EP3349744A1 - Sulfolipide als neue glutaminylcyclase-inhibitoren - Google Patents

Sulfolipide als neue glutaminylcyclase-inhibitoren

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EP3349744A1
EP3349744A1 EP16769934.7A EP16769934A EP3349744A1 EP 3349744 A1 EP3349744 A1 EP 3349744A1 EP 16769934 A EP16769934 A EP 16769934A EP 3349744 A1 EP3349744 A1 EP 3349744A1
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EP
European Patent Office
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formula
compound
salt
hydrogen atom
methanol
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP16769934.7A
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English (en)
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Inventor
Stephanie Hielscher-Michael
Carola Griehl
Hans-Ulrich Demuth
Stephan Schilling
Ludger Wessjohann
Norbert Arnold
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Hochschule Anhalt
Leibniz-Institut fur Pflanzenbiochemie (ipb)
Leibniz Institut fuer Pflanzenbiochemie
Original Assignee
Hochschule Anhalt
Leibniz-Institut fur Pflanzenbiochemie (ipb)
Leibniz Institut fuer Pflanzenbiochemie
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Publication date
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Publication of EP3349744A1 publication Critical patent/EP3349744A1/de
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    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
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    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/44—Preparation of O-glycosides, e.g. glucosides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine

Definitions

  • the invention relates to the use of a compound or compound containing the compound as
  • Glutaminyl cyclase (QC) inhibitor and method of preparation.
  • the glutaminylcyclases (EC 2.3.2.5) belong to the class of acyltransferases (EC 2.3.2). QC catalyzes the
  • QC inhibitors are described, for example, in WO 2010/026212, WO 2011/029920; WO 2011/101433; WO 2011/107530; and where Described 2011/110613. QC inhibitors from natural
  • Sulfolipids are known as biologically active natural products.
  • the bioactivities so far described for sulfolipids include: immunosuppressive effects, antiviral effects (e.g., against HIV), antineoplastic effects, a
  • Caspase e.g., an effect in inflammatory skin diseases or diseases such as psoriasis in particular
  • anti-proliferative effects on various human cancer cell lines e.g., a prophylactic action against a Mycobacterium tuberculosum infection, and an anti-protozoal activity.
  • Active ingredients or molecular components provides a great
  • Object of the present invention was to provide new QC inhibitors derived from natural sources, have no cytotoxic effects and are usually well tolerated.
  • the invention relates to the use of a compound or compound containing the compound as
  • Glutaminyl cyclase (QC) inhibitor and method of preparation.
  • the present invention provides a compound of the formula (I):
  • C 1 -C 2 6 alkyl as used herein means an alkyl group and denotes a saturated
  • Ci-C26alkyl radicals are, for example, the methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl (or valeryl), hexyl (or capro), heptyl (or ⁇ nanthyl-), octyl ( or caprylic), nonyl (or pelargonyl), decyl (or caprine), undecyl; Dodecyl (or lauryl), tridecyl, tetradecyl (or myristyl), pentadecyl, hexadecyl (or cetyl), heptadecyl, octadecyl (or stearyl); Nonadecyl, eicosyl, heneicosyl, doeicosyl, tricosyl, tetracosyl, pentacosyl, Hexacosyl, isopropyl, sec-butyl, isobut
  • -C 2 -C 26 alkenyl as used herein means an alkenyl group and denotes an at least partially unsaturated, straight-chain or branched, optionally substituted hydrocarbon group containing 2 to 26
  • Representative "-C 2 -C 6 alkenyl" radicals are, for example, the vinyl, allyl, 1-butenyl, 2-butenyl, - isobutylenyl, 1-pentenyl, 2-pentenyl, 3-methyl-1-butenyl , 2-methyl-2-butenyl, 2, 3-dimethyl-2-butenyl-ethenyl, hex-2-enyl, 9-hexadecenyl (or palmitoleyl), 9-octadecenyl (oleyl), II-octadecenyl, 9,12-octadecadienyl (or
  • Linoleyl 6, 9, 12-octadecatrienyl (or linolenyl)
  • alkenyl groups contain one or more
  • the compound of the formula (I) can be used in stereoisomeric forms (enantiomers, diastereomers) exist.
  • the invention therefore includes the enantiomers or diastereomers as well as mixtures thereof. From such mixtures of enantiomers and / or diastereomers, the stereoisomerically uniform constituents can be isolated in a known manner, for example by means of column chromatography.
  • the present invention covers all tautomeric forms.
  • Physiologically acceptable salts of the compound of formula (I) may include acid addition salts of mineral acids, carboxylic acids and sulfonic acids, e.g. Salts of hydrochloric acid,
  • Methanesulfonic acid ethanesulfonic acid, toluenesulfonic acid,
  • physiologically acceptable salts of the compound of formula (I) may also include salts of conventional bases, such as, for example, alkali metal salts (e.g., sodium and potassium salts); Alkaline earth salts (e.g., calcium and magnesium
  • Magnesium salts and ammonium salts derived from ammonia or organic amines having 1 to 16 C atoms, such as
  • ethylamine for example, ethylamine, diethylamine, triethylamine, Ethyldiisopropylamine, monoethanolamine, diethanolamine,
  • Triethanolamine dicyclohexylamine, dimethylaminoethanol, procaine, dibenzylamine, N-ethylmorpholine, arginine, lysine, ethylenediamine and N-ethylpiperidine.
  • R 1 is a hydrogen atom, a palmitoyl, palmitoleoyl, oleoyl, linoleoyl, linolenoyl, eicosatetraenoyl or eicosapentaenoyl group;
  • R 2 is a hydrogen atom, a palmitoyl, palmitoleoyl, oleoyl, linoleoyl, linolenoyl, eicosatetraenoyl or eicosapentaenoyl group.
  • the compound of the formula (I) or a salt thereof may be selected for use as QC inhibitor from the group: 1,2-di-O-palmitoyl -3-0- ( ⁇ '-deoxy-6 '- sulfo-D-glycopyranosyl, 1-0-palmitoyl-2-0-linolenyl-3-0- (6'-deoxy-6 'sulfo-D-glycopyranosyl, 10-linolyl-2-0-palmitoyl-3-0 - (6 '-deoxy-6' -sulfo-D-glycopyranosyl, 1-0- palmitoyl-3-0 (6 '-sulpho- -quinovopyranosyl) -glycerol and 1-0- (6-deoxy-6-sulphoglucopyranosyl) glycerol.
  • Eicosatetraenoyl, or an eicosapentaenoyl group used as QC inhibitor.
  • l, 2-di-0- palmitoyl -3-0- (6 '-deoxy-6' -sulfo-D-glycopyranosyl, 1-0- palmitoyl-2-0-1inoleny1-3-0- (6 ' -deoxy-6 '-sulfo-D-glycopyranosyl, l-0-linolyl-2-0-palmitoyl-3-0- (6' -deoxy-6 '- sulfo-D-glycopyranosyl, lO-palmitoyl-3-0 (6 * -sulpho-a-quinovopyranosyl) -glycerol, or 1-0- (6-deoxy-6-sulphoglucopyranosyl) -glycerol may be used as the QC inhibitor The use may be in vitro or in vivo
  • Diagnostic procedures that are performed on the human or animal body are excluded. On the other hand, it includes the use of the compound of the formula (I) or a salt thereof for the manufacture of a medicament for a Use for the prophylaxis or treatment of a QC-associated disease.
  • composition comprising any of the aforementioned compounds of the formula (I) or a salt thereof for use as a QC inhibitor is the subject of the present invention.
  • the composition comprising a compound of the formula (I) or a salt thereof for use as a QC inhibitor is the subject of the present invention.
  • the composition comprising a compound of the formula (I) or a salt thereof for use as a QC inhibitor is the subject of the present invention.
  • the composition comprising a compound of the formula (I) or a salt thereof for use as a QC inhibitor is the subject of the present invention.
  • the composition comprising a compound of the formula (I) or a salt thereof for use as a QC inhibitor is the subject of the present invention.
  • the composition comprising a compound of the formula (I) or a salt
  • microalgae of the species are suitable for obtaining the extract: Scenedesmus sp., E.g. B. Scenedesmus producto capitatus, Scenedesmus rubescens, Scenedesmus acuminatus
  • microalgae extract include
  • composition or microalgae extract for use as a QC inhibitor may further contain a solvent.
