KR20220114614A - 비유도된 탈분화 라벤더 식물 세포, 이의 추출물, 및 이의 미용 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 라벤더(Lavandula angustifolia) 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포, 또는 이의 추출물에 관한 것이며, 또한 이를 포함하는 미용 조성물, 이의 용도, 및 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키기 위해, 또한 피부의 보습을 개선시키기 위해 상기 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는 미용 처리 방법에 관한 것이다.

Description

비유도된 탈분화 라벤더 식물 세포, 이의 추출물, 및 이의 미용 용도

본 발명은 피부 관리 분야에 관한 것이다.

본 발명은 라벤더(Lavandula angustifolia) 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 및 이의 추출물에 관한 것이고, 또한 이를 포함하는 미용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 장벽 기능을 개선시키도록 의도되며, 상기 정의된 바와 같은 적어도 하나의 조성물을 피부에 도포하는 것으로 구성된 적어도 하나의 단계를 포함하는, 피부 치료용 미용 방법에 관한 것이다.

특히, 본 발명의 조성물은 피부의 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키도록 의도된다. 또한, 본 발명은 피부 보습, 피부의 탄력 개선, 및 울퉁불퉁한 피부결(microrelief)의 개선 및/또는 감소에 사용된다. 또한, 본 발명은 건성 피부의 치료에 사용된다.

인간의 피부는 두 개의 구획, 즉 깊은 구획인 진피와 표층 구획인 표피로 구성된다.

진피는 표피에 고체 지지체를 제공한다. 이는 또한 표피의 영양 요소이다. 이는 주로 섬유아세포 및 세포외 기질로 이루어지고, 그 자체는 주로 콜라겐, 엘라스틴 및 기저 물질로서 알려진 물질로 구성되며, 이들 성분은 섬유아세포에 의해 합성된다. 백혈구, 비만 세포 및 조직 대식세포가 또한 그 안에서 발견된다. 이는 또한 혈관 및 신경 섬유를 함유한다.

표피는 외부 환경과 접촉한다.

천연의 인간 표피는 주로 3가지 유형의 세포, 즉 대부분을 형성하는 각질형성세포(keratinocyte), 멜라닌세포 및 랑게르한스(Langerhans) 세포로 구성된다.

표피를 구성하는 세포들은 세포간 지질 영역에 의해 경계가 정해진다.

이들 세포 유형 각각은 그 고유한 기능으로 인해 피부가 체내에서 수행하는 필수적인 역할에 기여한다. 특히, 각질형성세포는 표피의 기저층에 존재하는 각질형성세포로부터, 그 분화의 말기 단계의 각질형성세포로 이루어진 완전히 각질화된 사멸 세포인 각질세포의 형성을 유발하는 연속적이고 지향적인 성숙 과정을 겪는다.

분화 과정에서, 표피의 살아 있는 층의 세포막의 유체 구조를 생성하는 역할을 하는 인지질은 주로 지방산, 콜레스테롤 및 스핑고지질(세라미드)로 구성된 혼합물로 점차적으로 대체된다. 특정한 층상 액정 상으로서 조직된 이러한 지질은 각질층의 세포내 시멘트를 형성하며, 물의 교환 및 표피의 장벽 기능을 위해 필수적이다. 따라서, 표피의 지질 영역의 지질 및 각질세포의 층상 구조는 표피 장벽 기능에 참여한다.

따라서, 피부는 외부 공격, 특히 화학적, 기계적 또는 감염성 공격에 대한 장벽을 만들고, 이와 관련하여, 환경 요인(기후, 자외선, 담배 등) 및/또는 생체 이물 요인, 예를 들어 미생물에 대한 특정 수의 방어 반응이 그 위에서 일어난다.

장벽 기능으로서 알려진 이러한 특성은 표피의 최상위 층, 즉 각질층으로서 알려진 각화층에 의해 주로 보장된다.

피부 및 점막 장벽의 품질 및 평형은 수많은 성장 인자, 부착 분자, 호르몬 및 지질 대사 효소를 포함하는 복잡한 내인성 생물 메커니즘에 의존하는 것이 명백하다.

따라서, 피부 장벽의 손상은 외부 공격 요인, 예컨대 자극제(세제, 산, 염기, 산화제, 환원제, 농축 용매, 가스 또는 유독 가스), 기계적 응력(마찰, 충격, 찰과상, 표면의 찢김, 먼지 또는 입자의 돌출, 면도 또는 제모), 열 또는 기후 불균형(추위, 건조, UV 방사선), 생체 이물(바람직하지 않은 미생물, 알레르겐) 또는 내부 공격 요인, 예컨대 심리적 스트레스의 존재하에 발생할 수 있다.

외부 공격에 의한 이러한 장벽 기능 손상에 대해 다음의 사람들이 보다 특히 우려될 수 있다:

- 온도 또는 상대 습도의 큰 진폭 변화 동안 빠르게 불균형해지는 "연약한" 또는 "섬세한" 그리고 취약한 피부를 갖는 사람들(예를 들어, 아기 피부의 경우);

- "무른" 피부를 갖는 사람들, 특히 다음을 포함하는 사람들:

- 60세 이상의 고령자의 경우, 특히 초고령자(적어도 75세 이상)의 경우와 같이, 땀, 피지 및 천연 보습 인자로 구성된 보호성 수지질막이 감소되는 사람들;

- 수지질막의 조성이 변경된 사람들;

- 신경성 과잉행동으로 인해 저하된 반응성 역치를 갖는 사람들; 따라서 이들의 피부 유형은 다른 이들의 피부 유형보다 훨씬 더 빠르고 빈번하게 이러한 감각 및 임상 징후를 보일 것이며, 이들은 민감성 피부를 갖는 사람들이다.

예를 들어 면도된 피부와 같은 "공격받은" 피부를 갖는 사람들은 언급되지 않을 수도 있다.

피부 장벽 기능의 손상은 특히 보습 장애, 피부의 탄력 손실, 피부색의 광채 손상 및 피부의 거친 외관, 또는 피부결의 손상에 의해 반영될 수 있다.

또한, 피부 장벽 기능을 강화시키기 위해 표피 분화를 증가시키는 것이 적절하다.

따라서, 특히 다음을 위해 피부 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키도록 추구된다:

- 피부, 특히 점막의 보습 문제를 극복하고, 특히 건성 피부를 치료하기 위함,

- 피부의 탄력을 개선시키기 위함,

- 피부색의 광채를 유지하고/하거나 개선시키기 위함,

- 피부 거칠기 또는 피부결의 손상을 예방하고/하거나 치료하기 위함.

장벽 기능의 불균형을 방지하기 위해서, 천연 기원의 활성제, 특히 탈분화된 식물 세포 및 또한 이의 추출물에 특별한 주의를 기울여야 한다.

탈분화된 식물 세포는 1902년 Haberland에 의한 연구로부터 발생하였다. 지난 40년 동안, 식물 세포 배양은 관심 있는 대사산물의 생산 또는 정확하게 동일한 식물의 증식(체세포 배형성)에 사용되어 왔다. 이러한 식물 생물공학은 다음과 같은 세포 전분화능의 개념에 기초한다: "임의의 식물 세포는 그것이 유래된 것과 동일한 다른 개체를 탈분화하고 재생할 수 있다". 탈분화된 식물 세포는, 배양되어, 그의 기관 특이성, 특히 그의 잎, 줄기, 뿌리 또는 꽃잎 특이성을 상실하고 다시 한 번 잠재적으로 전체 식물을 생성할 수 있게 된, 기관(잎, 줄기, 뿌리, 꽃잎 등)으로부터 기원하는 식물 세포이다.

미분화된 식물 세포는 분열 식물 세포로부터 유래되고, 기관-특이성 생물학적 이력을 갖지 않는 실제 식물 줄기 세포와 동일하다.

예를 들어, 국제 특허 WO2009/151302 및 대한민국 특허공개 제2009-0118877호에는 고려인삼(Panax ginseng)의 형성층 또는 주목(Taxus) 속의 식물로부터 유래된 미분화된 식물 세포를 함유하는 노화 방지 또는 항산화 조성물이 기재되어 있다.

식물 세포에 대해 승인된 특성을 위해 주로 추출물의 형태로 화장품에서 탈분화된 식물 세포를 사용하는 것은 종래 기술로부터 알려진 실무 사항이다.

특히, 유럽 특허 EP1485064호에는 항산화 특성을 갖는 라벤더 및 방향성 좀목형(Vitex negundo)으로부터 유도된 탈분화된 식물 세포의 기저 재료를 포함하는 미용 조성물이 기재되어 있다.

따라서, 피부의 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키기 위한 신규한 기술적 해결책을 모색할 필요성이 있다.

특히, 외부 공격으로부터의 피부 보호를 개선시키고/시키거나 강화시키고, 피부 보습, 피부의 탄력 및 피부색의 광채를 개선시키고/시키거나, 피부의 거칠기 또는 울퉁불퉁한 피부결을 감소시키기 위한 신규한 활성제가 제안될 필요성이 있다.

본 발명의 목적은 특히 이러한 필요성을 충족시키는 것이다.

구체적으로, 본 발명자들은 이제 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물이 피부의 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시킬 수 있음을 입증하였다.

특히, 라벤더의 탈분화된 식물 세포의 유도의 부재는, 하기 비교예 3b에 나타낸 바와 같이, 각화층의 조립을 담당하는 것(SPRR1A, CNFN), 각질형성세포 분화를 담당하는 것(AQP3); 또는 글리코사미노글리칸 GAG의 합성을 담당하는 것(HAS3) 및 표피 재생을 담당하는 것(HBEGF)과 같은 장벽 기능 및 보습 표지자의 발현 증가를 획득할 수 있게 한다.

본 발명자들이 아는 한, 본 명세서에 기재된 특정한 미용 특성을 갖는, 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 세포주 또는 이의 추출물의 생성에 관한 문헌은 없다.

제1 양태들 중 하나에 따르면, 본 발명은 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포, 또는 이의 추출물에 관한 것이다.

본 발명의 제2 청구 대상은 본 발명에 따른 상기 세포 및/또는 추출물을 생리학적으로 허용가능한 매질 중에 포함하는 미용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부의 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키기기 위한 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도에 관한 것이다.

