CN103340881B

CN103340881B - 一种寡糖类化合物在神经保护方面的应用

Info

Publication number: CN103340881B
Application number: CN201310287472.5A
Authority: CN
Inventors: 沈竞康; 耿美玉; 章海燕; 陈越磊; 姜如炜; 杜晓光; 傅燕; 张翾; 胡定宇; 王昕�; 孟韬
Original assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Current assignee: Shanghai Institute of Materia Medica of CAS
Priority date: 2013-07-09
Filing date: 2013-07-09
Publication date: 2016-06-08
Anticipated expiration: 2033-07-09
Also published as: CN103340881A

Abstract

本发明涉及式（I）所示的寡糖类化合物(包括甘露糖寡糖，纤维糖寡糖和麦芽糖寡糖)及其立体异构体、互变异构体、溶剂合物或前药在神经保护方面的应用：

Description

一种寡糖类化合物在神经保护方面的应用

技术领域

本发明属于药物化学领域，更具体而言，涉及一种寡糖类化合物在神经保护方面的应用。

背景技术

阿尔茨海默症（Alzheimer’sdisease，AD），也称之为老年痴呆，是一种常见的老年性疾病。常在不知不觉中起病，呈持续进行性智能衰退，病程一般是5～12年，平均生存期为5.5年，死亡率高，是继肿瘤、心脏病、脑血管疾病之后引起老年人死亡的第四大病因。

随着人口老龄化及全球人口寿命的延长，AD的发病率与日俱增，目前仅在美国就有540多万患者，全球约有3000万患者遭受AD的困扰，预计到2050年，全球患者将超过5000万。我国目前有500多万AD患者，每年相关的医护开支超千亿元。AD作为一个不可忽视的卫生和社会问题，给家庭和社会带来的压力和负担也越来越严重。

AD是以进行性记忆和认知功能损害为特征的多病因参与的原发性神经退行性疾病，临床以进行性记忆丧失、认知能力下降、行为异常、直至失去生活自理能力为特征。最典型的病理变化包括β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成、神经元外存在轴突斑块(neutricplaques，又称老年斑(senileplaques,SP))、神经元内出现神经纤维缠结（neurofibrillarytangles,NFT)、基底前脑胆碱能功能障碍、皮层与海马广泛的神经元丢失和突触形态的改变。AD的发病机制多种多样，主要集中于遗传和环境因素所致的脑内慢性炎症和胆碱能系统功能进行性下降，但其确切机制仍不十分明了。目前Aβ淀粉样肽假说是研究热点之一。越来越多的研究表明：Aβ对神经细胞的毒性作用在AD的发病过程中起着至关重要的作用。因此，Aβ已成为AD研究中的一个重要靶点，寻找有效抑制Aβ毒性的药物是治疗AD的一个重要研究方向。

糖类药物因其具有低毒、高效、生物适应性好及容易透过血脑屏障等优点，已被应用在AD的治疗上。其中从海洋植物中提取、分离并经降解而得到的具有特定分子骨架的寡聚β-甘露糖酸混合物971正处于II期临床研究中。另据报道，非糖酸类的多糖类化合物也有神经保护作用，例如红芪多糖、枸杞多糖等。

发明内容

本发明的一个方面在于提供了一种式（I）所示的寡糖类化合物及其立体异构体、互变异构体、溶剂合物或前药在制备神经保护药物中的用途：

式（I）中，n表示0或1-5的整数。

本发明中，式（I）所示的寡糖类化合物通过抑制Aβ毒性或H₂O₂损伤，而产生保护神经细胞的神经保护作用。

因此，本发明的另一个方面在于提供了式（I）所示的寡糖类化合物、其立体异构体、互变异构体、溶剂合物或前药在制备用于治疗与β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成相关的疾病，尤其是阿尔茨海默症的药物中的用途。

本发明的还一个方面在于提供了式（I）所示的寡糖类化合物、其立体异构体、互变异构体、溶剂合物或前药在制备抑制过氧化氢（H₂O₂）损伤的神经保护药物中的用途。

本发明中，优选地，所述寡糖类化合物的糖苷键为alpha-构型。

本发明中，优选地，所述寡糖类化合物的糖苷键为beta-构型。

本发明中，优选地，所述寡糖类化合物的单糖片段为甘露糖。

本发明中，优选地，所述寡糖类化合物的单糖片段为葡萄糖。

优选地，所述寡糖类化合物选自甘露糖寡糖、纤维糖寡糖和麦芽糖寡糖。

所述甘露糖寡糖例如可以选自甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖和甘露七糖，更优选选自1,4-β-甘露二糖、1,4-β-甘露三糖、1,4-β-甘露四糖、1,4-β-甘露五糖和1,4-β-甘露六糖。

