JPH0335788A - ヒアルロン酸の生合性 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はヒアルロン酸に係り特にヒアルロン酸への有機
先駆物質の微生物学的転移に関する。

〔発明の背景〕

ヒアルロン酸はストレプトコッカスのＡ群の多くの菌株
によりおよび０群の大抵の菌株により形成される莢膜の
主成分である。これらの微生物はグルコースを同化する
ことができそして種々の環境条件下に二次代謝物質とし
てヒアルロン酸を生産する；例えばＲｏｓｅｎ＋ａｎら
による記載、　Ｊ、　ＢｉｏＩ。

Ｃｈｅｗ、　恩堕、　２１３　（１９５３）を参照のこ
と。

ストレプトコンカスによるヒアルロン酸の合成は多くの
変化するファクター、遺伝子や栄養のファクターによっ
て影響される。ストレプトコッカスによるヒアルロン酸
の生産のための最適な条件に関する多くの報告にもかか
わらず、これまで条件のすべてが明らかにされていると
は限らない。

遺伝子ファクターに関して、ストレプトコッカスのある
一定の菌株はその生活の一期間中にヒアルロン酸を生産
しそしてもっと遅い時期でヒアルロン酸収率を分泌する
；例えば：　Ｐｉｋｅ、　Ｒ，Ｍ、。

Ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ　ａｎｄ　ｔｌｙａｌｕｒ
ｏｎｉｃ　Ａｃ１ｄ　ｏｆ　ｇｒｏｕｐ　ＡＳｔｒｅ　
　ｔｏｃｏｃｃｉ、＋　　へｍ、　　Ｊ、　　Ｍｅｄ、
、　　４　４６８．　　（１９４８）を参照のこと。予
想されたように、ストレプトコッカスの細胞外ヒアルウ
ロニダーゼ陰性の菌株は制御された条件下に増殖させる
と、高分子量のヒアルロン酸の産出が得られることが報
告されているＧ　Ｂｒｏｗｎらの米国特許第４．７８２
．０４６号を参照のこと。

ストレプトコッカスによるヒアルロン酸の生産のために
必要な環境上のファクターは嫌気性醗酵条件および好気
性醗酵条件の両方を含むことが報告されている。嫌気性
条件下で、醗酵培地１ｉあたり０．３〜１．０　ｇのヒ
アルロン酸収率が報告されている；例えばＴｈｏｎａｒ
ｄ　ら、　Ｊ、　Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｍ、。

２３９、７２６　（１９６４）；　ＨｏＩｔｓｓｔｒａ
ｍら、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏ、、　１５＋１４０９　（１
９６７）；　およびにｊｅｍｓａｎｄ　Ｌｅｂｅｃｈ、
へｅｔａＰａｔｈ、旧ｃｒｏｂｉｏ１．５ｃａｎｄ、、
　８４．１６２　（１９７６）を参照のこと。これらの
方法で得られるヒアルロン酸は一般に７００，０００ま
たはそれ未満の重量平均分子量を有している　［極限粘
度数から計算ＨＬａｕｒｅｎｔらの方法、　Ｂｉｏｃｈ
ｉｍｉｃａ　ｅＬ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ　ＡｃＬａ、
　４２４７６　（１９６０）］、好気性醗酵条件下で、
報告によればより高い重量平均分子量を有する産出物（
約２．０００，０００またはそれ以上）が同等の全収量
で得られるＨ　Ａｋａｓａｋａらにより出願された日本
国公開特許昭５８−０５６６９２号（１９８３年４月４
日）を参照のこと。より高い分子量の産出物は多数の商
業上の目的に有利である。

Ａｋａｓａｋａ　らの公報と同時に、ヒアルロン酸を生
産するストレプトコッカスの培養の際の通気の役割に関
する討論が生じた。Ｃ１ｅａｒｙらのより早期の刊行物
、Ｊ、　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、　１４！１
．　　第３巻、第１０９０〜１０９７頁（１９７９）は
、ヒアルロン酸が酸素分子の有毒な作用からストレプト
コッカスを保護する、酸素を通さない遮蔽物として作用
することを示唆している。従って、細胞保護メカニズム
として、好気性条件はヒアルロン酸の生産を刺激すると
考えられる。この理論に同意する当業者がおりそしてデ
ータをこの主張の支持して向けることができる。実際、
我々自身の研究は少なくともこの理論を一部支持し得る
。

しかしながら、Ｂｒａｃｋｅら　（米国特許第４．５１
７，２９５号、　１９８５年５月１４日）はヒアルロン
酸の改善された収率（培養ブロス１ｆｆｉあたり「最小
限Ｊ２ｇと報告されている）が二酸化炭素が豊富な嫌気
性条件下に得られることを開示している。