또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 또한 외부 공격으로부터의 피부 보호를 개선시키고/시키거나 강화시키기기 위한 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 보습을 개선시키고, 거칠기 또는 울퉁불퉁한 피부결을 예방 및/또는 치료하고/하거나, 피부색의 광채를 개선시키고/시키거나, 피부의 탄력을 개선시키기 위한 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 건성 상태의 미용 징후를 예방 및/또는 치료하기 위한 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도에 관한 것이다.

본 발명의 다른 청구 대상은 피부의 피부 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키기 위해 본 발명에 따른 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부의 미용 치료 방법이다.

또한, 본 발명은 외부 공격으로부터의 피부의 보호를 개선시키고/시키거나 강화시키기 위해 본 발명에 따른 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부의 미용 치료 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 보습을 개선시키고, 거칠기 또는 울퉁불퉁한 피부결을 예방 및/또는 치료하고/하거나, 피부색의 광채를 개선시키고/시키거나, 피부의 탄력을 개선시키기 위해 본 발명에 따른 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 피부의 미용 치료 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 피부 건성 상태의 미용 징후를 치료하기 위해 본 발명에 따른 조성물을 건성 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 건성 피부 치료용 미용 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 방법은 특히 개인의 피부의 연령 또는 유형 또는 건성 상태의 원인에 상관 없이, 피부 건성 상태를 갖는 사람들을 위한 것이다.

다른 실시형태에 따르면, 상기 조성물은 연약한 피부, 무른 피부, 공격 받은 피부 및/또는 민감성 피부로부터 선택된 피부의 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키도록 의도될 수 있다.

본 발명과 관련하여, 조성물은 상기에서 재차 언급된 바와 같이 외부 공격을 겪거나 겪을 수 있는, 건강한 피부에 도포하기 위해 사용될 수도 있다. 다른 특별한 경우, 본 발명의 조성물은 피부 장벽 결핍의 임상 징후가 존재하는 경우 피부에 도포될 수 있다.

도 1은 실시예 1a에 따라 수득된 라벤더 종의 비유도된 탈분화 식물 세포의 추출물(본 발명에 따름) 대 실시예 2에 따라 수득된 라벤더 종의 UV-유도된 탈분화된 식물 세포의 추출물(본 발명의 범위 밖)의 HPLC 크로마토그램이다.

정의

용어 "미용 조성물"은 생리학적으로 허용가능한 매질, 즉 피부와 양립할 수 있는 매질을 포함하는 조성물을 의미한다.

용어 "피부"는 신체의 피부 전체, 바람직하게는 얼굴, 목선, 목, 팔 및 팔뚝의 피부, 또는 보다 더 바람직하게는 얼굴, 특히 이마, 코, 뺨, 턱 및 눈 주위 영역의 피부를 지칭한다.

용어 "비유도된 세포"는 유도를 겪지 않은 세포를 의미한다.

용어 "유도"는 본원에서 외인성 유도 물질에 의해, 다른 유기체 또는 세포에서 드물게 발현된 대사 경로를 유도하거나, 다른 유기체 또는 세포에서 침묵 대사 경로를 각성시키는 것을 의미한다.

용어 "유도 물질"은 본원에서 다른 유기체에서 드물게 발현된 대사 경로를 유도시킬 수 있거나, 다른 유기체에서 침묵 대사 경로를 각성시킬 수 있는 분자 또는 유기체를 의미한다. 많은 수의 유도 물질이 당업자에게 공지되어 있고, 여기에는 생물 유도 물질, 예컨대 자스모네이트 및 이의 유도체, 및 비생물 유도 물질, 예컨대 온도, pH, UV, CO₂와 같은 가스 또는 삼투압 충격이 포함된다.

용어 "유도 단계를 포함하지 않는 방법"은 탈분화된 세포가 상기 정의된 바와 같은 유도 물질과 접촉하여 배치되지 않는 방법을 의미한다.

용어 "접촉하여 배치됨"은 본원에서 탈분화된 식물 세포 및 유도제를 동일한 배양 배지에서 인큐베이션하는 것을 의미한다.

용어 "피부 건성 상태의 미용 징후"는 피부의 팽팽함 및/또는 긴장 감각, 피부의 비늘 모양의 외관 및/또는 거친-느낌의 피부의 외관을 의미한다.

비유도된 탈분화 라벤더 식물 세포, 이의 추출물

본 발명의 목적을 위해, 용어 "탈분화된 식물 세포"는 라벤더 종 식물의 기관으로부터 유래되고, 특정한 실험실내 배양 조건하에 수득되며, 더 이상 어떠한 특수화 특징을 나타내지 않고, 유도 효과하에 그의 게놈에 따라 임의의 분화가 이루어질 수 있고, 그것이 기원하는 식물의 전체 식물을 스스로 생성할 수 있는 임의의 세포 균주를 의미한다. 그러한 세포는 스스로 생존할 수 있고, 다른 세포와 의존 관계에 있지 않다.

탈분화된 식물 세포는 식물에 자연적으로 존재하는 미분화된 식물 세포와 구별된다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "탈분화된 식물 세포"는 임의의 세포 유형(전분화) 또는 몇몇 세포 유형(다분화), 특히 배형성 세포 또는 분열 세포로의 유도 효과하에 분화될 수 있고/있거나, 특수화된 세포의 새로운 특징을 획득할 수 있는, 라벤더 종 식물의 기관으로부터 유래된, 실험실내 재배에 의해 수득된 균주를 의미한다.

정상 조건하에서, 식물 세포는 그의 게놈의 약 20%를 발현하고, 나머지 80%는 오직 특정 환경 조건에만 반응하여 발현한다. 특정 배양 조건하에 이들 세포를 실험실내 재배하면, 세포를 "다시 프로그램"하여, 이에 따라 전체 식물에서 발현되지 않는 이 게놈의 일부에 접근할 수 있게 된다. 식물로부터 추출하여 수득하기 곤란한 일부 화합물은 세포 배양으로 더욱 쉽게 접근할 수 있게 된다.

따라서, 유리하게는, 본 발명의 탈분화된 식물 세포는 전체 식물에 존재하지 않는 신규한 화합물에 접근하거나, 또는 전체 식물에 알려져 있지만 희귀한 분자의 발현을 상당히 증가시킬 수 있게 한다.

본 발명은 또한 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 세포에 관한 것으로, 상기 탈분화된 세포는 실시예를 포함한 본 명세서에 상세하게 기재된 방법에 의해 수득된다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 방법이 라벤더 종 식물의 탈분화된 세포주를 수득할 수 있게 하며, 그러한 계통의 세포가 임의의 검출가능한 그의 형태학의 변형 없이, 그리고 임의의 검출가능한 그의 특성의 변형 없이, 특히 장벽 기능 및 보습과 관련하여 임의의 검출가능한 그의 특성의 변형 없이, 매우 긴 기간에 걸쳐 탈분화된 세포의 형태로 재배될 수 있음을 보여주었다.

본 발명의 비유도된 탈분화 식물 세포는 라벤더 종의 임의의 식물 부분 또는 상기 식물의 세포로부터 수득될 수 있다.

용어 "식물 부분(들)"은 식물의 하나 이상의 전체 기관, 예를 들어 잎, 줄기, 꽃, 꽃잎, 꽃받침, 씨앗 또는 뿌리, 또는 생체내 또는 야생에서 재배된 상기 식물 기관(들)의 하나 이상의 단편 중 어느 하나를 의미한다. 따라서, 본 발명의 비유도된 탈분화 식물 세포를 생성하기 위해 라벤더 식물의 하나 이상의 잎 또는 하나 이상의 잎 단편을 사용할 수 있다.

용어 "생체내 재배"는 통상적인 유형의 임의의 재배, 즉 야외 또는 온실 내의 토양에서 또는 대안적으로 토양 밖의 재배를 의미한다.

용어 "실험실내 재배"는 재생성가능한 방식으로 식물 또는 식물 부분을 인공적으로 수득하기 위해 당업자에게 알려진 모든 기술을 의미한다.

우선적으로는 본 발명에 따르면, 생체내 재배로부터 수득한 식물, 보다 우선적으로는 생체내 재배로부터 수득한 식물 부분이 사용된다.

바람직하게는, 본 발명의 비유도된 탈분화 식물 세포는 라벤더 종 식물의 적어도 하나의 잎 또는 잎 부분으로부터 수득된다.

보다 바람직하게는, 본 발명의 비유도된 탈분화 식물 세포는 백색 품종의 라벤더 식물로부터 수득된다. 이러한 품종은 특히 French Pharmacopea에 등록되어 있다.

백색 품종의 라벤더 식물은 le jardin du pic vert 공급자에 의해 판매되는 라벤더 ≪ Hidcote White ≫, 라벤더 ≪ Silberm

we ≫, 라벤더 ≪ Alba ≫, 라벤더 ≪ Arctic Snow ≫ 또는 프랑스 소재의 Dr

me에서 재배되는 백색 라벤더로부터 선택될 수 있다.

매우 바람직한 실시형태에서, 백색 품종의 라벤더는 Dr

me(프랑스 소재)로부터 기원한다.

완전히 바람직하게는, 본 발명에 따른 비유도된 탈분화 식물 세포는 출발 산물로서 백색 품종의 라벤더 식물의 잎을 사용하여 수득된다.

유리하게는, 본 발명의 비유도된 탈분화 식물 세포를 수득하기에 적합한 배양 배지는 식물에 자연적으로 존재하는 호르몬을 포함하며, 상기 배양 배지는 유도 물질을 포함하지 않는다.

우선적인 실시형태에 따르면, 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 세포는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 수득된다:

i. 라벤더 종의 하나 이상의 식물 부분, 특히 하나 이상의 잎 전체 또는 하나 이상의 잎 단편을 제공하는 단계;

ii. 단계 i에서 제공된 상기 식물 부분(들)을 적어도 하나의 식물 호르몬을 포함하는 배양 배지에서 재배하여 탈분화된 세포를 생성하는 단계; 및

iii. 단계 ii의 종료 시에 수득된 탈분화된 세포를 회수하는 단계;

iv. 선택적으로, 단계 iii에서 회수된 탈분화된 세포를 추출하는 단계;

상기 방법은 상기 탈분화된 세포를 유도하는 단계를 포함하지 않는다.