所述纤维糖寡糖例如可以选自纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖和纤维七糖。

所述麦芽糖寡糖例如可以选自麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖。

本发明中，式（I）所示的寡糖类化合物可以通过商业途径得到，或者采用本领域中已知的方法得到，或者采用本发明人提供的如下方法制得。

本发明提供了上述式（I）所示的寡糖类化合物(包括甘露糖寡糖，纤维糖寡糖和麦芽糖寡糖)及其立体异构体、互变异构体、溶剂合物或前药的制备方法，其包括以下步骤：

反应路线如下：

其中，P1为苄基（-Bn），P2为苯基（-Ph），P3为乙酰基（-Ac），

使1-苯基亚砜单糖I与苄醇发生糖苷化反应后，得1位是苄氧基的单糖化合物II；

脱去其4,6位羟基上的叉基保护及选择性保护其6位羟基，得4位羟基游离而6位羟基有保护的单糖III；

使单糖III与单糖I发生糖苷化反应可得全保护的二糖IV；

脱除二糖IV的非还原端糖环4’,6’位羟基的叉基保护及选择性保护其6’位羟基得4’位羟基游离而6’位羟基有保护的双糖V；

将V与单糖I发生糖苷化反应得全保护的三糖VII；

重复上述步骤，可得全保护的四糖、五糖、六糖及七糖；

无保护的二糖VI可由二糖化合物V脱去其羟基的保护基而得，类似的，无保护的三、四、五、六、七糖可由相应的含保护基的三、四、五、六、七糖脱去其羟基的保护基而得。

特别是，本发明提供了一种式（I）所示的1,4-β-甘露寡糖的制备方法，为下列反应之一：

反应路线1：

全保护的1,4-β-甘露二糖4的合成：试剂和条件：(a)Tf₂O,TTBP,BnOH;(b)TFA，Ac₂O,Et₃N;(c)Tf₂O,TTBP

以D-甘露糖为原料，经反应得1-苯基亚砜单糖1，

使单糖1与苄醇发生糖苷化反应，得1-β-苄氧基化合物2，

酸性条件下脱除化合物2的4,6位羟基苄叉保护基，得到4,6位羟基游离在外的双羟基化合物中间体，选择性的对所述中间体的6位羟基用乙酰基保护，得4-OH游离的单糖3，

使单糖3与单糖1发生糖苷化反应得到全保护的1,4-β-甘露二糖4；

反应路线2：

1,4-β-甘露二-六糖的合成：试剂和条件：(a)TFA,Ac₂O,Et₃N;(b)K₂CO₃,MeOH,20%Pd(OH)₂/C,H₂.

脱去1,4-β-甘露二糖4的4’,6’位羟基苄叉保护基，得到4’,6’位羟基游离的中间体（结构未显示）；

选择性保护其6’-羟基，得双糖5；

将双糖5与单糖1发生糖苷化反应得全保护的1,4-β-甘露三糖7，

如此重复可得全保护的1,4-β-甘露四糖10、全保护的1,4-β-甘露五糖13、全保护的1,4-β-甘露六糖16；

分别脱去二糖-五糖化合物（5，8，11，14）的羟基保护基，得相应的1,4-β-甘露二-五糖（6，9，12，15）；

另外，1,4-β-甘露六糖17由16经相同脱保护反应而得。

根据本发明的再一个方面，提供了一种治疗β-淀粉样蛋白（Aβ）沉积形成相关疾病的方法，其包括向需要治疗的对象施用治疗有效量的本发明的式（I）所示的寡糖类化合物、其立体异构体、互变异构体、溶剂合物或前药。

本发明中，术语“有效量”可指为实现预期的效果所需的剂量和时段的有效的量。此有效量可能因某些因子而产生不同的变化，如疾病的种类或治疗时疾病的病症、被施用的特定标的器官的构造、病人个体大小、或疾病或症状的严重性。本领域具有通常知识者不需要过度实验即可凭经验决定特定化合物的有效量。

