DE3929694A1

DE3929694A1 - Albocyclin und deren derivate, verfahren zur herstellung und seine verwendung als antiviraler wirkstoff

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Publication number: DE3929694A1
Application number: DE19893929694
Authority: DE
Inventors: Klaus Dr Huetter; Susanne Dr Grabley; Joachim Dr Wink; Matthias Dr Helsberg; Irvin Dr Winkler; Axel Prof Dr Zeeck
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1989-09-07
Filing date: 1989-09-07
Publication date: 1991-03-14

Description

Bergy et al. beschreiben im US Patent 36 51 219 die Herstellung von Ingramycin, auch Albocyclin genannt, durch Fermentation von Streptomyces maizeus. Albocyclin inhibiert das Wachstum von Staphylococcus aureus und wird daher gemäß der US-Patentschrift zur Desinfektion von Lebensmittel- Gebrauchsgegenständen verwendet.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß Albocyclin und dessen neue Derivate als antivirales Agens eingesetzt werden können.

Die Erfindung betrifft somit:

1. Die Verbindung der allgemeinen Formel I in ihren am C₃ möglichen diastereomeren Formen, in der R¹ Wasserstoff und
R² Wasserstoff oder die Gruppen NR′R″ oder SR′ bedeutet, wobei R′ (C₁-C₈)-alkyl, Hydroxy-(C₁-C₈)-alkyl, (C₁-C₈)-alkyl-O-glycosyl oder Wasserstoff ist und R″ (C₁-C₈)-acyl oder Wasserstoff ist.
2. Ein Verfahren zur Herstellung der unter 1. charakterisierten Verbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß Streptomyces spec. DSM 5469 kultiviert wird und die Verbindung der Formel II (Albocyclin) isoliert und derivatisiert wird.
3. Eine Verwendung der unter 1. charakterisierten Verbindung sowie von Albocyclin als antivirales Agens.

Im folgenden wird die Erfindung detailliert beschrieben, insbesondere in ihren bevorzugten Ausführungsformen. Ferner wird die Erfindung in den Ansprüchen definiert.

Streptomyces spec. DSM 5469 wurde am 24. 07. 1989 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) unter der angegebenen Nummer nach den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt.

Zur Fermentation von Albocyclin können anstelle des Stammes DSM 5469 natürlich auch seine Mutanten und Varianten eingesetzt werden, soweit sie Albocyclin synthetisieren. Solche Mutanten können in an sich bekannter Weise durch physikalische Mittel, beispielsweise Bestrahlung, wie mit Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen, oder chemische Mutagene, wie beispielsweise Ethansulfonsäuremethylester (Ethylmethylsulfonat, EMS) oder 2-Hydroxy-4-methoxy benzophenon (MOB), erzeugt werden.

Als bevorzugte Kohlenstoffquellen für die aerobe Fermentation eignen sich assimilierbare Kohlenhydrate und Zuckeralkohole, wie Glukose, Laktose oder D-Mannit sowie kohlenhydrathaltige Naturprodukte, wie Malzextrakt. Als stickstoffhaltige Nährstoffe kommen in Betracht: Aminosäuren, Peptide und Proteine sowie deren Abbauprodukte, wie Peptone oder Tryptone, ferner Fleischextrakte, gemahlene Samen, beispielsweise von Mais, Weizen, Bohnen, Soja oder der Baumwollpflanze, Destillationsrückstände der Alkoholherstellung, Fleischmehle oder Hefeextrakte, aber auch Ammoniumsalze und Nitrate. An anderen anorganischen Salzen kann die Nährlösung beispielsweise Chloride, Carbonate, Sulfate oder Phosphate der Alkali- oder Erdalkalimetalle, Eisen, Zink und Mangan enthalten.