우선적으로는, 단계 ii에서, 식물 부분(들), 특히 잎(들) 전체 또는 잎 단편(들)은 무균 형태(임의의 생물학적 오염 물질이 없음)로 재배된다.

상기 방법의 단계 ii에서, 상기 식물 부분(들)은 적합한 배양 배지에서 재배되며, 이 배지는 파이토호르몬(phytohormone)으로서 또한 알려진 적어도 하나의 식물 호르몬을 포함한다. 특정 실시형태에서, 상기 배양 배지는 복수개의 식물 호르몬, 예를 들어 2 또는 3개의 식물 호르몬을 포함한다.

상기 배양 배지에 함유된 파이토호르몬은 옥신, 사이토키닌, 지베렐린 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 옥신은 IAA(인돌-3-아세트산), IBA(인돌부티르산), 페닐아세트산 및 NAA(나프탈렌아세트산) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다. 우선적으로는, 2,4-D(2,4-디클로로페녹시아세트산)은 비천연 화합물이므로, 본 발명에서 사용하기에 적합한 옥신으로부터 제외된다.

본 발명에서 사용하기에 가장 특히 적합한 사이토키닌은 키네틴(N-(퓨란-2-일메틸)-7H-푸린-6-아민), 제아틴(2-메틸-4-(7H-푸린-6-일아미노)부트-2-엔-1-올) 및 벤질 아데닌(N-벤질-7H-푸린-6-아민) 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

지베렐린은 지베렐린 A3, A1, A12 및 이들의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

상기 방법의 단계 ii에서, 식물 호르몬(들) 또는 파이토호르몬(들)은 우선적으로는 인돌-3-아세트산, 인돌부티르산, 페닐아세트산, 나프탈렌아세트산, 키네틴, 제아틴, 벤질 아데닌, 지베렐린산 및 지베렐린 A1, A3 및 GA3으로부터 선택된다.

바람직한 실시형태에서, 식물 호르몬(들) 또는 파이토호르몬(들)은 우선적으로는 나프탈렌아세트산 및 키네틴으로부터 선택된다.

바람직하게는, 단계 ii에서 배양 배지는 수성 배지이다.

본 발명의 목적을 위해, 용어 "수성 배지"는 물 및 선택적으로 특히 식물 세포의 재배와 양립할 수 있는 추가의 수성 용매를 포함하는 배지를 의미한다.

특정 실시형태에 따르면, 단계 ii에서 상기 배양 배지는 다음을 포함하는 수성 배지이다:

- 적어도 하나의 식물 호르몬, 예컨대 1-나프탈렌아세트산, 키네틴 및 이들의 혼합물; 및

- NH₄NO₃; KNO₃; CaCl₂, 예컨대 CaCl₂·2H₂O; MgSO₄; KH₂PO₄; MnSO₄, 예컨대 MnSO₄·4H₂O; ZnSO₄, 예컨대 ZnSO₄·7H₂O; KI; Na₂MoO₄, 예컨대 Na₂MoO₄·2H₂O; CuSO₄, 예컨대 CuSO₄·5H₂O; Na₂EDTA, 예컨대 Na₂EDTA·2H₂O; FeSO₄, 예컨대 FeSO₄·7H₂O; 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 선택적으로 수화된 형태의 적어도 하나의 염; 및

- 바람직하게는 단당류, 올리고당 또는 다당류, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 탄소 공급원; 특히, 글루코스, 프룩토스, 수크로스 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 탄소 공급원, 바람직하게는 수크로스; 및

- 선택적으로 미오이노시톨, 니코틴산, 피리독신 HCl, 티아민 HCl 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물; 및

- 선택적으로 폴리비닐피롤리돈.

유리하게는, 배양 배지에 존재하는 탄소 공급원의 양은 5 내지 40 g/배양 배지 l, 바람직하게는 10 내지 30 g/l이고; 보다 양호하게는, 배양 배지에 존재하는 탄소 공급원의 양은 20 g/배양 배지 l이다.

바람직한 실시형태에 따르면, 배양 배지는 적어도 NH₄NO₃; KNO₃; CaCl₂·2H₂O; MgSO₄; KH₂PO₄; MnSO₄·4H₂O; ZnSO₄·7H₂O; KI; Na₂MoO₄·2H₂O; CuSO₄·5H₂O; Na₂EDTA·2H₂O; FeSO₄·7H₂O; 미오이노시톨; 니코틴산; 피리독신 HCl; 티아민 HCl; 나프탈렌아세트산; 키네틴; 수크로스, 및 선택적으로 폴리비닐피롤리돈을 함유하는 수성 배지이다.

유리하게는, 배양 배지는 1200 내지 2000 mg/l의 NH₄NO₃; 1500 내지 2100 mg/l의 KNO₃; 300 내지 500 mg/l의 CaCl₂·2H₂O; 150 내지 200 mg/l의 MgSO₄; 153 내지 187 mg/l의 KH₂PO₄; 10 내지 30 mg/l의 MnSO₄·4H₂O; 5 내지 10 mg/l의 ZnSO₄·7H₂O; 0.001 내지 0.91 mg/l의 KI; 0.001 내지 0.30 mg/l의 Na₂MoO₄·2H₂O; 0.01 내지 0.05 mg/l의 CuSO₄·5H₂O; 10.5 내지 50 mg/l의 Na₂EDTA·2H₂O; 10 내지 30 mg/l의 FeSO₄·7H₂O; 70 내지 150 mg/l의 미오이노시톨; 0.3 내지 0.6 mg/l의 니코틴산; 0.4 내지 0.6 mg/l의 피리독신; 0.08 내지 0.15 mg/l의 티아민; 0.001 내지 11 mg/l의 나프탈렌아세트산; 0.001 내지 1 mg/l의 키네틴; 10 내지 30 g/l의 수크로스; 및 물, 및 선택적으로 0.1 내지 0.5 g/L의 폴리비닐피롤리돈을 포함할 수 있다.

배양 배지에 포함된 다양한 구성성분의 농도는 질량 농도로서 표현된다.

단계 ii에서의 재배는 유리하게는 20 내지 30℃, 바람직하게는 24 내지 28℃의 범위, 보다 양호하게는 27℃의 온도에서 수행된다.

단계 ii에서의 재배는 유리하게는 약 8% 내지 80%의 O₂ 분압, 예컨대 30%의 O₂ 분압을 포함하는 배양에서 수행된다.

단계 ii에서의 방법은 배치식, 유가식(반연속식) 또는 연속 발효 기술, 바람직하게는 배치 발효 기술을 통해 수행될 수 있다.

적합한 배지에서의 재배 후, 본 발명의 비유도된 탈분화 식물 세포는, 예를 들어 여과에 의해 단계 iii에서 수확되고, 동결 건조되거나 추출 과정에 가해질 수 있다.

특정 실시형태에 따르면, 재배 단계 ii는 6 내지 14일 동안, 우선적으로는 6 내지 10일 동안 수행된다.

또한, 본 발명은 출원인에 의해 분리되고, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ)[독일 생물 자원 센터]에 의한 참조 번호 DSM 33100하에 2019년 2월 28일자의 Budapest 조약에 따라 기탁된 세포주에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 단계 iii에서 수득된 신선하거나 동결 건조된 탈분화된 식물 세포, 또는 단계 iv의 종료 시에 회수된 이의 추출물, 또는 이들을 안정화시키는 조성물에서 재형화된 것들이 사용될 수 있다.

본 발명의 특히 바람직한 실시형태에 따르면, 비유도된 탈분화 식물 세포의 추출물이 사용될 수 있다. 필연적으로, 본 발명은 장벽 기능의 개선 및/또는 강화 및/또는 보습의 개선에 대해 얻어지는 효과와 관련하여 비유도된 탈분화 식물 세포의 활성 추출물에 관한 것이다. 본 발명의 추출물의 활성은 특히 하기 나타낸 실시예에서 상술한 다양한 실험 프로토콜에 의해 평가될 수 있다.

단계 iv에서, 당업자에게 알려진 임의의 추출 방법을 사용하여 본 발명에 따른 비유도된 탈분화 식물 세포의 추출물을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 또한 단계 iii과 추출 단계 iv 사이에 수-혼화성 유기 용매를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다. 단계 iv는 수-혼화성 유기 용매를 첨가하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 추출물로서, 수성 추출물, 유기 추출물, 모든 비율에서 물과 혼화성인 적어도 하나의 유기 추출 용매와 물을 혼합함으로써 수득된 추출물, 예컨대 수성-알코올성 추출물이 언급될 수 있고; 선택적으로 상기 추출물은 특히 증발, 동결 건조 또는 미립자화에 의해 수득된 건조 추출물의 형태이다.

바람직하게는, 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 세포의 추출물은 다음으로부터 선택된다:

- 세포내 매질의 수성 추출물, 세포내 매질의 수성-알코올성 추출물, 또는 세포내 매질의 유기 추출물; 선택적으로 상기 추출물은 건조 추출물의 형태임; 또는

- 상기 세포의 불용성 구성성분의 수성 추출물, 상기 세포의 불용성 구성성분의 수성-알코올성 추출물, 또는 상기 세포의 불용성 구성성분의 유기 추출물; 선택적으로 상기 추출물은 건조 추출물의 형태이고, 상기 세포의 상기 불용성 구성성분은 불용성 세포내 구성성분, 펙토셀룰로오스 벽, 세포막 및 이들의 혼합물로부터 선택되고, 바람직하게는 펙토셀룰로오스 벽 및/또는 세포막임.

훨씬 더 바람직하게는, 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 세포의 추출물은 다음으로부터 선택된다:

- 세포내 매질의 수성 추출물, 세포내 매질의 수성-알코올성 추출물, 또는 세포내 매질의 유기 추출물; 선택적으로 상기 추출물은 건조 추출물의 형태임; 또는

- 효소 이중 절단(enzymatic double digestion)에 의해 수득되는, 바람직하게는 하나 이상의 카보히드라아제를 사용하는 효소 절단의 제1 단계에 이어서 하나 이상의 프로테아제를 사용하는 효소 절단의 제2 단계 후 수득되는, 펙토셀룰로오스 벽 및/또는 세포막의 수성, 수성-알코올성 또는 유기 추출물.

