℃；
步骤d所述还原剂选自四氢铝锂、二异丁基氢化铝、硼烷、硼氢化锂、硼氢化钾或硼氢化钠，优选四氢铝锂或二异丁基氢化铝；反应的溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿，甲醇或乙醇，优选二氯甲烷或甲醇；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9,9-二氟-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物6)与还原剂的摩尔比1:1-1:15，优选1:5；反应温度-10℃-100℃，优选0℃-50℃，特别优选5℃-25℃；
当步骤d使用碱脱保护时，所述碱为无机碱，选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠或磷酸钾，优选碳酸钾或氢氧化锂；反应的溶剂选自水、甲醇，异丙醇，叔丁醇或乙醇，优选甲醇；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9,9-二氟-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物6)与碱的摩尔比1:1-1:25，优选1:6；反应温度-10℃-100℃，优选0℃-50℃，特别优选15℃-25℃；
步骤e所述卤代试剂选自三卤化磷、五卤化磷或三卤氧磷；反应的溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿，优选二氯甲烷；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-羟基-2α，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物7)与卤代试剂的摩尔比1:1-1:15，优选1:2；反应温度-40℃-100℃，优选-20℃-50℃，特别优选0℃-15℃；
当步骤e采用appel反应卤代时，所述卤代试剂选自卤素、N-卤代丁二酰亚胺或者四卤化碳，在膦试剂存在下进行，所述膦试剂选自三苯基膦，三丁基膦或三甲基膦；反应的溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿，优选二氯甲烷或四氢呋喃；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-羟基-2α，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物7)与卤代试剂的摩尔比1:1:1-1:15:15，优选1:2:2；反应温度-40℃-100℃，优选-20℃-50℃，特别优选15℃-25℃。
步骤f所述还原剂选自四氢铝锂、二异丁基氢化铝、硼烷、硼氢化锂、硼氢化钾或硼氢化钠，优选四氢铝锂或二异丁基氢化铝；反应的溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿，甲醇或乙醇，优选二氯甲烷或甲醇；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-氟(或氯，或溴，或碘)-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物8)与还原剂的摩尔比1:1-1:15，优选1:5；反应温度-10℃-100℃，优选0℃-50℃，特别优选5℃-25℃；
当步骤f使用碱脱保护时，所述碱为无机碱，选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠或磷酸钾，优选碳酸钾或氢氧化锂；反应的溶剂选自水、甲醇，异丙醇，叔丁醇或乙醇，优选甲醇；((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-氟(或氯，或溴，或碘)-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)(化合物8)与碱的摩尔比1:1-1:25，优选1:6；反应温度-10℃-100℃，优选0℃-50℃，特别优选15℃-25℃；
本发明的又一目的是提供了所述卤代四环三萜衍生物在制备治疗心血管药物中的应用。
本发明的卤代四环三萜衍生物进行了药代动力学研究，在大鼠全血中较为稳定，雄性大鼠单次灌胃给药后的绝对生物利用度为15.6％；雌性大鼠单次灌胃给药后的绝对生物利用度为28.4％，平均生物利用度22％。对本发明化合物1和2、天然产物(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9三醇的在人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性进行评价，发现化合物1和2在人和大鼠肝微粒体均比较稳定，远大于天然产物(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9-三醇的稳定性。化合物2对小鼠慢性心衰的体内药效研究，化合物2显著增加了心衰小鼠的射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、显著改善每分心输出量CO而不增加心率(HR)，以10mg/kg效果最为显著，比临床金标准治疗药物依那普利效果更好。以心衰治疗新药LZC696(沙库必曲缬沙坦钠)为阳性对照，进行药效学比及机制研究，化合物2对慢性心衰小鼠具有治疗作用。以EF(射血分数)为金标准，化合物2在10mg/kg剂量效果最为显著，和现有常用标准药依那普利以及新药LCZ696(沙库必曲缬沙坦钠)相比，其效果更优。因此，本发明提供的卤代四环三萜衍生物可以用于制备治疗心血管疾病药物。
本发明提供了所述卤代四环三萜衍生物在制备治疗心衰药物中的应用。
本发明提供了所述卤代四环三萜衍生物在制备治疗慢性心衰药物中的应用。
本发明所述药物是由卤代四环三萜衍生物作为唯一活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
本发明药物在使用时小鼠有效剂量3mg/kg-100mg/kg
本发明提供的卤代四环三萜衍生物克服了天然产物四环三萜成药性差的缺点，本发明方法将四环三萜苷糖片段去除，同时将容易被氧化的3-位羟基以卤素取代，得到卤代四环三萜衍生物。本发明通过对天然四环三萜的结构改造，不仅保留了生物活性，还降低了分子量、使其亲脂性显著提高。本发明提供的卤代四环三萜衍生物的生物利用度较天然产物四环三萜及其糖苷大幅增加，代谢稳定性也显著提高，可用于制备心脑血管疾病药物，有较好的临床前景和较大的社会效益。