Die Bildung des Albocyclin verläuft besonders gut in einer Nährlösung, die Glycerin und Caseinpepton, enthält. Die Fermentation erfolgt aerob, also beispielsweise submers unter Schütteln oder Rühren in Schüttelkolben oder Fermentern, gegebenenfalls unter Einführen von Luft oder Sauerstoff. Die Fermentation kann in einem Temperaturbereich von etwa 18 bis 35°C, vorzugsweise bei etwa 25 bis 30°C, insbesondere bei 28 bis 30°C erfolgen. Der pH-Bereich sollte zwischen 6 und 8 liegen, vorteilhaft zwischen 6,5 und 7,5. Unter diesen Bedingungen zeigt die Kulturbrühe im allgemeinen nach 1 bis 5 Tagen eine nennenswerte antivirale Wirkung.

Vorteilhaft kultiviert man in mehreren Stufen, d. h. man stellt zunächst eine oder mehrere Vorkulturen in einem flüssigen Nährmedium her, die dann in das eigentliche Produktinsmedium, die Hauptkultur, beispielsweise im Volumenverhältnis 1 : 10, überimpft werden. Die Vorkultur erhält man z. B., indem man ein versportes Mycel in eine Nährlösung überimpft und etwa 48 bis 72 Stunden wachsen läßt. Das versporte Mycel kann erhalten werden, indem man den Stamm etwa 7 Tage auf einem festen oder flüssigen Nährboden, beispielsweise Hefe-Malz-Agar, wachsen läßt.

Der Fermentationsverlauf kann anhand des pH-Wertes der Kultur oder dem Mycelvolumen, durch Dünnschichtchromatographie oder Ausprüfen der biologischen Aktivität überwacht werden. Albocyclin ist sowohl im Mycel als auch im Kulturfiltrat enthalten.

Die Isolierung der genannten Verbindungen aus dem Kulturmedium erfolgt nach bekannten Methoden unter Berücksichtigung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften der Produkte. Zum Testen der Konzentration des antiviralen Agens im Kulturmedium oder in den einzelnen Isolierungsstufen kann die Dünnschichtchromatographie, beispielsweise auf Kieselgel mit n-Butanol/Essigsäure/Wasser als Laufmittel verwendet werden, wobei die Menge der gebildeten antiviralen Substanz zweckmäßig mit einer Eichlösung verglichen wird.

Zur Isolierung der Verbindungen werden Kulturbrühe und Mycel zuerst mit organischen Lösungsmitteln, wie z. B. Chloroform, Essigester usw. extrahiert, um die unpolaren Verunreinigungen zu entfernen. Anschließend wird mit einem polaren Lösungsmittel, beispielsweise niederen Alkanolen oder Gemischen aus Chloroform und Essigester mit einem niederen Alkanol, extrahiert.

Die Reinisolierung erfolgt vorzugsweise an geeigneten Medien, wie z. B. Kieselgel, Aluminiumoxid oder Ionenaustauschern, durch anschließende Elution mit organischen, polaren Lösungsmitteln oder Lösungsmittelgemischen, wie z. B. Essigester, Gemischen aus Essigester und einem niederen Alkanol gegebenenfalls mit Wasser, bzw. einem für Ionenaustauscher geeigneten Salzgradienten, wie beispielsweise Kochsalz oder Tris-HCl und Sammeln der antiviralen Fraktionen.

Die Derivatisierung des Albocyclin erfolgt nach an sich bekannten Methoden durch Reaktion mit einem nucleophilen Agens, wie z. B. Aminen und Mercaptanen, in einem polaren Lösungsmittel. Die angelagerten Substituenten haben die allgemeine Formel NR′R″ oder SR′, in der R′ Alkyl, Hydroxyalkyl, Alkyl-O-glycosyl oder Wasserstoff ist, wobei Alkyl aus 1 bis 8, bevorzugt 1 bis 4 C-Atomen besteht und R″ Wasserstoff oder eine Acylgruppe mit 1 bis 8 C-Atomen, bevorzugt 1 bis 4 C-Atomen bedeutet. Die Glycosylgruppe, die auch acetyliert sein kann, ist bevorzugt ein Hexopyranosylrest, insbesondere Glucose. Acetylierte Glucose kann auch orthoesterartig mit dem Hydroxyalkylrest verknüpft sein.