용어 "수성 추출물"은 수성 추출 용매에 의해 수득된 추출물을 의미한다.

용어 "수성 추출 용매"는 물이거나, 또는 물로 이루어진 용매를 의미한다.

용어 "물과 적어도 하나의 수-혼화성 유기 용매의 혼합물"은 모든 비율의 물/유기 용매 혼합물을 의미한다.

용어 "수성-알코올성 추출물"은 모든 비율의 물과 에탄올의 혼합물에 의해 수득된 추출물을 의미한다.

용어 "유기 추출물"은 유기 추출 용매에 의해 수득된 추출물을 의미한다.

수-혼화성 유기 추출 용매 중에서, 에탄올, 이소프로판올, 프로필렌 글리콜, 1,3-프로판디올 및 이들의 혼합물이 언급될 수 있다.

용어 "건조 추출물"은 5 중량% 미만의 용매, 바람직하게는 3 중량% 미만의 용매, 보다 양호하게는 1 중량% 미만의 용매를 포함하는 추출물, 특정 실시형태에서는 0%의 용매를 포함하는 추출물을 의미한다. 용매는 물, 유기 용매 또는 이들의 혼합물일 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 건조 추출물은, 예를 들어 동결 건조, 미립자화 또는 증발에 의해 수득될 수 있다.

제1 실시형태에서, 본 발명에 따른 추출물을 수득하는 데 적합한 추출 방법은 다음을 포함할 수 있다:

i. 비유도된 탈분화 식물 세포를 추출 용매에서 분열시키는 제1 단계로서, 상기 추출 용매는 수성 및 유기 추출 용매 또는 물과 적어도 하나의 수-혼화성 유기 용매의 혼합물로부터 선택되고; 상기 제1 분열 단계는, 예를 들어 특히 실온에서 고압 균질화기를 사용하여 수행되는, 단계,

ii. 바람직하게는 원심분리에 이은 여과 단계에 의해 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분을 제거하여 제1 단계로부터 수득된 농축 추출 용매를 회수하는 단계.

이러한 추출 방법에 의해, 특히 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포의 세포내 매질의 추출물이 생성된다.

용어 "상기 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포의 현탁액 중의 구성성분"은 단계 i의 추출 용매에서 25℃의 온도에서 불용성인 구성성분을 의미하며; 이러한 구성성분은 특히 불용성 세포내 구성성분, 펙토셀룰로오스 벽, 세포막 및 이들의 혼합물일 수 있다.

용어 "농축 추출 용매"는 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포의 25℃의 온도에서 가용성인 세포내 구성성분을 포함하는 추출 용매를 의미한다.

비유도된 탈분화 세포를 분열시키는 단계 i은 당업자에게 알려진 임의의 기술, 예를 들어 초음파를 사용하거나 온도를 증가시켜 열-유도 분열을 생성함, 또는 전단과 같은 세포에 대한 기계적 구속의 사용, 초음파의 사용 또는 고압의 적용을 통해 수행될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 추출물을 생성시키는 세포의 분열은 특히 고압 균질화기를 사용하여, 고압, 바람직하게는 500 bar 내지 2000 bar, 보다 양호하게는 1000 bar 내지 2000 bar의 압력을 적용함으로써 수행된다.

단계 i에서, 추출 용매가 물과 적어도 하나의 수-혼화성 유기 추출 용매의 혼합물인 경우, 상기 유기 추출 용매는 에탄올 또는 1,3-프로판디올일 수 있다. 바람직하게는, [물/유기 추출 용매] 질량비는 1/2 내지 1/1이다. 또한, [세포/수성 + 유기 추출 용매] 질량비는 1/2 내지 0.9/1이다. 또한, 추출물의 건조 단계는 단계 ii의 종료 시에, 특히 회전 증발기를 사용하여, 특히 건조 상태로 농축함으로써 수행된 후, 선택적으로 수성 용매 중에 재현탁하고/하거나 선택적으로 동결 건조 단계가 후속할 수 있다.

단계 i에서, 추출 용매가 유기 추출 용매인 경우, 상기 유기 추출 용매는 에탄올 또는 1,3-프로판디올일 수 있다. 또한, [세포/유기 추출 용매] 질량비는 1/2 내지 0.9/1이다. 또한, 추출물의 건조 단계는 단계 ii의 종료 시에, 특히 회전 증발기를 사용하여, 특히 건조 상태로 농축함으로써 수행된 후, 선택적으로 수성 용매 중에 재현탁하고, 선택적으로 동결 건조 단계가 후속할 수 있다.

현탁액 중의 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분을 제거하는 단계 ii는 당업자에게 알려진 임의의 기술을 통해, 바람직하게는, 바람직하게는 6000×G 내지 12 000×G, 보다 양호하게는 8000×G 내지 10 000×G의 원심분리 단계 후 상청액의 여과에 의해 수행될 수 있다.

원심분리는 20분 내지 40분 동안 수행될 수 있다.

원심분리는 4℃의 온도에서 수행될 수 있다.

여과는 당업자에게 알려진 임의의 여과 방법에 의해, 바람직하게는 셀룰로오스 필터, 특히 0.1 μm 내지 1 μm, 예컨대 0.7 μm의 필터, 특히 0.7 μm Whatman 필터를 사용하여 수행될 수 있다.

상기 추출 방법은 또한 제2 단계로부터 수득된 농축 추출 용매를, 예를 들어 115℃ 내지 130℃, 특히 121℃에서 오토클레이빙함으로써 멸균하는 선택적 단계를 포함할 수 있다.

제1 변형예에서, 사용된 추출 용매(들)와 상관 없이, 단계 i에서 사용된 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포는 신선한 세포, 즉 특히 증발, 동결 건조 또는 미립자화에 의해 단계 i 전에 건조 단계를 겪지 않은 세포이다.

제2 변형예에서, 사용된 추출 용매(들)와 상관 없이, 단계 i에서 사용된 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포는 특히 증발, 동결 건조 또는 미립자화에 의해 단계 i 전에 건조 단계를 겪은 세포이다.

제2 실시형태에서, 본 발명에 따른 추출물을 수득하기에 적합한 또 다른 추출 방법은 전술한 제2 단계 ii 대신에, 예를 들어, 상기 기재된 조건하에서 원심분리에 의해, 제1 단계로부터 수득된 농축 추출 용매를 제거하여 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분을 회수하는 제2 단계를 포함할 수 있다.

이러한 제2 단계는 또한 다음의 단계가 후속할 수 있다:

i. 선택적으로, pH를 조정하는 단계;

ii. 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분의 제1 효소 절단을 수행하는 단계;

iii. 선택적으로, pH를 조정하는 단계;

iv. 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분의 제2 효소 절단을 수행하는 단계로서, 상기 제2 효소 절단을 상기 제1 효소 절단에서 사용한 것 이외의 하나 이상의 효소에 의해 수행하는, 단계;

v. 효소 절단을 불활성화시키는 단계;

vi. 선택적으로, pH를 조정하는 단계;

vii. 선택적으로, 원심분리에 의해 정화하는 단계;

viii. 선택적으로, 단계 vii로부터 수득된 상청액을 동결 건조하거나 미립자화하는 단계.

바람직한 실시형태에서, 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분을 이중 절단 단계 전에 원심분리 단계에 가하고, 이중 절단 단계를 원심분리로부터 수득된 펠렛 상에서 수행한다.

효소 이중 절단 단계에 선행할 수 있는 pH 조정은 선택적이다. 수행하는 경우, 유기 산 또는 미네랄 산 또는 염기의 수용액을 첨가함으로써 pH는 변경되고, 이러한 조정의 목적은 필요한 경우 펠렛의 pH를 절단 단계에 사용된 효소의 최적 작동 pH에 대응하는 값으로 조정하는 것이다.

바람직하게는, pH 조정을 수행한다. 바람직하게는, 유기 산 또는 무기 산의 용액을 첨가함으로써, 바람직하게는 3 내지 6, 보다 우선적으로는 3.5 내지 4.5의 pH로, 특히, 4의 pH로 조정한다. 바람직하게는, 10 내지 100 mM, 예컨대 50 mM의 농도의 시트레이트/포스페이트 완충제, 또는 3 내지 6, 바람직하게는 4의 카보히드라아제의 우선적인 pH로 완충할 수 있게 하는 임의의 다른 조성물에 의해 pH를 조정한다. 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분/완충 용액의 비율은 2/100 내지 30/100, 바람직하게는 10/100이다.

대안적으로, 유기 산 또는 미네랄 염기의 용액을 첨가함으로써, 바람직하게는 6.5 내지 8.5, 보다 우선적으로는 7.5 내지 8.5의 pH로, 특히, 8의 pH로 조정한다. 바람직하게는, 0.1 M 내지 3 M, 바람직하게는 1 M의 농도의 수산화칼륨 또는 수산화나트륨, 또는 6.5 내지 8.5, 바람직하게는 8의 프로테아제의 우선적인 pH로 완충할 수 있게 하는 임의의 다른 조성물에 의해 pH를 조정한다. 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분/완충 용액의 비율은 2/100 내지 30/100, 바람직하게는 10/100이다.

특정 실시형태에서, 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분의 효소 이중 절단은 카보히드라아제 및 프로테아제 효소를 사용하여 수행된다.

제1 변형예에 따르면, pH를 주어진 값으로 선택적 조정한 후, 순차적으로 카보히드라아제 효소의 작용에 의해 그리고 이어서 프로테아제 효소의 작용에 의해 절단이 수행된다.

제2 변형예에 따르면, pH를 주어진 값으로 선택적 조정한 후, 순차적으로 프로테아제 효소의 작용에 의해 그리고 이어서 카보히드라아제 효소의 작용에 의해 절단이 수행된다.

