CN103183715A - 呋甾烷型皂苷衍生物及其用途 - Google Patents

Abstract

一种呋甾烷型皂苷衍生物，其结构如下式所示。经实验证明，该呋甾烷型皂苷衍生物具有显著的抗抑郁药理活性，可作为活性成分制成药物、食品和保健品，单独或与其它物质组合用于预防和治疗抑郁症。

Description

呋甾烷型皂苷衍生物及其用途

技术领域

本发明涉及一种甾体皂苷衍生物，尤其涉及一种呋甾烷型皂苷衍生物及其差向异构体，以及这些衍生物在预防和治疗抑郁症中的应用。

背景技术

知母（又名兔子油草，穿地龙）为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides）的干燥根茎。据《植物志》中记载，其性苦寒，有滋阴降火、润燥滑肠、利大小便之效。

中药材知母主要的化学成分有甾体皂苷、双苯吡喃酮类、多糖类和木质素类等，如：知母皂苷（甙）（timosaponin）A-Ⅰ、A-Ⅱ、A-Ⅲ、A-Ⅳ、B-Ⅰ、B-Ⅱ和B-Ⅲ，其中，知母皂苷A-Ⅱ、A-Ⅳ结构尚不明。以及知母皂苷（amemarsaponin）A2，即马尔考皂苷元-3-O-β-D-吡喃葡萄糖基（1→2）-β-D-吡喃半乳糖苷B（marlogenin-3-O-β-D-glucopyranosy（1→2）-β-D-galactopyranoside B）、去半乳糖替告皂苷（desgalactotigonin）、F-芰脱皂苷（F-gitonin）和异菝葜皂苷（smilageninoside）等。此外，还含有知母多糖（anemaran）A/B/C/D、顺-扁柏树脂酚（cis-hinokiresinol）、单甲基-顺-扁柏树脂酚（monomethyl-cis-hinokiresinol）、氧化-顺-扁柏树脂酚（oxy-cis-himokiresinol）、2,6,4′-三羟基-4-甲氧基二苯甲酮（2,6,4′-trihydroxy-4-methoxybenzophenone）、对-羟苯基巴豆油酸（p-hydroxyphenyl crotonic acid）、二十五烷酸乙烯脂（pentacosyl vinyl ester）、β-谷甾醇（β-sitosterol）、芒果苷（mangiferin）、烟酸（nicotinicacid）、烟酰胺（nicotinamide）及泛酸（pantothenic acid）等。

知母皂苷B-Ⅱ对脑缺血造成的学习记忆障碍具有改善作用（Neuroscience letter.,2007,421,147-151）。知母皂苷A-Ⅲ主要通过抑制乙酰胆碱酯酶，以及抑制炎症因子的表达而对记忆缺失具有缓解作用（Pharmacol.Biochem.Be.,2009,93,121-127）。

已有诸多研究证明，知母所含的这些物质对多种疾病具有治疗作用，如：知母总皂苷可用于治疗心肌缺血（CN1682873A），以知母皂苷A-Ⅲ和B-Ⅱ为主要成分制成的药剂也已经用于治疗血栓性疾病（WO2011/026259）。知母皂苷A-Ⅲ可诱发人宫颈癌细胞凋亡，在体内和体外实验中都证明其具有治疗结肠和直肠癌的作用（Cancer Res.,2008,68,10229-10237），以及具有抑制血管内皮细胞增殖的显著效果，对于治疗肿瘤和类风湿性关节炎等疾病具有治疗作用（CN102030812A）。

近来相关研究还表明，知母总皂在多种抑郁模型上具有抗抑郁作用，可能与其增强去甲肾上腺素能及5-羟色胺能神经系统有关（中药新药与临床药理，2007，18，29）。通过动物实验验证，知母中所含有的菝葜皂苷元对小鼠实验性抑郁有一定作用，可以影响小鼠脑内多巴胺和单胺氧化酶的活性，而使该类皂苷元具有抗抑郁活性（Biol.Pharm.Bull.,2006,29,2304-2306）。伊佳等人的研究发现，知母皂苷B-Ⅱ具有抗抑郁活性，其作用机制可能与增强脑内5-HT和DA神经系统作用有关（CN101214253A；药学实践杂志，2010，28，283-287）。

中医认为，抑郁症多因忧思过度，劳伤心脾为病，治疗应以宁心安神，养血滋阴为主。因此，在大部分用于中医治疗抑郁症的处方中，知母也是一味较为常用的中药材。临床上当前应用较为常用的抗抑郁药物有：三环和四环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-HT重吸收抑制剂（SSRI）、非典型抗抑郁药和锂盐等。

近年来，临床上应用最广的SSRI类药物——氟西汀存在诸多不良反应，如：全身或局部过敏，胃肠道功能紊乱等（中国现代应用药学，2008，25，763-765；中国新药杂志，2001，10，20；实用医学杂志，2004，20，318-319）。有研究指出，幼儿患者服用氟西汀后有可能增加自杀倾向，亦有报道称服用氟西汀可能引起暴力倾向增强和先天性心血管出生缺陷。

SSRI类药物——舍曲林（Sertraline）是美国处方量较大的抗抑郁品牌药，但易引起患者窦性心动过速和ST-T改变等（中国新药与临床杂志，2002，21，711-713）不良反应，在治疗抑郁发作过程中会在一定程度上引起躁狂发作或转躁（国外医学精神病学分册，2004，31，104）。

文拉法辛和氯米帕明虽一样易于耐受，但约有1/3的用药者会发生恶心反应，特别在开始用药的几周中较为明显。已发现的文拉法辛所致的不良反应有恶性综合征、诱发躁狂、紫癜、幻觉、骤停致幻觉、戒断反应、5-HT综合征、胸闷、眩晕、低血压、停经和眼压升高等，对儿童的转躁率较高（临床精神医学杂志，2002，12，382）。

据世界卫生组织专家预测，到2020年抑郁症的社会总负担在所有疾病负担中将上升为第一位，而用于治疗抑郁症活性的药物中所含的活性分子主要依靠化学合成的方式获取，大都存在毒副作用大、抗抑郁谱狭窄和价格昂贵等问题，我们国家目前接受治疗的抑郁症患者仅有2%，对家庭和社会具有潜在的极大危害。因此，研发安全、有效和价廉的抗抑郁创新药物显得尤为必要。

中药和天然药物是创新药物研究开发的重要源头之一。近年来，国际和国内对贯叶连翘等具有抗抑郁作用的天然药物研究和开发取得了一系列成果（中国现代中药，2009，11，6-9；中成药，2006，28，713-716；广东医学，2005，859-860；南京中医药大学学报，2001，17，294-298；解放局药学学报，2003，19，426-428；药学实践杂志，2004，22，104-105；Pharm.Biol.,2006,44,503-510）。但至今未见治疗抑郁症的中药新药上市，也鲜有这方面化学结构与药效机制关系的研究报道。