附图说明
图1化合物4的核磁氢谱
图2化合物5的核磁氢谱
图3化合物6的核磁氢谱
图4化合物2的核磁氢谱
图5实施例7正常小鼠射血分数EF在70-90％，心衰小鼠EF在40％以下，EF是评价心衰的重要指标，Enalapril(p<0.01)阳性对照药，10mg/kg组,30mg/kg组的小鼠EF都有显著性升高(p<0.0005),其中10mg/kg提升最高(p<0.0001)；柱状图白框表示第0天，黑框表示第28天
图6实施例7每分心输出量(CO)，CO＝SVxHR,心衰时CO下降，给药后小鼠的CO均有上升，Enalapril(p<0.0001)阳性对照药有极显著性升高，30mg/kg,100mg/kg的小鼠CO显著性升高(p<0.01),10mg/kg组的小鼠CO(p<0.05)也有统计学意义；柱状图白框表示第0天，黑框表示第28天
图7实施例7心衰时短轴缩短率FS％会降低，给药后小鼠的FS％均有上升，Enalapril(p<0.05)阳性对照药，10mg/kg组的小鼠FS有显著性升高(p<0.0005)；柱状图白框表示第0天，黑框表示第28天
图8实施例8(正常小鼠射血分数EF在70-90％，心衰小鼠EF在40％以下，EF是评价心衰的重要指标，LCZ696和化合物2组的小鼠EF都有显著性升高(p<0.0005),但化合物2的效果更显著；心衰时短轴缩短率FS％会降低，给药后小鼠的FS％均有上升，化合物2的效果更显著(p<0.0005))；柱状图白框表示第0天，黑框表示第28天
图9(心率(HR)，正常老鼠心率基本不变化，心衰老鼠心率会有显著变化，LCZ696和化合物2组的小鼠心率都没有明显变化；每分心输出量(CO)，CO＝SVxHR,心衰时CO下降，给药后小鼠的CO均有上升，LCZ696组升高无统计学意义，化合物2组的小鼠CO显著性升高(p<0.01))；柱状图白框表示第0天，黑框表示第28天
具体实施方式
本发明实施例所用原料和试剂除另有说明外，均可市售得到。
实施例1、化合物4((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-4,7-二羟基-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-9H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-9-酮)的合成
取化合物3(环黄芪醇，购自成都锦泰和)(4.9g,10mmol)溶于70mL干燥二甲基亚砜，分批加入三氧化硫吡啶(4.7g,30mmol)和三乙胺(3.03g,30mmol)。室温(20-25℃)搅拌8h，加水100mL稀释，乙酸乙酯萃取3次(每次的量80mL)，有机相合并，水洗，浓缩后35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂，(石油醚/乙酸乙酯＝1/2)柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)或甲醇重结晶(20mL甲醇)分别得产物白色固体化合物4(3.2g,65％)或(2.44g,50％)，m.p.222-225℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.70(td,J＝7.9,6.2Hz,1H),3.77(t,J＝7.3Hz,1H),3.54(td,J＝10.0,3.5Hz,1H),2.68–2.52(m,2H),2.48–2.41(m,1H),2.34(d,J＝7.8Hz,1H),2.09(dd,J＝13.2,7.3Hz,2H),2.05–1.96(m,3H),1.94(d,J＝9.7Hz,1H),1.78(dd,J＝12.3,4.5Hz,1H),1.70–1.60(m,3H),1.49–1.36(m,3H),1.36(s,3H),1.31(s,3H),1.28(s,3H),1.24(s,3H),1.22(s,3H),1.16(s,3H),1.05(ddd,J＝14.0,9.9,3.4Hz,1H),0.97(s,3H),0.66(d,J＝4.5Hz,1H),0.45(d,J＝4.5Hz,1H)；ESI-ms:[M+H]+489.2.
实施例2、化合物5((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5a，8,8-四甲基-9-氧代四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)的合成
取化合物4(4.9g,10mmol)、对4-吡咯烷基吡啶(1.65g,12mmol)和三乙胺(9g,90mmol)溶于60mL干燥甲苯，加入醋酐(9.1g,90mmol)，升温回流10h，反应液加入60mL乙酸乙酯稀释，后依次用水,3M稀盐酸，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤浓缩(35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂)得粗品，甲醇打浆过滤得白色固体化合物5(5.5g,90％)；m.p.155-157℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.35-5.30(m,1H),4.71(td,J＝3.6,10.0Hz,1H),4.02(t,J＝7.6Hz,1H),2.55(dd,J＝8.0,13.6Hz,1H),2.54(d,J＝8.0Hz,1H,overlapped),2.43(d,J＝8.0Hz,1H),2.22-2.15(m,3H),2.03(s,3H),2.02(s,3H),1.97(s,3H),2.06-1.91(m,2H,overlapped),1.76(t,J＝8.0Hz,2H),1.43(s,3H),1.41(s,3H),1.35(s,3H),1.33(s,3H),1.52-1.25(m,6H,overlapped),1.16(s,3H),1.13(s,3H),0.97(s,3H),0.76(d,J＝4.8Hz,1H),0.50(d,J＝4.8Hz,1H)；ESI-ms:[M+H]+615.2.