従って、ストレプトコッカス体を用いたヒアルロン酸の
生合成における好気性および嫌気性条件の役割に関する
論争がある。

我々は、ヒアルロン酸のさらに高い収率が、微生物の培
養中の好気性条件の制御によってそして制御を通じてス
トレプトコッカスにより生産されることができることを
見出した。我々は操作のいかなる理論によっても拘束さ
れないが、我々は本発明の方法およびその有利な収率が
一部次の説明のためになり得ることを信じている。

病原体であることが知られているストレプトコッカスは
好ましくは閉鎖系で培養される。系を先ず栄養素で満た
しそして密閉することができる。

種子培養菌を密閉系に導入しそして培養を促進す゛る。

代謝産物（二酸化炭素以外の）は、通常、培養中に系か
ら除去されない。

培養の開始時に必要な全ての栄養素を満たした閉鎖系に
おけるストレプトコッカスの好気性培養において、増殖
および代謝結果の典型的な順序がある。先ず、比較的遅
い速度での微生物の一次増殖があるいわゆる「誘導期Ｊ
が起こる。この誘導期の間の培地は、液体栄養培地を発
酵を開始する前に溶存酸素で飽和させる一般に行われる
傾向があるので、一般に高い溶存酸素含量を有している
。

誘導期において、通常、バイオマス、即ち存在する成熟
細胞の重量に比例して微生物によるヒアルロン酸の比較
的高い生産がある。これは少なくとも一部において高い
酸素の存在のためであり得る（前記Ｃ１ｅａｒｙら）。

ある時点で、通常誘導期に入って約４〜８時間後、全バ
イオマスの観察できる増加を伴う指数関数的な細胞増殖
が起こる（「指数増殖期」と称する）。誘導期および指
数増殖期の間、微生物は栄養素および酸素を細胞増殖（
分裂）、維持および二次代謝のために利用する。指数増
殖期の間、ヒアルロン酸を生産しそして培地に、バイオ
マスの増加に実質的に平行に比例して分泌する。これは
誘導期に関連したヒアルロン酸のより高く比例した生産
と対照をなしておりそして細胞活性が二次代謝でなく細
胞分裂のために栄養素を使用することに集中されるので
、予期することができる。細胞代謝は、指数増殖期では
主に生殖に向けられている。

栄養素が培地から枯渇すると、増殖はもはや指数関数的
に持続し得ない。細胞のバイオマスの増加はピークに達
し、いわゆる「定常期」において横ばいとなり次いで微
生物が生殖よりも速く死滅する末期または死滅期におい
て衰退する。栄養素は、細胞生存能力のために細胞維持
のみが続く点に枯渇する。

上記の全てから、当業者はストレプトコッカスによるヒ
アルロン酸の最も良好な全収率は酸素に感性のある微生
物を指数増殖期の間嫌気性条件下に培養しバイオマスの
最適な指数増殖期の増加を獲得し次いで通気を供給して
微生物のより高い固体群を引起してヒアルロン酸分泌を
最大限度に到達させるとしたら得られるであろうと予想
するかもしれない、異なる順序が所望の産出物のより良
好な全収率を提供することおよび厳格な嫌気性条件は全
く必要とされないか望まれないことは我々の知見である
。実際に、培養および比較的高い酸素濃度の存在下での
増殖の指数増殖期の開始を始め次いで指数増殖期の間に
増殖バイオマスに酸素の不足を感じさせるならば、より
高い全収率のヒアルロン酸が得られる。指数関数的に増
殖する間のある時点での酸素有効性の削減は微生物によ
るヒアルロン酸生産のレベルを上げる。

〔発明の構成〕

本発明は、 ヒアルロン酸を生産する、ヒアルウロニダーゼ陰性の微
生物の菌株を供給し； 供給された微生物の培養のために液体栄養素培地を供給
し； 供給された培地に供給された微生物を接種し；接種され
た微生物を、微生物のバイオマスが細胞の乾燥重量に対
して２〜約１０倍のファクターで増加する指数増殖点ま
で好気性条件下に培養し；そして 増加したバイオマスの微生物を減ぜられた溶存酸素有効
性の好気性条件下に培養し； その際微生物は、指数増殖気中に、該微生物が減ぜられ
た酸素有効性の条件の不存在下に生産するであろうより
も不釣合いに大量のヒアルロン酸を生産する ことを特徴とする、ヒアルロン酸の生合成方法を包含す
る。

本発明の方法は栄養素（ヒアルロン酸の有機前駆物質）
の与えられた割合からより大きな全収率のヒアルロン酸
を作り出ス。

〔発明の詳細な説明〕

装置 病原性微生物の培養に一般に使用される慣用の発酵容器
のいずれもが本発明の方法に使用されることができる。

本明細書中に記載された装置は代表的なものである。先
ず第１図を参照すると、本発明の方法の好適な一実施態
様を行うための装置の略図が表されている。先決された
容量の発酵容器１０は完全に閉じられそして大気または
外部環境から封止される。断面図で示された容器１ｏは
内部の、封止された発酵室１２を明らかにする。