일 실시형태에 따르면, 불활성화 단계, 특히 열 불활성화는 2개의 효소 절단 단계들 사이에 발생한다. 이러한 실시형태의 제1 변형예에 따르면, 상기 세포의 현탁액 중의 선택적으로 원심분리된 구성성분은 선택적으로 주어진 pH로 조정되고 이어서 프로테아제 효소로 먼저 처리되며, 이어서 불활성화 단계에 가해지고, 이어서 카보히드라아제 효소로 처리된다. 이러한 실시형태의 제2 변형예에 따르면, 상기 세포의 현탁액 중의 선택적으로 원심분리된 구성성분은 선택적으로 주어진 pH로 조정되고 이어서 카보히드라아제 효소로 먼저 처리되며, 이어서 불활성화 단계에 가해지고, 이어서 프로테아제 효소로 처리된다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 용어 "카보히드라아제 효소"는 셀룰라아제(엔도-글루카나아제, 셀로바이오히드롤라아제, 베타-글루코시다아제), 헤미셀룰라아제, 자일라나아제, 펙티나아제 및 이들의 혼합물, 예를 들어 Novozyme 사에 의해 판매되는 효소 Viscozyme L®과 같은 효소를 의미한다. Viscozyme L은 아스페르길루스(Aspergillus) 종으로부터 분리된 카보히드라아제의 혼합물이다. 사용되는 카보히드라아제의 양은 0.01 중량% 내지 5 중량%, 보다 우선적으로는 2 중량% 내지 3 중량%, 예컨대 2.5 중량%이다. 작동 온도는 40℃ 내지 60℃, 우선적으로는 50℃이고; 작동 pH는 3 내지 6(경계값 포함), 바람직하게는 4이고, 처리 시간은 특히, 50 rpm 내지 250 rpm, 예컨대 150 rpm으로 교반하면서 30분 내지 24시간, 우선적으로는 90분이다. 효소 용액/상기 세포의 구성성분의 완충 현탁액의 비율은 0.5/100 내지 20/100, 바람직하게는 2.5/100 범위이다.

용어 "프로테아제 효소"는, 예를 들어 EC3.4 분류의 효소, 예컨대 엑소프로테아제, 엔도프로테아제 및 이들의 혼합물을 의미한다.

본 발명의 바람직한 형태에 따르면, 용어 "프로테아제 효소"는 Novozyme 사에 의해 판매되는 효소 Alcalase 2.4L을 의미한다. Alcalase 2.4L은 바실러스 리케니포르미스(Bacillus licheniformis)로부터 정제되고 분리된 넓은 범위의 엔도프로테아제이다. 사용되는 프로테아제의 양은 0.01 중량% 내지 5 중량%, 보다 우선적으로는 2 중량% 내지 3 중량%, 예컨대 2.5 중량%이다. 작동 온도는 40℃ 내지 60℃, 우선적으로는 50℃이고; 작동 pH는 6.5 내지 8.5(경계값 포함), 우선적으로는 7.5 내지 8.5, 예컨대 8이고, 처리 시간은 특히, 50 rpm 내지 250 rpm, 바람직하게는 150 rpm으로 교반하면서 30분 내지 24시간, 우선적으로는 90분이다. 효소 용액/상기 세포의 구성성분의 완충 현탁액의 비율은 0.5/100 내지 20/100, 바람직하게는 2.5/100 범위이다.

바람직한 실시형태에 따르면, 상기 세포의 현탁액 중의 구성성분의 절단은 순차적으로 Novozyme 사에 의해 판매되는 Viscozyme L®의 작용에 의해 그리고 이어서 Novozyme 사에 의해 판매되는 Alcalase 2.4L의 작용에 의해 수행된다.

특정 실시형태에 따르면, 효소 절단의 불활성화는 10분 내지 30분, 바람직하게는 15분의 기간에 걸쳐 수행될 수 있는 열 불활성화이다.

특정 실시형태에서, 효소 절단의 불활성화는 80℃ 내지 90℃의 항온, 바람직하게는 90℃의 온도에서 수행된다.

용어 "약 15분"은 15분 ± 5분의 기간을 의미한다.

특정 실시형태에서, 불활성화 단계의 종료 시에, 반응 매질의 pH는 유기 산 또는 미네랄 산 또는 유기 염기 또는 미네랄 염기, 바람직하게는 유기 산 또는 미네랄 산에 의해 7로 조정된다.

효소 이중 절단으로부터 수득된 가수분해 생성물은 30분 동안 4℃에서 특히 10 000×G의 원심분리 단계를 겪을 수 있다. 이러한 원심분리 단계 후에 수득된 상청액은 당업자에게 알려진 임의의 건조 기술을 통해, 바람직하게는 동결 건조 또는 미립자화에 의해 건조된다.

이렇게 수득된 추출물은 또한 상기 세포의 불용성 구성성분의 가수분해물, 특히 펙토셀룰로오스 벽 및/또는 세포막의 가수분해물로 불릴 수 있다.

본 발명에서 사용하기에 적합한 또 다른 추출물은 증발, 동결 건조 또는 미립자화와 같은 임의의 통상적인 건조 단계에 따라, 특히 상기 제1 및 제2 실시형태에서 언급한 것과 같은 추출물로부터 수득된, 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포의 건조 추출물일 수 있다. 따라서, 분말이 수득되고, 이는 직접 사용되거나 또는 그렇지 않으면 사용 전에 적절한 용매에서 혼합될 수 있다.

본 발명의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물은 또한 동결 건조물의 형태로 사용될 수 있다. 그러한 동결 건조물은 당업자에게 알려진 임의의 동결 건조 방법에 의해 수득될 수 있다.

원칙적으로, 동결 건조는 냉기와 진공의 결합된 작용에 의해 액체, 페이스티 또는 고체 생성물로부터 물을 제거하는 것으로 구성된다. 고체 상태의 물을 매우 낮은 압력에서 가열하는 경우, 물은 승화하고, 즉 고체 상태에서 기체 상태로 직접적으로 이동한다. 수증기(또는 임의의 다른 용매의 증기)는 생성물을 떠나고, 이는 응축기 또는 트랩을 사용하여 동결시킴으로써 포획된다. 이러한 기술은 처리된 생성물의 부피 및 외관 둘 모두를 보존할 수 있게 한다. 이러한 기술은 동결 건조기를 사용하여 수행될 수 있다.

동결 건조는 다음의 적어도 2개의 단계를 포함한다: 동결, 승화 및 선택적으로 2차 건조.

동결은 액체 상태에 있었던 위치에서 얼음 형태로 물을 차단하기 위해 물질을 -20℃ 내지 -80℃의 온도로 매우 빠르게 만드는 것으로 구성된다.

승화는 "자유" 물을 제거하는 것으로 구성된다. 생성물 마다 크게 달라질 수 있지만 100 μbar 내지 1000 μbar의 영역의 진공하에서, 열이 생성물로 공급되고; 얼음은 승화를 겪는다. 생성물 및 생성 요구 사항에 따라, 온도는 사이클 동안 달라질 수 있다. 수증기는 "트랩" 또는 "응축기"에 의해 포획되고, 생성물의 탈수가 연속적으로 진행된다. 대부분의 물이 승화를 겪는 경우, 생성물은 약 80% 내지 90%의 수분을 상실한다.

2차 건조는 포획된 물을 생성물로부터 제거하는 것으로 구성된다. 이 단계에서, 진공은 5 μbar 내지 100 μbar의 영역에서 높다. 이 단계 후에, 생성물은, 특히 90% 내지 99%, 예컨대 95% 건조하다.

예를 들어, 제어된 다공성(약 50 μm)을 갖는 거즈를 통해 여과하여 배양 배지로부터 세포를 회수한 후에, 세포를 저온, 바람직하게는 -20℃ 내지 -80℃의 온도에서 동결시킨다. 이어서, 동결된 세포를 100 내지 1000 μbar 범위의 진공하에서 얼음을 승화하는 단계에 가하고, 이어서, 5 μbar 내지 100 μbar 범위의 진공하에서 2차 건조하는 단계에 가한다.

동결 건조된 비유도된 탈분화 식물 세포를 사용 전에 물 또는 물을 함유하는 혼합물로 보충할 수 있다.

미용 조성물

유리하게는, 상기 비유도된 탈분화 식물 세포 및/또는 이의 추출물은 이를 함유하는 조성물의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 40 중량%의 고체를 나타내는 양으로, 우선적으로는 조성물의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 20 중량%의 고체를 나타내는 양으로, 바람직하게는 조성물의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 10 중량%의 고체를 나타내는 양으로 사용된다.

본 발명에 따른 조성물은 생리학적으로 허용가능한 매질를 함유한다.

이러한 생리학적으로 허용가능한 매질은, 보다 특히 물, 및 선택적으로, 예를 들어 1 내지 8개의 탄소 원자, 특히 1 내지 6개의 탄소 원자를 포함하는 저급 알코올, 예를 들어 에탄올, 이소프로판올, 프로판올 또는 부탄올; 6 내지 80개의 에틸렌 옥사이드 단위를 함유하는 폴리에틸렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 프로필렌 글리콜, 이소프렌 글리콜, 부틸렌 글리콜, 글리세롤, 소르비톨 또는 1,3-프로판디올로부터 선택되는 생리학적으로 허용가능한 유기 용매로 이루어질 수 있다.

이는 또한 무수 매질, 특히 오일 및/또는 오일 이외의 지방 물질을 함유하는 오일 매질일 수 있다.

생리학적으로 허용가능한 매질이 수성 매질인 경우, 이는 바람직하게는 3 내지 8, 보다 양호하게는 4 내지 7 범위의 피부와 양립할 수 있는 pH를 갖는다.

조성물이 수성 또는 수성-알코올성 매질을 포함하는 경우, 이러한 매질에 지방(또는 오일) 상을 첨가할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 특히 피부에 국소 도포하기 위한 조성물이다.

따라서, 상기 정의된 바와 같은, 라벤더 종 식물의 탈분화된 식물 세포 또는 이의 추출물을 함유하는 본 발명에 따른 조성물은 국소 도포를 위해 통상적으로 사용되는 임의의 제시 형태, 특히 수성, 수성-알코올성 또는 오일 용액, 수중유(O/W), 유중수(W/O) 또는 다중(삼중: W/O/W 또는 O/W/O) 에멀젼, 수성 또는 오일 겔, 액체, 페이스티 또는 고체 무수 생성물, 또는 소구체(spherule)를 이용한 수성 상 중의 지방 상의 분산액의 형태일 수 있으며, 이러한 소구체는 가능하게는 나노스피어 및 나노캡슐과 같은 중합체성 나노입자, 또는 이온성 및/또는 비이온성 유형의 지질 액포이다. 이러한 조성물은 일반적인 방법에 따라 제조된다.