本发明中，生物学测试表明：本发明的式（I）所示的寡糖类化合物能够保护神经细胞，减少Aβ引起的神经毒性作用及降低H₂O₂导致的细胞损伤作用。因此本发明的式（I）所示的寡糖类化合物可用于预防或治疗阿尔茨海默症。

具体实施方式

下列实施例用于进一步说明本发明，但不构成对本发明范围的限制。

以下实施例中的试剂及溶剂一般可来自商业来源，例如国药集团化学试剂有限公司(上海)，或通过本领域技术人员所熟知的方法即可制备；所用薄层层析硅胶板购自烟台江友硅胶开发有限公司；所用质谱仪器型号为MAT-95型质谱仪，所用核磁仪器型号为BRUKERAMX-400型和VARIAN-300型核磁共振仪。

实施例1：1,4-β-甘露二糖和1,4-β-甘露六糖的制备

具体路线如下：

1,4-β-甘露二糖6及1,4-β-甘露六糖17的合成：试剂和条件：(a)Tf₂O,TTBP,BnOH;(b)TFA,Ac₂O,Et₃N;(c)Tf₂O,TTBP,1;(d)K₂CO₃,MeOH,20%Pd(OH)₂/C,H₂.

化合物1的制备：

化合物1根据文献Tetrahedron1998;54:8321-48由D-甘露糖经6步反应合成所得。

1HNMR(300MHz,CDCl₃)δ7.57–7.45(m,8H),7.42–7.29(m,9H),7.28–7.26(m,1H),7.22(dd,J=6.9,3.2Hz,2H),5.63(s,1H),4.87–4.78(m,1H),4.71–4.55(m,3H),4.50(s,1H),4.40(d,J=1.8Hz,1H),4.30(m,2H),4.22(dd,J=10.2,4.8Hz,1H,),4.16–4.05(m,1H),3.75(t,J=10.0Hz,1H).

化合物2的制备：

圆底烧瓶中放入分子筛和搅拌子，氩气保护下，加入100mg（0.18mmol）化合物1，112mg（0.45mmol）2,4,6-三叔丁基嘧啶（TTBP），滴入新蒸的二氯甲烷（DCM）5mL，室温搅匀，置于零下78℃搅拌0.5h后，向其中滴入1M的三氟甲磺酸酐/二氯甲烷（Tf₂O/DCM）溶液200μL（0.2mmol），此温度下搅拌10min后，逐滴滴入23mg（0.216mmol）苄醇（BnOH）溶解在2mL新蒸二氯甲烷中的溶液，零下78℃下搅拌1h后，逐渐升温至零下20℃,薄层色谱（TLC）检测原料反应完全后。向反应液中加入5mL饱和碳酸氢钠溶液，硅藻土过滤，滤液用饱和碳酸氢钠洗，水洗，饱和食盐水洗。无水硫酸钠干燥，旋去溶剂，残留物经200-300目硅胶柱层析纯化，得74mg白色固体化合物2，收率：76.7%。

1HNMR(300MHz,CDCl₃)δ7.54–7.20(m,20H),5.63(s,1H),4.96(dt,J=27.1,9.3Hz,3H),4.61(dt,J=12.5,7.5Hz,3H),4.52(s,1H),4.35(dd,J=10.4,4.9Hz,1H),4.24(t,J=9.6Hz,1H),3.97(dd,J=14.0,6.5Hz,2H),3.58(dd,J=9.9,3.1Hz,1H),3.33(td,J=9.7,4.8Hz,1H).

化合物3的制备：

将14.86g（27.62mmol）化合物2溶于200mLDCM后，冰浴下滴入42.6mL（552.42mmol）三氟醋酸（TFA）和42.6mL（V:V=1:1）水的混合液，室温反应1h，TLC检测原料反应完全后，冰浴下滴入饱和碳酸氢钠至溶液呈中性，有机相用水洗，饱和食盐水洗。无水硫酸钠干燥后，旋干溶剂，残留物用150mLDCM溶解，向其中滴入9.6mL(69.05mmol）三乙胺（TEA）和6.5mL(552.42mmol）乙酸酐（Ac₂O），室温反应4h，TLC检测原料反应完全后，向反应液中加入50mL水，有机相用1M稀盐酸洗，饱和碳酸氢钠洗，水洗，饱和食盐水洗。无水硫酸钠干燥后，旋干溶剂，残留物经200-300目硅胶柱层析纯化后得6.3g无色油状物3，收率：46%。