实施例3、化合物2((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，11aR，12AS)-9,9-二氟-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇)(化合物2)的合成
DAST:二乙胺基三氟化硫；DABALH：二异丁基氢化铝
取化合物5(3.08g,5mmol)溶于40mL干燥甲苯，降至0℃滴入二乙胺基三氟化硫(1.61g,10mmol)，升温至90℃反应6h，再两次滴入二乙胺基三氟化硫(1.61g,10mmol)，每次滴完50℃反应6h，反应液加入60mL乙酸乙酯稀释，加入1M稀盐酸搅拌1h，分出水相，有机相依次用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶(20mL甲醇)得白色固体化合物6(2.71g,85％)；m.p.139-142℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.32(m,1H),4.71(ddd,J＝5.6,4.0Hz,1H),4.01(t,J＝7.4Hz,1H),2.42(d,J＝7.6Hz,1H),2.19-2.09(m,3H),2.01(s,6H),1.97(s,3H),1.98-1.82(m,4H),1.73(t,J＝7.6Hz,3H),1.63-1.48(m,2H),1.43(s,3H),1.41(s,3H),1.33(s,6H),1.25(s,3H),1.36-1.21(m,5H,overlapped),1.07(s,3H),1.04(s,3H),0.97(s,3H),0.63(d,J＝4.8Hz,1H),0.43(d,J＝4.4,4.4Hz,1H)；ESI-ms:[M+H]+637.2.将此二氟产物溶于60mL无水二氯甲烷，降至0℃滴入二异丁基氢化铝(15mL,15mmol，1M)，自然恢复至室温(20-25℃)反应3h，滴入1M稀盐酸淬灭反应，反应液依次1M稀盐酸和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩(35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂)，甲醇/水＝1/3重结晶得产物化合物2(1.98g,92％)，白色固体，m.p.189-192℃,[α]D 25＝118(c 1.0,CHCl3)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ4.69(q,J＝7.2Hz,1H),3.77(t,J＝7.2Hz,1H),3.51(td,J＝10.0,3.6Hz,1H),2.57(q,J＝10.6Hz,1H),2.33(d,J＝7.6Hz,1H),2.06-1.94(m,6H),1.83-1.56(m,6H),1.46-1.36(m,4H),1.32(s,3H),1.30(s,3H),1.28(s,3H),1.25(s,3H),1.17(s,3H),1.13(s,3H),0.96(s,3H),0.58(d,J＝4.4Hz,1H),0.44(d,J＝4.4Hz,1H)；ESI-ms:[M+H]+511.2.
实施例4、化合物2的合成
BAST or Fluolead:双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫或4-叔丁基-2,6-二甲基苯基三氟化硫；LiOH:氢氧化锂取化合物5(3.08g,5mmol)溶于40mL干燥甲苯，降至0℃加入双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫(2.21g,10mmol)或4-叔丁基-2,6-二甲基苯基三氟化硫(2.5g,10mmol)和催化量(0.15mL)的氢氟酸吡啶，升温至40℃反应12h，反应液加入60mL乙酸乙酯稀释，加入1M稀盐酸搅拌1h，分出水相，有机相依次用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，甲醇重结晶(20mL甲醇)得白色固体化合物6(2.75g,88％)；m.p.139-142℃,1H NMR(400MHz,CDCl3)δ5.32(m,1H),4.71(ddd,J＝5.6,4.0Hz,1H),4.01(t,J＝7.4Hz,1H),2.42(d,J＝7.6Hz,1H),2.19-2.09(m,3H),2.01(s,6H),1.97(s,3H),1.98-1.82(m,4H),1.73(t,J＝7.6Hz,3H),1.63-1.48(m,2H),1.43(s,3H),1.41(s,3H),1.33(s,6H),1.25(s,3H),1.36-1.21(m,5H,overlapped),1.07(s,3H),1.04(s,3H),0.97(s,3H),0.63(d,J＝4.8Hz,1H),0.43(d,J＝4.4,4.4Hz,1H)；ESI-ms:[M+H]+637.2.
将此二氟产物6溶于60mL无水二氯甲烷，降至0℃滴入二异丁基氢化铝(15mL,15mmol，1M)，自然恢复至室温(20-25℃)反应3h，滴入1M稀盐酸淬灭反应，反应液依次1M稀盐酸和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩(35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂)，甲醇/水＝1/3重结晶得白色固体化合物2(2.0g,92％)，m.p.189-192℃,[α]D 25＝118(c 1.0,CHCl3)；1HNMR(400MHz,CDCl3)δ4.69(q,J＝7.2Hz,1H),3.77(t,J＝7.2Hz,1H),3.51(td,J＝10.0,3.6Hz,1H),2.57(q,J＝10.6Hz,1H),2.33(d,J＝7.6Hz,1H),2.06-1.94(m,6H),1.83-1.56(m,6H),1.46-1.36(m,4H),1.32(s,3H),1.30(s,3H),1.28(s,3H),1.25(s,3H),1.17(s,3H),1.13(s,3H),0.96(s,3H),0.58(d,J＝4.4Hz,1H),0.44(d,J＝4.4Hz,1H)；ESI-ms:[M+H]+511.2.
实施例5、化合物1((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-9-R11 )-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇)的合成
DABALH：二异丁基氢化铝
1、取化合物7(3.1g,5mmol)溶于50mL干燥二氯甲烷，降至0℃加入4-叔丁基-2,6-二甲基苯基三氟化硫(2.5g,10mmol)，在此温度下反应3h，加水0.1M稀盐酸40mL淬灭，分出水相，有机相依次用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析得氟代产物((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-氟-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)2.5g，白色固体；ESI-ms:[M+H]+619.2.
将此氟代产物溶于60mL无水二氯甲烷，降至0℃滴入二异丁基氢化铝(15mL,15mmol，1M)，自然恢复至室温反应3h，滴入1M稀盐酸淬灭反应，反应液依次1M稀盐酸和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩(35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂)，柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)(石油醚/乙酸乙酯＝2:3)得产物(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-9-氟-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇(1.88g,95％)，白色固体，[α]D 25＝188(c 1.0,CHCl3)；ESI-ms:[M+H]+493.2.