또한, 본 발명에 따라 사용된 조성물은 거의 유체일 수 있고 백색 또는 유색의 크림, 포마드(pomade), 유액(milk), 로션, 세럼, 페이스트 또는 무스의 외관을 가질 수 있다. 이들은 선택적으로 에어로졸 형태로 피부에 도포될 수 있다. 이들은 또한 고체 형태, 예를 들어 스틱의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명에 따라 사용된 조성물이 오일 상을 포함하는 경우, 이는 바람직하게는 적어도 하나의 오일을 함유한다. 이는 또한 다른 지방 물질을 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물에 사용될 수 있는 오일로서, 언급될 수 있는 예는 하기를 포함한다:

- 동물 기원의 탄화수소계 오일; 식물 기원의 탄화수소계 오일,

- 특히 지방산, 예를 들어 화학식 R1COOR2 및 R1OR2(여기서, R1은 8 내지 29개의 탄소 원자를 포함하는 지방산 잔기를 나타내고, R2는 3 내지 30개의 탄소 원자를 함유하는 분지형 또는 비분지형 탄화수소계 사슬을 나타냄)의 오일의 합성 에스테르 및 에테르,

- 미네랄 또는 합성 기원의 선형 또는 분지형 탄화수소,

- 8 내지 26개의 탄소 원자를 함유하는 지방 알코올,

- 부분적으로 탄화수소계인 플루오로 오일, 및/또는

- 선형 또는 환형 실리콘 사슬을 갖는 휘발성 또는 비휘발성 폴리메틸실록산(PDMS)과 같은 실리콘 오일(이는 실온에서 액체 또는 페이스티일 수 있음), 및

- 이들의 혼합물.

상기에 언급된 오일의 목록에서, 용어 "탄화수소계 오일"은 주로 탄소 및 수소 원자, 그리고 가능하게는 에스테르, 에테르, 플루오로, 카르복실산 및/또는 알코올 기를 포함하는 임의의 오일을 의미한다.

오일 상에 존재할 수 있는 다른 지방 물질은, 예를 들어 8 내지 30개의 탄소 원자를 포함하는 지방산, 왁스, 실리콘 수지 및 실리콘 탄성중합체이다.

이러한 지방 물질은 예를 들어 주도(consistency) 또는 텍스쳐(texture)의 관점에서 원하는 특성을 갖는 조성물을 제조하기 위해 당업자에 의해 다양한 방식으로 선택될 수 있다.

본 발명의 특정 실시형태에 따르면, 본 발명에 따른 조성물은 유중수(W/O) 또는 수중유(O/W) 에멀젼, 보다 특히 O/W 에멀젼이다. 에멀젼의 오일 상의 비율은 조성물의 총 중량에 대해 5 중량% 내지 80 중량%, 바람직하게는 5 중량% 내지 50 중량%의 범위일 수 있다. 조성물에서 에멀젼 형태로 사용되는 오일, 유화제 및 보조유화제(coemulsifier)는 화장품 또는 피부과에서 통상적으로 사용되는 것들로부터 선택된다. 유화제 및 보조유화제는 일반적으로 조성물의 총 중량에 대해 0.3 중량% 내지 30 중량%, 바람직하게 0.5 중량% 내지 20 중량% 범위의 비율로 조성물에 존재한다. 에멀젼은 또한 지질 액포를 함유할 수 있다.

에멀젼은 일반적으로 단독으로 또는 혼합물로 사용되는, 양쪽성, 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 유화제로부터 선택되는 적어도 하나의 유화제를 함유한다. 유화제는 수득될 에멀젼(W/O 또는 O/W 에멀션)에 따라 적절한 방식으로 선택된다.

본 발명의 미용 조성물은 또한 미용 분야에서 일반적인 보조제, 예컨대 친수성 또는 친유성 겔화제 또는 증점화제, 예컨대 잔탄 검, 친수성 또는 친유성 활성제, 방부제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 스크리닝제, 냄새 흡수제, 염료 및 염을 함유할 수 있다. 이러한 다양한 보조제의 양은 고려되는 분야에서 통상적으로 사용되는 양, 예를 들어 조성물의 총 중량의 0.01% 내지 20%이다. 보조제의 속성에 따라서, 이러한 보조제는 지방 상 내로 또는 수성 상 내로, 또는 지질 소구체 내로 도입될 수 있다.

실시예

실시예 1

실시예 1a - 라벤더(프랑스 소재의 Dr

me에서 재배됨)의 비유도된 탈분화 세포의 세포내 매질의 수성 추출물의 생성 - 본 발명에 따름

30분 동안 차아염소산칼슘(60%의 활성 염소를 함유하는 50 g/l 또는 40 g/l) 중 기생(aerial) 부분의 수집 및 이어서 오염 제거. 멸균 삼투압수를 갖는 3개의 욕에서 연속적으로 세정(5분/욕).

기생 부분의 외식편으로의 세절, 오직 잎만을 수집.

명암하에 아가(agar) 상에 하기 표 1에 나타낸 배양 배지 상에서 잎을 재배한다.

[표 1]

배양 배지의 존재하에서 연속적 계대배양 후, 발효조에서 재배될 수 있는 탈분화된 식물 세포를 수득하였다. 생물 반응기에서의 재배를 제어하기 위해 사용되는 파라미터는 다음과 같다:

- T°: 27℃;

- 에어레이션: pO₂ 30%, 세포에 대한 어떠한 전단 응력을 방지하면서 유입되는 멸균 공기에 의해 및/또는 교반을 통해 조절됨.

- 교반: 150 rpm.

배치 방식 생성을 약 10일 지속한다. 이어서, 수득된 배양 배지를 50 μm의 다공성을 갖는 거즈를 통해 여과하여 탈분화된 세포로부터 분리한다.

여과 단계의 종료 시에, 물의 존재하에 1/1의 [세포/물] 질량비로 고압 균질화기(2000 bar)를 사용하여 상기 수득된 세포를 밀링한다. 이어서, 4℃에서 30분 동안 10 000×G에서의 여과 후 상청액을 0.7 μm Whatman 셀룰로오스 필터를 사용하여 여과함으로써 현탁액 중의 입자를 제거하여 세포내 매질의 수성 추출물을 수득한다.

이렇게 수득된 수성 추출물을 다음의 조건하에서 동결 건조에 의해 건조시킨다: -40℃에서 샘플을 동결시키는 단계에 이어서 20℃에서 진공하에(< 1 mbar) 두어 승화시킨 다음, 시스템으로의 공기 주입을 제거하여 100 μbar의 보다 낮은 압력에서 2차 건조를 달성함; 이에 의해 건조 추출물이 생성된다.

실시예 1b - 라벤더의 비유도된 탈분화 세포의 세포내 매질의 알코올성 추출물의 생성 - 본 발명에 따름

실시예 1에서 50 μm 거즈를 통한 여과 단계의 종료 시에, 에탄올의 존재하에 고압 균질화기(2000 bar)를 사용하여 상기 수득된 세포를 밀링한다: [세포/용매] 비는 1/1이다. 이어서, 4℃에서 30분 동안 10 000×G에서의 여과 후 상청액을 0.7 μm Whatman 셀룰로오스 필터를 사용하여 여과함으로써 현탁액 중의 입자를 제거하여 세포내 매질의 알코올성 추출물을 수득한다.

이렇게 수득된 추출물을 2개의 단계로 건조한다:

- 50℃에서 회전 증발기 상에서 농축한 후 물에 재용해시킴; 및 이어서

- 다음의 조건하에 동결 건조시킴: -40℃에서 샘플을 동결시키는 단계에 이어서 20℃에서 진공하에(< 1 mbar) 두어 승화시킨 다음, 시스템으로의 공기 주입을 제거하여 100 μbar의 보다 낮은 압력에서 2차 건조를 달성함; 이에 의해 건조 추출물이 생성됨.

실시예 1c - 라벤더의 비유도된 탈분화 세포의 펙토셀룰로오스 벽 및 세포막의 가수분해물의 생성 - 본 발명에 따름

실시예 1에서 50 μm 거즈를 통한 여과 단계의 종료 시에, 물의 존재하에 1/1의 [세포/물] 질량비로 고압 균질화기(2000 bar)를 사용하여 상기 수득된 세포를 밀링한다. 이어서, 현탁액 중의 입자 또는 파편을 4℃에서 30분 동안 10 000×G으로 원심분리하여 회수한다.

수득된 펠렛의 효소 가수분해의 제1 단계를 카보히드라아제에 의해 수행하고, 이 단계는 셀룰로오스 화합물의 가수분해를 가능하게 한다:

- 10/100의 파편/완충된 용액 비율로 pH 4의 완충된 용액(50 mM 시트레이트/포스페이트 완충제) 중에 벽 파편을 현탁하는 단계.

- 2.5/100 범위의 효소 용액/완충된 파편 현탁액 비율로 카보히드라아제의 효소 용액(Novozyme으로부터의 Viscozyme L)을 첨가함으로써 벽 파편을 가수분해하는 단계. 이 혼합물을 50℃의 카보히드라아제의 최적 작동 온도에 두고, 90분의 기간 동안 150 rpm으로 교반한다.

이어서, 프로테아제에 의한 단백질 가수분해의 제2 단계를 수행한다:

- 수산화칼륨과 같은 진한 염기성 용액을 단순히 첨가하여, 반응 혼합물의 pH를 프로테아제에 대해 우선적인 pH, 즉 8로 조정하는 단계.

- 2.5/100 범위의 효소 용액/완충된 파편 현탁액 비율로 프로테아제의 효소 용액(Novozyme으로부터의 Alcalase 2.4L)을 첨가함으로써 벽 파편을 가수분해하는 단계. 이 혼합물을 50℃의 프로테아제의 최적 작동 온도에 두고, 90분의 기간 동안 150 rpm으로 교반한다.

이러한 가수분해 단계를 완료하기 위해, 가수분해 생성물을 15분 동안 90℃에서 효소의 불활성화를 겪게 한 후 원심분리(10 000×G, 4℃, 30분)에 의해 선행하는 2개의 가수분해 단계로부터 수득된 가수분해 생성물로부터 현탁액 중에 남아 있는 입자를 분리한다.