  • the solvent may for example be selected from:
  • composition or microalgae extract for use as QC inhibitor may further comprise two, three or more than three compounds according to formula (I) or salt thereof
  • composition or microalgae extract for use as a QC inhibitor may also be another therapeutic agent
  • Acetylcholinesterase inhibitors e.g., Aricept®, Exelon®
  • NMDA receptor antagonists eg, memantine
  • neuroprotectors eg, anti-Parkinson's drugs, antidepressants, anxiolytic drugs, antipsychotic drugs, drugs for multiple sclerosis
  • ACE inhibitors eg, Enap, Enalapril, Capoten, Renitec, Prestarium (Berlipril , Diroton, Capoten, Quadropril, Monopril, Renitec, Prestarium, Noliprel-Forte, Enap-N
  • Diuretics eg Furosemide,
  • Inhibitors of aggregation eg (acetylsalicylic acid, CardiASK, Cardiomagnyl, Thrombo ASS), antihypoxemic, anticoagulant (eg thrombomodulin, warfarin), cytostatics and antibiotics is selected.
  • composition or microalgae extract for use as a QC inhibitor may also contain a carrier,
  • a pharmacologically inert, inorganic or organic excipient substance e.g. mannitol
  • Lactose sucrose, glucose, gelatin, malt, silica gel, starch or derivatives thereof, talc, stearic acid or theirs
  • composition or the microalgae extract for use as QC inhibitor also additives to
  • Flavorings, salts for changing the osmotic pressure, buffers, coating additives and antioxidants Flavorings, salts for changing the osmotic pressure, buffers, coating additives and antioxidants.
  • the invention also relates to a process for the preparation of a compound of formula (I) according to the
  • any microalgae which produces compounds of the formula (I) as a secondary metabolite or secondary metabolites, or a mixture of such microalgae for example, a microalgae of Phyla Bacillariophyta, Chlorophyta, Ochrophyta and cyanobacteria, and preferably the species: Scenedesmus sp. , z. B.
  • Synechocystis sp. Spirulina sp., E.g. Spirulina maxima and Spirulina platensis; Prochlorococcus sp., Synechococcus sp., Trichodesmium erythraeum, Arthrospira platensis, Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme, Microcystis aeruginosa,
  • Nannochloropsis sp. E.g. Nannochloropsis oculata, Porphyridium sp., E.g. Porphyridium cruentum and Porphyridium purpureum
  • Chilomonas paramecium Bumilleriopsis filiformes, Emiliana huxleyi, Chlorella sp. , z. Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana, Chlorella variegate, Chlorella kessleri, Chlorella minutissima and
  • Muriella zofingiensis Chloroidium saccharophilum
  • step (a) The cultivation of the microalgae (s) according to step (a) can be carried out under known conditions, for example in one Photobioreactor, pH 5-8 (preferably pH 7), and a
  • Medium suitable for the cultivation of the microalgae are known media, such as, for example, Setlik medium (KNO3 (2020.00 mg / l), H2PO4 (340.00 mg / l), MgSO 4 .7H 2 O (990.00 mg / l)).
  • Setlik medium KNO3 (2020.00 mg / l)
  • H2PO4 340.00 mg / l
  • MgSO 4 .7H 2 O 990.00 mg / l
  • Recovery of the algal biomass in step (b) may be accomplished by any one of numerous known physical or chemical methods for separating biomass from a
  • Culture medium for example, be obtained by centrifuging off the medium for cultivation and / or lyophilization.
  • the digestion of the algal cells in step (b) may be conveniently carried out using one of the
  • Seaweed biomass sea sand 1: 2) and solvent (e.g., water).
  • solvent e.g., water
  • Temperature e.g. Room temperature, done.
  • Methanol according to step (c) is preferably a solid-liquid extraction is applied, wherein the extraction is carried out with stirring and each 100 ml of methanol / l g of the
  • the separation the liquid methanol extract phase from the biomass may be by centrifugation, eg 1000-5000 rpm, preferably 1500-3000 rpm, more preferably 2000-2500 rpm, and especially at about 2000 rpm.
  • the biomass can be extracted three times each with methanol.
  • the liquid methanol extract phases of the extractions of the biomass can be combined.
  • the combined liquid methanol extract phases can be concentrated to dryness in vacuo, for example using a vacuum rotary evaporator.
  • step (d1) The isolation of a compound of formula (I) from the extraction product obtained in step (d) in step (d1) can be carried out by one of the numerous known physical or chemical processes for the isolation of compounds from an extract, for example
  • Sorbents known, for example, an aminopropyl-modified silica gel phase can be used.
  • Solvents for elution can be known in the SPE
  • suitable solvents such as, for example, methanol, ethanol, isopropanol, water, chloroform,
  • the product of the SPE can be further purified, for example by means of
  • the product of SPE can be prepared according to the method of Folch et al. (J. Biol. Chem., 226, 497-509 (1957)).
  • the invention also provides a process for the production of an extract from a microalgae, which has a
  • Extraction product can be prepared using a known
  • a solid phase extraction can be carried out.
  • Numerous sorbents are known for solid phase extraction, for example, an octadecyl-modified silica gel phase can be used.
  • suitable solvents known in solid phase extraction may be used, preferably methanol.
  • Figure 1 Schematic representation of the method according to the invention for the preparation of a compound of formula (I) having QC-inhibiting activity or for producing an extract from a microalgae containing at least one compound of formula (I) with QC-inhibiting activity.
  • Figure 2 QC-inhibiting effect of compositions of the invention.
  • FIG. 3 Base-peak chromatogram and MS 1 mass spectrum of the compounds of the formula (I) according to the invention with QC-inhibiting action.
  • the MS 1 mass spectrum shows a molecular ion [MH] ⁇ at m / z 555 for the retention time of 6.9 min, which can be assigned to a SQMG.
  • the peak at the retention time of 9.9 - 10 min shows in the MS 1 mass spectrum the molecular ions [MH] - at m / z 794 and 815. It is thus the peak the SQDG.
  • the main compounds are thus the sulfolipids 1,2-di-O-palmitoyl -3-0- (6 '-deoxy-6' -sulfo-D-glycopyranosyl) with [MH] ⁇ at m / z 793 and l-0- palmitoyl-2-0-linolenyl-3-0- (6 '-deoxy-6' -sulfo-D-glycopyranosyl) included with [MH] "at m / z 815th Furthermore, it could as by connecting the SQMG 1-0- palmitoyl -3-0 (6 * -sulpho -quinovopyranosyl) -glycerol
  • the reactor system has a flow cell in which both a
  • Temperature and pH probe and a probe for measuring the optical density (OD) and a p02 probe were integrated. An inline measurement of the following parameters was carried out: temperature, pH value, OD and pump speed. These were recorded using the MFSC win software over the entire cultivation period. Cultures in the 100 L PBR were also carried out at a temperature of 28 ° C +/- 3 ° C. It was with a light intensity of 60 ⁇ 1 / ⁇ 2 * 3 at OD ⁇ 20 and a Light intensity of 150 ⁇ 1 / ⁇ 2 * 3 of the light module at OD> 20 cultivated. The cultivation was carried out in a modified fed-batch process.
  • the nutrient salts were dissolved in 1 L of distilled water and autoclaved at 121 ° C for 20 min.
  • the lyophilized algal biomasses of the exponential and stationary growth phases of each microalgae studied were digested with sea-sand in a 1: 2 ratio with mortar and pestle using solvent.
  • Solvent methanol extracted The extraction was carried out in three steps with 100 mL each of Lsm. / 1 g BM with stirring on the magnetic stirrer at RT for 1 h. The separation of the liquid extract phase from the biomass was carried out by means of
  • chlorophyllf fluat was collected in glass test tubes.
  • Chromabond® C18ec cartridge 500 mg / 3 mL or 1000 mg / 6 mL, Macherey & Nagel. Elution was carried out with 100% MeOH.
  • known detection methods of QC catalysis can be used.
  • the assay was performed in 96-well transparent microtiter plates (NUNC, Costar Corning Incorporated, Acton, MA, USA) as a triplicate. The measurements showed a total volume of 250 pL per well. These consisted of 100 ⁇ , 0.25 mM substrate, 50 pL 0.2 mg / mL sample and 25 pL auxiliary enzymes pGAP together. Since QC activity is pH dependent, 50 ⁇ l Tris buffer (0.1 M, pH 8) was added to each assay. The start of the reaction was carried out after 10 minutes incubation at 30 ° C by the addition of 25 pL QC. The measurements or the
  • Period of 12 min ( ⁇ 27 cycles) at a temperature of 30 ° C on a FluoStar Multiplate Reader from BMG Labtech measured.
  • Microalgae extracts the activity of QC specific and concentration dependent.
  • microalgae extracts according to the invention were analyzed by mass spectrometry.
  • the mass spectrometric analyzes were carried out using an API-150EX mass spectrometer with a "Turbo Ion Spray” ion source from Applied Biosystems.
  • the sample injection (10 ⁇ ) was carried out via direct inlet into a continuous flow of a MeOH / H 2 O mixture (6: 4; v) at a flow rate of 400 pL / min.