室１２への出入は貯蔵器１６からの滅菌培地のための人
口である導管Ｉ４を通じて達成される。バルブ手段１８
は出入を制御する。導管２ｏは室１２に装入する培地の
通気のためのガス入口でありそしてガス貯蔵器２２から
室１２に、好ましくは微小バブルを培地に拡散するため
のガラスフリット２４を通じて酸素を含むガスを運搬す
る手段を提供する。導管２０上のバルブ手段２６は室１
２に入るガスの速度と容積を制御する手段を提供する。

導管２０上の細菌フィルターは培養した微生物が外部環
境に移動するのを妨げそして室１２に運搬される空気や
別の酸素を含むガスを清浄にする。

導管３０は室１２中の培地への通路を提供しｐｉｆ調整
試薬（アルカリまたは酸）を貯蔵器手段３２から供給し
そしてバルブ手段３４によって制御される。導管３６は
室内春物のサンプリングのための室１２への再封止可能
な出入口を提供しそして通常封止されて包含される材料
の流出を避ける。

導管４０は、通気孔でありそして細菌フリツタ−４２を
包含する。バルブ手段４日はそのように望まれた時空１
２の内容物を排出するための手段を提供する。いかなる
数と種類のセンサー線もが、温度、ｐｌＬ溶存酸素含量
および容器１０の内部環境の同様の条件を測定するため
に容器を通ることができる。第１図の図中、酸素センサ
ー５０および溶存酸素測定装置５２のみが図を明らかに
するために示されている。モーター５６は攪拌手段（ミ
キサー５８）を動かす手段を提供する。容器１０は好ま
しくはジャケットをかぶせられて発酵の操作のための加
熱および冷却手段を提供し、微生物を培養する。

溶存酸素を、室１２中に装入された栄養培地に導入する
いかなる慣用の手段もが本発明の方法の実施の際に使用
されることができる；例えば米国特許第４．２０４．０
４２号および同第４，６４３，９７２号に開示されてい
る機械的手段を参照のこと。一般に、慣用の手段は栄養
培地の通気と撹拌（好気性−液内培養技術およびいわゆ
る「エアリフト」技術に一般に使用される）を包含する
。酸素は好ましくは栄養培地に空気の一成分としてかま
たは別のガス、例えば窒素と混和して導入される。

酸素を含むガスを導入するためのガススパージャ−は容
器ｌＯの底で室１２の周囲に置かれた多数のガス開口部
をもつプレナムの形を取ることができる。臨界ではない
が、開口部は、約０．５０〜１０圓の距離によって互い
に隔てられた約０．０５！１１１１〜１００　ａｉの範
囲の直径を有することができる。

栄養培地中の溶存酸素濃度を制御するため、既知のかつ
慣用的に使用される技術のいずれもが使用され得る。例
えば、空気、酸素またはこれらの混合物を用いた通気に
よる酸素の部分圧を変える方法が使用されることができ
る。ガス接触領域中の変化、ガスと液体相（栄養培地）
との間の接触時間、高められた圧力下での培養またはこ
れらのファクターの組合せを同様に用いることができる
。

発酵容器１０の室１２の形状および容器ｌＯ中で遠戚さ
れる混合程度を使用して栄養培地中の「よどんでいる」
帯域を制御することができる。この方法において、酸素
の熔解は、容器ｌＯの設計および攪拌の程度の両方によ
って制御され得る。均質の混合が有利である。

容器ｌＯは如何なる慣用の材料、例えばガラスまたはス
テンレス１４３０４からも、如何なる所望の大きさおよ
び形状に、容認されるそして良好な処理方法に伴い構成
されることができる。一般に、容器１０は約１７１〜約
４：１の範囲にある高さと直径の比率を持つ室１２と共
に実質的に円筒形である。

微生曳 ヒアルロン酸を生産し、ヒアルウロニダーゼ陰性である
ことが知られているストレプトコンカスＡ群およびＣ群
の広範な変種がある；例えばＦａｂｅｒ、　Ｖ、、およ
びｔ？ｏｓｅｎｄａｌ、　Ｋ、＋　１９５４＋５Ｌｒｅ
ｐｔｏｃｏｃｃａｌ　ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ：　
Ｉｌ、　５ｔｕｄｉｅｓ　ｏｎｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　ｈｙａｌｕｒｏｎｉｄａｓｅ　ａｎｄｈ
ｙａｌｕｒｏｎｉｃ　ａｃｉｄ　ｂｙ　ｒｅｐｒｅｓｅ
ｎｔａｔｉｖｅｓ　ｏｆ　ａ目ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｈｅ
ｍｏｌｙｔｉｃ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ　ｂｅｌｏ
ｎｇｉｎｇ　ｔ。