Besonders bevorzugte Substituenten sind die Gruppen NHCH₂-CH₂O-β-D-Glc, NHCH₂-CH₂OH, NHCH₂-CH₂O-β-D-GlcAc₄, N(Ac)CH₂-CH₂OAc, SCH₃CH₃ oder SCH₂CH₂OH.

Bevorzugt wird die Reaktion in Gegenwart eines basischen Katalysators durchgeführt, beispielsweise Trialkylamin (C₁-C₆) oder Pyridin. Es wird bei ca. 0 bis 70°C, vorzugsweise bei Raumtemperatur inkubiert. Die Inkubationstemperatur wird entsprechend dem Siedepunkt des Lösungsmittels gewählt, d. h. sie kann aus einem Bereich von 0°C bis zu einer Temperatur, die kurz vor dem Siedepunkt des Lösungsmittels liegt, gewählt werden. Die Inkubationszeit liegt zwischen einer Stunde und 1 1/2 Tagen und dauert vorzugsweise ca. 24 Stunden.

Die Aufarbeitung der Derivate erfolgt entsprechend der Aufarbeitung von Albocyclin wie oben beschrieben.

Albocyclin und seine Derivate zeigen antivirale Wirkung, insbesondere gegen Influenza- und Rhino-Viren. Die Albocyclin-Derivate zeichnen sich durch eine geringere Toxizität und zum Teil durch bessere Wasserlöslichkeit aus als das Albocyclin.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weitergehend erläutern.

Beispiele 1. Fermentation des Produzentenstammes DSM 5469 a) Herstellung einer Sporensuspension des Produzentenstamms

100 ml Nährlösung (4 g Hefeextrakt, 10 g Malzextrakt, 4 g Glucose, 1 l Leitungswasser, pH-Wert vor dem Sterilisieren 7,3) in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben werden mit dem Stamm beimpft und 72 Stunden bei 27°C und 120 UpM auf der rotierenden Schüttelmaschine inkubiert. Anschließend werden 20 ml Kulturflüssigkeit in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben mit dem Nährboden der oben genannten Zusammensetzung, dem 20 g Agar/l zur Verfestigung zugegeben wurde, gleichmäßig verteilt und dekantiert. Die Kulturen werden 10 bis 14 Tage bei 27°C inkubiert. Die nach dieser Zeit entstandenen Sporen eines Kolbens werden mit 500 ml entionisiertem Wasser, das einen Tropfen eines handelsüblichen nichtionischen Tensids enthält, abgeschwemmt, sofort weiterverwendet oder bei -22°C aufbewahrt.

b) Herstellung einer Kultur bzw. Vorkultur eines Produzentenstammes im Erlenmeyerkolben

Ein 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 100 ml einer Nährlösung der Zusammensetzung 2% Fleischmehl, 10% Malzextrakt, 1% Calciumcarbonat und Wasser ad 100% (pH 7,2 vor dem Autoklavieren) wird mit einer auf einem Schrägröhrchen gezogenen Kultur oder mit 0,2 ml Sporensuspension angeimpft und auf einer Schüttelmaschine bei 120 UpM und 27°C inkubiert. Die maximale Produktion des gewünschten Stoffes ist nach 72 Stunden erreicht. Zum Animpfen von 10 und 100 l Fermentern genügt eine 48 Stunden alte Submerskultur (5%) aus der gleichen Nährlösung.

c) Herstellung des Albocyclins

Ein 10-l-Fermenter wird unter folgenden Bedingungen betrieben:

Nährmedium:
3% Glycerin
	0,2% Caseinpepton
	pH 7,2
Inkubationszeit:	72 Stunden
Inkubationstemperatur:	30°C
Rührergeschwindigkeit:	250 UpM
Belüftung:	4 l Luft/Min

Durch wiederholte Zugabe weniger Tropfen ethanolischer Polyollösung kann die Schaumentwicklung unterdrückt werden. Das Produktionsmaximum wird nach ca. 70 Stunden (pH=5,3) erreicht. Die Ausbeuten liegen bei ca. 20 mg/l Fermenterlösung.