2、取化合物7(3.1g,5mmol)溶于50mL干燥二氯甲烷，降至0℃加入四溴化碳(1.66g,5mmol)和三苯基膦(1.31g,5mmol)，在此温度下反应6h，加水0.1M稀盐酸40mL淬灭，分出水箱，有机相依次用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)得溴代产物((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-溴-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)2.4g，白色固体；ESI-ms:[M+H]+679.3.
将此溴代产物溶于60mL无水二氯甲烷，降至0℃滴入二异丁基氢化铝(15mL,15mmol，1M)，自然恢复至室温反应3h，滴入1M稀盐酸淬灭反应，反应液依次1M稀盐酸和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩(35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂)，柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)(石油醚/乙酸乙酯＝2:3)得产物(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-9-溴-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇(1.77g,91％)，白色固体，[α]D 25＝101(c 1.0,CHCl3)；ESI-ms:[M+H]+553.3.
3、取化合物7(3.1g,5mmol)溶于50mL干燥二氯甲烷，降至0℃加入N-氯代丁二酰亚胺(0.62g,5mmol)和三苯基膦(1.31g,5mmol)，在此温度下反应6h，加水0.1M稀盐酸40mL淬灭，分出水相，有机相依次用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)得氯代产物((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-氯-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)2.1g，白色固体；ESI-ms:[M+H]+635.3.
将此氯代产物溶于60mL无水二氯甲烷，降至0℃滴入二异丁基氢化铝(15mL,15mmol，1M)，自然恢复至室温反应3h，滴入1M稀盐酸淬灭反应，反应液依次1M稀盐酸和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩(35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂、)，柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)(石油醚/乙酸乙酯＝2:3)得产物(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-9-氯-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇(1.55g,92％)，白色固体，[α]D 25＝133(c 1.0,CHCl3)；ESI-ms:[M+H]+509.3.
4、取化合物7(3.1g,5mmol)溶于50mL干燥二氯甲烷，降至0℃加入碘(1.27g,5mmol)和三苯基膦(1.31g,5mmol)，在此温度下反应6h，加水0.1M稀盐酸40mL淬灭，分出水相，有机相依次用1M稀盐酸，饱和碳酸氢钠和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)得溴代产物((2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-乙酰氧基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-9-碘-2a，5a，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙烷[e]菲-4,7-二乙酸二乙酯)2.7g，白色固体；ESI-ms:[M+H]+727.3.
将此溴代产物溶于60mL无水二氯甲烷，降至0℃滴入二异丁基氢化铝(15mL,15mmol，1M)，自然恢复至室温(20-25℃)反应3h，滴入1M稀盐酸淬灭反应，反应液依次1M稀盐酸和饱和食盐水洗，无水硫酸钠干燥，过滤，浓缩(具体方法以及具体条件，浓缩到什麽程度35℃旋转蒸发仪蒸除溶剂)，柱层析(无定型硅胶，粒度40–63μm，孔径)(石油醚/乙酸乙酯＝2:3)得产物(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9R，11aR，12AS)-9-碘-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基吡啶-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7-二醇(2.0g,90％)，白色固体，[α]D 25＝87(c 1.0,CHCl3)；ESI-ms:[M+H]+601.3.
实施例6、化合物2(实施例4制得)药代动力学研究一、化合物2在新鲜大鼠全血中稳定性试验
1材料与方法
1.1实验流程及孵育条件供试品配制：化合物2用适量二甲基亚砜(DMSO)溶解，得到浓度为400μM的工作液。
表1-1稳定性研究试剂使用情况
1)新鲜大鼠全血加于EP管中，轻轻震荡混合；
2)EP管置于水浴37℃预孵5分钟；
3)加入化合物2起始反应，继续37℃孵育；