1HNMR(300MHz,CDCl₃)δ7.44–7.21(m,15H),4.99(d,J=11.9Hz,2H),4.80(d,J=12.4Hz,1H),4.61(d,J=12.0Hz,1H),4.51–4.39(m,4H),4.29(d,J=11.8Hz,1H),3.99–3.87(m,2H),3.40(ddd,J=9.6,4.9,3.1Hz,1H),3.27(dd,J=9.4,3.0Hz,1H),2.55(s,1H),2.12(s,3H).

ESI-MS:m/z515.3[M+Na]⁺.

化合物4的制备：

除了使用化合物3替代苄醇以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物2的制备，得无色油状化合物4，收率：65%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.49-7.20(m,30H),5.52(s,1H),5.01-4.86(m,3H),4.84-4.72(m,3H),4.68–4.55(m,4H),4.50(d,J=11.9Hz,1H),4.46(s,1H),4.31(m,2H),4.14–4.03(m,2H),3.99(dd,J=10.4,4.8Hz，1H),3.90(m,2H),3.66(t,J=10.2Hz,1H),3.58-3.49(m,2H),3.49-3.43(m,1H),3.09(td,J=9.9,4.9Hz,1H),2.08(s,3H).

ESI-MS:m/z945.6[M+Na]⁺.

化合物5的制备：

除了使用化合物4替代化合物2以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物3的制备，得无色油状化合物5，收率：70%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.30(ddd,J=25.2,15.9,7.7Hz,25H),5.00–4.89(m,2H),4.86–4.71(m,3H),4.56(m,5H),4.44(m,4H),4.17(m,2H,),4.10(t,J=8.9Hz,1H),3.90(m,2H),3.83(t,J=9.4Hz,1H),3.62–3.53(m,2H),3.20(m,1H),3.10(m,1H),2.49(s,1H),2.09(s,3H),1.91(s,3H).

ESI-MS:m/z899.5[M+Na]⁺.

化合物6的制备：

将87.6mg(0.1mmol)化合物5溶于2.5mL甲醇中，向其中加入13.8mg（0.1mmol）碳酸钾粉末，室温反应1h。TLC检测原料反应完全后，滤除不溶固体，旋干滤液。残留物用5mL甲醇溶解后，向其中加入87.6mg20%Pd(OH)₂/C，氢气球下反应一天，TLC检测原料反应完全后，硅藻土滤除Pd(OH)2，旋干滤液，残留物用纯水溶解后，sephadexLH20凝胶柱层析纯化，纯水做洗脱剂，用6%的苯酚水溶液和浓硫酸（V/V=1:5）做显色剂，合并显色流分，冷冻干燥得20mg白色无定形固体化合物6，收率：58%。

1HNMR(400MHz,D₂O)δ5.23(s,0.68H),4.96(s,0.32H),4.79(s,1H),4.11(s,1H),4.08–3.89(m,5H),3.89–3.75(m,3H),3.71(d,J=9.5Hz,1H),3.62(t,J=9.7Hz,1H),3.50(dd,J=19.7,12.6Hz,1H).

ESI-MS:m/z386.6[M+HCOO]^-.

化合物7的制备：

除了使用化合物5替代苄醇以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物2的制备，得无色油状化合物7，收率：65%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.62–6.96(m,40H),5.51(s,1H),4.99–4.90(m,2H),4.88–4.68(m,7H),4.65–4.48(m,7H),4.44(s,1H),4.33(m,2H),4.14–3.92(m,6H),3.91–3.82(m,3H),3.61(t,J=10.2Hz,1H),3.56–3.43(m,4H),3.26(m,1H),3.07(td,J=9.7,4.9Hz,1H),2.08(s,3H),1.90(s,3H).

ESI-MS:m/z1329.7[M+Na]⁺.