d) Aufarbeitung

Die Kulturbrühe wird durch Zentrifugation von festen Bestandteilen befreit und die klare Lösung mit Ethylacetat oder n-Hexan mehrmals extrahiert. Die organischen Phasen werden bei vermindertem Druck eingeengt und der ölige Rückstand gefriergetrocknet. Das Rohprodukt wird an einer Kieselgelsäule (6×30 cm) mit CHCl₃-Methanol 20 : 1 chromatographiert. Ausbeute an gereinigtem Rohprodukt: 800 mg. Die Endreinigung erfolgt an einer Sephadex-LH 20-Säule (2,5×80 cm) in Methanol. Ausbeute an reinem Albocyclin 300 mg.

2. Herstellung und Charakterisierung der Albocyclin-Derivate 2.1 R¹=H, R²=NHCH₂-CH₂OH

1 g Albocyclin werden in 10 ml Ethanol gelöst und mit 1 ml Ethanolamin versetzt und 1 Tag bei Raumtemperatur gerührt. Einengen im Vakuum zu einem Sirup und Chromatographie mit CHCl₃/MeOH/NH3, 33%, 7 : 1 : 0,01 an einer Kieselgelsäule ergibt jeweils 200 mg der voneinander getrennten Diastereomeren a) und b).

a) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.95 (d, 3H, J=6.7 Hz, 12-CH₃); 1.09 (d, 3H, J=6.4 Hz, 13-CH₃); 1.27 (s, 3H, 4-CH₃); 1.52 (t, 3H, J=1/1.5 Hz, 8-CH₃); 2.46 (dd, 1H, J=13.8/2.3 Hz, 2-H_a); 2.7 (m, 3H, 2-H_b, NCH₂, 3-H); 3.02 (ddd, 1H, J=12.5/5/5 Hz, NCH₂); 3.21 (s, 3H, 7-OCH₃); 3.66 (t, 2H, J=5 Hz, OCH₂); 4.12 (t, 1H, J=2.5/2 Hz, 7-H); 4.88 (dq, 1H, J=6.4/3 Hz, 13-H); 5.16 (dd, 1H, J=15.7/2.2 Hz, 5-H); 5.25 (dbr, 1H, J=11.5/1 Hz, 9-H); 5.96 (dd, 1H, J=15.7/2.5 Hz, 6-H) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl₃):
δ=11.1 (q, 8-CH₃); 14.1 (q, 12-CH₃); 15.2 (q, 13-CH₃); 24.6 (t, C-10); 26.6 (q, 4-CH₃); 33.0 (t, C-11); 33.5 (t, C-2); 36.1 (d, C-12); 50.3 (t, NCH₂); 55.9 (q, OCH₃); 62.4 (t, OCH₂); 65.8 (d, C-3); 72.6 (d, C-13); 75.7 (s, C-4); 89.0 (d, C-7); 130.0 (d, C-9); 132.2 (d, C-6); 134.7 (d, C-5); 136.2 (s, C-8); 173.1 (s, C-1) ppm.
b) ¹HNMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.93 (d, 3H, J=6.8 Hz, 12-CH₃); 1.04 (d, 3H, J=6.4 Hz, 13-CH₃); 1.21 (s, 3H, 4-CH₃); 1.57 (t, 3H, J=1.5/1 Hz, 8-CH₃), 2.7 (ddd, 1H, J=12.3/5/4 Hz, N CH₂), 2.86 (dd, 1H, J=8.5/3.2 Hz, 3-H); 3.00 (ddd, 1H, J=12.3/6.7/4.2 Hz, NCH₂); 3.50 (s, 3H, 7-OCH₃); 3.70 (m, 2H, OCH₂); 4.08 (dd, 1H, J= 1.7 Hz, 7-H), 4.80 (dq, 1H, J=6.4/3.5 Hz, 13-H), 5.27 (d br, 1H, J=11 Hz, 9-H); 5.45 (dd, 1H, J=15.8/1.7 Hz, 5-H); 5.96 (dd, 1H, J=15.8/4.3 Hz, 6-H) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl₃):
δ=10.9 (q, 8-CH₃); 13.2 (q, 12-CH₃); 14.7 (q, 13-CH₃); 23.2 (q, 4-CH₃); 23.3 (t, C-10); 31.3 (t, C-11); 34.9 (d, C-12); 35.6 (t, C-2); 49.5 (t, NCH₂); 55.5 (q, OCH₃); 60.9 (t, OCH₂); 64.3 (d, C-3); 71.0 (d, C-13); 73.7 (s, C-4); 87.4 (d, C-7); 128.3 (d, C-9); 130.4 (d, C-6); 133.4 (d, C-5); 135.4 (s, C-8); 171.3 (s, C-1) ppm.