4)分别于0，3min，6min，15min，30min，60min于样品管中取50μL至终止管(内含5μL内标，5μg/mL甲苯磺丁脲)中，加入150μL乙腈，震荡，终止反应；PBS孵育体系孵育0和60min。
5)13000r/min、4℃离心5min，吸取上清，分析。
注：每个样品双复管。
1.2测定方法
1.2.1仪器
戴安公司Ultimate3000液相色谱系统(包括Ultimate3000型三元输液泵，Ultimate3000型柱温箱，Ultimate3000型自动进样器和Ultimate3000型真空脱气机)和AB公司4000Q-Trap型串联质谱仪，配有电喷雾电离源(ESI源)，AB公司Analyst(version1.6.3)数据采集及分析软件；电热恒温水浴锅，HHS-21-6。
1.2.2测定条件
1.2.2.1标准溶液的配制
贮备液：精密称取化合物2 5mg于5mL聚丙烯管，用DMSO溶解，加50％甲醇-H2O至体积，配制成含化合物2 1mg/mL的贮备液，于4℃冰箱内保存。
1.2.2.2色谱条件
色谱柱：XtimateTMC18(50×2.1mm)；进样体积：5μL；流动相：C(0.05％氨水)，A(乙腈)，梯度洗脱(见下表)；流速：0.3mL/min；柱温：40℃；进样盘温度：10℃
1.2.2.3质谱条件
离子源为电喷雾离子化源(ESI)；干燥气体(N2)温度450℃；电喷雾电压为4500V；检测方式为负离子检测；扫描方式为选择反应监测(MRM)方式，扫描时间为0.15s。质谱检测参数如下：
1.2.3样品处理
50μL大鼠全血，加入5μL内标工作液(5μg/mL甲苯磺丁脲)，用150μL乙腈沉淀蛋白，13000rpm、4℃下离心5min。取上层有机相，0.22μM微孔滤膜过滤，LC-MS/MS进样分析。
1.2.4线性
取50μL空白大鼠全血，分别加入不同浓度工作液5μL，使成浓度为0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0μM的系列溶液，按样品处理方法操作。
以被测物化合物2的峰面积与内标物峰面积比值对被测物在生物样品中的浓度进行线性回归，并以浓度平方的倒数(1/x/x)为加权系数，求得测定效应与浓度的回归方程。
2结果
2.1化合物2在大鼠全血中的稳定性
化合物2在大鼠全血中孵育3、6、15、30、60min后浓度无显著变化，化合物2在大鼠全血中较为稳定；以孵育体系中化合物2的ln剩余率对孵育时间作图，进行线性回归得到斜率k，按公式(T1/2＝－0.693/k)求T1/2(min)。
体外T1/2为639.77min。
二、吸收试验
1材料与方法
1.1药品
化合物2。
1.2试验动物
品系：SD大鼠；性别：雌雄各半；体重：约200-250克；源：上海斯莱克实验动物有限责任公司；实验动物生产许可证号：SCXK(沪)2017-0005；实验动物使用许可证号：SYXK(沪)2014-0018；饲养：恒温净化通风动物房，20-26℃，自由进食与饮水，湿度40-70％，光照12h。
1.3试验方法
1.3.1给药方法
A途径：单次灌胃给药；容量：按10mL/kg体重计算；配制：称取适量化合物2，先加少量0.5％CMC-Na研磨，加0.5％CMC-Na至体积。
B途径：单次静脉注射给药；容量：按5mL/kg体重计算；配制：称取适量化合物2，用3％总体积的DMSO溶解后，再加3％总体积蓖麻油涡旋混匀，后加生理盐水至体积，制得静脉注射药液(0.4mg/mL澄清溶液)。
1.3.2给药与样品采集
SD大鼠12只，分成2组，每组6只，雌雄各半。给药前禁食12h，自由饮水。按10mg/kg的剂量单次灌胃、2mg/kg的剂量单次静注给药。灌胃给药，于给药前、给药后3min、10min、20min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、11h、24h眼眶采血约100μL；静注给药，于给药前、给药后3min、8min、15min、30min、1h、2h、3h、4h、6h、8h、11h、24h眼眶采血。血液用1％肝素抗凝，8000rpm离心4min，分离血浆。-20℃保存待测。高浓度样品用空白血浆稀释。
1.4血浆样品测定方法
1.4.1仪器(LC-MS/MS)
液相色谱系统：Ultimate3000液相色谱系统(包括Ultimate3000型三元输液泵，Ultimate3000型柱温箱，Ultimate3000型自动进样器和Ultimate3000型真空脱气机)，戴安公司
MS/MS系统：4000Q-Trap型串联质谱仪，配有电喷雾电离源(ESI源)，AB公司
数据采集：Analyst(version 1.6.3)，AB公司
1.4.2测定条件
1.4.2.1标准溶液的配制
化合物2贮备液：精密称取化合物2于5mL聚丙烯管中，少量甲醇溶解，50％甲醇-H2O加至体积，配制成1mg/mL的化合物2贮备液，于4℃冰箱内避光保存。
甲苯磺丁脲贮备液：精密称取甲苯磺丁脲5mg于5mL聚丙烯管中，少量甲醇溶解，50％甲醇-H2O加至体积，配制成1mg/mL的甲苯磺丁脲贮备液，于4℃冰箱内保存。
1.4.2.2色谱条件
色谱柱：Athena C18-WP 100A(2.1×50mm，5μm)；进样体积：10μL；流动相：A：乙腈；C：0.05％氨水，梯度洗脱(见下表)；流速：0.3mL/min
1.4.2.3质谱条件
离子源为电喷雾离子化源(ESI)；干燥气体(N2)温度500℃；电喷雾电压为-4500V；检测方式为负离子检测；扫描方式为选择反应监测(MRM)方式，扫描时间为0.15s。质谱检测参数如下：
1.4.3样品处理
取50μL血浆样品，加入2.5μL内标(250ng/mL甲苯磺丁脲)，涡旋混匀10s后，150μL乙腈沉淀蛋白，13000rpm×5min离心。微孔滤膜过滤后，取上清进行LC-MS/MS分析。
2结果
2.1方法学考核