  • microalgae extracts according to the invention were purified by means of UPLC-ESI ion trap MS n on a Waters Acquity UPLC system using an RP18 column (Acquity UPLC HSS T3 1.8 ⁇ , 1x100mm, Waters) examined.
  • the samples were analyzed by negative ionization using electrospray ionization (ESI) at a spray voltage of 4 kV, a capillary temperature of 275 ° C and a capillary voltage of 27V using nitrogen as a shielding gas (flow rate 35-40 arb. Units).
  • ESI electrospray ionization
  • the mass spectrometric analyzes of the extracts investigated showed that the compounds of the formula (I) are responsible for the QC-inhibiting action.
  • the mass spectrometry-identified compounds it was the SQDG 's 1,2-di-O-palmitoyl -3-0- (6' -deoxy-6 '- sulfo-D-glycopyranosyl with [MH] ⁇ at m / z 793, 1-O-palmitoyl 2-0-linolenyl-3-0- (6 '-deoxy-6' -sulfo-D-glycopyranosyl with [M- H] - at m / z 815 and lO-linolyl-2 -0- palmitoyl-3- ⁇ - (6 '-deoxy- 6' -sulfo-D-glycopyranosyl with [MH] - at m / z 817 and around the SQMG lO-palmito
  • aminopropyl-modified silica gel cartridges (NH2 cartridge) from Macherey & Nagel (3 mL / 500 mg or 6 mL / 1000 mg) were used.
  • the conditioning of the NH2 cartridges was carried out in several steps using 2 mL MeOH, 2 mL dist. H 2 0, 4 mL 0.1M HCl (for 1h on column), 2 mL dist. H 2 0, 2 mL MeOH, 2 mL DCM / I isopropanol / MeOH (15:30:50 v / v / v).
  • Each sample of NH 2 was sampled with 20 mg of methanolic extract dissolved in DCM / MeOH (1: 1, v / v). When 6 mL / 1000 mg NH2 cartridges were used, the volumes of solvents used and the sample applied were doubled.
  • step 1 the uncharged substance was first eluted with 9 ml DCM / isopropanol / MeOH 15:30:50 (v / v / v).
  • step 2 the compounds according to formula (I) were mixed with 5 mL DCM / ACN / isoprop / MeOH / 0.1M NH 4 Ac (10: 10: 10: 50: 15; v / v / v / v / / v v v). eluted; Fraction 2.
  • the lipophilic phase with the compounds of formula (I) was removed with a Pasteur pipette, transferred to a round bottom flask and concentrated to dryness by means of a vacuum rotary evaporator.
  • the yields of the compounds of the formula (I) varied depending on the biomass used (algae species and growth phase) between 3 - 26%. For example, from 25 mg of the methanolic extract from Scenedesmus acuminatus (stationary phase) compounds according to formula (I) could be obtained with a yield of 26%, ie, it could be isolated 6.5 mg. Identification of the compounds obtained
  • the isolated compounds were analyzed by mass spectrometry.
  • the isolated compounds are compounds according to formula (I), namely the SQDG- sulfolipids 1,2-di-O-palmitoyl -3-0- (6 '-deoxy-6' -sulfo-D-glycopyranosyl ) with [MH] - for m / z 793 and lO-palmitoyl-2- ⁇ -linolenyl-3- ⁇ - (6'-deoxy-6'-sulfo-D-glycopyranosyl) with [MH] - at m / z 815, as well as the SQMG sulfolipid 10-palmitoyl-3-0 (6 "-sulpho-a-quinovopyranosyl) -glycerol with [MH] " at m / z 555.

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Abstract

Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung der Formel (I) oder einer die Verbindung enthaltenden Zusammensetzung als Glutaminylcyclase (QC) -Inhibitor sowie Herstellungsverfahren.

Description

SULFOLIPIDE ALS NEUE GLUTAMI NYLCYCLASE-INHIBITOREN
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung oder einer die Verbindung enthaltenden Zusammensetzung als
Glutaminylcyclase (QC) -Inhibitor sowie Herstellungsverfahren.
Stand der Technik
Die Glutaminylcyclasen (QCs) (EC 2.3.2.5) gehören zur Klasse der Acyltransferasen (EC 2.3.2). QC katalysiert die
intramolekulare Zyklisierung N-terminaler L-Glutaminreste von Peptiden und Proteinen zu Pyroglutaminsäure (pGlu) unter
Freisetzung von Ammoniak und die intramolekulare Zyklisierung von N-terminalem Glutamat zu Pyroglutaminsäure unter
Freisetzung von Wasser. QC ist an einer Vielzahl von
physiologischen Prozessen beteiligt und es konnte gezeigt werden, dass QC pathophysiologisch bei verschiedenen
Krankheiten involviert ist. Entsprechend stellt QC ein
pharmakologisch interessantes Target dar, da die Hemmung von QC als vielversprechende Möglichkeit zur Behandlung dieser QC- assoziierten Erkrankungen/Zustände angesehen wird.
Es sind bereits verschiedene QC-Inhibitoren bekannt.
Beispielsweise wurden Thioharnstoff-Derivate und Imidazol- Propyl-Thioamide von Buchholz et al. (J Med Chem (52), 7069- 7080; 2006) als effektive QC-Inhibitoren identifiziert.
Weitere QC-Inhibitoren sind beispielsweise in WO 2010/026212, WO 2011/029920; WO 2011/101433; WO 2011/107530; und WO 2011/110613 beschrieben. QC-Inhibitoren aus natürlichen
Quellen sind bisher nicht bekannt.
Sulfolipide sind als biologisch aktive Naturstoffe bekannt. Die bisher für Sulfolipide beschriebenen Bioaktivitäten umfassen: immunosuppressive Wirkungen, antivirale Wirkungen (z.B. gegen HIV), antineoplastische Wirkungen, eine
inhibierende Wirkung der enzymatischen Aktivitäten der DNA- Polymerasen pol α und pol ß, der α-Glucosidase und der
Caspase, anti-inflammatorische Aktivitäten (z.B. eine Wirkung bei entzündlichen Hauterkrankungen oder Erkrankungen wie insbesondere Psoriasis) und anti-proliferative Wirkungen auf verschiedene humane Krebszelllinien, eine prophylaktische Wirkung gegen eine Mykobakterium tuberculosum-Infektion, und eine antiprotozale Aktivität.
Ein häufiges Problem von Inhibitoren sind ihre Nebenwirkungen, wie beispielsweise Zytotoxizität. Auch das zunehmende
Auftreten von Unverträglichkeiten gegenüber bestimmten
Wirkstoffen oder Molekülbestandteilen stellt ein großes
Problem dar. Entsprechend besteht ein großes Bedürfnis für Inhibitoren ohne zytotoxische Wirkung.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Bereitstellung neuer QC-Inhibitoren, die aus natürlichen Quellen stammen, keine zytotoxischen Wirkungen besitzen und in der Regel gut verträglich sind.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Verwendung einer Verbindung oder einer die Verbindung enthaltenden Zusammensetzung als
Glutaminylcyclase (QC ) -Inhibitor sowie Herstellungsverfahren. Hierzu stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel ( I ) :
oder ein Salz derselben, zur Verwendung als Glutaminylcyclase (QC) -Inhibitor bereit, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci-C26alkyl oder -C(=0)C2- C26alkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci-Czealkyl oder -C(=0)C2- C26alkenyl ist.
Der Ausdruck "Ci-C26alkyl " , wie er hierin verwendet wird, steht für eine Alkylgruppe und bezeichnet eine gesättigte,
geradkettige oder verzweigte, optional substituierte,
Kohlenwasserstoffgruppe, die 1 bis 26 Kohlenstoffatome
aufweist. Repräsentative "Ci-C26alkyl " Reste sind, z.B. die Methyl-, Ethyl-, Propyl-, Butyl-, Pentyl- (oder Valeryl-) , Hexyl- (oder Capron-) , Heptyl- (oder Önanthyl-) , Octyl- (oder Capryl-) , Nonyl- (oder Pelargonyl-) , Decyl- (oder Caprin-), Undecyl-; Dodecyl- (oder Lauryl-) , Tridecyl-, Tetradecyl- (oder Myristyl-) , Pentadecyl-, Hexadecyl- (oder Cetyl-) , Heptadecyl-, Octadecyl- (oder Stearyl-) ; Nonadecyl-, Eicosyl-, Heneicosyl-, Doeicosyl-, Tricosyl-, Tetracosyl-, Pentacosyl-, Hexacosyl-, Isopropyl-, sec-Butyl-, Isobutyl-, tert-Butyl-, Isopentyl-, 2- Methylbutyl- und die 2- Methylhexyl-Gruppe .