2.2 R¹=H, R²=NHCH₂-CH₂O-β-D-Glc Ac₄

65 mg (0,17 mmol) a) oder b) werden mit 108 mg (0,36 mmol) Acetobromglucose und 68 mg (0,26 mmol) Ag-trifluormethansulfonat versetzt und bei Raumtemperatur 3 Stunden gerührt. Nach der Chromatographie an einer Kieselgelsäule (CHCl₃-EtOAc 1 : 1) erhält man eine Ausbeute von jeweils 60 mg der Diastereomeren c) oder d).

c) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.92 (d, 3H, J=6.8 Hz, 12-CH₃); 1.04 (d, 3H, J=6.3 Hz, 13-CH₃); 1.22 (s, 3H, 4-CH₃); 1.50 (s, 3H, 8-CH₃); 1.71 (s, 3H, Orthoester-CH₃); 2.08-2.13 (3s, 9H, Acetyl-CH₃); 3.08 (m, 1H, 3-H); 3.20 (s, 3H, OCH₃); 3.56 (t, 2H, OCH₂); 3.93 (ddd, 1H, 5′-H); 4.10 (t, 1H, J=2/1.5 Hz, 7-H); 4.19 (d, 2H, 6′-Hz); 4.38 (ddd, 1H, J=5.4/2.9/1 Hz, 2′-H); 4.8-5.0 (m, 2H, 13-H, 4′-H); 5.14 (dd, 1H, J=15.8/2.2 Hz, 5-H); 5.19 (t, 1H, J=2.9 Hz, 3′-H), 5.23 (dbr, 1H, J=11 Hz, 9-H); 5.75 (d, 1H, J=5.4 Hz, 1′-H); 5.90 (dd, 1H, J=15.8/2.2 Hz, 6-H) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl₃):
δ=11.0, 12.8, 14.6 (3q, 4-CH₃, 12-CH₃, 13-CH₃); 2.06, 20.7, 20.8 (q, 3 Acetyl-CH₃), 23.8 (t, C-10); 25.7 (q, 8-CH₃); 3.07, 31.5 (t, C-2, C-11); 34,5 (q, Orthoester-CH₃); 46.5 (t, NCH₂); 50.7 (d, C-12); 55.6 (q, OCH₃); 63.2, 63.7 (t, 2 OCH₂); 65.7, 66.9, 68,3, 70.1, 70.4, 73.0 (6d, C-3, C-13, C-2′, C-3′, C-4′, C-5′); 73.8 (s, C-4); 87.4 (d, C-7); 97.0 (d, C-1′), 121.2 (s, Orthoester-C); 129.3, 131.9, 132.4 (3d, C-5, C-6, C-9); 134.9 (s, C-8); 169.2, 169.7, 170.8, 171.0 (4s, C-1, 3x Acetyl-CO) ppm.
d) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.93 (d, 3H, J=6.8 Hz, 12-CH₃; 1.08 (d, 3H, J=6.4 Hz, 13-CH₃); 1.12 (s, 3H, 4-CH₃); 1.54 (sbr, 3H, 8-CH₃); 1.73 (s, 3H, Orthoester-CH₃); 2.08-2.13 (3s, 9H, Acetyl-CH₃); 2.98 (m, 1H, 3-H); 3.20 (s, 3H, OCH₃); 3.59 (t, 2H, J=5 Hz, OCH₂); 3.94 (ddd, 1H, J=9.5/4/4 Hz, 5′-H); 4.09 (dd, 1H, J=3.5/1.8 Hz, 7-H); 4.20 (d, br, 2H, 6′-H₂); 4.33 (ddd, 1H, J=5.4/3/1 Hz, 2′-H); 4.81 (dq, 1H, J=6.4/3.5 Hz, 13-H); 4.90 (dd, 1H, J=9.5/3 Hz, 4′-H); 5.19 (t, 1H, J=3/3 Hz, 3′-H); 5.23 (dbr, 1H, 9-H); 5.36 (dd, 1H, J=15.8/2 Hz, 5-H); 5.72 (d, 1H, J=5.4 Hz, 1′-H); 5.96 (dd, 1H, J=15.8/3.7 Hz, 6-H) ppm.
¹³C-NMR (50.3 MHz, CDCl₃):
δ=10.9, 13.3, 14.8 (3q, 4-CH₃, 12-CH₃, 13-CH₃), 20.8, 20.9 (3q, 3 Acetyl-CH₃); 22.8 (q, 8-CH₃); 23.5 (t, C-10); 31.4, 36.2 (2t, C-2, C-11); 34.9 (q, Orthoester-CH₃) 47.4 (t, NCH₂); 50.5 (d, C-12); 55.6 (q, OCH₃); 62.9, 63.1 (2t, 2 OCH₂); 64.5, 67.0, 68.1, 70.1, 71.1, 73.1 (6d, C-3, C-13, C-2′, C-3′, C-4′, C-5′), 73.4 (s, C-4); 87.4 (d, C-13); 97.0 (d, C-1); 121.4 (s, Orthoester-C); 128.6, 130.4, 133.4 (3d, C-5, C-6, C-9); 135.4 (s, C-8); 169.8, 171.4 (4s, Acetyl-CO, C-1) ppm.