在本试验条件下，受试物与样品中的组分得到良好分离，不受内源性杂质峰干扰。
2.1.1线性
大鼠血浆中化合物2浓度在5-500ng/mL范围内，化合物2浓度(X)与化合物2和内标(甲苯磺丁脲)峰面积比值(Y)成线性，回归方程分别为Y＝0.0015X-0.0061，相关系数为0.9958。标准曲线最低浓度点实测值与标示值之间的偏差在±20％以内，其余各浓度点的偏差在±15％以内。
2.1.2精密度和准确度
准确度(％REC)104.3-107.8、精密度(％RSD)2.3-10.5。验证中QC样品的准确度和精密度符合接受标准。
2.1.3稳定性试验
质控样品处理前，放置3h(室温)，然后考察稳定性。结果表明化合物2此条件下是稳定的。
本试验所建立的LC-MS/MS测定法，线性好、灵敏度高，线性范围为5-500ng/mL，血浆中杂质不干扰样品峰。批内精密度<15％，准确度在85-115％之内；稳定性考察中，血浆浓度点的偏差在±15％以内。符合生物样品测定的有关规定。
2.2大鼠血药浓度及药代动力学参数
2.2.1静注给药
大鼠静注2mg/kg化合物2后血药浓度表1，
大鼠单次静注给予2mg/kg化合物2后的药动学参数总结见表1。
表1大鼠静注2mg/kg化合物2后血浆药代动力学参数(用非房室模型分析，n＝3或6)
2.2.2单次灌胃给药
大鼠单次灌胃给予10mg/kg化合物2后的药动学参数总结见下表2。
表2大鼠灌胃化合物2后血浆药代动力学参数(用非房室模型分析，n＝3或6)
3结论
大鼠静脉注射2mg/kg化合物2后，雄、雌大鼠药动学参数(除C0.05)均显示统计学差异(P<0.05)，雄、雌大鼠清除率分别为1.86L/h/kg和0.894L/h/kg，雄性大鼠体内清除中度、雌性大鼠体内清除较慢，平均血浆消除半衰期分别为0.90h和1.47h。
灌胃给予10mg/kg化合物2后，雄、雌大鼠主要药动学参数未显示统计学差异(P>0.05)，在大鼠体内血浆浓度达峰时间Tmax为2.17h，达峰浓度Cmax为323ng/mL，血浆浓度-时间曲线下面积AUC0-t为1916ng·h/mL(雄性为831ng·h/mL，雌性为3001±2432ng·h/mL)，消除半衰期t1/2为2.89h。雄性大鼠单次灌胃给药后的绝对生物利用度为15.6％；雌性大鼠单次灌胃给药后的绝对生物利用度为28.4％，平均生物利用度22％。
实施例7、化合物肝微粒体代谢稳定性研究
1.研究方法：
主要试剂
供试品的准备：化合物1(实施例5制得)和2(实施例4制得)、化合物3是天然产物(环黄芪醇，购自成都锦泰和公司)用适量DMSO溶解，得到浓度为10mM的工作液。
2.实验流程及孵育条件
表1.人、鼠肝微粒体水解稳定性研究试剂使用情况
1)化合物用DMSO稀释为0.5mM，实验前利用PBS稀释为1/20备用
2)人肝微粒体与磷酸钾缓冲液分别加于EP管中，轻轻震荡混合；
3)EP管置于金属浴37℃预孵5分钟；
4)加入化合物1，或2，或3起始反应，继续置于金属浴37℃孵育；
5)分别于0，60，120，240，360分钟于样品管中取100μl加入到终止管中(含100μl冰乙腈溶液)剧烈震荡终止反应，置于-30℃冰箱直至分析；
6)20,000g(14300r/min),4℃离心10分钟，吸取上清置于-30℃冰箱直至分析
3.分析方法
UFLC：LC-20A
色谱柱：Shim-pack XR-ODS II,2.0×75mm；流动相：流动相B：含0.2％甲酸的水溶液；流动相A：乙腈溶液；流动相比例：
自动进样器设置温度：4℃；流速：0.4ml/min；进样体积：15μl；运行时间：16min
4.结果
化合物1和2、3的在人和大鼠肝微粒体的代谢稳定性进行评价，发现化合物1和2在人和大鼠肝微粒体均比较稳定，远大于天然产物(2AR，3R，4S，5AS，5BS，7S，7AR，9S，11aR，12AS)-3-((2R，5S)-5-(2-羟基丙烷-2-基)-2-甲基四氢呋喃-2-基)-2a，5α，8,8-四甲基十四氢-1H，12H-环戊二烯并[a]环丙并[e]菲-4,7,9-三醇(化合物3,环黄芪醇)的稳定性。
实施例8、化合物2(实施例4制得)对小鼠慢性心衰的体内药效研究
1.实验目的
本实验采用国际通用的C57小鼠冠状动脉结扎方法制备小鼠CHF模型，观察给药后小鼠慢性心衰模型在超声心动图、血液动力学及组织病理学等方面的差异。
2.实验材料
2.1.受试物
受试品：化合物2；溶剂：0.3％羧甲基纤维素钠；给药剂量：1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg；给药途径：灌胃给药；对照药物：依那普利2mg/kg
2.2.实验动物
品系：C57小鼠；周龄：7周龄；体重：18-20g；性别：雄性；级别：SPF级
来源：由第二军医大学提供；饲养条件：室温20～25℃，湿度40～70％，标准饲料，自由饮食和饮水；动物总数：100只
2.3.试验方法选择及依据
由于慢性心力衰竭病因及病机非常复杂，不同方法制备的CHF动物模型心功能改变和特点各不相同。因此CHF动物模型的制备比较困难，这也限制了对药物抗心衰机制的进一步深入研究。
本实验采用国际通用的C57小鼠行冠状动脉结扎术制备小鼠CHF模型，观察给药后小鼠模型在超声心动图、血液动力学及病理学等方面的差异。
2.4.剂量设置及依据
化合物2设置5个剂量组,本试验中选用依那普利为阳性对照，每日一次，连续28天；小鼠剂量为1mg/kg、3mg/kg、10mg/kg、30mg/kg、100mg/kg
2.5.试验对照
假手术组：假手术小鼠给予0.3％羧甲基纤维素钠；
模型对照组：CHF建立后给予0.3％羧甲基纤维素钠；
阳性对照组：CHF建立后给予依那普利(2mg/kg)
2.6.实验仪器与试剂
0.9％氯化钠注射液：浙江天瑞药业有限公司，规格：500ml:4.5g，批号：716022605；
HANGPING，ELECTRONIC BALANCE分析天平：型号JA5003N；