Der Ausdruck "-C2-C26alkenyl" , wie er hierin verwendet wird, steht für eine Alkenylgruppe und bezeichnet eine zumindest teilweise ungesättigte, geradkettige oder verzweigte, optional substituierte Kohlenwasserstoffgruppe , die 2 bis 26
Kohlenstoffatome aufweist. Repräsentative "-C2-C26alkenyl" Reste sind, z.B. die Vinyl-, Allyl-, 1-Butenyl, 2-Butenyl-, - Isobutylenyl-, 1-Pentenyl-, 2-Pentenyl-, 3-Methyl-l-butenyl-, 2-Methyl-2-butenyl-, 2 , 3-Dimethyl-2-butenyl-ethenyl-, Hex-2- enyl-, 9-Hexadecenyl- (oder Palmitoleyl- ) , 9-0ctadecenyl- (Oleyl-) , ll-Octadecenyl--, 9 , 12-Octadecadienyl (oder
Linoleyl-), 6, 9 , 12-Octadecatrienyl- (oder Linolenyl-),
5, 8 , 11, 14 -Eicosatetraenyl oder 5 , 8 , 11 , 14 , 17-Eicosapentaenyl . Die Alkenylgruppen enthalten eine oder mehrere
Doppelbindung (en) , vorzugsweise 1, 2, 3, 4 oder 5
Doppelbindung (en) .
Der Ausdruck "optional substituiert", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet Gruppen, in denen ein oder mehrere Wasser- stoffatom(e) durch ein oder mehrere Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatom(e), OH, =0, SH, =S, NH2, =NH, N02, -C(0)R', -0C(0)R', - C(0)0R', -C(0)NH2, -C(0)NHR*, -C ( 0 ) N ( R')2, -NHC(0)R', -S(0)2R', -S(0)R', -N3, -NH(R'), -N(R')2 oder -CN ersetzt ist/sind, vorzugsweise durch ein oder mehrere Fluor-, oder Chloratom ( e ) , OH, C(0)R', -0C(0)R', oder -C(0)0R', stärker bevorzugt durch ein oder mehrere Fluor-, oder Chloratom (e) , oder OH, wobei R' jeweils unabhängig ausgewählt ist aus unsubstituiertem Ci- C3alkyl.
Die Verbindung der Formel (I) kann in Abhängigkeit von ihrer Struktur in stereoisomeren Formen (Enantiomere, Diastereomere) existieren. Die Erfindung umfasst deshalb die Enantiomeren oder Diastereomeren sowie Mischungen derselben. Aus solchen Mischungen von Enantiomeren und/oder Diastereomeren lassen sich die stereoisomer einheitlichen Bestandteile in bekannter Weise, z.B. mittels Säulenchromatographie, isolieren.
Sofern die Verbindung der Formel (I) in tautomerer Form vorkommen kann, umfasst die vorliegende Erfindung sämtl tautomere Formen.
Als Salze sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung
physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung der Formel (I) bevorzugt. Umfasst sind aber auch Salze, die für
physiologische Anwendungen selbst nicht geeignet sind, jedoch beispielsweise als Forschungswerkzeug, in kosmetischen
Anwendungen, oder für die Isolierung oder Reinigung der
Verbindung oder anderer Moleküle verwendet werden können.
Physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung der Formel (I) können Säureadditionssalze von Mineralsäuren, Carbonsäuren und Sulfonsäuren, z.B. Salze der Chlorwasserstoffsäure,
Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure,
Methansulfonsäure, Ethansulfonsäure, Toluolsulfonsäure,
Benzolsulfonsäure, Naphthalindisulfonsäure, Essigsäure,
Trifluoressigsäure, Propionsäure, Milchsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Zitronensäure, Fumarsäure, Maleinsäure und
Benzoesäure sein. Ferner können physiologisch unbedenkliche Salze der Verbindung der Formel (I) auch Salze üblicher Basen umfassen, wie zum Beispiel Alkalimetallsalze (z.B. Natrium- und Kaliumsalze); Erdalkalisalze (z.B. Calcium- und
Magnesiumsalze); und Ammoniumsalze, abgeleitet von Ammoniak oder organischen Aminen mit 1 bis 16 C-Atomen, wie
beispielsweise Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Ethyldiisopropylamin, Monoethanolamin, Diethanolamin,
Triethanolamin, Dicyclohexylamin, Dimethylaminoethanol , Prokain, Dibenzylamin, N- ethylmorpholin, Arginin, Lysin, Ethylendiamin und N- ethylpiperidin .
Bevorzugt ist eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci3-C2oalkyl oder -C(=0)Ci3- C2ialkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C ( =0) Ci3-C2ialkyl oder -C(=0)Ci3- C2ialkenyl ist.
Weiterhin bevorzugt ist eine Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist.
Erfindungsgemäß bevorzugt kann die Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor ausgewählt sein aus der Gruppe: l,2-di-0- palmitoyl -3-0- (β'- deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl, l-0-palmitoyl-2-0-linolenyl- 3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl, l-O-linolyl-2-0- palmitoyl-3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl , 1-0- palmitoyl-3-0 ( 6 ' -sulpho- -quinovopyranosyl ) -glycerol und 1-0- ( 6-Deoxy-6-sulphoglucopyranosyl) -glycerol . Erfindungsgemäß ist auch die Verwendung der Verbindung gemäß der Formel (I) oder einem Salz derselben, als QC-Inhibitor , wobei R1 ein Wasserstoffatom, —C (=0) Ci-C26 lkyl ; oder —C(=0)C2- C26alkenyl ist; und R2 ein Wasserstoffatom, —C (=0) Ci-C26alkyl; oder —C (=0) C2~C26alkenyl ist. Dabei kann bevorzugt eine
Verbindung der Formel (I) oder ein Salz derselben, wobei R1 ein Wasserstoffatom, —C (=0) Ci3-C2oalkyl, oder —C(=0)Ci3- C2ialkenyl; insbesondere ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-,
Eicosatetraenoyl- , oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; und R2 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci3-C2oalkyl, oder -C(=0)Ci3- C2ialkenyl; insbesondere ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-,
Eicosatetraenoyl-, oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; als QC-Inhibitor verwendet werden. Insbesondere kann l,2-di-0- palmitoyl -3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl , 1-0- palmitoyl-2-0-1inoleny1-3-0- ( 6 ' -deoxy-6 '-sulfo-D- glycopyranosyl , l-0-linolyl-2-0-palmitoyl-3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' - sulfo-D-glycopyranosyl , l-O-palmitoyl-3-0 ( 6 * -sulpho-a- quinovopyranosyl ) -glycerol , oder 1-0- ( 6-Deoxy-6-sulphogluco- pyranosyl ) -glycerol als QC-Inhibitor verwendet werden. Die Verwendung kann in vitro oder in vivo erfolgen. Eine
Verwendung in vivo betrifft beispielsweise die Verbindung gemäß der Formel (I) oder einem Salz derselben, zur Verwendung bei der Prophylaxe oder Behandlung einer mit QC-assoziierten Krankheit. Jedoch sind bei der Verwendung in vivo Verfahren zur chirurgischen oder therapeutischen Behandlung des
menschlichen oder tierischen Körpers und
Diagnostizierverfahren, die am menschlichen oder tierischen Körper vorgenommen werden ausgeschlossen. Umfasst ist hingegen die Verwendung der Verbindung gemäß der Formel (I) oder einem Salz derselben, zur Herstellung eines Arzneimittels für eine Anwendung zur Prophylaxe oder Behandlung einer mit QC- assoziierten Krankheit.
Auch eine Zusammensetzung, umfassend eine der vorstehend genannten Verbindungen gemäß der Formel (I) oder ein Salz derselben, zur Verwendung als QC-Inhibitor ist Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Vorzugsweise kann die Zusammensetzung, die eine Verbindung gemäß der Formel (I) oder ein Salz
derselben, umfasst, ein Extrakt aus einer Mikroalge sein. Zur Gewinnung des Extrakts eignen sich beispielsweise Mikroalgen der Spezies: Scenedesmus sp., z. B. Scenedesmus producto- capitatus , Scenedesmus rubescens, Scenedesmus acuminatus
Scenedesmus vacuolatus und Scenedesmus pectinatus sowie
Tetradesmus wisconsinensis; Eustigmatos sp., z. B. Eustigmatos magnus, Cyclotella sp., Odontella sp., Synechocystis s . , Spirulina sp., z.B. Spirulina maxima und Spirulina platensis; Prochlorococcus sp., Synechococcus sp., , Trichodesmium erythraeum , Arthrospira platensis , Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme, Microcystis aeruguinosa, Stephanodiscus sp . , Skeletonema costatum , Phaeodactylum tricornutum , Heterosigma carterae, Nannochloropsis sp., z.B. Nannochloropsis oculata, Porphyridium sp., z.B. Porphyridiu cruentum und Porphyridium purpureum ; Chilomonas paramecium, Bumilleriopsis filiformis, Emiliana huxleyi , Chlorella sp . , z. B. Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana , Chlorella variegate, Chlorella
kessleri , Chlorella minutissima und Muriella zofingiensis;
Chloroidium saccharophilum, Parietochloris incisa , Prototheca portoricensis , Dictyochloris fragrans , Chlamydomonas
reinhardtii, Dunaliella parva, Tetraselmis chuii und Deasonia sp. z.B. Deasonia punctata und Deasonia granata ; und besonders bevorzugte Beispiele für den Mikroalgen-Extrakt umfassen
Extrakte, die aus einer Spezies, welche ausgewählt ist aus Scenedesmus acuminatus , Scenedesmus pectinatus, Chlorella vulgaris und Spirulina platensis , gewonnen werden können.