2.3 R¹=H, R²=NHCH₂-CH₂O-β-D-Glc

65 mg a) oder b) werden in 5 ml absolutem Methanol mit 3 Tropfen 1%igem Natriummethanolat 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Reinigung über einen schwach basischen Ionenaustauscher und Einengung erhält man jeweils 50 mg der Diastereomeren e) bzw. f).

e) ¹H-NMR (100 MHz, CDCl₃):
δ=0.9 (d, 3H, 12-CH₃); 1.1 (d, 3H, 13-CH₃); 1.3 (s, 3H, 4-CH₃), 1.5 (sbr, 3H, 8-CH₃); 1.7 (s, 3H, Orthoester-CH₃); 3.2 (s, 3H, OCH₃); 4.1 (m, 1H, 7-H); 4.9 (dq, 1H, 13-H); 5.1 (dd, 1H, 5-H); 5.2 (dbr, 1H, 9-H); 5.8 (d, 1H, 1′-H); 5.9 (dd, 1H, 6-H) ppm.
f) ¹H-NMR (100 MHz, CDCl₃):
δ=0.9 (d, 3H, 12-CH₃); 1.1 (d, 3H, 13-CH₃); 1.2 (s, 3H, 4-CH₃), 1.6 (sbr, 3H, 8-CH₃); 1.7 (s, 3H, Orthoester-CH₃); 3.2 (s, 3H, OCH₃); 4.8 (m, 1H, 13-H); 5.9 (m, 2H, 6-H); 1′-H) ppm

2.4 R¹=H, R²=N(Ac)CH₂-CH₂OAc

50 mg a) bzw. b) werden mit je 1 ml Pyridin und Acetanhydrid und 1 mg Dimethylaminopyridin versetzt und bei Raumtemperatur gerührt. Die Mischung wird auf Eis gegeben, 1 Stunde gerührt, mit NaHCO₃-Lösung gewaschen und mit CHCl₃ extrahiert. Nach dem Trocknen über MgSO₄ und Einengen im Vakuum wird der Rückstand auf Kieselgel (CHCl₃/MeOH 9 : 1) chromatographiert. Ausbeute: je 30 mg der Diastereomeren g) bzw. h).

g) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.90 (d, 3H, J=6.8 Hz, 12-CH₃); 1.20 (m, 6H, 13-CH₃); 1.62 (s, 3H, 8-CH₃); 1.09+1.20 (2s, 6H, 2 Acetyl-CH₃); 2.58 (dd, 1H, J=16/7.8 Hz, 2-H_a); 2.88 (dd, 1H, J=16/ 2.3 Hz, 2-H_e); 3.22 (s, 3H, OCH₃); 3.37 (dd, 1H, J=7.8/ 2.3 Hz, 3-H); 3.5 (m, 2H, NCH₂); 4.04 (d, 1H, J=8.2 Hz, 7-H); 4.15 (m, 2H, OCH₂); 4.41 (dq, 1H, J=6.4/4 Hz, 13-H); 5.47 (d br, J=15.5 Hz, 5-H); 5.55 (m, 1H, 9-H); 6.07 (dd, 1H, J=15.5/8.2 Hz, 6-H) ppm
h) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.91 (d, 3H, J=6.8 Hz, 12-CH₃); 1.14 (d, 3H, J=6.3 Hz, 13-CH₃); 1.25 (s, 3H, 4-CH₃); 1.63 (s, 3H, 8-CH₃); 2.07+ 2.13 (2s, 6H, 2 Acetyl-CH₃); 3.20 (s, 3H, OCH₃); 4.03 (d br, 1H, J=7 Hz, 7-H); 5.42 (dd, 1H, J=15.5/1.5 Hz, 5-H); 5.87 (dd, 1H, J=15.5/6.8 Hz, 6-H) ppm.

2.5 R¹=H, R²=SCH₂-CH₃

200 mg Albocyclin werden in 1 ml Ethanol gelöst, mit jeweils 1 ml Ethylmercaptan und Triethylamin versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Reinigung durch Säulenchromatographie auf Kieselgel (CHCl₃/MeOH 20 : 1) erhält man eine Ausbeute von 57 mg i).

i) ¹H-NMR (100 MHz, CDCl₃):
δ=0.85 (d, 3H, 12-CH₃); 1.16 (d, 3H, 13-CH₃); 1.20 (t, 3H, -CH₂-CH₃); 1.50 (s, 3H, 4-CH₃); 1.58 (sbr, 8-CH₃); 3.20 (s, 3H, OCH₃); 4.06 (d, 1H, 7-H); 4.53 (dq, 1H, 13-H); 5.46 (m, 1H, 9-H); 5.55 (dd, 1H, 5-H); 5.93 (dd, 1H, 6-H) ppm.

2.6 R¹=H, R²=SCH₂-CH₂OH

200 mg Albocyclin, 1 ml Ethanol, 1 ml Mercaptoethanol und 1 ml Triethylamin werden über Nacht bei Raumtemperatur oder bei 40°C gerührt. Nach der Reinigung durch Säulenchromatographie auf Kieselgel erhält man eine Ausbeute von 13 mg der Diastereomeren j) bzw. 23 mg k).

j) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.93 (d, 3H, J=6.8 Hz, 12-CH₃); 1.11 (d, 3H, J=6.4 Hz, 13-CH₃); 1.32 (s, 3H, 4-CH₃); 1.60 (s, 3H, 8-CH₃); 2.56 (dd, 1H, J=15.6/7.7 Hz, 2-Ha); 2.73 (dd, 1H, J=15.6/4.3 H_b); 2.90 (t, 2H, SCH₂); 3.23 (s, 3H, OCH₃); 3.83 (t, 2H, OCH₂); 4.07 (dd, 1H, J=5/1.3 Hz, 7-H); 4.77 (dq, 1H, J=6.4/5 Hz, 13-H); 5.29 (dbr, 1H, J=10.9 Hz, 9-H); 5.55 (dd, 1H, J=15.7/ 1.4 Hz, 5-H); 5.99 (dd, 1H, J=15.7/5 Hz, 6-H) ppm.
k) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.90 (d, 3H, J=6.9 Hz, 12-CH₃); 1.20 (d, 3H, J=6.4 Hz, 13-CH₃); 1.47 (s, 3H, 4-CH₃); 1.60 (sbr, 3H, 8-CH₃); 2.8-2.9 (m, 2H, SCH₂); 3.22 (s, 3H, OCH₃); 3.74 (t, 2H, OCH₂); 4.08 (d, 1H, J=6.1 Hz, 7-H); 4.54 (dq, 1H, J=6.9/5.4 Hz, 13-H); 5.42 (m, 1H, 9-H); 5.50 (dd, 1H, J=15.7/1.2 Hz, 5-H); 5.90 (dd, 1H, J=15.7/6.2 Hz, 6-H) ppm.