发明内容

本发明的一个目的在于提供一种甾体皂苷衍生物，具有抗抑郁的药理作用，可作为活性成分用于制备治疗和预防抑郁症的药物。

本发明的另一个目的在于提供一种呋甾烷型皂苷衍生物或其差向异构体组合物，具有抗抑郁的药理作用。

本发明的又一个目的在于提供一种由知母皂苷B-Ⅲ或从中药材知母中制取而得的呋甾烷型皂苷衍生物或其差向异构体组合物，具有抗抑郁的药理作用。

本发明的再一个目的在于提供一种组合物，以所提供的各种甾体皂苷衍生物或其组合物为活性成分制成药物、食品和保健品，单独或与其它物质组合用于预防和治疗抑郁症。

本发明所称的“甾体皂苷衍生物”是指甾体皂苷衍生物以及所成的药学上可接受的盐，如：但不仅限于盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、钾盐、钠盐、钙盐、镁盐、钡盐、锰盐、锌盐、铁盐和季铵盐等。

本发明所称的“呋甾烷型皂苷衍生物”是指呋甾烷型皂苷衍生物以及所成的药学上可接受的盐，如：但不仅限于盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、钾盐、钠盐、钙盐、镁盐、钡盐、锰盐、锌盐、铁盐和季铵盐等。

本发明所称的“从中药材知母中制取而得的呋甾烷型皂苷衍生物”是指该衍生物与各种无机酸、无机碱、有机酸或有机碱所成的化合物，包括为从中药材知母中制取呋甾烷型皂苷衍生物的过程中，呋甾烷型皂苷衍生物及其生成该衍生物的直接或间接的前体化合物（如：知母皂苷B-Ⅲ）与制取所使用的各种试剂所成的药学上可接受的盐，如：盐酸盐、硫酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、乙酸盐、钠盐、钾盐或季铵盐等。

本发明所称的“中药材知母”是指百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides）的各个部分，如：根、茎、页和果实等，由于从该植物的根茎中能够制取最多的目标甾体皂苷衍生物，因此本发明优先选择其干燥的根茎。这些知母药材的选料和炮制过程是否符合中药材加工工艺和标准不得限定本发明。

本发明所称的“抑郁症（depression）”属情感性精神障碍性疾病（mood disorders），是一种以显著而持久的心境低落为主要特征的综合征。通常所说的抑郁症是指临床上的重症抑郁症（major depression）（中国实验方剂学杂志，2005，11，46；药学实践杂志，2008，26，282）。抑郁症的患者常伴有焦虑症状，焦虑又可加重抑郁的发展（中国临床康复，2006，10，58）。抑郁症发作以心境低落为主，与其处境不相称，可以从闷闷不乐到悲痛欲绝，甚至发生木僵。严重者可出现幻觉、妄想等精神病性症状。某些病例的焦虑与运动性激越很显著。其诊断标准也以心境低落为主，并伴有至少有以下所列4项：（1）兴趣丧失、无愉快感；（2）精力减退或疲乏感；（3）精神运动性迟滞或激越；（4）自我评价过低、自责，或有内疚感；（5）联想困难或自觉思考能力下降；（6）反复出现想死的念头或有自杀、自伤行为；（7）睡眠障碍，如失眠、早醒，或睡眠过多；（8）食欲降低或体重明显减轻；以及（9）性欲减退。而社会功能受损，给本人造成痛苦或不良后果则属于病情发展的严重标准。就其病程角度，患者符合症状标准和严重标准至少已持续2周；可存在某些分裂性症状，但不符合分裂症的诊断。若同时符合分裂症的症状标准，在分裂症状缓解后，满足抑郁发作标准至少2周（中国精神障碍分类与诊断标准[M]，济南：山东科学技术出版社，2001，28-35）。

本发明所称的“抗抑郁”是指能对抑郁症患者的症状起到治疗、改善或治愈的目的，以使患者的病情得到改善以致恢复正常。

本发明所称的“强迫游泳实验（Forced Swimming Test，FST）”或“强迫游泳的抑郁症动物模型”是指通过将实验动物（如：小鼠）置于一个局限的环境中（如：水中），动物在该环境中拼命挣扎试图逃跑又无法逃脱，从而提供了一个无可回避的压迫环境，一段时间的实验后，动物即表现出典型的“不动状态”，实际上动物放弃逃脱的希望，反映了一种被称之为“行为绝望状态”，记录处于该环境的动物产生绝望的不动状态过程中的一系列参数。该系统使用摄像头对实验过程录像并用相应软件对图像进行跟踪分析，减少人为操作，数据具有客观性。强迫游泳的抑郁症动物模型，是研究人类抑郁症药理学及其发病机理、筛选观察抗抑郁药物研究中可靠的实验模型，其主要的特点是药物作用的高度特异性，该实验能够很好的将抗抑郁药物与强安定和抗焦虑药加以区别，而且大多数抗抑郁药所产生的效应与临床效价显著相关（Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.,1977,229,327-336；Neurosei.Biobehav.Rev.,1995,19,377-395）。

本发明所称的“悬尾实验（Tail Suspension Test，TST）”是一种经典而又能快速评价抗抑郁药物药效的方法。其原理是利用小鼠悬尾后企图逃脱但又无法逃脱，从而放弃挣扎，进入特有的抑郁不动状态，实验过程中记录动物不动时间来反映抑郁状态，抗抑郁药物能明显地缩短改变其状态。

本发明所称的“生物体”、“动物”或“患者”是指人、野生动物和家畜（Livestock）。野生动物为自然状态下未经人工驯化的动物。家畜是为了提供食物来源而人工饲养的动物，如：但不仅限于狗、猫、鼠、大鼠、仓鼠、猪、兔、奶牛、水牛、公牛、绵羊、山羊、鹅和鸡等。给予治疗的“患者”、“动物”或“生物体”优先选择哺乳动物，尤其是人。

本发明所称的“预防”是指在未被临床标准认定的疾病前，各种用于防止疾病发生或发展的手段或措施，包括医学、物理或化学的方法，以阻止和降低疾病各种症状的发生或发展。

本发明所称的“治疗”是指为了阻止和降低疾病的发生或发展，使疾病病程的发展或加重得以抑制、遏制、减轻、改善、减缓、停止、延迟或反转，所描述的保持和/或用药时的疾病的、紊乱的或病理学状态的各种指标包括减轻或减少症状或并发症，或治愈或消除疾病、紊乱或状况。

本发明所称的“食品”是指包括本发明提供的各种甾体皂苷衍生物制成可食用的单一化合物或组合物。该种单一化合物或组合物的生产和制造应当符合相关食品安全标准，但是这些食品安全标准不得限定本发明。

本发明所称的“保健品”是指将包括本发明提供的各种甾体皂苷衍生物制成可食用的单一化合物或组合物以施于患者，起到对疾病进行预防和治疗的目的。其属于本发明所称的食品，但其生产、制造和销售还应当符合各种相关的要求、标准和规范。

本发明所称的“药物”是指可以用于预防或治疗某种疾病的单一化合物、多种化合物形成的组合物、中药材及其提取物，或指以单一化合物为主要活性成分的组合物或制剂（formulation），还指由多种化合物为活性成分的组合物或制剂。“药物”应理解为不仅指根据一国之法律规定，通过其设立的行政机构审批并准予生产的产品，还指在为了获得通过审批和准予生产的过程中，所形成的含单一化合物为活性成分的各类物质形态。“形成”应理解为通过化学合成、生物转化或购买等途径获得。