ｇｒｏｕｐＡ、　Ａｃｔａ　Ｐａｔｈ、Ｍｉｃｒｏｂｉ
ｏｌ、５ｃａｎｄ、＋　Ｆａｓｃ、　２゜１０９−１６
４においてこのように同定された微生物を参照のこと。

本発明の方法において使用され得る好ましい微生物はＳ
、　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ、　Ｓ。

ｅｑｕｉｓｉｍｉ　ＩｉｓまたはＳ、　ｐＶＯｇｅｎｅ
ｓ　である。最も好ましい種はＳ、　ｚｏｏｅｐｉｄｅ
ｍｉｃｕｓでありそして好ましい菌株は保管されており
そして公衆がＮａ　ＬｉｏｎａｌＣｕｌｔｕｒｅ　Ｔｙ
ｐｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　６１　Ｃｏ１１ｎｄａ
ｌｅ　Ａｖｅ、。

Ｌｏｎｄｏｎ　ＮＨ３５１１Ｔから自由に入手できるＳ
。

ｓｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ　（ＮＣＴＣ７０２３）で
ある。これはＭａｃＬｅｎｎａｎ、　Ｊ、　Ｇｅｎ、　
Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　１５：　４８５−４９１によりヒ
アルロン酸生産が不十分なヒアルロン酸生産菌株として
記載されている。

欠五壇逍 栄養学的観点から、ストレブトコ・ノカスは培養するた
めに栄養学的に必要なものに関して最も複雑なバクテリ
アの種の中の一つである。しかしながら、文献にはこれ
らの微生物の培養しそしてヒアルロン酸の生産を促進す
るのに必要な栄養素および培地が十分に記載されている
。このような栄養培地はカルボヒトラード、ビタミン、
ア稟ノ酸、無機塩およびある一定の補助的な物質を含む
。栄養学的に必要なものの文献記載の代表的なものはＷ
ｉｌｓｏｎ＋　Ａ、Ｔ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ
　Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ　ＡｓＧｒｏｗｔｈ　Ｆａｃ
ｔｏｒｓ　Ｆｏｒ　ＣｅｒＬａｉｎ　Ｇｒｏｕｐ　Ａ　
ｌｌｅｍｏｌｙｔｉｃＳＬｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、　Ｐ
ｒｏｃ、　Ｓｏｃ、　Ｅｘｐ、　Ｂｉｏｌ、　ａｎｄ　
Ｍｅｄ。

川、　２４９−２５４　（１９４５）中にそしてＷｉｌ
ｓｏｎ、　　　１１．＋　　　Ｐａｎｔｏｔｈｅｎｉｃ
　　Ａｃ１ｄ　　ａｎｄ　　ｔｈｅ　　Ｇｒｏ−むｈｏ
ｆ　５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　Ｈｅｍｏｌｙｔｉｃ
ｕｓ、＋　　Ｂｒ１ｔ、　　Ｊ、　　Ｅｘｐ。

Ｐａｔｈ、　２０．３３０−３４１　（１９３９）中に
見出されるものである。

一般に、サッカロースおよびグルコースはヒアルロン酸
生産のためのカルボヒトラード源として同様に充分に役
立つ。ヒアルロン酸のグルコサミンおよびグルクロン酸
部分はグルコース分子の破壊なくグルコースから誘導さ
れる。グルコースはヒアルロン酸ポリマーのための本質
的な構成単位であるが細胞増殖のための「エネルギー源
」でもある。

高い細胞核グルコース濃度は細胞の呼吸に影響を及ぼす
。短期間の呼吸速度はグルコースのより高い濃度によっ
て減ぜられる。一般に、約３０〜約８５ｇ／ｆの初期の
グルコース装入が栄養培地において使用される。本発明
の好ましい方法は一般に発酵の開始時に約６０　ｇ　／
　ｆｆｉのグルコースの装入を課する。有利には、１〜
３ｇ／Ｉ！、の乾燥細胞重量バイオマスおよび３〜６ｇ
／ｉのヒアルロン酸が生じるように考慮された充分なグ
ルコースが栄養培地に供給される。

栄養培地に包含される窒素源は有機または無機窒素化合
物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン
酸アンモニウム、水酸化アンモニウム、尿素、グルタご
ン、アミノ酸、ペプトン、大豆蛋白質の氷解物等である
ことができる。

さらに、培地に微生物の増殖に有利な適当な種類の無機
塩、例えばカルシウム、カリウム、ナトリウム、マグネ
シウム、マンガン、鉄、銅および亜鉛の例えばスルフア
ート、ヒドロクロリド、カルボナート、ニドラード、ホ
スファートおよびアセタートを添加することもできる。

同様に、微生物の増殖に有利である７５ノ酸、ビタミン
等も添加することができる。これらの栄養素は当業者に
よって判断された量で単独でまたは組み合わせて使用さ
れることができる。