원심분리로부터 수득된 상청액을 농축시키고 저장하기 위해서, 다음의 조건하에서 동결 건조에 의해 건조시킨다: -40℃에서 샘플을 동결시키는 단계에 이어서 20℃에서 진공하에(< 1 mbar) 두어 승화시킨 다음, 시스템으로의 공기 주입을 제거하여 100 μbar의 보다 낮은 압력에서 2차 건조를 달성함.

수득된 생성물은 세포 벽 가수분해물로 불리고; 이는 당류 화합물이 풍부하다.

실시예 2 - 라벤더의 UV-유도된 탈분화된 세포의 수성 추출물의 생성- 본 발명의 범위 밖

생성 배지(표 1의 배양 배지 조성 참고) 중에서 이들의 재배 동안, 라벤더 세포주를 접종 후 10일에 50 cm의 거리에 놓인 4개의 Philips CLEO 퍼포먼스 태양등(40-0-14/2.6)을 사용하여 15시간 동안 세포 위의 직사 광선에서 UV 광(280 내지 400 nm)으로 유도한다.

이러한 유도는 명백하게 세포 배양에 어떠한 불순물도 형성되지 않음을 의미한다. 재배의 종료 시에, 즉 유도 후 24 시간에, 식물 세포를 50 μm의 다공성을 갖는 거즈를 통해 여과하여 남아 있는 배양 배지를 제거한다. 여과 단계의 종료 시에, 이에 따른 새로운 바이오매스(biomass)가 수득되고; 수득된 상기 세포를 2000 bar에서 물의 존재하에 고압 균질화기에서 밀링하여 세포의 세포내 매질을 추출한다. 이렇게 수득된 추출물을 다음의 조건하에서 동결 건조에 의해 건조시킨다: -40℃에서 샘플을 동결시키는 단계에 이어서 20℃에서 진공하에(< 1 mbar) 두어 승화시킨 다음, 시스템으로의 공기 주입을 제거하여 100 μbar의 보다 낮은 압력에서 2차 건조를 달성함.

실시예 3

실시예 3a: 실시예 1a에 따라 수득된 추출물(본 발명에 따름) 및 실시예 2에 따라 수득된 추출물(본 발명의 범위 밖)의 UPLC 크로마토그래피 프로파일의 분석

A) 재료 및 방법

추출물 1a 및 2의 유사-정량 분석을 수행하기 위해서, 이들을 동일한 농도로 준비하고, 용액을 UV 범위에서 흡수하는 표준물, 즉 카페인으로 도핑한다.

제1 단계는 샘플을 물에 용해시켜 5 g/L의 용액을 제공하는 것으로 구성된다. 이렇게 생성된 용액을 온화하게 가열하고, 30분 동안 초음파 처리한다.

제2 단계는 0.17 g/L의 농도로 물 중 카페인의 용액을 제조하는 것으로 구성된다.

최종 단계는 1.8 mL의 샘플 용액(세포 추출물 1a 또는 2)을 0.2 mL의 카페인 용액과 혼합하고, 혼합물을 균질화한 후, 0.45 μm 필터에 이어서 0.2 μm 필터를 통해 여과하는 것으로 구성된다.

다이오드 어래이 검출기, Corona 검출기(CAD) 및 단일 4중극자 질량 분석기를 포함하는 Acquity UPLC Additol H-Class 시스템(Waters) 상에서 분석을 수행한다.

크로마토그래피 시스템

- Acquity UPLC BEH Shield RP18 컬럼

- 길이 50 mm

- 내경 2.1 mm

- 컬럼 부피 0 ml

- 입자 직경 1.8 μm

- 이동상: A = 물 0.1% HCOOH; B = ACN(아세토니트릴) 0.1% HCOOH

- 유속 = 0.5 mL/분

- 주입 부피 2 μL

- 온도: T컬럼 = 30℃; T샘플 = 20℃

구배 1이 하기 표 2에 나타나 있다.

[표 2]

검출

- 다이오드 어래이 검출기(DAD): 200 내지 700 nm 범위에 걸쳐 크로마토그램을 기록한다.

- Corona 충전 에어로졸 검출기(CAD): 압력을 P = 35.1 psi로 설정하고, 이는 D = 1.21 bar로 설정된 질소 유속에 상응한다.

- 질량 분석기(MS): HPLC의 질량 분석기에의 커플링은 전기 분무 이온화(ESI) 공급원이 구비된 단일 4중극자 질량 분석기에 의해 수행되고; 질량 분석기는 100 내지 2000 amu 질량 범위에 걸쳐 양이온 및 음이온 이온화 모드로 동시에 작동한다.

B) 결과

추출물 1a 및 2의 2개의 크로마토그램이 중첩되어 있다(도 1 참고).

23개의 타겟 화합물 중에서:

- 1 화합물은 세포가 UV로 유도될 때 소모되고,

- 6 화합물은 유도에 의해 영향을 받지 않고,

- 11 화합물은 세포가 UV로 유도될 때 농축되고,

- 5 화합물은 새롭게 합성되었다(방법의 한계로, 비유도된 샘플 중에 검출되지 않음).

따라서, 2개의 추출물 1a 및 2는 그의 조성이 서로 상이하다.

실시예 3b: 실시예 1a에 따라 수득된 라벤더의 비유도된 탈분화 세포의 추출물(본 발명에 따름) 대 실시예 2에 따라 수득된 라벤더의 UV-유도된 탈분화된 세포의 본 발명의 범위 밖의 추출물(본 발명의 범위 밖)의 장벽 기능/보습 표지자에 대한 효과의 평가

A) 재료 및 방법

세포 독성

정상 인간의 표피 각질형성세포를 96-웰 배양판에 시딩한 후, 24시간 동안 배양 배지에서 37℃ 및 5% CO₂에서 재배하였다. 이어서, 상기 배지를 시험 화합물(8개의 농도가 시험됨)을 함유하거나 함유하지 않은(대조군) 배양 배지로 대체한 후, 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 조건은 n = 2로 수행하였다. 인큐베이션의 종료 시에, Alamar Blue®를 사용하여 미토콘드리아 활성을 측정하는 표준 시험에 의해 세포 생존력을 측정하였다.

RT-qPCT에 의한 장벽 기능/보습과 관련된 유전자의 발현 분석

정상 인간의 표피 각질형성세포(NHEK)를 48-웰 배양판에 시딩한 후, 재배 첫 24시간 후 배양 배지를 재생하면서 배양 배지에서 37℃ 및 5% CO₂에서 3일 동안 재배하였다. 인큐베이션의 종료 시에, 배양 배지를 시험 화합물을 함유하지 않거나 함유하는(대조군) 시험 배지(1.5 mM CaCl₂로 보충됨)로 대체한 후, 세포를 24시간 동안 인큐베이션하였다. 모든 조건은 n = 2로 수행하였다.

처리의 종료 시에, 배양 배지를 제거하고, 세포를 PBS로 2회 세정하였다(w/o CaCl₂, w/o MgCl₂). 이어서, 전체 RNA를 공급자의 권고 사항에 따라 자기 비드 추출 키트를 사용하여 분리하였다(MagMAXTM-96 전체 RNA 분리 키트, Ambion). RNA 정량화 및 그의 정성 조절을 Labchip GX(Perkin Elmer)에 의해 분석하였다.

선택된 전사물의 발현을 정량 PCR에 의해 2개의 단계로 분석하였다. 먼저, cDNA를 공급자의 권고사항에 따라 Quantitect® 역 전사 키트(Qiagen)를 사용하여, RNA로부터 역 전사시켰다. 이어서, 정량 PCR 실험을 SYBR®Green(Roche) 혼입 기술에 따라 384-웰 판에서 LightCycler® 480 실시간 PCR 시스템(Roche)을 사용하여 수행하였다. 사용된 프라이머가 하기 표2에 나타나 있다.

[표 3]

B) 결과

[표 4]

실시예 1a에 따라 수득된 비유도된 세포의 추출물(본 발명에 따른 추출물)은 실시예 2에 따른 UV-유도된 세포의 추출물(본 발명의 범위 밖의 추출물)과 비교하여 각화층의 조립(SPRR1A, CNFN), 각질형성세포 분화(AQP3) 및 표피 재생(HBEGF)에 관여하는 전사물의 발현을 현저히 자극하였다.

따라서, 본 발명에 따른 라벤더로부터의 비유도된 탈분화 세포의 추출물 1a는 탈수된 피부를 예방하고 치료하며, 장벽 기능을 개선시키고 강화시키는 데 특히 효과적인 것으로 판명된다.

실시예 4 - 코니오미터(corneometer)를 사용한 측정에 의한 분리된 각질층에 대한 보습 잠재력의 평가

조성물의 총 중량에 대해 5 중량%의 양으로 비히클(80%/20% 물/n-프로판올) 중에 제형화된 본 발명의 추출물의 보습 잠재력을 평가하기 위한 시험을 수행하였다.

이 기술은 각질층(SC)의 유전 용량을 측정할 수 있게 하는데, 상기 유전 용량은 상기 조직의 평균 유전율 값에 따라 달라진다. 유전율은 SC에 함유된 물의 양에 따라 크게 달라진다.

SC 샘플을 측정 및 처리 전/그 동안 75%의 상대 습도 및 25℃에서 컨디셔닝한다. 유전 용량 측정은 Corneometer™(Courage & Khazaka, 독일 소재)을 사용하여 수행한다.

시험 추출물, 즉 본 발명에 따른 추출물 1a, 1b 및 1c 또는 보습 활성제, 예컨대 글리세롤을 물/n-프로판올 혼합물(80/20)에 용해시키고 상기 용액을 10 μL/cm²의 속도로 SC 상에 침적시키고, 이어서 총 4시간의 지속 시간 동안 공기 건조시킨다.

측정치를 처리 전, T0에서 취하고, 측정치 T처리(4h)를 처리의 전체 건조 후에 취한다.

각각의 처리를 그의 대조군(비히클) 및 T0과 체계적으로 비교한다.

SC의 적어도 2개의 상이한 배치를 사용하여, 4 내지 5개의 SC 샘플을 처리마다 측정한다.