本发明所称的“制剂”是指含有本发明异黄酮类化合物的有利于给药（drugdelivery）的剂型，如：但不仅限于，水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。这些药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于，等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善本发明化合物在生物体内的代谢，进而增强给药效果。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于，明胶、白蛋白、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。

本发明所称的“有效治疗剂量”指能减缓各种病理学意义上的症状而使用本发明化合物作为活性成分的量，所给的量一般根据生物体的体重确定，如：每天给予总量0.05mg/kg-50mg/kg。根据生物体及其病情的实际情况，所用的量和所用的次数亦可以调整，如：每天2次以上给予总量0.05-0.5mg/kg、0.6-1mg/kg、1-10mg/kg、11-25mg/kg、26-40mg/kg或41-50mg/kg。根据药物的剂型的不同，所给的要亦会发生变化，如：普通片剂需要给予10mg/kg，而采用缓控释制剂则所需的量更低。本发明甾体皂苷衍生物的特定剂量需要根据具体的情况加以确定，如：给药的方式、给药途径、给药时患者的状态以及在治疗时的病理学状况等。

本发明所称的“基础化合物”是以“氢”代替化合物结构式上所有可变的取代基而获得的化合物。举例而言，将“氢”同时代替如下式Ⅰ所示结构中的取代基R₁、R₂和R₃获得的化合物，即为基础化合物。

本发明所称的“取代基”是指取代基础化合物上特定位置氢原子的一种或几种无机或有机基团的统称。

本发明所称的“卤素”包括氟、氯、溴和碘，并以-F、-Cl、-Br和-I的集合方式作为取代基应用于基础化合物。

本发明所称的“氧代基”在化合物结构式上以“=O”表示，并与基础化合物上的原子共价连接。举例而言，氧代基与C原子共价连接而成羰基（C=O）。

本发明所称的“硫酸酯基”为-OSO₃H、-OSO₃Na、-OSO₃K和-OSO₃NH₄。

本发明所称的“磷酸酯基”为-OPO(HO)₂，以及其上氢被取代所成的药学上可接受的盐。

本发明所称的“三氟乙酸基”为-OCOCF₃。

本发明所称的“取代的氨基”为氨基上氢被C1-C3饱和烷烃部分或全部取代的氨基，如：但不仅限于甲氨基和二甲氨基。

本发明所称的“C1-C3饱和烷烃”为碳原子数1-3的烷烃。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：1、2或3，表示基团所含的碳原子个数，如：甲烷、乙烷和丙烷等。

本发明所称的“糖”，亦称“糖类”，为化学或生物化学中一类基本的有机物，是以C、H和O元素组成的多羟基（大于2个）醛、多羟基酮（大于2个）以及能水解而生成多羟基醛或多羟基酮的有机化合物。按其分子结构可分为“单糖”、“二糖”和“多糖”。由若干个单糖分子经由糖苷键缩合而成的有机化合物，亦称“糖链”。本发明优先选择单糖或二糖作为取代基应用于基础化合物。

本发明所称的“单糖（monosaccharide）”是指以C、H和O元素组成的一种有机化合物，也是构成其它糖类物质的基本单元，一般是含有3-6个碳原子的多羟基醛或多羟基酮的有机物。优先选择碳原子为5或6的多羟基醛或多羟基酮有机物，也称“戊糖”和“已糖”如：但不仅限于核糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿洛酮糖、果糖、山梨糖、塔格糖、古洛糖、伊杜糖、塔罗糖、阿洛糖和阿卓糖等。本发明单糖结构中，O元素可为S元素部分或全部替代。

本发明所称的“二糖（disaccharide）”是指以C、H和O元素组成一种有机化合物，一般是由2个单糖分子通过缩合和失水而成糖苷键的方式连接而成，熟知的二糖如：蔗糖、乳糖、纤维二糖、海藻糖和麦芽糖等。单糖分子之间所成的糖苷键如：但不仅限于α-1,1-、α-1,2-、α-1,3-、α-1,4-、β-1,4-和α-1,6-等几种糖苷键形式。本发明二糖结构中，O元素可为S元素部分或全部替代。

本发明所称的“多糖（polysaccharide）”也包括寡糖（oligosaccharide），是指以C、H和O元素组成一种有机化合物，一般是由3个以上单糖分子通过缩合和失水而成糖苷键的方式连接而成的线性或分支的聚合物。优先选择3-15个单糖分子由糖苷键连接而成的线性或分支的聚合物，熟知的多糖如：龙胆三糖、松三糖、洋槐三糖、毛蕊花糖、水苏糖和棉籽糖等。单糖分子之间所成的糖苷键如：但不仅限于α-1,4-、β-1,4-和α-1,6-等几种糖苷键形式。本发明多糖结构中，O元素可为S元素部分或全部替代。

本发明所称的“C1-C6的醇”为一个或多个羟基取代的直链或支链的饱和或不饱和烃。其中，字母C表示碳原子，其后数字为正整数，如：1、2、3、4或5等，表示基团所含的碳原子个数，如：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇和正丁醇等。

本发明提供的一种甾体皂苷衍生物，为呋甾烷型皂苷衍生物，其结构如式Ⅰ所示，其中R₁表示一种取代基，选自于-OH、-SH、卤素、氧代基、硫酸酯基、通过O-糖苷键连接的糖、通过S-糖苷键连接的糖、C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一种基团；R₂表示一种取代基，选自于-OH、-SH和卤素之一种基团；R₃表示一种取代基，选自于-OH、-SH、卤素、氧代基、硫酸酯基、磷酸酯基、三氟乙酸基、C1-C3饱和烷烃取代的氨基、通过O-糖苷键连接的糖和通过S-糖苷键连接的糖之一种基团。

本发明提供的另一种甾体皂苷衍生物，为呋甾烷型皂苷衍生物，结构如式Ⅰ所示，其中R₁表示一种取代基，选自于-OH、-SH、卤素、C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一种基团；R₂表示一种取代基，选自于-OH、-SH和卤素之一种基团；R₃表示一种取代基，选自于-OH、-SH、卤素、氧代基、硫酸酯基、磷酸酯基、三氟乙酸基、C1-C3饱和烷烃取代的氨基、通过O-糖苷键连接的单糖和通过S-糖苷键连接的单糖之一种基团。

本发明提供的另一种甾体皂苷衍生物，为呋甾烷型皂苷衍生物，其结构如式Ⅱ所示，其中R₁表示一种取代基，选自于-OH、-SH、卤素、C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一种基团；R₃表示一种取代基，选自于-OH、-SH、卤素、氧代基、硫酸酯基、磷酸酯基、三氟乙酸基、C1-C3饱和烷烃取代的氨基、通过O-糖苷键连接的单糖和通过S-糖苷键连接的单糖之一种基团。

本发明提供的另一种甾体皂苷衍生物，为呋甾烷型皂苷衍生物，其结构如式Ⅲ所示，其中R₃表示一种取代基，选自于-OH、-SH、卤素、氧代基、硫酸酯基、磷酸酯基、三氟乙酸基、C1-C3饱和烷烃取代的氨基、通过O-糖苷键连接的单糖和通过S-糖苷键连接的单糖之一种基团。