具体的な栄養培地は米国特許第４，５１７，２９５号（
Ｂｒａｃｋｅら）に記載されている。本発明の方法に有
利に使用される別の具体的な栄養培地は次のものを包含
する： 羞地Δ 栄養培地を、水１１あたり指示された割合で以下の成分
を混合することにより調製する：酵母抽出物　　　　　
１０〜５０　ｇ Ｋ、５０４　　　　　　　　１．３５ ＭｇＳ０４７Ｈ２０１，Ｏｇ ＮａｚＳＯ）　　　　　　　　０．２　ｇＣａＣｌｚ　
２Ｈ２０５ｍｇ ＦｅＳＯａ　７８２０　　　　　５　　ｍｇＭｎＳＯｎ
　４１１ｚＯ１ｍｇ ＺｎＳＯａ　７１１ｚＯ１ｍｇ ＣｕＳＯ４５Ｈｔ０　　　　　０．１ｍｇ［１３ＰＯ４
（濃）　　　　　　　１　　ｍｌ培地を０．２μｍのフ
ィルターを通じて濾過することによりまたは２０分間温
度１２１”Ｃに加熱することによって滅菌する。

一般に、培地のｐＨは５〜約８の範囲に調整される。好
ましいｐＨ範囲は６．８〜７．５である。培地のｐｔ＋
が発酵の間に変化して好適な範囲を越えた場合は、調整
するのに必要とされる適当な量の酸またはアルカリを添
加することによって培地のｐｌ＋をそのような範囲に戻
すことができる。アルカリ試薬は水酸化アルカリ、炭酸
カルシウム等の水溶液または懸濁液、または例えばアン
モニアガスであることができる。稀鉱酸、例えば塩酸の
ような酸試薬を使用することができる。

立法 第−図に示されるような装置を使用して、無菌栄養培地
を室１２に装入しそして約３０〜４０°Ｃの範囲内の温
度、好ましくは約３７°Ｃに加熱する。微生物を液体栄
養培地に接種しそして好気性条件下に培養する。

好気性条件は８０％の飽和度より高い、飽和状態の１０
０％までの飽和度の栄養培地中の初期溶存酸素含量を包
含する。これは一般に空気を栄養培地に０．１〜１．０
νｖｍ（栄養培地の容積あたりの容積）一般的には０．
４　ｖｖｓ（即ち：培地３５００戚中に空気１４００ｄ
／分）の速度で導入することによって達成される。溶存
酸素含有量の所望のレベルは、通常、培地を、例えば２
５０〜１５００ｒｐｍ　、一般には９００ｒｐｍで攪拌
することによって均質に混合することにより維持される
ことができる　（羽根車形状；下の羽根車と上の羽根車
、１つのタービンまたは２つのタービン）。

発酵混合物の通気と攪拌に影響を与えるファクターは培
地粘度である。培地粘度は濃度とともに直線的よりもむ
しろ対数関数的に増加するので、通気／攪拌の程度は発
酵の過程の間このファクターを考慮して調整されねばな
らない。代わりに、低粘度混合物で発酵を開始すること
ができ、その結果、発酵が進行でいるので、調整はほと
んどまたは全く必要とされない。

低いまたは高い酸素環境中のＳ、　ｚｏｏｅｐｉｄｅｍ
ｉｃｕｓ（ＮＣＴＣ７０２３）はホモ発酵型であり、代
謝最終産物はそれぞれ、図式によればし＝乳酸および酢
酸である： 中間の酸素濃度、例えば１０〜１００ｍｏ＋Ｈｇで、Ｓ
。

ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ　（ＮＣＴＣ７０２３）は
へテロ発酵型でありそして乳酸および酢酸が乳酸を優性
型として生産される。

「酢酸」代謝のそれ以上の結果は増加した細胞収率であ
り、すなわち、産出物よりもむしろ細胞を生産する傾向
にある。条件が「乳酸」生産代謝を生ずる時、生殖され
た細胞よりもむしろヒアルロン酸産出物を生ずる傾向に
ある。従って、代謝は図弐二 〔図式中” ”で囲まれたものは主な産出物（細胞 またはヒアルロン酸）を示す〕 に従う。これは本発明の基礎を形成する平衡の単純化で
あるが、細胞生産を制御し従ってヒアルロン酸生産を促
進するため酸素有効性を制御する必要を説明している。