化合物8的制备：

除了使用化合物7替代化合物2以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物3的制备，得无色油状化合物8，收率：81%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.41–7.19(m,35H),4.99–4.89(m,2H),4.83–4.68(m,6H),4.64–4.50(m,6H),4.48(s,1H),4.46–4.28(m,4H),4.21–4.10(m,4H),4.08–3.96(m,2H),3.90(m,1H),3.87–3.79(m,3H),3.53(m,3H),3.35(dd,J=8.1,4.2Hz,1H),3.21(dd,J=9.4,2.6Hz,1H),3.16–3.08(m,1H),2.55(s,1H),2.07(s,3H),1.91(s,3H),1.90(s,3H).

ESI-MS:m/z1283.6[M+Na]⁺.

化合物10的制备：

除了使用化合物8替代苄醇以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物2的制备，得无色油状化合物10，收率：68%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.32(mz,50H),5.50(s,1H),4.94(dd,J=16.4,12.2Hz,2H),4.87–4.66(m,10H),4.66–4.51(m,8H),4.43(m,2H),4.36–4.25(m,2H),4.10(m,6H),4.03–3.91(m,4H),3.88(dd,J=9.1,2.8Hz,2H),3.82(dd,J=7.1,2.4Hz,2H),3.60(t,J=10.3Hz,1H),3.56–3.48(m,4H),3.26(m,2H),3.13–2.98(td,J=9.9,4.9Hz,1H),2.06(s,3H),1.89(2s,6H).

ESI-MS:m/z1713.3[M+Na]⁺.

化合物11的制备：

除了使用化合物10替代化合物2以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物3的制备，得无色油状化合物11，收率：80%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.53–7.02(m,45H),4.94(dd,J=16.0,12.2Hz,2H),4.82–4.68(m,8H),4.55(m,9H),4.45–4.27(m,4H),4.20–4.12(m,4H),4.11–3.91(m,5H),3.87(dd,J=9.4,2.8Hz,2H),3.85–3.78(m,3H),3.50(m,4H),3.35(m,1H),3.28(m,1H),3.21(dd,J=9.4,2.7Hz,1H),3.14–3.08(m,1H),2.49(s,1H),2.06(s,3H),1.90(s,3H),1.89(s,3H),1.88(s,3H).

ESI-MS:m/z1667.8[M+Na]⁺.

化合物13的制备：

除了使用化合物11替代苄醇以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物2的制备，得无色油状化合物13，收率：75%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.51–7.14(m,60H),5.51(s,1H),4.95(dd,J=16.1,12.2Hz,2H),4.89–4.66(m,12H),4.65–4.48(m,11H),4.44(d,J=7.2Hz,1H),4.41–4.23(m,3H),4.21–4.00(m,8H),3.96(m,4H),3.88(m,2H),3.85–3.78(m,3H),3.61(t,J=10.3Hz,1H),3.57–3.40(m,6H),3.34–3.21(m,3H),3.07(td,J=9.7,4.9Hz,1H),2.06(s,3H),1.95–1.82(3s,9H).

ESI-MS:m/z2099.6[M+Na]⁺.

化合物14的制备：

除了使用化合物13替代化合物2以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物3的制备，得无色油状化合物14，收率：65%。

1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.42–7.21(m,55H),4.95(dd,J=20.0,12.2Hz,2H),4.83–4.70(m,12H),4.56(ddd,J=31.6,16.6,10.2Hz,11H),4.47–4.28(m,5H),4.21–4.10(m,7H),4.08–4.04(m,1H),4.01(d,J=9.1Hz,1H),3.99–3.93(m,2H),3.89(dd,J=13.4,2.4Hz,2H),3.86–3.78(m,4H),3.57–3.46(m,5H),3.39–3.33(m,1H),3.33–3.26(m,2H),3.22(dd,J=9.4,2.4Hz,1H),3.15–3.09(m,1H),2.07(s,3H),1.96–1.85(4s,12H).

ESI-MS:m/z2054.8[M+Na]⁺.

化合物16的制备：

除了使用化合物14替代苄醇以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物2的制备，得无色油状化合物16，收率：60%。

1HNMR(400MHz,CDCl₃)δ7.47–7.17(m,70H),5.50(s,1H),4.94(dd,J=16.4,12.2Hz,2H),4.87–4.76(m,2H),4.76–4.67(m,13H),4.64–4.47(m,14H),4.43(s,1H),4.39–4.26(m,2H),4.17–4.03(m,9H),4.02–3.90(m,6H),3.87(dd,J=8.3,3.1Hz,2H),3.83–3.76(m,4H),3.60(t,J=10.2Hz,1H),3.55–3.43(m,7H),3.33–3.21(m,4H),3.06(td,J=9.7,4.8Hz,1H),2.05(s,3H),1.88(4s,12H).