本发明提供的另一种甾体皂苷衍生物，为呋甾烷型皂苷衍生物，结构如式Ⅳ所示。

本发明提供的另一种甾体皂苷衍生物，为呋甾烷型皂苷衍生物，其结构分别如式Ⅴ-Ⅰ和式Ⅴ-Ⅱ所示。

本发明提供的另一种甾体皂苷衍生物，由式Ⅴ-Ⅰ和式Ⅴ-Ⅱ所示的呋甾烷型皂苷衍生物差向异构体组成。

本发明提供的各种甾体皂苷衍生物，可采用多种方式制取而得，如将知母皂苷B-Ⅲ、知母皂苷B-Ⅲ皂苷元或知母皂苷A-Ⅰ皂苷元溶于溶剂，加入各种必要试剂后，在惰性气体（如：但不仅限于氮气、氢气或氦气）保护下反应，反应结束后，采用三甲胺、三乙胺、碳酸氢钠或硫代硫酸钠等淬灭剂终止反应。所得产物采用填料为硅胶、氧化铝、ODS或大孔树脂等的柱层析分离，分离所用的溶剂如：但不仅限于四氢呋喃、石油醚、乙酸乙酯、DMF、吡啶、二氯甲烷、乙醇、甲醇或水之一种或几种。

本发明提供的一种获取本发明Ⅴ-Ⅰ和式Ⅴ-Ⅱ所示甾体皂苷衍生物较为直接方法，如：按知母皂苷B-Ⅲ重量份数与溶剂（溶剂可为10v/v%-100v/v%C1-C6醇的水溶液以及其它常见有机溶剂的水溶液，或水中加入助溶剂，如：表面活性剂）体积比1∶0.2-10，将知母皂苷B-Ⅲ溶解于容器中，按知母皂苷B-Ⅲ重量份数与无机酸（如：盐酸和硫酸等）体积比1∶1-4加入无机酸，于60℃-100℃反应1-10小时，之后停止反应，反应液中加入适量碱液（如：碳酸氢钠或氢氧化钠等）中和至pH6-8，按知母皂苷B-Ⅲ重量份数与正丁醇体积比1∶1-10萃取1-3次，合并正丁醇萃取部分，减压回收溶剂，得固体物。固体物用常用有机溶剂（如：乙腈或甲醇等）溶解，经分析型、半制备型或制备型HPLC或开放ODS柱分离并收集主要色谱峰，含有本发明目标产物的溶液经回收溶剂后，得到微黄色或白色产物，即为本发明呋甾烷型皂苷衍生物。

多种直接或间接的方法可以获得本发明所提供的各种甾体皂苷衍生物、药学上可接受的盐或其组合物。本领域技术人员可以预见，从知母或其提取物中先提取知母皂苷B-Ⅲ（如：CN101307090A），再经上述公开的酸水解方法即可间接制取本发明提供的各种呋甾烷型皂苷衍生物，如：将从中药材知母中获取的知母皂苷B-Ⅲ进行酸水解后，经分离制得式Ⅴ-Ⅰ或式Ⅴ-Ⅱ所示的呋甾烷型皂苷衍生物及其任意比例的组合物。此外，通过知母皂苷B-Ⅲ皂苷元、知母皂苷A-Ⅰ或知母皂苷A-Ⅰ皂苷元也可获得本发明目标衍生物，以及其它诸如：有机合成、从生物体代谢产物中提取、分离和纯化、化学全合成和生物催化和转化等方式同样也能获得这些衍生物。本发明所列举的各种制备方法应当理解为对实施本发明技术方案进行的必要公开。本领域技术人员可以根据教科书和实验手册的教导，以及通过必要的实验获得本发明提供的甾体皂苷衍生物，这些所记载的获得甾体皂苷衍生物的方法不得作为对本发明的限定。

本发明提供的各种甾体皂苷衍生物可以作为唯一的或主要的活性成分用于制备预防或治疗病毒性疾病的药物，或与其它一种或多种具有抗抑郁作用的化学物质或药物一并给予生物体。这些化学物质如：但不仅限于知母提取物、知母总皂苷及其水解物、知母皂苷B-Ⅱ及其水解物、知母皂苷B-Ⅲ及其水解物、知母皂苷B-Ⅲ皂苷元、知母皂苷A-Ⅰ及其水解产物、知母皂苷A-Ⅰ皂苷元、三环和四环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性5-HT重吸收抑制剂（SSRI）、非典型抗抑郁药和锂盐等。所称的“一并给予生物体”是指本发明各种甾体皂苷衍生物单独或与其它一种或多种具有抗抑郁作用的化合物或药物混合后经单一的给药途径，如：但不仅限于，口服（Oral）、鼻腔（Nasal）、（面）颊（Buccal）、透皮（Transdermal）、肺部（Pulmonal）、阴道（Vaginal）、皮下（Subcutaneous）或静脉（Intravenous）给予生物体；或与其它一种或多种具有抗抑郁作用的化学物质或药物分别经多种的给药途径给予生物体，如：但不仅限于速释的口服制剂与缓控释的埋植制剂配合。

经强迫游泳实验和悬尾实验证明，将有效治疗剂量的本发明提供的各种甾体皂苷衍生物（如：式Ⅱ、式Ⅲ或其组合物）给予生物体，能使生物体抑郁症状得到改善或消除。由此表明，本发明提供的呋甾烷型皂苷衍生物具有显著的抗抑郁活性，以其为活性成分制成药物、食品和保健品，应用于抑郁症的预防和治疗。

本发明提供的一种药物组合物，以所提供的各种甾体皂苷衍生物或其组合物为活性成分用于预防和治疗抑郁症。

本发明提供的一种食品，以所提供的各种甾体皂苷衍生物或其组合物为活性成分用于预防和治疗抑郁症。

本发明提供的一种保健品，以所提供的各种甾体皂苷衍生物或其组合物为活性成分用于预防和治疗抑郁症。

本发明技术方案实现的有益效果：

本发明提供的一种甾体皂苷衍生物，具体为式Ⅰ所示的呋甾烷型皂苷衍生物，尤其是如式Ⅱ、式Ⅲ、式Ⅳ、式Ⅴ-Ⅰ和式Ⅴ-Ⅱ所示结构的呋甾烷型皂苷衍生物，具有显著的抗抑郁药理活性，可作为活性成分制成药物、食品和保健品，单独或与其它物质组合用于抑郁症的预防和治疗。

附图说明

图1为式Ⅴ-Ⅰ¹HNMR谱（400MHz，Pyr-d₅）；

图2为式Ⅴ-Ⅰ¹³C-NMR谱和DEPT135谱（100MHz，Pyr-d₅）；

图3为式Ⅴ-ⅠHMBC谱（Pyr-d₅）；

图4为式Ⅴ-ⅠROESY谱（Pyr-d₅）；

图5为式Ⅴ-ⅠHMBC相关图，图中“→”代表氢碳远程相关关系；

图6为式Ⅴ-ⅠROESY相关图，图中“←→”代表氢氢NOE相关关系；

图7为式Ⅴ-Ⅱ¹H NMR谱（400MHz，Pyr-d₅）；

图8为式Ⅴ-Ⅱ¹³C-NMR谱和DEPT135谱（100MHz，Pyr-d₅）；

图9为式Ⅴ-ⅡHMBC谱（Pyr-d₅）；

图10为式Ⅴ-ⅡROESY谱（Pyr-d₅）；

图11为式Ⅴ-ⅡHMBC相关图，图中“→”代表氢碳远程相关关系；

图12为式Ⅴ-ⅡROESY相关图，图中“←→”代表氢氢NOE相关关系。

具体实施方式

以下结合附图详细描述本发明的技术方案。本发明实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自于西格玛－奥德里奇（Sigma－Aldrich）。