高いおよび低い酸素条件下に、微生物の指数関数的な増
殖が起こりそして増殖はバイオマスの乾燥重量の定期的
な試料採取により観察されることができる。細胞の具体
的な増殖速度は定期的な培養時間での細胞濃度を測定す
ることにより次式に従って計算されることができる：〔
但し、 Ｘｏ・初期細胞濃度； Ｘｔ＝を時間後の細胞濃度、そして Ｌ　・培養時間（時間）〕 増殖速度が指数関数的である、即ちバイオマスが指数関
数的に増加していることが計算される場合、操作員は、
次に、バイオマスが少なくとも２倍（接種の直ぐ後より
も）しかし約１０倍未満に増加したちょうどよい時点を
選択することができる。この期間内で選択された時点で
、培地の溶存酸素含量は減ぜられるかまたは８０％未満
の飽和度、好ましくは約０〜約５％の飽和度の範囲内に
下落させる。これは、指数関数的に増殖する微生物が、
生産されるバイオマスの重量から期待されるより不釣り
合いに高いレベルのヒアルロン酸ヲ生産するのを観察さ
れ得る条件を提供する。

上述したように、技術水準から知られる栄養培地中の溶
存酸素含量を制御する多くの技術があり、そして如何な
る公知の方法をも、液体培地の酸素含量を本発明の方法
において見出された必要なレベルに減するために使用さ
れることができる。例えば、ガス接触領域またはガス／
液相間の接触時間の減少、即ち、ガス容積及び／又は発
酵混合物の攪拌の程度の減少を用いることができる。本
発明の方法の好適な実施Ｂ様において、増加するバイオ
マスの増殖速度が使用されその結果微生物は液体栄養培
地に導入されるよりも多くの酸素を消費する。これは自
動的に培地の溶存酸素含量を所望のレベルに減する。絶
えず増殖速度および減少する酸素含量を監視することに
より、指数関数的な増殖速度が実質的に持続する間に、
より高いヒアルロン酸生産速度を起こす発酵の時点に到
達することができる。

培養の持続期間に関しては、微生物を、少なくともヒア
ルロン酸の収率が極大になるまで培養する。一般に、所
望の目的は、微生物を２４〜１４４時間未満で培養する
ことにより達成されることができる。アルカリ消費、溶
存酸素圧力レベルまたはＣＯ２生産を介して決定される
方法の中止時点で、抽出のために培養菌を殺すかまたは
除去することができる。本発明により発酵ブロス中に作
り出されたヒアルロン酸は、単独でまたは混合物として
、イオン交換樹脂または活性炭素を用いたクロマトグラ
フィー、沈澱、溶媒抽出等の如き公知精製方法によりプ
ロスから回収されることができる。

終結および所望のヒアルロン酸からの微生物の分離のた
めの具体的な技術はよく知られている：例えば日本国特
許昭和６３−１２２９３号および米国特許第４．５１７
，２９５号および同４．７８０，４１４号に記載の技術
を参照のこと。

殺したまたは死滅した微生物からヒアルロン酸を物理的
に分離する方法も技術水準からよく知られている；例え
ばＮｉｍｒｏｄらにより、米国特許第４．７８０，４１
４号に記載の方法を参照のこと。

〔実施例〕

以下の実施例および準備は本発明に役に立ちかつ本発明
を使用する方法および過程を開示しそして本発明を実施
する発明者により予想されたしかし本発明を限定すると
して解釈されるべきでない最も良好な方法を説明する。

報告において、以下の試験が行われた： ９ｉＬ！、ＬＬＬ＝ 報告された分子量は、Ｌａｕｒｅｎ　Ｌら、Ｂ　１ｏｃ
ｈ　ｉｎ　１ｃａｅｔ　Ｂｆｏｐｈｙｓｉｃｓ　Ａｃｔ
ｓ、、　４２：　４７６−４８５　（１９６０）の式を
用いた極限粘度数から計算することによって求められる
重量平均分子量である。

軌鋭変工交立し： 温度２５°Ｃおよび剪断速度１ｓｅｃ−’で円錐スピン
ドルＣ［’５２を持つブルックフィールドデジタル粘度
計モデルＲＶＴＤＣＰを用いてで測定される。

指恨幕変敗ユ土ヱＬ： 極限粘度数はＣａｎｎｏｎ−［Ｊｂｂｅｌｏｈｄｅセコ
コクロ希釈粘度計、サイズ７５を用いて３７°Ｃで測定
され、ｍｌ／グラム（ｄ／ｇ）で報告されている。