Die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Extrakt zur Verwendung als QC-Inhibitor kann ferner ein Lösungsmittel enthalten. Das Lösungsmittel kann beispielsweise ausgewählt sein aus:
Methanol, Ethanol, Isopropanol, Wasser, Chloroform,
Ethylacetat, Dichlormethan, Aceton, Diethylether , Hexan, und Mischungen derselben; vorzugsweise Methanol.
Die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Ext kt zur Verwendung als QC-Inhibitor kann ferner zwei, drei ode mehr als drei Verbindungen gemäß der Formel (I) oder Salz derselben
umfassen .
Die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Extrakt zur Verwendung als QC-Inhibitor kann auch ein weiteres therapeutisches
Mittel, welches aus der Gruppe, umfassend
Acetylcholinesterasehemmer (z.B. Aricept®, Exelon®
und Reminyl®), NMDA-Rezeptorantagonisten (z.B. Memantin) , Neuroprotektoren, Anti-Parkinson-Arzneimittel, Antidepressiva, anxiolytische Arzneimittel, antipsychotische Arzneimittel, Arzneimittel gegen Multiple Sklerose, ACE-Inhibitoren (z.B. Enap, Enalapril, Capoten, Renitec, Prestarium (Berlipril, Diroton, Capoten, Quadropril, Monopril, Renitec, Prestarium, Noliprel-Forte , Enap-N) , Diuretika (z.B. Furosemid,
Veroshpiron, Hypothiazid, Arifon Retard, Indapamid,
Hypothiazid, Diuver, Indap, Indapamid) , ß-Rezeptorblocker , Nitrate, Herzglykoside , Calciumantagonisten (z.B. (Normodipin, Cordäflex, Amlovas, Amlodipin, Amlovas, Amlotop, Cardilopin, Corda lex, Lipidsenker (z.B. (Vasilip, Liprimar, Liptonorm, Simvahexal, Simvastol, Simvacard, Simgal, Tulip) ,
Aggregationshemmer (z.B. (Acetylsalicylsäure, CardiASK, Cardiomagnyl , Thrombo ASS), Antihypoxämika, Gerinnungshemmer (z.B. Thrombomodulin, Warfarin) , Cytostatika und Antibiotika ausgewählt ist.
Die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Extrakt zur Verwendung als QC-Inhibitor kann auch einen Träger enthalten,
vorzugsweise eine pharmakologisch inerte, anorganische oder organische Arzneimittelträgersubstanz, wie z.B. Mannit,
Lactose, Sucrose, Glucose, Gelatine, Malz, Silicagel, Stärke oder Derivaten derselben, Talkum, Stearinsäure oder ihre
Salze, Trockenmagermilch, pflanzliche Öle, Petroleum,
tierische oder synthetische Öle, Wachse, Fette, Polyole.
Ferner kann die Zusammensetzung bzw. der Mikroalgen-Extrakt zur Verwendung als QC-Inhibitor auch Zusatzstoffe zur
Konservierung, Stabilisierung, Emulgatoren, Süßstoffe,
Aromastoffe, Salze zur Veränderung des osmotischen Drucks, Puffer, Umhüllungszusatzstoffe und Antioxidantien enthalten.
Darüber hinaus betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) gemäß den
vorstehenden Ausführungen, oder eines Salzes derselben, umfassend:
(a) Kultivierung von mindestens einer Mikroalge;
(b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der
Algenzellen;
(c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) mit Methanol, umfassend die Suspension der
aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen
Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
(dl) Isolierung einer Verbindung der Formel (I), oder eines Salzes derselben, aus dem in Schritt (c) gewonnenen
Extraktionsprodukt . In dem Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) kann als Mikroalge jede Mikroalge, die Verbindungen der Formel (I) als Sekundärmetabolit oder Sekundärmetaboliten produziert, oder eine Mischung von derartigen Mikroalgen eingesetzt werden, beispielsweise eine Mikroalge der Phyla Bacillariophyta, Chlorophyta, Ochrophyta und Cyanobacteria, und vorzugsweise der Spezies: Scenedesmus sp. , z. B.
Scenedesmus producto-capitatus , Scenedesmus rubescens,
Scenedesmus acuminatus Scenedesmus vacuolatus und Scenedesmus pectinatus sowie Tetradesmus wisconsinensis; Eustigmatos sp. , z. B. Eustigmatos magnus, Cyclotella sp . , Odontella sp.,
Synechocystis sp., Spirulina sp., z.B. Spirulina maxima und Spirulina platensis; Prochlorococcus sp., Synechococcus sp., , Trichodesmium erythraeum, Arthrospira platensis , Scytonema hofmanni, Nostoc punctiforme, Microcystis aeruguinosa,
Stephanodiscus sp., Skeletonema costatum, Phaeodactylum tricornutum, Heterosigma carterae, Nannochloropsis sp., z.B. Nannochloropsis oculata, Porphyridium sp., z.B. Porphyridium cruentum und Porphyridium purpureum; Chilomonas paramecium , Bumilleriopsis filiformes, Emiliana huxleyi, Chlorella sp . , z. B. Chlorella vulgaris, Chlorella sorokiniana, Chlorella variegate, Chlorella kessleri, Chlorella minutissima und
Muriella zofingiensis; Chloroidium saccharophilum ,
Parietochloris incisa, Prototheca portoricensis , Dictyochloris fragrans , Chlamydomonas reinhardtii , Dunaliella parva,
Tetraselmis chuii und Deasonia sp. z.B. Deasonia punctata und Deasonia granata ; und besonders bevorzugt Scenedesmus
acuminatus , Scenedesmus pectinatus, Chlorella vulgaris und Spirulina platensis .
Die Kultivierung der Mikroalge (n) gemäß Schritt (a) kann unter bekannten Bedingungen erfolgen, beispielsweise in einem Photobioreaktor, pH 5-8 (vorzugsweise pH 7), und einer
Temperatur von 10-45°C, vorzugsweise 20-40 °C, stärker
bevorzugt 23-35°C, und besonders bevorzugt 25-31 °C. Als
Medium für die Kultivierung der Mikroalge eignen sich bekannte Medien, wie beispielsweise Setlik-Medium (KNO3 (2020,00 mg/L) , H2PO4 (340,00 mg/L), MgS04 * 7 H20 (990,00 mg/L), Fe-EDTA (18,50 mg/L), Ca(N03)2 * 4 H20 (10, 00 mg/L), H3BO3 (3,09 mg/L), MnS04 * 4 H20 (1,20 mg/L), CoS04 (1,40 mg/L), CuS04 * 5 H20 (1,24 mg/L), ZnS04 (1, 43 mg/L), (ΝΗ )6Μο7θ24 * 4 H20 (1,84 mg/L) ) .
Die Gewinnung der Algenbiomasse in Schritt (b) kann durch eines der zahlreichen bekannten physikalischen oder chemischen Verfahren für die Abtrennung von Biomasse aus einem
Kulturmedium erfolgen, beispielsweise durch Abzentrifugieren des Mediums für die Kultivierung und/oder Lyophilisierung gewonnen werden. Der Aufschluss der Algenzellen in Schritt (b) kann in geeigneter Weise unter Verwendung eines der
zahlreichen bekannten physikalischen oder chemischen Verfahren für den Zellaufschluss von Mikroorganismen erfolgen, wie sie z.B. in Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 2003, Band 5, Biochemical Separations, Tabelle 3 beschrieben sind. Eine Möglichkeit ist beispielsweise Zermahlen, z.B. mit Mörser und Pistill unter Verwendung von Seesand (Verhältnis
Algenbiomasse : Seesand 1:2) und Lösungsmittel (z.B. Wasser). Der Zellaufschluss kann bei einer beliebigen geeigneten
Temperatur, z.B. Raumtemperatur, erfolgen.