实施例1呋甾烷型皂苷单糖衍生物的制取

以知母皂苷B-Ⅲ为反应起始物制取呋甾烷型皂苷单糖衍生物，具体步骤如下：

（1）将0.05mol知母皂苷B-Ⅲ溶于300mL体积比为10v/v%的甲醇溶液（水或30v/v%乙醇溶液或1w/v%吐温溶液）中，加入0.5mL-1mL浓硫酸，80℃-150℃反应1小时-6小时。

（2）将上述反应液用氢氧化钠调节至pH6-7。

（3）用900mL-1200mL正丁醇分3次萃取步骤（2）中和后所得溶液，萃取液减压浓缩至蒸干得呋甾烷型皂苷单糖衍生物2（NMR：详见表1）。

（4）用水将所得的呋甾烷型皂苷单糖衍生物2固体溶解，并使吸附于ODS柱后，用50v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物2-1和R构型的衍生物2-2的洗脱液。

（5）将溶液减压回收，蒸干即分别制得呋甾烷型皂苷单糖衍生物2-1和2-2。

实施例2呋甾烷型皂苷单糖衍生物的制取

以知母皂苷B-Ⅲ为反应起始物制取呋甾烷型皂苷单糖衍生物，具体步骤如下：

（1）将0.05mol知母皂苷B-Ⅲ溶于300ml体积比为10v/v%的甲醇溶液（水或30v/v%乙醇溶液或1w/v%吐温溶液）中，加入2ml-4ml浓盐酸，80℃-150℃反应1小时-6小时。

（2）将上述反应液用氢氧化钠调节至pH6-7。

（3）用900ml-1200ml正丁醇分3次萃取步骤（2）中和后所得溶液，萃取液减压浓缩至蒸干得呋甾烷型皂苷单糖衍生物2（NMR：详见表1）。

（4）用水将所得的呋甾烷型皂苷单糖衍生物2固体溶解，并使皂苷吸附于ODS柱后，用40v/v%-60v/v%的甲醇洗脱，先后收集S构型的衍生物2-1和R构型的衍生物2-2洗脱液。

（5）将溶液减压回收，蒸干分别制得呋甾烷型皂苷单糖衍生物2-1和2-2。

实施例3呋甾烷型皂苷单糖衍生物的制取

以知母皂苷A Ⅰ为反应起始物制取呋甾烷型皂苷单糖衍生物的制取，步骤如下：

（1）将0.05mol知母皂苷A Ⅰ的皂苷元3和0.06mol-0.1mol叔丁基二甲基氯硅烷溶解于200ml-250ml DMF中，在60℃-90℃反应8小时-10小时；加入600ml-800ml石油醚于反应液中，再用900ml水洗两次，600mlNaCl水溶液洗一次。分出有机相，用无水硫酸钠干燥。过滤，对滤液减压蒸除溶剂。

（2）将步骤（1）所得产物和0.8mol-1.1mol NaHCO₃溶解于700ml比例为1∶1∶1的二氯甲烷，丙酮，1mmol/L Na₂EDTA的混合溶液中；将溶有0.2mol过氧硫酸氢钾复合盐的1mmol/L-3mmol/L Na₂EDTA溶液加到反应溶液中，20℃-30℃反应10小时-16小时。减压旋出有机相，加入二氯甲烷溶解沉淀；水洗有机相，再用无水硫酸钠干燥。减压蒸出溶剂。用20∶1的石油醚、乙酸乙酯展开剂分离化合物4，将同一化合物合并回收。

（3）将步骤（2）所得产物4和0.05mol-0.07mol T1溶于300ml二氯甲烷中，降低体系温度至0℃--30℃，并用氮气保护，加入4.7mmol-5.5mmol CF₃SO₃Si(CH₃)₃，反应40分钟-1小时，用三乙胺淬灭反应，减压旋干溶剂。用20∶1-10∶1的石油醚、乙酸乙酯展开剂分离化合物5，将同一化合物合并回收。

（4）将步骤三所得化合物5溶于200ml-300ml乙醇中，加入0.01mol-0.015mol NaBH₄，加热到60℃-75℃，反应3小时。

（5）旋干溶液，将沉淀加入到200mLCH₂Cl₂-MeOH（2∶1,v/v）溶液中，再加入1mol/L-1.4mol/L的甲醇钠甲醇溶液50ml，反应3小时-5小时，得呋甾烷型皂苷单糖衍生物2。

（6）真空旋干溶剂，用水将呋甾烷型皂苷单糖衍生物2固体溶解，并使吸附于ODS柱后，用50v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物2-1和R构型的衍生物2-2洗脱液。

（7）将溶液减压回收，蒸干得到呋甾烷型皂苷单糖衍生物固体2-1和2-2。

实施例4呋甾烷型皂苷单糖衍生物的制取

以知母皂苷B-Ⅲ为反应起始物先制取皂苷苷元化合物6，然后加入试剂T1制得呋甾烷型皂苷单糖衍生物2，具体步骤如下：

（1）将0.1mol知母皂苷B-Ⅲ溶于600ml体积比为10%的甲醇溶液中，加入30mL-50mL浓盐酸，80℃-100℃反应2小时。

（2）用氢氧化钠调节至pH=6-7。

（3）用1.8L-2.4L正丁醇分3次萃取步骤（2）中和后所得溶液，萃取液减压浓缩至蒸干。

（4）用水将上述固体溶解，并使皂苷吸附于ODS柱后，用60v/v%-80v/v%的乙腈水溶液洗脱收集化合物6的洗脱液。

（5）将溶液减压回收，蒸干即得皂苷苷元化合物6（NMR：30.47(1-C);27.12(2-C);66.06(3-C);36.95(4-C);40.00(5-C);26.58(6-C);28.59(7-C);35.37(8-C);36.98(9-C);35.42(10-C);21.00(11-C);40.39(12-C);44.49(13-C);53.73(14-C);34.32(15-C);75.93(16-C);63.39(17-C);13.65(18-C);24.20(19-C);49.34(20-C);16.78(21-C);214.86(22-C);40.21(23-C);26.88(24-C);35.47(25-C);67.87(26-C);17.16(27-C)）。

（6）将0.05mol皂苷苷元化合物6和0.05mol-0.07mol试剂T1用二氯甲烷溶解，在氮气保护下降温到-20℃-0℃，加入0.91ml-1.4ml CF₃SO₃Si(CH₃)₃，反应40分钟-1小时后停止。

（7）加入三乙胺淬灭反应，减压旋干溶剂。

（8）沉淀加入到200ml CH₂Cl₂-MeOH（2∶1,v/v）溶液中，再加入1mol/L-1.5mol/L的甲醇钠甲醇溶液50ml，反应3-5小时，得呋甾烷型皂苷单糖衍生物2，蒸干反应液。

（9）用水将上述固体溶解，并吸附于ODS柱后，用50v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物2-1和R构型的衍生物2-2洗脱液。将溶液减压回收，蒸干即得产物2-1和2-2。