１穴　　　　Ｄ　Ｏ： 溶存酸素の濃度はＢｅｃｋｍａｎ　Ｏ，０，メーターで
測定し空気飽和％（溶存酸素圧力）として報告される。

準璽上 並置 種菌は、フラスコに培地２００　ｄを添加することによ
り作られる。培地は、水ＩＣあたり次のものからなる。

酵母自己分解物　　　　　１０　　　ｇに１ＩｚＰＯ４
２，Ｏｇ ＨｇＳＯ４７８２００，２ｇ ＭｎＳＯｎ　　・４０ｚ０　　　　　　　０．０５　１
１１ｇＦｅ５Ｏａ　７８２０　　　　　　　　５　　　
ｍｇ微量元素　　　　　　　　　１ｍｌ １２あたりの微量元素溶液の組成（硫酸塩として）は次
の通りである： カルシウム　　　　　　　７２０　　　■マンガン　　
　　　　　　２４　　　■亜鉛　　　　　　　　　　２
２　　　■銅　　　　　　　　　　　　５　　■ ｐＨを７．２に調整（２Ｎ　ＮａＯＨまたは２Ｎ　ＨＣ
Ｉのいずれかを用いて）Ｌ１２１°Ｃで１５分間オート
クレーブにかける。フラスコが冷えたらすぐ、１ｊ２あ
たり次のものを無菌で添加する： ＮａＨＣＯ：＋　　　　　　　　　　１２．５　　■Ｎ
ａ１ｌｚＰＯｎ　　−１１ｚｏ　　　　　　　１５．９
８　　ＩＩｌｇＮａｚｌＰＯｎ　　　　　　　　　　３
６．７６　　■を含む無菌緩衝液（ｐＨ７，２）　　４
０　ｍｌおよび５０％（ｗ／ｖ）の無菌グルコース　　
１２　ｄグリセロール保存菌（ｓｔｏｃｋｓ）または凍
結乾燥培養菌として貯蔵されたＳ、　ｚｏｏｅｐｉｄｅ
ｍｉｃｕｓ　（ＮＣＴＣ７０２３）の保存培養菌　をＴ
ｏｄｄ　Ｈｅｗｉｔｔブロスアガー斜面上で画線培養し
、３７°Ｃで増殖させそして使用するまで４°Ｃで貯蔵
する。培地を種菌フラスコに添加するため、Ｔｏｄｄ　
Ｈｅｗｉｔｔブロス斜面上の細胞を１１あたり ＮａＣ１２，２５ｇ ＫＣＩ　　　　　　　　　　　　　Ｏ，１０５ｇＣａＣ
ｌｚ　　・２Ｈｚ０　　　　　　　０．１２　　　ｇＮ
ａｌｌＣＯ３０，０５ｇ からなる、ｐｌ＋を７．０に調整（２Ｎ　ＨＣＩまたは
２ＮＮａＯＨを用いて）した５ｄのＲｉｎｇｅｔ’　ｓ
溶液中で無菌で再懸濁する。

次′いて細胞懸濁液（２，５ｄ）を種菌フラスコに無菌
で添加する。次いでフラスコを３７°Ｃで１６時間培養
したのち、培養菌純度を検査し発酵槽に接種するために
使用する。

夫嵐明土 上記」４日−の種菌のうち２００成を グルコース　　　　　　　　３３　　　　ｇＫｚＳＯａ
　　　　　　　　　　　　１．３　　　ｇＭｇＳＯ，・
７Ｈ２０１，Ｏｇ 濃Ｆ１．ＰＯ４（比重１．６５）　　　　　　１．０　
　　ｄＦｅＳ０４・７ｔｌｚＯ５，０■および微量元素
溶液　　　　　　　２．５− からなる栄養素溶液ｍ酸物３１に無菌で添加する。

微量元素溶液は上の準厘土に記載されたものである。

微生物を１８時間培養する。培養は充分な好気性条件下
に行われ（空気０，４ｖｖ＋ａ）そして９００ｒｐｎ＋
で充分に通気する。この方法（ｒｅｇｉｍｅ）を用いて
すら、増殖は溶存酸素圧力を数時間、例えば指数増殖期
の２時間〜６時間で零に減するほどである。発酵槽中の
１８時間の滞留時間の最後には、微生物細胞３．０ｇ／
１．　（乾燥重量）がヒアルロン酸１．１ｇ／ｌと一緒
に生産される。産出物の酸に関して行われた物理試験を
以下の第２表に記載に記載する。

実益班主 上記実施例１の方法を繰り返すが、但し、初期グルコー
ス濃度を７５ｇ／ｆに増加する。３２時間の滞留時間後
、細胞２ｇ／Ｉ！、ｃ乾燥重Ｍ）がヒアルロン酸５．１
ｇ／　Ｉ！、と−緒に生産される。醗酵の間定期的に測
定した醗酵混合物の乾燥細胞重量、溶存酸素含量、栄養
素（グルコース）レベルおよびヒアルロン酸含量を以下
の第１表に記載しそして第２図の図で示す。微生物を殺
しそしてヒアルロン酸を分離する。精製したヒアルロン
酸（）ＩＡ）を解析的手法を用いた試験によって特徴づ
け、以下の第２表に報告する。