ESI-MS:m/z2482.9[M+Na]⁺.

化合物17的制备：

除了使用化合物16替代化合物5以外，其他实验操作及反应投料比例同化合物6的制备，得白色无定形固体化合物17，收率：50%。

1HNMR(500MHz,D₂O)δ5.06(s,0.60H),4.79(s,0.40H),4.62(d,J=11.9Hz,5H),4.01(s,3H),3.93(t,J=10.6Hz,2H),3.82(dt,J=29.0,12.0Hz,8H),3.75–3.57(m,14H),3.54(dd,J=16.2,6.8Hz,2H),3.43(d,J=9.0Hz,4H),3.41–3.27(m,3H).

ESI-MS:m/z1034.7[M+HCOO]^-.

实施例2：寡糖类化合物抑制Aβ神经毒性作用实验

1.实验细胞：SH-SY5Y（神经母细胞瘤细胞），购自ATCC，DMEM培养基(Invitrogen,美国)，加10%Gibco胎牛血清(Invitrogen,美国)，37℃，5%CO₂培养。

2.实验方法：

Aβ1-40的聚集：将Aβ1-40（购自Aldrich）粉末溶于无菌水，然后用PBS稀释成为1mg/mL，37℃孵育4天，分装冻存（-80℃）备用。

化合物配制：将待测化合物溶于双蒸水，过滤除菌，浓度为10μmol/L，4℃保存备用。

细胞的接种：取对数生长期细胞接种于96孔板（3500/孔），培养过夜。换无血清培养基，加入浓度为10μmol/L的待测化合物，然后加入聚集的Aβ1-40（终浓度2μM），作用48小时，CCK-8法检测。

检测方法：CCK-8法。CellCountingKit-8简称CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂盒。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂存在的情况下，可以被线粒体内的一些脱氢酶还原生成橙黄色的甲瓒（formazan）。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

统计方法：实验结果以“均值±标准差”（meanvalues±SD）表示，采用studentT测试进行比较。

3.实验结果：

3.11,4-β-甘露寡糖系列化合物抑制Aβ神经毒性作用实验

将1,4-β-甘露二糖（化合物6）、1,4-β-甘露三糖（化合物9）、1,4-β-甘露四糖（化合物12）、1,4-β-甘露五糖（化合物15）、1,4-β-甘露六糖（化合物17）以及甘露糖（购自国药）等化合物用纯水配成浓度为10μmol/L的溶液，与阳性对照物971（上海药物所耿美玉老师实验室提供）和Alzhemed（AZ，3-氨基丙磺酸，购自Aldrich，是第一个以Aβ1-40为作用位点的糖胺聚糖类似物，曾进入临床三期实验）一同测试它们抑制Aβ神经毒性的神经保护作用，实验结果见表1。

表1.甘露糖系列化合物抑制Aβ神经毒性的神经保护作用

对照：正常培养的细胞，模型：加入Aβ而不加入药物的细胞；###p<0.001vs对照,^*p<0.05vs模型；甘露糖系列化合物浓度均为10μmol/L，971浓度为50μg/mL，AZ浓度为50μmol/L。

3.2麦芽糖、纤维糖系列化合物抑制Aβ神经毒性作用实验

将麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖、麦芽七糖和纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖（以上化合物均购自J&KChemicalLtd）等化合物用纯水配成浓度为10μmol/L的溶液，与阳性对照物971（上海药物所耿美玉老师实验室提供），一同测试它们抑制Aβ神经毒性的神经保护作用，实验结果见表2。

表2.麦芽糖、纤维糖系列化合物抑制Aβ神经毒性的神经保护作用

对照：正常培养的细胞，模型：加入Aβ而不加入药物的细胞；###p<0.001vs对照,^***p<0.001,^**p<0.01,^*p<0.05vs模型；麦芽糖、纤维糖系列化合物浓度均为10μmol/L，971浓度为为50μg/mL。