实施例5呋甾烷型皂苷碘代衍生物的制取

以实施例4制得的皂苷苷元化合物6为反应起始物，制取呋甾烷型皂苷碘代衍生物7，具体步骤如下：

（1）将0.05mol实施例4中第（5）步得到的皂苷苷元化合物6和0.05mol碘化钠溶于150ml 2-丁酮中，在25℃反应1小时。

（2）反应结束后，将反应液倒入1.25L水中，过滤，并用水洗两次。

（3）将滤饼干燥，之后，用甲醇重结晶，得呋甾烷型皂苷碘代衍生物7（NMR：30.47(1-C);27.12(2-C);66.06(3-C);36.95(4-C);40.00(5-C);26.58(6-C);28.59(7-C);35.37(8-C);36.98(9-C);35.42(10-C);21.00(11-C);40.39(12-C);44.49(13-C);53.73(14-C);34.32(15-C);75.93(16-C);63.39(17-C);13.65(18-C);24.20(19-C);49.34(20-C);16.78(21-C);214.86(22-C);15.91(23-C);26.88(24-C);35.47(25-C);40.16(26-C);20.12(27-C)）。

（4）过滤，用水将呋甾烷型皂苷碘代衍生物7固体溶解，并吸附于ODS柱后，用50v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物7-1和R构型的衍生物7-2的洗脱液。

（5）将溶液减压回收，蒸干即分别得呋甾烷型碘代衍生物7-1和7-2。

实施例6呋甾烷型皂苷溴代衍生物的制取

以实施例4制得的皂苷苷元化合物6为反应起始物，制取呋甾烷型皂苷溴代衍生物10，具体步骤如下：

（1）将0.05mol实施例4中第（5）步得到的皂苷苷元化合物6溶于250ml CH₂Cl₂中，加入50ml-70ml三氟化硼-乙醚络合试剂（CAS：109-63-7），滴加醋酸酐0.1mol-0.2mol，20℃-60℃反应30分钟-1小时，用1L饱和NaCl水溶液洗反应液，再用750ml-1L水洗反应液，分出有机相，用Na₂SO₄干燥；将有机相过滤，旋干滤液，用硅胶柱层析纯化产物，展开剂为体积比6∶1的石油醚与乙酸乙酯。

（2）将步骤（1）所得产物溶解于250ml-300ml四氢呋喃溶液中，加入0.05mol-0.1mol NBS和0.005mol-0.01mol(Ph)₃P，常温反应5小时-7小时。

（3）过滤反应液，减压旋蒸干溶剂，加入200ml CH₂Cl₂-MeOH（2∶1,v/v）溶液萃取，加入1mol/L-1.5mol/L的甲醇钠甲醇溶液50ml-100ml，20℃-50℃反应5小时-8小时。

（4）减压蒸馏，浓缩反应，用乙醇和乙酸乙酯混合液重结晶，得到呋甾烷型皂苷溴代衍生物10（NMR：30.47(1-C);27.12(2-C);66.06(3-C);36.95(4-C);40.00(5-C);26.58(6-C);28.59(7-C);35.37(8-C);36.98(9-C);35.42(10-C);21.00(11-C);40.39(12-C);44.49(13-C);53.73(14-C);29.78(15-C);39.98(16-C);55.89(17-C);12.61(18-C);24.20(19-C);49.34(20-C);16.78(21-C);214.86(22-C);38.89(23-C);27.92(24-C);33.56(25-C);67.23(26-C);17.04(27-C)）。

（5）用水将呋甾烷型皂苷溴代衍生物10固体溶解，并吸附于ODS柱后，用50v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集化合物S构型的衍生物10-1和R构型的衍生物10-2的洗脱液。

（6）将溶液减压回收，蒸干即分别制得呋甾烷型溴代衍生物10-1和10-2。

实施例7呋甾烷型皂苷磷酸酯基衍生物的制取

以实施例4制得的皂苷苷元化合物6为反应起始物，制取呋甾烷型皂苷磷酸酯基衍生物11，具体步骤如下：

（1）将实施例4中第（5）步得到的皂苷苷元0.05mol溶于200mL四氢呋喃中降温至-50℃--20℃，向其中缓缓加入0.25mol-0.3mol的焦磷酰氯，保持温度不变，反应1小时-3小时。

（2）用水稀释反应液，升温到40℃-60℃左右，向其中加入一定量Na₂CO₃至无气泡放出，在25℃-35℃搅拌反应0.5小时-1.5小时，过滤，分层，下层水溶液在50℃下旋蒸至无明显气泡。向其中加入盐酸，调节pH=1-2，析出白色沉淀。

（3）过滤沉淀，用盐酸酸洗涤沉淀三遍，得到呋甾烷型皂苷磷酸酯基衍生物11（NMR：30.47(1-C);27.12(2-C);66.06(3-C);36.95(4-C);40.00(5-C);26.58(6-C);28.59(7-C);35.37(8-C);36.98(9-C);35.42(10-C);21.00(11-C);40.39(12-C);44.49(13-C);53.73(14-C);34.32(15-C);75.93(16-C);63.39(17-C);13.65(18-C);24.20(19-C);49.34(20-C);16.78(21-C);214.86(22-C);38.79(23-C);27.61(24-C);32.43(25-C);71.23(26-C);16.71(27-C)）。

（4）用水将，得到呋甾烷型皂苷磷酸酯基衍生物11固体溶解，并使皂苷吸附于ODS柱后，用20v/v%-40v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物11-1和R构型的衍生物11-2的洗脱液。

（5）将溶液减压回收，蒸干即分别制得呋甾烷型皂苷磷酸酯基衍生物11-1和11-2。

实施例8呋甾烷型皂苷硫酸酯基衍生物的制取

以实施例4制得的皂苷苷元化合物6为反应起始物，制取呋甾烷型皂苷硫酸酯基衍生物12，具体步骤如下：

（1）将0.05mol实施例4中第（5）步得到的皂苷苷元化合物6溶于300ml DMF中，通入氮气保护，降温至-15℃-0℃。将0.05mol-0.1molEt3N·SO3与0.4mol-0.6mol对甲苯磺酸加入反应液，反应3小时-5小时。

（2）加入0.05mol-0.07mol三乙胺，之后加入与溶液1∶1体积比的甲醇。继续搅拌，反应3小时-5小时；升温至20℃-30℃，继续搅拌，搅拌2小时-4小时。

（3）真空旋干溶剂，用水将溶解，并吸附于ODS柱后，用40v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，收集洗脱液。

（4）将溶液减压回收，蒸干得到固体。

（5）用50ml-60ml的1mol/L的NaOH溶液溶解固体，加热到40℃-70℃，搅拌1-3小时。

（6）蒸干溶剂，用丙酮重结晶，得呋甾烷型皂苷硫酸酯基衍生物12（NMR：30.47(1-C);27.12(2-C);66.06(3-C);36.95(4-C);40.00(5-C);26.58(6-C);28.59(7-C);35.37(8-C);36.98(9-C);35.42(10-C);21.00(11-C);40.39(12-C);44.49(13-C);53.73(14-C);34.32(15-C);75.93(16-C);63.39(17-C);13.65(18-C);24.20(19-C);49.34(20-C);16.78(21-C);214.86(22-C);38.89(23-C);27.92(24-C);33.56(25-C);84.04(26-C);17.44(27-C)）。