Für die Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen mit
Methanol gemäß Schritt (c) wird vorzugsweise eine Fest- Flüssig-Extraktion angewendet, wobei die Extraktion unter Rühren erfolgt und jeweils 100 mL Methanol / l g der
aufgeschlossenen Algenzellen eingesetzt werden. Die Abtrennung der flüssigen Methanol-Extraktphase von der Biomasse kann mittels Zentrifugation, z.B. 1000-5000 rpm, vorzugsweise 1500- 3000 rpm, stärker bevorzugt 2000-2500 rpm, und insbesondere bei etwa 2000 rpm, erfolgen. Vorzugsweise kann die Biomasse jeweils drei Mal mit Methanol extrahiert werden. Die flüssigen Methanol-Extraktphasen der Extraktionen der Biomasse können vereinigt werden. Die vereinigten flüssigen Methanol- Extraktphasen können im Vakuum zur Trockne eingeengt werden, z.B. mit Hilfe eines Vakuum-Rotationsverdampfer.
Die Isolierung einer Verbindung der Formel (I) aus dem in Schritt (c) gewonnenen Extraktionsprodukt gemäß Schritt (dl) kann durch eines der zahlreichen bekannten physikalischen oder chemischen Verfahren für die Isolierung von Verbindungen aus einem Extrakt erfolgen, beispielsweise durch
Festphasenextraktion (SPE) . Für die SPE sind zahlreiche
Sorbentien bekannt, beispielsweise kann eine Aminopropyl- modifizierte Kieselgelphase eingesetzt werden. Als
Lösungsmittel zur Elution können bei der SPE bekannte
geeignete Lösungsmittel verwendet werden, wie beispielsweise Methanol, Ethanol, Isopropanol, Wasser, Chloroform,
Ethylacetat, Dichlormethan, Aceton, Diethylether, Hexan, und Mischungen derselben; vorzugsweise Methanol. Zur Entfernung von nicht-Lipid-Verunreinigungen kann das Produkt der SPE weiter gereinigt werden, beispielsweise mittels
Chromatographie oder anderer bekannter Reinigungsverfahren; vorzugsweise kann das Produkt der SPE gemäß dem Verfahren von Folch et al. (J. Biol. Chem. , 226, 497-509 (1957)) weiter gereinigt werden.
Gegenstand der Erfindung ist ferner auch ein Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus einer Mikroalge, der eine
Verbindung der Formel (I) gemäß den vorstehenden Ausführungen, oder eines Salzes derselben, enthält, wobei das Verfahren umfasst :
(a) Kultivierung der Mikroalge;
(b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der
Algenzellen;
(c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt
(b) mit Methanol, umfassend die Suspension der
aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen
Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
(d2) Entfernung von Chlorophyll aus dem in Schritt (c) gewonnenen Extraktionsprodukt .
Die Schritte (a) , (b) und (c) des Verfahrens zur Herstellung eines Extrakts aus einer Mikroalge können dabei analog zu den Schritten (a) , (b) und (c) des vorstehend beschriebenen
Verfahrens zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) ausgeführt werden.
Die Entfernung von Chlorophyll aus dem gewonnenen
Extraktionsprodukt kann unter Verwendung eines bekannten
Verfahrens erfolgen, beispielsweise durch
Ionenaustauschchromatograpie , z.B. unter Verwendung
kommerziell erhältlicher Säulen zum Austausch von Kationen. Als Lösungsmittel für die Ionenaustauschchromatographie können bekannte geeignete Lösungsmittel eingesetzt werden,
beispielsweise Methanol. Zur weiteren Reinigung des Extrakts kann eine Festphasenextraktion durchgeführt werden. Für die Festphasenextraktion sind zahlreiche Sorbentien bekannt, beispielsweise kann eine Octadecyl-modifizierte Kieselgelphase eingesetzt werden. Als Lösungsmittel zur Elution können bei der Festphasenextraktion bekannte geeignete Lösungsmittel verwendet werden, vorzugsweise Methanol. Kurze Beschreibung der Abbildungen
Abbildung 1: Schematische Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung einer Verbindung der Formel (I) mit QC-inhibierender Wirkung bzw. zur Herstellung eines Extrakts aus einer Mikroalge, der mindestens eine Verbindung der Formel (I) mit QC-inhibierender Wirkung enthält.
Abbildung- 2: QC-inhibierende Wirkung von erfindungsgemäßen Zusammensetzungen. Konzentration-Wirkungsdiagramm für die Aktivität von Extrakten aus Eustig atos magnus, Tetradesmus wisconsinensisf Scenedesmus pectinatus, Scenedesmus
acuminatus, Scenedesmus rubescens, und Scenedesmus producto- capitatus . Wie der Abb. 2 zu entnehmen ist, inhibieren die Extrakte, welche aus Mikroalgen in der exponentiellen
Wachstumsphase gewonnen wurden, QC stärker als die Extrakte, welche aus Mikroalgen in der der stationären Wachstumsphase gewonnen wurden. Ferner ist aus Abb. 2 ersichtlich, dass die QC-Hemmung spezifisch und konzentrationsabhängig erfolgt.
Abbildung 3: Base-Peak Chromatogram und MS1Massenspektrum der mit dem erfindungsgemäßen Verfahren isolierten Verbindungen gemäß der Formel (I) mit QC-inhibierender Wirkung. Diese
Verbindungen sind auch in den er indungsgemäßen
Zusammensetzungen bzw. Mikroalgen-Extrakten enthalten.
Das MS1 Massenspektrum zeigt hierbei für die Retentionszeit von 6,9 min ein Molekülion [M-H]~ bei m/z 555, welches einem SQMG zugeordnet werden kann. Der Peak bei der Retentionszeit von 9,9 - 10 min zeigt im MS1 Massenspektrum die Molekülionen [M-H ] - bei m/z 794 und 815. Es handelt sich somit um den Peak der SQDG. Als Hauptverbindungen sind somit die Sulfolipide 1,2-di-O- palmitoyl -3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl ) mit [M-H] ~ bei m/z 793 sowie l-0-palmitoyl-2-0-linolenyl-3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl ) mit [M-H]" bei m/z 815 enthalten. Weiterhin konnte als Nebenverbindung das SQMG 1-0- palmitoyl-3-0 ( 6 * -sulpho- -quinovopyranosyl ) -glycerol
detektiert werden.
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung anhand von
Beispielen erläutert.
Beispiele
Gewinnung der AIgenbiomasse
Mikroalgen der Spezies Eustigmatos magnus, Tetradesmus wisconsinensis, Scenedesmus pectinatus, Scenedesmus
acuminatus, Scenedesmus rubescens, und Scenedesmus producto- capitatus wurden zur Gewinnung von hinreichend Biomasse in einem tubulären Photobioreaktor PBR 100 GS/PL der Firma IGV GmbH mit einem Reaktorvolumen von 100 L kultiviert. Die
Steuerung der Pumpendrehzahl, der Temperatur sowie des pH- Wertes erfolgte mittels einer Biostat Steuereinheit der Firma Braun, wobei folgende Parameter: Temperatur 28°C+/-3°C; pH=7, Pumpendrehzahl 1750 rpm gesetzt wurden. Das Reaktorsystem besitzt eine Durchflusszelle, in welcher sowohl eine
Temperatur- und pH-Sonde als auch eine Sonde zur Messung der optischen Dichte (OD) und eine p02-Sonde integriert waren. Es erfolgte eine inline Messung folgender Parameter: Temperatur, pH-Wert, OD und Pumpendrehzahl. Diese wurden mittels der Software MFSC win über den gesamten Kultivierungszeitraum aufgezeichnet. Die Kultivierungen im 100 L PBR erfolgten ebenfalls bei einer Temperatur von 28°C+/- 3°C. Es wurde mit einer Lichtintensität von 60 μπιο1/ιτι2*3 bei OD < 20 und einer Lichtintensität von 150 μπιο1/Γη2*3 des Lichtmoduls bei OD > 20 kultiviert. Die Kultivierung wurde im modifizierten fed-batch Verfahren durchgeführt.
Für die Kultivierung der Mikroalgen wurde Setlik-Medium (Tab. 1) verwendet.
Tab. 1: Zusammensetzung des Setlik-Mediums
Nährsalz Eingesetzte Menge [mg/L]
KN03 2020, 00
KH2PO4 340, 00
MgS0 * 7 H20 990, 00
Fe-EDTA 18,50
Ca(N03)2 * 4 H20 10, 00
H3BO3 3,09
MnS04 * 4 H20 1,20
C0SO4 1,40
CuS04 * 5 H20 1,24
ZnS04 1,43
(NH4 ) 6M07O24 * 4 H20 1,84
Die Nährsalze wurden in 1 L destilliertem Wasser gelöst und 20 min bei 121°C autoklaviert .