H-600透射电子显微镜：日本日立公司；
医用脱脂纱布：上海宏隆医疗用品设备有限公司，批号：121112；
一次性护理口罩：上海宏隆医疗用品设备有限公司，批号：140703；
如意无粉乳胶手套：海门市如意实验器材厂，批号：160606；
一次性使用无菌注射器带针(1ml、2ml、5ml)：上海康德莱企业发展集团股份有限公司，批号：K20160318；
CP-8000科德士宠物电推剪，深圳科德士电器有限公司；
YP1201N电子天平：上海精密科学仪器有限公司；超声机：Esaote MyLabTMone/Touch；
麻醉机：惠德万邦IBIS200；异氟烷：沃尔德，批号：217170301；217161103；
3.实验方法
3.1.CHF动物模型制备以及筛选
将小鼠放入充满异氟烷的盒子中麻醉，等待小鼠麻醉后，在左侧第4肋间开胸，暴露左心耳及左心室。可见左冠状动脉自左心耳缘中部向下走行于左心室前壁，于左心耳下缘约1mm处高位缝扎冠状动脉，结扎后肉眼观察心肌由肉红色逐渐变为苍白色，表明心肌梗死模型建立成功，逐层关胸。待小鼠自主呼吸恢复后装笼，昼夜循环饲养，自由饮水进食。待饲养30天，心超检测慢性心衰模型，筛选慢性心衰造模成功小鼠。
3.2.实验分组
将心超筛选出的合格CHF小鼠进行分组，并进行随机分组。本试验分组详细情况见下表：
3.3.给药方法
小鼠连续给药28天，每天灌胃给药1次
3.4.检测指标
每周测量小鼠体重，给药28天后进行心超检测；气体麻醉机麻醉。每组3只小鼠心脏取1mm3大小组织，电镜固定液固定，进行透射电镜检测，观察心脏超微结构。剩余所有心脏组织10％甲醛固定，进行组织病理学HE染色，观察组织病理变化。
4.实验结果与结论
化合物2显著增加了心衰小鼠的射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、而不增加心率(HR)，以10mg/kg效果最为显著，比临床金标准治疗药物依那普利效果还要好。
心衰时短轴缩短率FS％会降低，给药后小鼠的FS％均有上升，Enalapril(p<0.05)阳性对照药，10mg/kg组的小鼠FS有显著性升高(p<0.0005)
实施例8、以心衰治疗新药LZC696为阳性对照，进行药效学比及机制研究
(1)实验一：心超筛选慢性心衰小鼠模型
与假手术组相比，心衰模型组左心室收缩期内径(LVIDs)明显增高，左室后壁厚度(LVPWd)明显降低。左心室射血分数EF％明显降低，短轴缩短率FS％明显降低。以EF<50％，筛选出慢性心衰小鼠。
表1心超检测筛选慢性心衰小鼠
与假手术组比较，*P<0.05，**P<0.01
(2)实验二：化合物2(HHQ16)显著改善心衰指标
给药28天后对小鼠进行心脏超声检测，与假手术组相比，心衰模型组，LVIDs明显增高，LVPWd明显降低，FS％短轴缩短率明显降低，慢性心衰小鼠左心室肿大，心室内径扩大。左心室射血分数EF％明显降低，慢性心衰鼠左心室射血功能明显降低。阳性对照药LCZ696给药剂量在60mg/kg和100mg/kg均有提高左心室射血分数EF％的作用，分别增加33.14％和45.36％，以100mg/kg差异具有显著性。且100mg/kg LCZ696显著提高短轴缩短率FS％。黄芪甲苷衍生物化合物2显著改善左心射血分数EF％(增加75.04％)和短轴缩短率FS％，效果优于阳性对照药LCZ696，且还能显著改善每分心输出量CO(表2及相应统计图)。
表2化合物2给药28天心超检测结果
28天与0天比较，*P<0.05，**P<0.01
6.结论
化合物2对慢性心衰小鼠具有治疗作用。以EF为金标准，化合物2在10mg/kg剂量效果最为显著，和现有标准用药依那普利以及新药LCZ696沙库必曲缬沙坦钠相比，具有显著的更好的效果。
图5实施例7正常小鼠射血分数EF在70-90％，心衰小鼠EF在40％以下，EF是评价心衰的重要指标，Enalapril(p<0.01)阳性对照药，10mg/kg组,30mg/kg组的小鼠EF都有显著性升高(p<0.0005),其中10mg/kg提升最高(p<0.0001)
图6实施例7每分心输出量(CO)，CO＝SVxHR,心衰时CO下降，给药后小鼠的CO均有上升，Enalapril(p<0.0001)阳性对照药有极显著性升高，30mg/kg,100mg/kg的小鼠CO显著性升高(p<0.01),10mg/kg组的小鼠CO(p<0.05)也有统计学意义
图7实施例7心衰时短轴缩短率FS％会降低，给药后小鼠的FS％均有上升，Enalapril(p<0.05)阳性对照药，10mg/kg组的小鼠FS有显著性升高(p<0.0005)
图8实施例8(正常小鼠射血分数EF在70-90％，心衰小鼠EF在40％以下，EF是评价心衰的重要指标，LCZ696和化合物2组的小鼠EF都有显著性升高(p<0.0005),但化合物2的效果更显著；心衰时短轴缩短率FS％会降低，给药后小鼠的FS％均有上升，化合物2的效果更显著(p<0.0005))
图9(心率(HR)，正常老鼠心率基本不变化，心衰老鼠心率会有显著变化，LCZ696和化合物2组的小鼠心率都没有明显变化；每分心输出量(CO)，CO＝SVxHR,心衰时CO下降，给药后小鼠的CO均有上升，LCZ696组升高无统计学意义，化合物2组的小鼠CO显著性升高(p<0.01))

Claims (18)

1.一种卤代四环三萜类衍生物，其特征在于，所述衍生物为化合物2，以下列结构式表示：
2.如权利要求1所述一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，该制备方法包括下列步骤，以下列反应式表示：
该制备方法包括下列步骤：
a、3-位羟基氧化：化合物3的3-位羟基采用三氧化硫吡啶/二甲基亚砜氧化得到化合物4；
b、羟基保护：化合物4的羟基采用羟基保护试剂保护，得到化合物5，Ac为羟基保护基；