（7）用水将呋甾烷型皂苷硫酸酯基衍生物12固体溶解，并吸附于ODS柱后，用20v/v%-40v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物12-1和R构型的衍生物12-2的洗脱液。

（8）将溶液减压回收，蒸干即分别制得呋甾烷型皂苷硫酸酯基衍生物12-1和12-2。

实施例9呋甾烷型皂苷三氟乙酸基衍生物的制取

以实施例4制得的皂苷苷元化合物6为反应起始物，制取呋甾烷型皂苷三氟乙酸基衍生物14，具体步骤如下：

（1）将0.05mol实施例4中第（5）步得到的皂苷苷元化合物6溶于250ml CH₂Cl₂中，加入50ml-60ml三氟化硼-乙醚络合，滴加醋酸酐0.15mol-0.2mol，20℃-40℃反应1小时-2小时，用1L饱和NaCl水溶液洗反应液，再用750ml水洗反应液，分出有机相，用Na₂SO₄干燥；将有机相过滤，旋干滤液，用硅胶柱层析纯化产物13，展开剂为体积比6:1的石油醚与乙酸乙酯。

（2）将步骤（1）中产物13溶于250mlCH₂Cl₂中，降温至-40℃--15℃，加入0.075mol-0.1mol三氟乙酰三氟甲磺酸酯（TFAT），反应2小时-4小时。

（3）反应结束，加入碳酸氢钠淬灭反应，继续搅拌30分钟-1小时，升高温度至20℃-30℃，继续搅拌30分钟-1小时，得呋甾烷型皂苷三氟乙酸基衍生物14（NMR：30.47(1-C);27.12(2-C);66.06(3-C);36.95(4-C);40.00(5-C);26.58(6-C);28.59(7-C);35.37(8-C);36.98(9-C);35.42(10-C);21.00(11-C);40.39(12-C);44.49(13-C);53.73(14-C);34.32(15-C);75.93(16-C);63.39(17-C);13.65(18-C);24.20(19-C);49.34(20-C);16.78(21-C);214.86(22-C);38.89(23-C);27.92(24-C);33.56(25-C);68.97(26-C);17.21(27-C);159.23(28-C);116.32(29-C)）。

（4）真空旋干溶剂，用水将呋甾烷型皂苷三氟乙酸基衍生物14固体溶解，并吸附于ODS柱后，用40v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物14-1和R构型的衍生物14-2的洗脱液。

（5）将溶液减压回收，蒸干即分别制得到S构型的衍生物14-1和R构型的衍生物14-2。

实施例10呋甾烷型皂苷烷氨基衍生物的制取

以实施例4制得的皂苷苷元化合物6为反应起始物，制取呋甾烷型皂苷烷氨基衍生物，具体步骤如下：

（1）将0.05mol实施例4中第（5）步得到的皂苷苷元化合物6溶于300ml四氢呋喃中，将温度降至-30℃-0℃；将0.1mol-0.2mol二甲胺、0.15mol-0.2mol偶氮二羧酸二乙酯、0.12mol-0.22mol PPh₃加入溶液，通入氮气保护，反应2小时-3小时。

（2）反应结束后，过滤，将滤液旋干，得呋甾烷型皂苷烷氨基衍生物15（NMR：33.37(1-C);24.59(2-C);71.65(3-C);30.46(4-C);44.65(5-C);26.58(6-C);28.59(7-C);35.37(8-C);36.98(9-C);35.42(10-C);21.00(11-C);40.39(12-C);44.49(13-C);53.73(14-C);34.32(15-C);75.93(16-C);63.39(17-C);13.65(18-C);24.20(19-C);49.34(20-C);16.78(21-C);214.86(22-C);39.84(23-C);29.46(24-C);31.26(25-C);67.82(26-C);18.25(27-C);42.31(3-N-CH₃);48.23(26-N-CH₃)）。

（3）真空旋干溶剂，用水将呋甾烷型皂苷烷氨基衍生物15固体溶解，并吸附于ODS柱后，用50v/v%-70v/v%的乙腈水溶液洗脱，先后收集S构型的衍生物15-1和R构型的衍生物15-2的洗脱液。

（4）将溶液减压回收，蒸干即分别制得呋甾烷型皂苷烷氨基衍生物15-1和15-2。

实施例11结构确认

将实施例1或实施例2所得的呋甾烷型皂苷单糖衍生物，经Molish反应和Liebermann-Burchard反应检测均呈阳性，其核磁共振谱图（Nuclear Magnetic Resonance，NMR）数据如表1。再综合HMBC、ROESY和MS等多种图谱结果分析如式Ⅴ-Ⅰ和式Ⅴ-Ⅱ所示衍生物。

式Ⅴ-Ⅰ衍生物，外观为白色无定形粉末，易溶于吡啶，可溶于丙酮-水、乙腈-水和水溶液。Liebermann-Burchard和Molish反应呈阳性，证明该化合物为甾体皂苷。

HR-ESI-MS（正离子模式）显示[M+Na]⁺m/z 619.3798（计为C₃₃H₅₆O₉Na：619.3817），确定其分子式为C₃₃H₅₆O₉。

核磁共振谱提示结构中含有一分子葡萄糖，氢谱（¹H-MNR，见图1）显示δ4.88（d，J=7.7Hz）为葡萄糖的端基质子信号，说明该葡萄糖为β构型。综合分析¹³C-NMR谱和DEPT谱（见图2），确定26个苷元上的碳信号中有4个是甲基碳信号，12个是亚甲基碳信号，14个次甲基碳信号和3个季碳信号。该化合物苷元部分的碳谱和氢谱数据均与知母皂苷B-Ⅲ相似，说明它与知母皂苷B-Ⅲ具有相似的母核。与知母皂苷B-Ⅲ苷元部分的碳谱相比，双键的信号消失，在δ_C 214.63出现了一个羰基信号。在HMBC谱（见图3）中，H-20（δ_H2.84），H-21（δ_H1.49）以及H-23（δ_H2.76）与δ_C 214.63存在远程相关，而H-17（δ_H2.23）与δ_C75.22存在远程相关，说明羰基位于C-22位上，而羟基位于C-16位上。δ_H4.88（H-1′）的葡萄糖端基质子与δ_C 75.01（C-26）存在HMBC远程相关确定糖苷化的位置，即葡萄糖与26-OH相连成苷。相对立体构型由ROESY谱（见图4）确定，具体为H-5和H-19存在NOE相关，说明苷元A环和B环是顺式构型。δ0.76（H-18)和δ4.09（H-16）存在NOE相关，说明16-OH是β构型。其它NMR数据及相关关系见表1、图5和图6。该化合物未见文献报道，为新化合物，命名为timosaponin BⅢ-1（或简称：BⅢ-1）。

式Ⅴ-Ⅱ衍生物，外观为白色无定形粉末，易溶于吡啶，可溶于丙酮-水、乙腈-水和水溶液。Liebermann-Burchard和Molish反应呈阳性，提示该化合物为甾体皂苷。