实验例3：寡糖类化合物抑制H₂O₂损伤作用实验

1.实验细胞：PC12（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）购自ATCC，DMEM培养基(Invitrogen,美国)加10%Gibco胎牛血清(Invitrogen,美国)和5%马血清(Invitrogen,美国)，37℃，5%CO₂培养；SH-SY5Y（神经母细胞瘤细胞）购自ATCC，DMEM培养基(Invitrogen,美国)加10%Gibco胎牛血清(Invitrogen,美国)，37℃，5%CO₂培养。

2.实验方法：

模型：过氧化氢（400μM,4h）。

化合物配制：将待测化合物溶于双蒸水，过滤除菌，终浓度10mM，4℃保存备用。

加药方式：造模前预孵育2h。

细胞的接种：取对数生长期细胞接种于96孔板（3500/孔），培养过夜。换无血清培养基，加入不同浓度的化合物预孵育2小时，然后加入过氧化氢（终浓度400μM），作用4小时。

筛选方法：四氮唑盐(Methyl-Thiazol-Tetrozolium,MTT)还原法。将处于对数生长期的上述细胞接种至96孔培养板，24小时后加入不同浓度的化合物预先处理2h，然后加入过氧化氢（终浓度400μM）作用4小时后加入20mL的5mg/mLMTT继续培养4小时，然后加100ml的三联液（10%SDS-5%异丁醇-10mMHCl）终止反应，37℃作用24h后，酶标仪（MolecularDevices，VERSAmax）上于570nm波长下测定OD值。

统计方法：结果以“均值±标准差”（meanvalues±SD）表示，采用studentT测试进行比较。

3.实验结果：

将1,4-β-甘露二糖（化合物6）、1,4-β-甘露三糖（化合物9）、1,4-β-甘露四糖（化合物12）用纯水配成10μM、1μM及0.1μM浓度的溶液，在SH-SY5Y（神经嗜铬母细胞瘤细胞）和PC12（大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞）上考察其抑制H₂O₂损伤的神经保护作用，实验结果见表3。

表3.1,4-β-甘露二三四糖抗抑制H₂O₂损伤的神经保护作用

对照：正常培养的细胞，模型：加入H₂O₂而不加入药物的细胞；###p<0.001vs对照，^*p<0.05，^**p<0.01，^***p<0.001vs模型。

Claims

1.一种式(I)所示的寡糖类化合物及其立体异构体、互变异构体在制备用于抑制β-淀粉样蛋白(Aβ)神经毒性的神经保护药物中的用途：

式(I)中，n表示0或1-5的整数。

2.一种式(I)所示的寡糖类化合物及其立体异构体、互变异构体在制备用于治疗与β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成相关的疾病的药物中的用途：

式(I)中，n表示0或1-5的整数。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述与β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积形成相关的疾病是阿尔茨海默症。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述寡糖类化合物的糖苷键为alpha-构型。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述寡糖类化合物的糖苷键为beta-构型。

6.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述寡糖类化合物的单糖片段为甘露糖。

7.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述寡糖类化合物的单糖片段为葡萄糖。

8.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中，所述寡糖类化合物选自甘露糖寡糖、纤维糖寡糖和麦芽糖寡糖。

9.根据权利要求8所述的用途，其中，所述甘露糖寡糖选自甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖和甘露七糖；所述纤维糖寡糖选自纤维二糖、纤维三糖、纤维四糖、纤维五糖、纤维六糖和纤维七糖；所述麦芽糖寡糖选自麦芽二糖、麦芽三糖、麦芽四糖、麦芽五糖、麦芽六糖和麦芽七糖。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述甘露糖寡糖选自1,4-β-甘露二糖、1,4-β-甘露三糖、1,4-β-甘露四糖、1,4-β-甘露五糖和1,4-β-甘露六糖。

11.一种式(I)所示的寡糖类化合物及其立体异构体、互变异构体在制备抑制过氧化氢(H₂O₂)损伤的神经保护药物中的用途：

式(I)中，n表示0或1-5的整数，所述寡糖类化合物的糖苷键为beta-构型，所述寡糖类化合物的单糖片段为甘露糖。

12.根据权利要求11所述的用途，其中，所述甘露糖寡糖选自甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖、甘露六糖和甘露七糖。

13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述甘露糖寡糖选自1,4-β-甘露二糖、1,4-β-甘露三糖、1,4-β-甘露四糖、1,4-β-甘露五糖和1,4-β-甘露六糖。