c、双氟代：化合物5采用三氟化硫及其衍生物和催化剂进行双氟代得到化合物6；所述三氟化硫衍生物选自二乙胺基三氟化硫、三氟化硫吗啉、二甲氨基三氟化硫、4-叔丁基-2,6-二甲基苯基三氟化硫或双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫；
d、脱保护基：化合物6采用还原剂或者碱脱保护得到化合物2。
3.根据权利要求2所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，
步骤a采用三氧化硫吡啶/二甲基亚砜/三乙胺体系，化合物3与三氧化硫吡啶的摩尔比为1:1-1:15；反应温度为-20℃-100℃。
4.根据权利要求2所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，
步骤b所述的羟基保护基选自乙酰基，丙酰基或三甲基乙酰基，溶剂为非质子溶剂；碱为有机碱或无机碱；化合物4与羟基保护试剂的摩尔比为1:1-1:15；反应温度为-10℃-160℃。
5.根据权利要求4所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，
步骤b所述羟基保护基为乙酰基，非质子溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、丙酮或N,N-二甲基甲酰胺；有机碱选自二乙胺、三乙胺、吡啶、哌啶、咪唑、N，N-二异丙基乙胺、4-吡咯烷基吡啶、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯、4-二甲氨基吡啶或1,4-二氮杂二环[2.2.2]辛烷；无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钾、碳酸氢钠、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠或磷酸钾；所述化合物4与羟基保护试剂的摩尔比为1:5；反应温度为20℃-120℃。
6.根据权利要求5所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤b反应温度为80℃-120℃。
7.根据权利要求2所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤c所述催化剂选自氢氟酸吡啶，氢氟酸三乙胺或氢氟酸二乙胺；反应的溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷或氯仿；化合物5与三氟化硫及其衍生物的摩尔比为1:1-1:15；反应温度为-50℃-150℃。
8.根据权利要求2所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤c所述三氟化硫衍生物为二乙胺基三氟化硫或双(2-甲氧乙基)氨基三氟化硫；催化剂为氢氟酸吡啶；反应溶剂为甲苯；化合物5与三氟化硫及其衍生物的摩尔比为1:3；反应温度为20℃-70℃。
9.根据权利要求2所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤d所述还原剂选自四氢铝锂、二异丁基氢化铝、硼氢化锂、硼氢化钾或硼氢化钠；反应溶剂选自甲苯、二甲苯、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙酸乙酯、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿，甲醇或乙醇；化合物6与还原剂的摩尔比为1:5；反应温度为-10℃-100℃。
10.根据权利要求9所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤d所述还原剂为四氢铝锂或二异丁基氢化铝；反应溶剂为二氯甲烷或甲醇；化合物6与还原剂的摩尔比为1:5；反应温度为0℃-50℃。
11.根据权利要求10所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，步骤d所述反应温度为5℃-25℃。
12.根据权利要求2所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，当步骤d使用碱脱保护时，所述碱为无机碱；反应溶剂选自水、甲醇、异丙醇、叔丁醇或乙醇；化合物6与碱的摩尔比为1:1-1:25；反应温度为-10℃-100℃。
13.根据权利要求12所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，当步骤d使用碱脱保护时，所述碱为氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸钠、碳酸铯、碳酸氢钾、醋酸钠、醋酸钾、磷酸钠或磷酸钾；反应溶剂为甲醇；化合物6与碱的摩尔比为1:6；反应温度为0℃-50℃。
14.根据权利要求13所述的一种卤代四环三萜类衍生物的制备方法，其特征在于，当步骤d使用碱脱保护时，所述碱为碳酸钾或氢氧化钾；反应温度为15℃-25℃。
15.如权利要求1所述卤代四环三萜衍生物在制备治疗心血管疾病药物中的应用，其特征在于，所述衍生物为化合物2。
16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述应用为卤代四环三萜衍生物在制备治疗心衰药物中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述应用为卤代四环三萜衍生物在制备治疗慢性心衰药物中的应用。
18.根据权利要求15-17中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物是由化合物2作为唯一活性成分与药用辅料组成的药物组合物。
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