(c 0.05mg/ml,pyridine)。

HR-ESI-MS（正离子模式）显示[M+Na]⁺m/z 619.3816（计为C₃₃H₅₆O₉Na:619.3817），确定其分子式为C₃₃H₅₆O₉。

核磁共振谱提示结构中含有一分子葡萄糖，氢谱（¹H-MNR，见图7）中δ4.85（d，J=7.7Hz）为葡萄糖端基质子信号，确定为β构型。综合分析¹³C-NMR谱和DEPT谱（见图8），确定26个苷元上的碳信号中有4个是甲基碳信号，12个是亚甲基碳信号，14个次甲基碳信号和3个季碳信号。该化合物苷元部分的碳谱和氢谱数据均与知母皂苷B3相似，说明它与知母皂苷B3具有相似的母核。与知母皂苷B3苷元部分的碳谱相比，双键的信号消失，在δ_C 214.86出现了一个羰基的信号。在HMBC谱（见图9）中，H-20（δ_H2.80），H-21（δ_H1.23）以及H-23（δ_H2.93,2.75）与δ_C 214.86存在远程相关，而H-17（δ_H1.90）与δ_C 75.93存在远程相关，说明羰基位于C-22位上，而羟基位于C-16位上。另外，δ_H4.85（H-1′）葡萄端基质子与δ_C 75.19（C-26）存在远程相关，确定糖苷化的位置，即葡萄糖与26-OH相连成苷。相对立体构型由ROESY谱（见图10）确定，即δ0.71（H-18）质子与δ4.29（H-16）质子存在NOE相关，确定16-OH是α构型。另外H-5质子和H-19质子存在相关，确定A环和B环为顺式构型。其它NMR数据及相关关系见表1、图11和图12。该化合物未见文献报道，为新化合物，命名为timosaponin BⅢ-2（或简称：BⅢ-2）。

表1Ⅴ-Ⅰ和式Ⅴ-Ⅱ所示衍生物的NMR数据

以上述相同的方法，即可对实施例5-实施例10所制得的衍生物进行结构确认。

实施例12抗抑郁活性验证

FST和TST两种行为绝望模型对绝大多数抗抑郁药敏感，操作简单、快捷，被广泛用于该类药物的筛选，本实施例也以此模型对实施例1-实施例10所制得的各种衍生物的抗抑郁药理作用进行验证。

实验选用雄性ICR小鼠，体重（20±2）g，购自中科院上海药物所实验动物中心，自由摄食饮水，室温（23±2）℃，自然光照。所有小鼠随机分组为10只/笼，于饲养环境中适应3天后开始实验，实验前禁食12小时，饮水自由。具体给药方法为：空白对照组一组，给等体积的生理盐水。

FST验证实验

1）具体操作：连续给药6天，末次给药后1小时进行测试。首先利用开野法测定小鼠的自主活动，即将小鼠单独置于圆柱型玻璃缸内，计时4分钟，记录后2分钟内的抬臂次数。然后将小鼠单独放入高20厘米、直径14厘米的圆柱型玻璃缸中，缸内水深10厘米，水温23℃-25℃。从小鼠入水后计时6分钟，记录后4分钟内的累计不动时间（判定不动标准：小鼠在水中停止挣扎，或呈漂浮状态，仅有细小的肢体运动以保持头部浮在水面）。各组小鼠平行操作。

2）实验数据处理：实验结果以均值±标准误（x±SE）表示。采用t检验进行统计分析，判断是否具有显著性意义。首先对其自主活动指标进行t检验，其P﹥0.05说明小鼠的自主后动没有影响，以避免中枢兴奋药的干扰。然后对强迫游泳实验指标进行t检验，判断是否具有抗抑郁作用。

TST验证实验

1）具体操作：连续给药6天，末次给药后1小时进行测试。首先利用开野法测定小鼠的自主活动，即将小鼠单独置于圆柱型玻璃缸内，计时4分钟，记录后2分钟内的抬臂次数。然后用胶带将小鼠尾在距尾尖2厘米处粘在横杠上，四周以板隔离动物视线，横杠距地面约25厘米，使小鼠距地面约10厘米，计时6min，记录后4分钟内累计不动时间，各组小鼠平行操作。

2）实验数据处理：实验结果以均值±标准误（x±SE）表示。采用t检验进行统计分析，判断是否具有显著性意义。首先对其自主活动指标进行t检验，其P﹥0.05说明小鼠的自主后动没有影响，以避免中枢兴奋药的干扰。然后对悬尾实验指标进行t检验，判断是否具有抗抑郁作用。

通过动物实验验证本发明制取的衍生物对抗抑郁的作用，结果和数据见表2和表3。

表2腹腔给药对ICR小鼠强迫游泳不动时间的影响

“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

表3腹腔给药对ICR小鼠悬尾不动时间的影响

“*”表示P＜0.05；“**”表示P＜0.01。

腹腔注射分别给予小鼠10mg/Kg上述化合物，另设空白对照组（生理盐水）。对小鼠自主活动的指标进行t检验，无显著差异，说明这些化合物都对小鼠的自主活动无影响。分别对小鼠强迫游泳和悬尾试验的不动时间进行t检验，结果表明，上述呋甾烷型皂苷衍生物均能明显缩短小鼠强迫游泳和悬尾的不动时间，提示它们具有显著的抗抑郁活性。

Claims (10)

1.一种如式Ⅰ所示结构的呋甾烷型皂苷衍生物，

其中，取代基R₁选自于-OH、-SH、卤素、氧代基、硫酸酯基、通过O-糖苷键连接的糖、通过S-糖苷键连接的糖、C1-C3饱和烷烃取代的氨基之一种；

取代基R₂选自于-OH、-SH和卤素之一种；

取代基R₃选自于-OH、-SH、卤素、氧代基、硫酸酯基、磷酸酯基、三氟乙酸基、C1-C3饱和烷烃取代的氨基、通过O-糖苷键连接的糖和通过S-糖苷键连接的糖之一种。

2.一种如式Ⅳ所示结构的呋甾烷型皂苷衍生物

3.根据权利要求2所述的呋甾烷型皂苷衍生物，其特征在于所述式Ⅳ包括式Ⅴ-Ⅰ和式Ⅴ-Ⅱ所示的一种或几种呋甾烷型皂苷衍生物

4.根据权利要求1-3之一所述的呋甾烷型皂苷衍生物，由知母皂苷B-Ⅲ、知母皂苷A-Ⅰ、知母皂苷B-Ⅲ皂苷元或知母皂苷A-Ⅰ皂苷元制得。

5.根据权利要求1-3之一所述的呋甾烷型皂苷衍生物，从知母或其提取物中制取而得。

6.根据权利要求1-3之一所述的呋甾烷型皂苷衍生物作为活性成分用于制备预防和治疗抑郁症的药物、食品或保健品。

7.一种抗抑郁的给药方法，对抑郁症患者给予有效治疗剂量的权利要求1-3之一所述的呋甾烷型皂苷衍生物。

8.根据权利要求7所述的抗抑郁的给药方法，其特征在于所述的有效治疗剂量为每天给予总量0.05mg/kg-50mg/kg的所述呋甾烷型皂苷衍生物。

9.一种用于抗抑郁的组合物，其活性成分含有权利要求1-3之一所述的呋甾烷型皂苷衍生物。

10.根据权利要求9所述的用于抗抑郁的组合物，将所含有的有效治疗剂量的所述呋甾烷型皂苷衍生物给予抑郁症患者。

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