JPH0327285A - 糖転移活性の強いβ―フラクトフラノシダーゼ、その製造法および該酵素を用いてアルドシルフラクトシドを製造する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規な糖転移活性の強いβ−フラクトフラノ
シダーゼ、その製造法および該酵素を用いてアルドシル
フラクトシドＥ製造する方法に関する。

〔従来の技術、発明が解決しようとする課題〕近年、健
康志向の増大にともない、グルコシル基あるいはフラク
トシル基転移酵素を用いた種々の生理活性を有するオリ
ゴ糖，有用配糖体の合或等の研究が盛んに行なわれてい
る。カップリングシュガー■、フラク１−オリゴ糖．パ
ラチノース，α−グルコシルステビオサイドなどが虫歯
にならない、またビフィズス菌増殖因子等の性質をもつ
ものとして実用化された例である。

現在、フラクトシル基転移酵素としてはバチルス・ズブ
チリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｔｊｓ）の生産
するレバンシコ、クラーゼおよびアスベルギルス・ニガ
−（Ｍ理お旦月４４社狂），ベニシリウム・オキザリク
ム（Ｐｅｎ　ｉ　ｃ　ｉ　ｌ　１　ｉ　ｕｓ　魁社Ｒ悲
）　＊　ベニシリウム・フリクエンタンス（Ｐｅｎｉｃ
ｉｌｌｉｕｍ　ｆｒｅ　ｕｅ　ｔａ　ｓＬペニシリウム
・エスビー（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｓｐ．）κ２５
などかびの生産するβ−フラクトフラノシダーゼが知ら
れている．このうちレバンシュクラーゼの糖転移作用を
利用して合威されるキシロシルフラク１シド，イソマル
トシルフラクトシドは抗う蝕性の性質を有し、さらにラ
クトシルフラクｌ・シドはビフィズス菌増殖因子として
の活性を有していることより、これらのオリゴ糖は有用
な甘味料として実用化される可能性を秘めている。しか
し、これらのオリゴ糖の生産に用いられているレバンシ
ュクラーゼはショ糖によって誘導されるため、培地にシ
ー！糖の添加が不可欠であり、このため培養液にレバン
を作り、粘度が高くなるため扱いにくい。

また、酵素の生産性も低く、さらに耐熱性が低いなどの
問題点が指摘されている。また、従来のかびの生産する
β−フラクトフラノシダーゼは菌体内酵素であり、受容
体特異性も狭いという欠点を持っている。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、上記の課題を解決するためショ糖からよ
り付加価値の高いＩ！質を合或し得る耐熱性の高いフラ
クトシル基転移酵素を菌体外に生産する微生物を検索し
てきた。その結果、アルスロバクター属に属する微生物
を栄養培地で培養することにより目的とずる糖転移活性
の強いβ−フラクトフラノシダーゼを菌体外に生産する
ことを見出し、本発明を完或するに至った。

本発明は、第１に以下に示す性質を有する新規なβ−フ
ラクトフラノシダーゼに関する．（１）本酵素は受容体
として各種単糖，糖アルコール，アルキルアルコール，
配糖体．オリゴ糖等の存在下ショ糖に作用させるとフラ
クトシル基を受容体に転移させ、その受容体特異性は極
めて広い。

（２）本酵素はショ糖，エルロース，キシａシルフラク
トシド，ラフィノース，ネオケス１・−ス，スタキオー
スをよく分解するが、■−ケストース．ニストース，イ
ヌ口ビオース，レバンビオースには作用しにくい。

（３）本酵素は４０℃にてｐ｝１６．５〜６．８が至適
であり、ｐＨ５．５〜ｌＯで安定である。

（４）　　本酵素はｐＨ　６。５において至適温度は５
５℃であり、６０℃でも７０％以上の残存活性を示す。

（５）本酵素は銀，水銀，亜鉛、銅．錫の存在で阻害を
受ける。

（６）本酵素の分子量は５　２．０　０　０±２，５０
０および５８．０００±２．５００（ディスクゲル電気
泳動およびゲル濾過法による）である。

（７）本酵素の等電点はＰＩＩ４．３および４．６（ア
ンフオライン電気泳動法による）である。

第２に本発明は、アルスロバクター属に属し、上記性質
を有する新規なβ−フラクトフラノシダーゼの生産能を
有ずる微生物を培養し、培養物中に当該酵素を蓄積せし
め、これを採取することを特徴とする新規なβ−フラク
トフラノシダーゼの製造法である。

第３に本発明は、アルドースの荏在下、ショ糖，ラフィ
ノースもしくはスタキオースに上記性質を有する新規な
β−フラクトフラノシダーゼを作用させることを特徴と
するアルドシルフラクトシドの製造法である。