Untersucht wurden die Biomassen der exponentiellen und stationären Wachstumsphase der genannten Mikroalgen.
Extraktion der Algenbiomasse — Methanol-Extrakt
Die lyophilisierten Algenbiomassen der exponentiellen und stationären Wachstumsphase jeder untersuchten Mikroalge wurde mit Seesand im Verhältnis 1:2 mit Mörser und Pistill unter Verwendung von Lösungsmittel aufgeschlossen. Der
Zellaufschluss erfolgte 10 min bei RT. Zur Extraktion wurde eine einstufige Extraktionsmethode auf Basis einer Fest-Flüssig-Extraktion angewendet. Hierbei wurden jeweils 10 g Algenbiomasse nach Zellaufschluss mit dem
Lösungsmittel Methanol extrahiert. In drei Schritten erfolgte die Extraktion mit jeweils 100 mL Lsm. / 1 g BM unter Rühren auf dem Magnetrührer bei RT für 1 h. Die Abtrennung der flüssigen Extraktphase von der Biomasse erfolgte mittels
Zentrifugation bei 2000 rpm und RT, so dass die Biomasse im 2. und 3. Extraktionsschritt analog extrahiert werden konnte. Die Extrakte aus den drei Extraktionsschritten wurden vereint und mittels Vakuum-Rotationsverdampfer der Firma Büchi bis zur absoluten Trockne eingeengt.
Chlorophyll Eliminierung
Die Eliminierung des Farbstoffes Chlorophyll erfolgte unter der Verwendung von CHROMABOND® SA (SCX) der Firma
Macherey&Nagel aus den Methanol-Extrakten. Die SA-Kartuschen wurden mit 0,5 g a2SC>4 beschichtet und mit 1 VE Dichlormethan / Aceton (3:1, v/v) konditioniert. Anschließend erfolgte jeweils die Aufgabe des Methanol-Extraktes. Das
chlorophyllf eie Fluat wurde in Glasprobengefäßen aufgefangen.
Gewinnung- Mikroalgen-Extrakt mit Verbindung der Formel (I)
Die chlorophyllfreien Extrakte wurden anschließend über
Chromabond® C18ec Kartusche (500 mg/3 mL bzw. 1000 mg/6 mL, Macherey&Nagel) aufgereinigt . Die Elution erfolgte hierbei mit 100 % MeOH.
QC inhibierende Wirkung der Mikroalgen-Extrakte
Die chlorophyll-freien über Chromabond® C18ec Kartuschen aufgereinigten Mikroalgen-Extrakte wurden auf ihre QC- inhibierende Aktivität untersucht. Hierzu können bekannte Nachweisverfahren der QC-Katalyse benutzt werden.
Beispielsweise kann das von Schilling et al. (Anal. Biochem. 303, 49-56 (2002); Biol. Chem. 384, 1583-1592 (2003)) entwickelte kontinuierliche Testverfahren, das auf dem Umsatz des freien Ammoniaks durch die Zyklisierung der N-terminalen Glutaminreste beruht (loc. cit. 2003) und zum anderen das gebildete Pyroglutamatpeptid mit Pyroglutaminylaminopeptidase (pGAP) umsetzt (loc. cit. 2002), siehe Reaktionsschema 1 unten, eingesetzt werden. Bei diesem Verfahren werden durch das Hilfsenzym pGAP fluorogene Gruppen abgespalten, was zu einem Anstieg der Fluoreszenz führt.
Reaktionsschema 1
Die QC-inhibierende Aktivität der erfindungsgemäßen
chlorophyll-freien über Chromabond® C18ec Kartuschen
aufgereinigten Mikroalgen-Extrakte wurde mit dem vorstehenden
Testverfahren von Schilling et al. in zwei Konzentrationen
(2 mg/mL und 0,2 mg/mL) ermittelt. Das Testverfahren wurde in transparenten 96- ell-Mikrotiterplatten (NUNC, Costar Corning Incorporated, Acton, MA, USA) als Dreifachbestimmung durchgeführt. Die Messansätze wiesen ein Gesamtvolumen von 250 pL pro Well auf. Diese setzten sich aus 100 μΐ, 0.25 mM Substrat, 50 pL 0,2 mg/mL Probe und 25 pL Hilfsenzyme pGAP zusammen. Da die QC-Aktivität pH-abhängig ist, wurden jedem Messansatz 50 pL Tris-Puffer (0.1 M; pH 8) zugesetzt. Der Start der Reaktion erfolgte nach 10 minütiger Inkubation bei 30 °C durch Zugabe von 25 pL QC . Die Messungen bzw. die
Zunahme des freien AMC wurde kontinuierlich über einen
Zeitraum von 12 min (~27 Zyklen) bei einer Temperatur von 30 °C an einem FluoStar Multiplate Reader der Firma BMG- Labtech gemessen.
Die Ergebnisse der Messung sind in Abb. 2 gezeigt. Wie aus
Abb. 2 ersichtlich, inhibierten die erfindungsgemäßen
Mikroalgen-Extrakte die Aktivität von QC spezifisch und konzentrationsabhängig .
Identifizierung der QC-Inhibitoren in den Mikroalgen-Exträkten
Zur Identifizierung der QC-Inhibitoren wurden die erfindungsgemäßen Mikroalgen-Extrakte massenspektrometrisch analysiert .
Die massenspektrometrischen Analysen erfolgten mittels eines API-150EX Massenspektrometer mit einer „Turbo Ion Spray"- Ionenquelle der Firma Applied Biosystems. Die Probeninjektion (10 μΐι) erfolgte über Direkteinlass in einen kontinuierlichen Fluss eines MeOH/H20-Gemisches (6:4; v/v) bei einer Fließgeschwindigkeit von 400 pL/min.
Weiterhin wurden die erfindungsgemäßen Mikroalgen-Extrakte mittels UPLC-ESI-Ion trap MSn an einer Acquity UPLC-Anlage der Firma Waters unter Verwendung einer RP18-Säule (Acquity UPLC HSS T3 1,8 μπι, 1x100mm, Waters) untersucht. Die Proben wurden mit negativer Ionisierung mittels Elektrospray Ionisation (ESI) bei einer Sprayspannung von 4 kV, einer Kapillartemperatur von 275 °C und einer Kapillarspannung von 27 V unter Verwendung von Stickstoff als Schutzgas (Flussrate 35 - 40 arb. units) analysiert.
Die massenspektrometrischen Analysen der untersuchten Extrakte ergaben, dass die Verbindungen der Formel (I) für die QC- inhibierende Wirkung verantwortlich sind. Bei den massenspektrometrisch identifizierten Verbindungen handelte es sich um die SQDG's 1,2-di-O- palmitoyl -3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' - sulfo-D-glycopyranosyl mit [M-H]~ bei m/z 793, 1-O-palmitoyl- 2-0-linolenyl-3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl mit [M- H]- bei m/z 815 und l-O-linolyl-2-0- palmitoyl-3-Ο- ( 6 ' -deoxy- 6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl mit [M-H]- bei m/z 817 sowie um das SQMG l-O-palmitoyl-3-0 ( 6 * -sulpho- -quinovopyranosyl ) -glycerol mit [M-H ] " bei m/z 555 und 1-0- ( 6-Deoxy-6- sulphoglucopyranosyl ) -glycerol mit [M-H]- bei m/z 317.
Gewinnung- von Verbindungen der Formel (I)
Zur Gewinnung der QC-inhibierenden Verbindungen aus den bei der vorstehend beschriebenen Extraktion aus der Algenbiomasse gewonnenen Methanol-Extrakten wurde eine Festphasenextraktion mit anschließendem "Folch Wash" eingesetzt.
Für die Festphasenextraktion der Methanol-Extrakte wurden Aminopropyl -modifizierte Kieselgel-Kartuschen (NH2-Kartusche ) der Firma Macherey&Nagel (3 mL/500 mg bzw. 6 mL/1000 mg) verwendet. Die Konditionierung der NH2-Kartuschen erfolgte in mehreren Schritten unter der Verwendung von 2 mL MeOH, 2 mL dest. H20, 4 mL 0,1M HCL (für lh auf Säule), 2 mL dest. H20, 2 mL MeOH, 2 mL DCM/ I sopropanol /MeOH (15:30:50 v/v/v). Pro NH2- artusche erfolgte ein Probenauftrag von 20 mg methanolischem Extrakt, gelöst in DCM/MeOH (1:1; v/v). Bei Verwendung von 6 mL/1000 mg NH2-Kartuschen wurden die Volumina der verwendeten Lösungsmittel sowie der aufgetragenen Probe verdoppelt .