2.7 R¹=R²=H

200 mg Albocyclin werden in 5 ml Methanol gelöst und mit 100 mg Pd/C (10% Pd, oxidische Form) versetzt. Die Hydrierung unter H₂ (1 atm) wird 3 Stunden bei Raumtemperatur durchgeführt. Nach der anschließenden Kieselgelchromatographie (CHCl₃/ MeOH 9/1 erhält man eine Ausbeute von 30 mg l).

l) ¹H-NMR (200 MHz, CDCl₃):
δ=0.91 (d, 3H, 12-CH₃); 1.11 (d, 13-CH₃); 1.31 (s, 3H, 4-CH₃); 1.64 (s, br, 3H, 8-CH₃); 3.20 (s, 3H; OCH₃); 4.05 (d, 1H, 7-H); 4.57 (dq, 1H, 13-H); 5.31 (dd, 1H, 9-H); 5.53 (dd, 1H, 5-H); 5.82 (dd, 1H, 6-H) ppm.

3. Antivirale Aktivität

Die antivirale Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen werden in in-vitro-Versuchen geprüft. Dazu werden die erfindungsgemäßen Verbindungen in verschiedenen Verdünnungen zu Zellkulturen von HeLa- und Verozellen in Mikrotiterplatten gegeben. Nach 3 h werden die Kulturen mit verschiedenen humanpathogenen Viren (z. B. Myxovirus Influenza A, Picorna Rhinovirus 2) infiziert. 48 bis 72 h nach der Infektion wird der Therapieerfolg anhand des cytopathogenen Effekts mikroskopisch und nach Neutralrot-Aufnahmen (Farbtest nach Finter) photometrisch bestimmt (Finter, N. B., In "Interferones", N. B. Finter et al., North Holland Publishing Co., Amsterdam, 1966). Die minimale Konzentration, bei der etwa die Hälfte der infizierten Zellen keinen cytopathogenen Effekt zeigen, wird als minimale Hemmkonzentration (MHK) betrachtet.

Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle zusammengefaßt.

Claims

1. Verbindung der allgemeinen Formel I in ihren am C₃ möglichen diastereomeren Formen in derR¹ Wasserstoff und
R² Wasserstoff oder die Gruppen NR′R″ oder SR′ bedeutet, wobei R′ (C₁-C₈)-alkyl, Hydroxy-(C₁-C₈)-alkyl, (C₁-C₈)-alkyl-O-glycosyl oder Wasserstoff ist und R″ (C₁-C₈)-acyl oder Wasserstoff ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
R² die Gruppen NHCH₂-CH₂O-β-D-Glc, NHCH₂-CH₂OH, NHCH₂-CH₂O-β-D-GlcAc₄, N(Ac)CH₂-CH₂OAc, SCH₃CH₃ oder SCH₂CH₂OH bedeutet.

3. Verfahren zur Herstellung der Verbindung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Streptomyces spec. DSM 5469. . . kultiviert wird, die Verbindung der Formel II (Albocyclin) isoliert und derivatisiert wird.

4. Verwendung der Verbindung nach Anspruch 1 oder 2, sowie von Albocyclin als antivirales Agens.

5. Arzneimittel enthaltend die Verbindung nach Anspruch 1 oder 2.

6. Verwendung von Albocyclin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von viralen Infektionen.