本発明の新規なβ−フラク］・フラノシダーゼは微生物
を用いて生産され、その生産菌としてはアルスロバクタ
ー属に属し、上記性質を有する酵素を生産する能力を有
するものであればよい。本発明に用いる微生物としては
アルスロバクター・エスピー（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅ
ｒ　ｓｐ．）κ一ｌとその変異種変異株などがあるが、
これら微生物に制限されるものではなく、上記酵素の生
産能を有するものであればよい。ここで変異手段として
は常法のものでよく、たとえばラジオアイソトープ（Ｒ
［）、紫外線（ＵＶ）、ニトロソグアニジンなどを用い
て行なえばよい．，また、遺伝子絹み換え技術を適用す
ることもできる。

以下に、アルスロバクター・エスピーＫ−．１の菌学的
性質を記載する。

Ｉ　形態学的性質 ａ　細胞形態 肉汁寒天培地では２４時間培養する間に若い細胞では桿
状で大きさは０．５〜３Ｘ０．６＝６μである。古い細
胞では球状（０．３〜０．５μｍ）も存在し、生育段階
により変化する。

ｂ　多形性 肉汁寒天培地ではＴ字型、Ｙ字型の細胞を観察すること
ができる。

Ｃ　運動性、鞭毛 鞭毛はな《、運動性も示さない。

ｄ　胞子 胞子は形成しない。

ｅ　グラム染免 若い細胞では陽性であり古い細胞では陰性となり生育段
階により変化する。

ｒ　抗酸性 陰性 ■　培養的性質 以下は０．０２％の酵母エキスを含む肉汁を基本培地と
したものであり２５℃で培養した結果である。

ａ　肉汁寒天平板培養 発育は良好であり、集落は直径２ｍの円形で、周囲はな
だらかであり、不透明であるが、光沢を有するロー・コ
ンペツクッス状（ｌｏｗ　ｃｏｎｖｅｘ）となる．集落
の色は賀色で拡散性の色素は産生しない。

ｂ　肉汁寒天斜面培養 発育は良好で、線状に生育し、光沢を有する。

集落の色は黄色で拡散性の色素は産生しない。

Ｃ　肉汁液体培養 表面発育において菌膜を形威しないが、もしくは形威し
ても非常番こうすい．その培養液は一様に懸濁後沈澱を
生じる。

ｄ　肉汁ゼラチン穿刺培養 表面のみに発育し、その発育は良好である。

ｇ　リトマスξルク 発育は弱く、２週間位でペブ１・ン化する。軟らかい凝
固またはアルカリ化する場合もある。

リトマスは還元しない。

■　生理的性質 ｃ　　ＭＲ試験　　　陰性 ｄ　　ＶＰ試験　　　陰性 ｅ　インドールの生成　　陰性 ｈ　クエン酸の利用　　　陰性 ｊ　色素の生威　黄色の色素を生戒する。

ｋ　ウレアーゼ　　献．ｔｌ ｌ　カタラーゼ　　陽性 オキシダーゼ　　陰性 セルラーゼ　　　陰性 ｍ　生育の範囲 ｐｌ｛　５．５〜９．５で生育し、生育の最適ｐｌ１は
７附近である。また１０〜４１℃で生育し、生育最適温
度は３７℃附近である。

ｎ　酸素に対する態度　　好気性 ｏＯ−Ｆテスト グルコースを用いた場合微弱であるが発酵により酸を生
威する。

Ｐ　糖類からの酸及びガスの生威 グルコース，マルトース，シュクロースより酸を生或す
る．澱粉、ラクトースでは生産しない。

化学的分析 細胞壁或分 ミコール酸　　　陰性 ジアミノ酸　　　リジン（主要構或或分）脂肪酸組成 イソＣ　　１５：０　　　　　　　　１．８５７ンテイ
ソＣ　　１５：０　　　　６０．６８イソＣ　　１６：
０　　　　　　　　４．２１イソＣ　　１７：０　　　
　　　　　０．４７アンテイソＣ　　１５：０　　　　
３１．．５４以上の性質を有する本菌株は、バージース
・マニュアル・オブ・デタミナティブ・バクテリオロジ
ー（Ｂａｒｇｅｙ　ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ａｆ　Ｄｅｔｅ
ｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）第８版
（１９７４）およびザ・ジャーナル・オブ・ゼネラル・
アンド・アブライド・マイクロバイオロジー（Ｔｈｅ　
ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　ａｎｄ＾ｐｐ
ｌｉｅｄ　Ｍｉｅｒｏｂｉｏ１ｏｇｙ）第１８巻、第４
１７頁（１９７２）によれば、アルスロバクター属に分
類される。本菌株は工業技術院微生物工業技術研究所に
寄託されており、その寄託番号はＶＥＲＮ　Ｐ−１０７
３６である。