Die Elution erfolgte in 2 Schritten. In Schritt 1 wurde zunächst die ungeladene Substanz mit 9 ml DCM/Isopropanol/MeOH 15:30:50 (v/v/v) eluiert. In Schritt 2 wurden die Verbindungen gemäß der Formel (I) mit 5 mL DCM/ACN/Isoprop/MeOH/ 0,1M NH4Ac (10:10:10:50:15; v/v/v/v/v) eluiert; Fraktion 2.
Der Fraktion 2 wurde mittels Vakuum-Rotationsverdampfer das Lösungsmittel entzogen und anschließend unter Zugabe von DCM/MeOH/0,1 NaAc-Puffer pH=4,0 (8:4:3, v/v/v) durch kräftiges, mehrminütiges Schütteln rückgelöst. Nach Inkubation über Nacht bei 4°C reicherten sich die Verbindungen gemäß der Formel (I) in der unteren, lipophilen Phase an. Die lipophile Phase mit den Verbindungen gemäß der Formel (I) wurde mit einer Pasteurpipette abgenommen, in einen Rundkolben überführt und bis zur Trockne mittels Vakuum-Rotationsverdampfer eingeengt .
Die Ausbeuten der Verbindungen gemäß der Formel (I) variierten in Abhängigkeit der verwendeten Biomasse (Algenspezies und Wachstumsphase) zwischen 3 - 26 %. Beispielsweise konnten aus 25 mg des methanolischen Extraktes aus Scenedesmus acuminatus (stationäre Phase) Verbindungen gemäß der Formel (I) mit einer Ausbeute von 26 % gewonnen werden, d.h. es konnten 6,5 mg isoliert werden. Identifizierung der gewonnen Verbindungen
Zur Identifizierung wurden die isolierten Verbindungen massenspektrometrisch analysiert .
Die massenspektrometrischen Untersuchungen der isolierten Verbindungen erfolgten wie bei den erfindungsgemäßen Mikroalgen-Extrakten mittels ESI-API-MS und UPLC-MS im negativen Ionenmodus. Das Base-Peak Chromatogramm sowie das zugehörige MS1-Spektrum ist in Abb . 3 gezeigt mit den für Verbindungen gemäß der Formel (I) charakteristischen Peaks bei 9, 9 - 10,0 min sowie bei 6,9 min.
Bei den isolierten Verbindungen handelt es sich um Verbindungen gemäß der Formel (I), nämlich um die SQDG- Sulfolipide 1,2-di-O- palmitoyl -3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D- glycopyranosyl ) mit [M-H]- bei m/z 793 und l-O-palmitoyl-2-Ο- linolenyl-3-Ο- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl ) mit [M-H]- bei m/z 815, sowie um das SQMG-Sulfolipid l-O-palmitoyl-3- 0 ( 6 " -sulpho-a-quinovopyranosyl ) -glycerol mit [M-H]" bei m/z 555.
QC-inhibierende Wirkung
Um zu bestätigen, dass die aus der Mikroalge Scenedesmus acuminatus isolierten Sulfolipide QC inhibieren, wurden sie in zwei Konzentrationen (0,25 mg/mL und 0,025 mg/mL i.A.) mit dem oben beschriebenen Testverfahren von Schilling et al. untersucht. Dabei wurde gefunden, dass die aus der Mikroalge isolierten Sulfolipide QC mit 81 % (0,25 mg/mL) bzw. 76 % (0,025 mg/mL) inhibieren. Als Positivkontrolle für die QC-inhibierende Wirkung der als aktivitätsrelevant identifizierten Verbindungen gemäß der Formel (I) wurde ein SQDG-Standard der Firma Lipid Products in den Konzentrationen 0,25 mg/mL und 0,025 mg/mL i.A. im Testverfahren von Schilling et al. untersucht. Der SQDG- Standard hemmte die QC um 77 % (0,25 mg/mL) bzw. 76 %
(0,025 mg/mL). Der für den SQDG-Standard ermittelte IC5o-Wert betrug 10,9 μΜ und liegt damit sogar unterhalb des Bereichs
(stärkere Wirksamkeit) der aus US 7,304,086 B2 bekannten QC- Inhibitoren mit ICso-Werten von 0,22 μΜ - 14 μΜ.
Da der SQDG-Standard als Referenzsubstanz für die Verbindungen gemäß der Formel (I) die QC inhibiert, ist damit eindeutig nachgewiesen, dass Verbindungen gemäß der Formel (I) QC- Inhibitoren sind.

Claims

Paten tan sprüche
1. Verwendung einer Verbindung der Formel
, oder eines Salz derselben, als Glutaminylcyclase (QC)- Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci-C26alkyl oder -C(=0)C2-
C26alkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci-C26alkyl oder -C(=0)C2- C26alkenyl ist.
2. Die Verwendung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes derselben nach Anspruch 1, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci3-C2oalkyl oder -C(=0)Ci3- C2ialkenyl ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci3-C2ialkyl oder -C(=0)Ci3- C2ialkenyl ist.
3. Die Verwendung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes derselben nach Anspruch 1 oder 2, wobei R1 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist; und
R2 ein Wasserstoffatom, eine Palmitoyl-, Palmitoleoyl-, Oleoyl-, Linoleoyl-, Linolenoyl-, Eicosatetraenoyl- oder eine Eicosapentaenoylgruppe ist.
4. Die Verwendung der Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes derselben nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe: l,2-di-0- palmitoyl -3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl, l-O-palmitoyl-2-0- linolenyl-3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl, 1-0- linol l-2-0-palmitoyl-3-0- ( 6 ' -deoxy-6 ' -sulfo-D-glycopyranosyl , 1-0-palmito 1-3-0 ( 6 " -sulpho-a-quinovopyranosyl ) -glycerol und 1-0- ( 6-Deoxy-6-sulphoglucopyranosyl ) -glycerol.
5. Verwendung einer Zusammensetzung, umfassend eine
Verbindung der Formel (I) :
oder eines Salz derselben, als QC-Inhibitor, wobei
R1 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci-C26alkyl oder -C(=0)C2- C26alke yl ist; und R2 ein Wasserstoffatom, -C (=0) Ci-C26alkyl oder -C(=0)C2- C2ealkenyl ist.
6. Die Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Zusammensetzung ein Extrakt aus einer Mikroalge ist.
7. Die Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Zusammensetzung ferner ein Lösungsmittel enthält.
8. Die Verwendung der Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus: Methanol, Ethanol,
Isopropanol, Wasser, Chloroform, Ethylacetat, Dichlormethan, Aceton, Diethylether , Hexan und Mischungen derselben.
9. Die Verwendung der Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 5 bis 8, wobei die Zusammensetzung zwei, drei oder mehr als drei Verbindungen gemäß der Formel (I) oder Salze derselben umfasst.
10. Die Verwendung der Zusammensetzung nach einem der
Ansprüche 5 bis 9, wobei die Zusammensetzung ein weiteres therapeutisches Mittel, welches aus der Gruppe, umfassend Acetylcholinesterasehemmer, NMDA-Rezeptorantagonisten,
Neuroprotektoren, Anti-Parkinson-Arzneimittel, Antidepressiva, anxiolytische Arzneimittel, antipsychotische Arzneimittel, Arzneimittel gegen Multiple Sklerose, ACE-Inhibitoren,
Diuretika, ß-Rezeptorblocker, Nitrate, Herzglykoside ,
Calciumantagonisten, Lipidsenker, Aggregationshemmer,
Antihypoxämika , Gerinnungshemmer, Cytostatika und Antibiotika ausgewählt ist.
11. Verfahren zur Herstellung einer in den Ansprüchen 1 bis 4 beschriebenen Verbindung der Formel (I) oder eines Salzes derselben, umfassend:
(a) Kultivierung von mindestens einer Mikroalge;
(b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der
Algenzellen;
(c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) mit Methanol, umfassend die Suspension der
aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen
Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
(dl) Isolierung einer Verbindung der Formel (I), oder eines Salzes derselben, aus dem in Schritt (c) gewonnenen
Extraktionsprodukt .
12. Verfahren zur Herstellung eines Extrakts aus einer
Mikroalge, der mindestens eine in den Ansprüchen 1 bis 4 beschriebene Verbindung der Formel (I) oder ein Salz
derselben, enthält, wobei das Verfahren umfasst:
(a) Kultivierung der Mikroalge;
(b) Gewinnung der Algenbiomasse und Aufschluss der
Algenzellen;
(c) Extraktion der aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) mit Methanol, umfassend die Suspension der
aufgeschlossenen Algenzellen aus Schritt (b) in Methanol, das Rühren der Suspension, und die Abtrennung der flüssigen
Methanol-Extraktphase von der Zellmasse;
(d2) Entfernung von Chlorophyll aus dem in Schritt (c)
gewonnenen Extraktionsprodukt.
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