時間 溶存酸素 （飽和２） 第１表 グルコース　細胞 （ｇ／　ｊ２）　　　（ｇ／　７！ 乾燥重Ｎ） ヒアルロン酸 （ｇ／　ｌ　） ０．０ ７．５ ８．０ ＩＯ８０ １１、Ｏ １３，０ １５，０ １６，０ １７、Ｏ １８，０ １９，０ １９，５ ２３、Ｏ ２５，０ ２７，０ ２８，０ ３２、Ｏ ５ ５ ５ ６ ５ ６ ４，５ ０，２０ ０，３０ ０，２０ ０，３０ ０，９０ ２、１０ ３，２３ ３，００ ２，００ ０，３０ ０，４４ ０，６０ ０，６８ ２，００ ４，５０ ４，８０ ５，１０ 実ＩＵ粗史 従った手順は上記、！Ｌｌ！ＬＬに記載されたものであ
る。但し、この場合ｐＨを１７％濃度のアンモニア溶液
で制御しそして培地をＮａｔｓｏａ　０．１ｇ／　ｉで
補う。出発グルコース濃度は５５　ｇ　／　ｉである。

滞留時間３１．２５時間後、細胞２．５ｇ／ｌ　（乾燥
重量）およびヒアルロン酸１．２ｇ／４２が生産される
。

災胤炎上 従った手順は上記災益明１に記載されたものである。但
し発酵槽中での滞留時間２３時間で細胞１．０ｇ／Ｉ！
　（乾燥重量）およびヒアルロン酸３．１ｇ／ｌを生じ
た。

尖施拠ｉ 従った手順は上記夫韮華（に記載されたものである。但
し発酵槽中での滞留時間２２．５時間で細胞２．３ｇ／
ｌ　（乾燥重量）およびヒアルロン酸３．３ｇ／２を生
じた。産出物の酸を特徴づける物理的試験の結果を以下
の第２表に記載する。

裏施斑且 従った手順は上記Ｍに記載したものである。但し初期グ
ルコース濃度は５８　ｇ　／　ｉである。

滞留時間１７時間で細胞２．０ｇ／ｌ　（乾燥重量）お
よびヒアルロン酸３．３ｇ／ｊ！を生じた。産出物の酸
を特徴づける物理的試験結果を以下のｍに記載する。

実１０組り 従った手順は上記実益汎芸に記載したものである。但し
滞留時間２１時間で細胞１．３ｇ／／！　（乾燥重量）
およびヒアルロン酸５．６ｇ／ｌを生じた。産出物の酸
を特徴づける物理的試験結果を以下の第２表に記載する
。

第２表 例　）ＩＡ湿潤 狙　重量 （ｇ） Ｖ ［ＡｆＡ縮 （ｍｇ／ｍ１） ＫＶ　（ｃＳＴ） 蛋白質 ＜ｐｐｍ） ２２６ ０２５ ８０３ ７９９ ９．５７ １０．０７ １１．４３ １１．３３ ２９．９１２ ３０、６０９ ４０．０９９ ７７３９ 上記実施例から、高収率のヒアルロン酸がヒアルロン酸
生産微生物の一定の固まりから制御された増殖によって
得られることがわかる。この制御された増殖は液体栄養
培地の溶存酸素含量の制御にも役立つ。指数関数的に増
殖するバイオマスの臨界段階での有効な酸素を減するこ
とによって、微生物を、より高い溶存酸素濃度で一般に
生産するよりも高いヒアルロン酸の生産速度に応じさせ
る。我々は観察された反応の理論上の理由によって拘束
されないが、酸素損失を経る本発明の方法はこの時の乳
酸お“よびヒアルロン酸の生産を促進するであろう。溶
存酸素のより高い濃度は、微生物が酢酸およびより少な
いヒアルロン酸を生産することを刺激する一方、エネル
ギーは細胞分裂に消費される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の方法の一実施態様を行うのに用いる装
置の略図であり、 第２図は本発明の方法の一実施態様を行う間の、実施例
２の培地の化学的および物理的分析時に得゛られる分析
結果を図示したものである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒアルロン酸を生産する、ヒアルウロニダーゼ陰
   性の微生物の菌株を供給し； 供給された微生物を培養するために液体栄養培地を供給
   し； 供給された培地に供給された微生物を接種し；接種され
   た微生物を、微生物のバイオマスが細胞の乾燥重量に対
   して２〜約１０倍のファクターで増加する指数増殖点ま
   で好気性条件下に培養し；そして 増加したバイオマスの微生物を減ぜられた溶存酸素有効
   性の好気性条件下に培養し； その際微生物は指数増殖期の間に、該微生物が減ぜられ
   た酸素有効性条件の不存在下に生産するであろうよりも
   不釣り合いに大量のヒアルロン酸を生産する ことを特徴とするヒアルロン酸の生合成方法。
2. （２）微生物がＳ．ｚｏｏｅｐｉｄｅｍｉｃｕｓ（ＮＣ
   ＴＣ７０２３）である、請求項１記載の方法。
3. （３）栄養素が窒素原としての酵母自己分解物を含む、
   請求項１記載の方法。
4. （４）好気性条件が約８０％の飽和度より高い溶存酸素
   含量を包含しそして減ぜられた酸素有効性が飽和度より
   低い溶存酸素含量である、請求項１記載の方法。