처리 후 코니오미터 신호(HCM)의 변화를 먼저 각각의 SC 샘플에 대해 계산한다: DHCMi = HCMi(T처리) - HCMi(T0). 이어서, DHCMi(비히클) 변화의 평균을 대조군 샘플(비히클로 처리됨)에 대해 계산하고; 이러한 평균 값을 모든 DHCMi(활성제) 및 DHCMi(양성 대조군) 변화로부터 공제하여 계통 오차를 보정한다.

각각의 샘플 i에 대해 다음을 측정한다:

비히클(대조군)에 대해: DHCMi(비히클) = HCMiveh(T처리) - HCMiveh(T0)

활성제에 대해: DHCMi활성제 = HCMi활성제(T처리) - HCMi활성제(T0)

양성 대조군(글리세롤)에 대해: DHCMi양성 대조군 = HCMi양성 대조군(T처리) - HCMi양성 대조군(T0).

비히클과 관련된 계통 오차를 보정하기 위해, 다음에 따라 활성제에 대해 보정 값 DHCMi보정 활성제를 고려한다: DHCMi보정 활성제 = DHCMi활성제 - M(비히클)

식 중, M(비히클)은 n 비히클 대조군 샘플에 대해 관찰된 DHCMi(비히클) 변화의 평균에 상응한다:

[수학식 1]

비히클과 관련된 계통 오차를 보정하기 위해, 다음에 따라 양성 대조군에 대해 보정 값 DHCMi보정 양성 대조군을 고려한다: DHCMi보정 양성 대조군 = DHCMi양성 대조군 - M(비히클)

식 중, M(비히클)은 앞서 정의된 바와 같다.

이어서, DHCMi보정 양성 대조군 및 DHCMi보정 활성제를 다음 계산식에 따라 정규화한다:

%정규화 = [(DHCMi보정 양성 대조군) / (M(양성 대조군) - M(비히클))] x 100

%정규화 = [(DHCMi보정 활성제) / (M(양성 대조군) - M(비히클))] x 100

식 중, M(비히클)은 앞서 정의된 바와 같고;

M(양성 대조군)은 n 양성 대조군 샘플에 대해 관찰된 DHCMi양성 대조군 변화의 평균에 상응한다:

[수학식 2]

5%의 글리세롤과 비교하여 5%에서 시험된 본 발명에 따른 추출물에 대해 수득된 %정규화 값이 하기 표에 기록되어 있다.

[표 5]

이 시험은 추출물 1a 또는 1b에 의해 수득된 각질층(SC)의 유전체 용량이 동일한 농도의 글리세롤에 의해 수득된 것과 유사함을 보여준다. 또한, 추출물 1c에 의해 수득된 각질층(SC)의 유전체 용량은 동일한 농도의 글리세롤에 의해 수득된 것보다 훨씬 더 양호하다.

예기치 않게, 본 발명에 따른 추출물 1a, 1b 및 1c는 각질층 및 이에 따른 피부의 우수한 보습을 허용한다. 이러한 보습 효과는 글리세롤의 것과 유사하거나(추출물 1a 및 1b) 더 큰 것(추출물 1c)으로 판명된다.

실시예 5 - 미용 조성물

하기 조성물을 제조하였다.

[표 6]

상기 조성물을 피부에 도포하여 장벽 기능을 강화시키고/시키거나 피부를 보습하였다.

Claims (18)

1. 라벤더(Lavandula angustifolia) 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포, 또는 이의 추출물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 수성 및 유기 추출물, 또는 모든 비율에서 물과 혼화성인 적어도 하나의 유기 추출 용매와 물을 혼합함으로써 수득된 추출물, 예컨대 수성-알코올성 추출물로부터 선택되고; 선택적으로 상기 추출물은 건조 추출물의 형태인 것을 특징으로 하는 세포, 또는 이의 추출물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
   상기 라벤더 종 식물의 비유도된 탈분화 세포의 추출물이 다음으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포, 또는 이의 추출물:
   - 세포내 매질의 수성 추출물, 세포내 매질의 수성-알코올성 추출물, 또는 세포내 매질의 유기 추출물; 선택적으로 상기 추출물은 건조 추출물의 형태임; 또는
   - 상기 세포의 불용성 구성성분의 수성 추출물, 상기 세포의 불용성 구성성분의 수성-알코올성 추출물, 또는 상기 세포의 불용성 구성성분의 유기 추출물; 선택적으로 상기 추출물은 건조 추출물의 형태이고, 상기 세포의 상기 불용성 구성성분은 불용성 세포내 구성성분, 펙토셀룰로오스 벽, 세포막 및 이들의 혼합물로부터 선택되고, 바람직하게는 펙토셀룰로오스 벽 및/또는 세포막임.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   라벤더 종 식물의 부분(들)으로부터 수득된 식물 재료로부터 수득되고, 상기 식물 부분(들)은 잎, 줄기, 꽃, 꽃잎, 꽃받침, 씨앗 또는 뿌리로부터 선택되는 식물의 하나 이상의 전체 기관, 또는 생체내 또는 야생에서 재배된 상기 식물 기관(들)의 하나 이상의 단편인 것을 특징으로 하는 세포, 또는 이의 추출물.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   라벤더 식물의 잎 또는 잎의 단편(들)으로부터 선택되는 식물 부분(들)으로부터 수득되는 것을 특징으로 하는 세포, 또는 이의 추출물.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   i. 상기 라벤더 종 식물의 하나 이상의 부분을 제공하는 단계;
   ii. 단계 i에서 제공된 상기 식물 부분(들)을 적어도 하나의 식물 호르몬을 포함하는 배양 배지에서 재배하여 탈분화된 세포를 생성하는 단계;
   iii. 단계 ii의 종료 시에 수득된 상기 탈분화된 세포를 회수하는 단계; 및
   iv. 선택적으로, 단계 iii에서 회수된 상기 탈분화된 세포를 추출하는 단계
   를 포함하는 방법을 통해 수득되고,
   상기 방법은 상기 탈분화된 세포를 유도하는 단계를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포, 또는 이의 추출물.
7. 제6항에 있어서,
   단계 ii에서의 상기 배양 배지는 다음을 포함하는 수성 배양 배지인 것을 특징으로 하는 세포, 또는 이의 추출물:
   - 적어도 하나의 식물 호르몬, 예컨대 1-나프탈렌아세트산, 키네틴 및 이들의 혼합물;
   - NH₄NO₃; KNO₃; CaCl₂, 예컨대 CaCl₂·2H₂O; MgSO₄; KH₂PO₄; MnSO₄, 예컨대 MnSO₄·4H₂O; ZnSO₄, 예컨대 ZnSO₄·7H₂O; KI; Na₂MoO₄, 예컨대 Na₂MoO₄·2H₂O; CuSO₄, 예컨대 CuSO₄·5H₂O; Na₂EDTA, 예컨대 Na₂EDTA·2H₂O; FeSO₄, 예컨대 FeSO₄·7H₂O; 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 선택적으로 수화된 형태의 적어도 하나의 염;
   - 바람직하게는 단당류, 올리고당 또는 다당류, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 탄소 공급원; 특히, 글루코스, 프룩토스, 수크로스 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 탄소 공급원, 바람직하게는 수크로스;
   - 선택적으로 미오이노시톨, 니코틴산, 피리독신 HCl, 티아민 HCl 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 적어도 하나의 화합물; 및
   - 선택적으로 폴리비닐피롤리돈.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
   적어도 NH₄NO₃; KNO₃; CaCl₂·2H₂O; MgSO₄; KH₂PO₄; MnSO₄·4H₂O; ZnSO₄·7H₂O; KI; Na₂MoO₄·2H₂O; CuSO₄·5H₂O; Na₂EDTA·2H₂O; FeSO₄·7H₂O; 미오이노시톨; 니코틴산; 피리독신 HCl; 티아민 HCl; 나프탈렌아세트산; 키네틴; 수크로스, 및 선택적으로 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 수성 배양 배지에서 상기 라벤더 종으로부터의 식물 부분(들)의 재배에 의해 수득되는 것을 특징으로 하는 세포, 또는 이의 추출물.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의한 세포 및/또는 이의 추출물을 생리학적으로 허용가능한 매질에서 포함하는 미용 조성물.
10. 제9항에 있어서,
    상기 탈분화된 식물 세포 및/또는 이의 추출물은 이를 함유하는 조성물의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 40 중량%의 고체를 나타내는 양으로, 우선적으로는 조성물의 총 중량에 대해 0.01 중량% 내지 20 중량%의 고체를 나타내는 양으로 사용되는, 조성물.
11. 피부의 피부 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키기 위해 제9항 또는 제10항에서 정의한 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 미용 치료 방법.
12. 피부 보습을 개선시키고, 거칠기 또는 울퉁불퉁한 피부결을 예방 및/또는 치료하고/하거나, 피부색의 광채를 개선시키고/시키거나, 피부의 탄력을 개선시키기 위해 제9항 또는 제10항에서 정의한 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 미용 치료 방법.
13. 외부 공격으로부터의 피부의 보호를 개선시키고/시키거나 강화시키기 위해 제9항 또는 제10항에서 정의한 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 미용 치료 방법.
14. 피부 건성 상태의 미용 징후를 치료하기 위해 제9항 또는 제10항에서 정의한 조성물을 피부에 도포하는 단계를 포함하는, 미용 치료 방법.
15. 피부의 피부 장벽 기능을 개선시키고/시키거나 강화시키기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의한 라벤더(Lavandula angustifolia) 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도.
16. 외부 공격으로부터의 피부의 보호를 개선시키고/시키거나 강화시키기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의한 라벤더(Lavandula angustifolia) 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도.
17. 피부 보습을 개선시키고, 거칠기 또는 울퉁불퉁한 피부결을 예방 및/또는 치료하고/하거나, 피부색의 광채를 개선시키고/시키거나, 피부의 탄력을 개선시키기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의한 라벤더(Lavandula angustifolia) 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도.
18. 피부의 건성 상태의 미용 징후를 치료하기 위한, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에서 정의한 라벤더(Lavandula angustifolia) 종 식물의 비유도된 탈분화 식물 세포 또는 이의 추출물의 미용 용도.

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