次に、本発明の新規なβ−フラクトフラノシダーゼを生
産するための微生物の培養条件について検討した。まず
、基本培地として１，Ｏ％ボリベプトン，０．２％硝酸
アンモニウム，０．１％硫酸マグネシウムおよび炭素源
を含むものを用い、炭素源については第１表に示した各
種物質を１％使用した。この培地にアルスロバクター・
エスピーκ−１（ＦＥＲ阿Ｐ−１０７３６）を植菌し、
３７℃で２日振盪培養した．このときの活性比率（可溶
性澱粉を１００としたときの値）を第１表に示す．Ｒか
ら明らかなように、本酵素はシ−ｙ［によって誘導され
るものではなく、グルコースのように発酵性の高いもの
以外は使用可能であり、炭素Ｒｔしては可溶性澱粉が最
良である。

第１表 活性（　ｕ　／　ｄ　）　　　活性比率シ！ｙ糖　　　
　　　０．１８　　　　　　３９グルコース　　　　Ｏ
Ｏ マルトース　　　　０．　１９　　　　　　　４１ラク
トース　　　　０．３３　　　　　　　７２フスマ　　
　　　　０．１４　　　　　　３０可溶性澱粉　　　　
０．　４６　　　　　　１００粉飴　　　　　　　０．
１６　　　　　　３５次に、有機窒素源について検討す
るため、１．０％可溶性澱粉，０．２％硝酸アンモニウ
ム，０．１％硫酸マグネシウムおよび１％有機窒素源を
含む培地に前記微生物を植菌し、３７℃で２日振盪培養
した。このときの活性比率（０．５％ポリベプトン＋０
．５％酵母エキスを１００としたときの値）を第２表に
示す。表から明らかなように、酵母エキスを用いた場合
に高い活性を示している。

第２表 活性（ｕ／ｄ）　　活性比率 無添加　　　　　　　０．１１　　　　　　３ｆリベブ
トン　　　　　　　　　　　　　　　０．３５　　　　
　　　　　　　　８コーンステーブリト　　　　　　　
　　　　２．２９　　　　　　　　　　　５２ポリベブ
トン＋酵母エキス　　　　　　４．３７　　　　　　　
　　　１００肉エキス　　　　　　０．３２　　　　　
　７脱脂大豆粉末　　　　０　　　　　　　　０魚肉エ
キス　　　　　０．４２　　　　　　１０さらに、培地
組威について検對した結果、最適の培地Ｍｉ或は１．２
％酵母エキス．０．８％ポリベブトン，４％可溶性澱粉
，０．４％（Ｎ　Ｈａ）ｚＨ　Ｐ　Ｏ４オヨび０．１％
Ｍｇ　５０４　・７　ＨｔＯ　（ｐＨ　７．０）　ヲ含
むものであった。したがって、培養に用いる培地として
は、上記知見を参考とし、供試菌株が目的とする酵素を
大量に生産し得る組或を選定すべきである。

本発明のβ−フラクトフラノシダーゼを生産するために
は、選定した培地に、上記微生物を植菌し、ｐＨを中性
ないし微アルカリ性、温度２０℃から４５℃、好ましく
は３０℃から４０℃に保ちつつ、１０時間から５日間振
盪あるいは通気攪拌培養すればよい。

以上の様にして得られた培養物より酵素は常法により採
取、精製できる．たとえば培養物より遠心分離し、菌体
を除いた上清液を粗酵素液として使用で券る。さらに、
必要に応じて、既知の方法を適当に組合せて精製して使
用で永る。

酵素の精製は各種方法により行なうことができるが、そ
の１例を示すと次の通りである．５℃の低温下、粗酵素
液に固形の硫酸アンモニウムを加え０．６飽和で沈澱す
る百分を集め、１０ｄリン酸緩衝液に溶解し、同緩衝液
に対して一晩透析したものについて以後の操作を行なう
．尚、この硫安塩析での回収率は約９０％である。次に
、ＤＢＡＨ−　｝ヨバール６５０によるイオン交換クロ
マトグラフィー，プチルトヨパール６５０による疎水ク
ロマトグラフィー，ウルトロゲルＡｃＡ４４を用いたゲ
ル濾過，ヒドロキシアバタイトによる吸着クロマトグラ
フｄ一等により精製されディスクゲル電気泳動的に単一
バンドを示す二つの標品（フラクシッンＡ，Ｂ）を得る
ことができる。尚、この標品の回収率はそれぞれ１５．
１４％である。

フラクシジンＡの精製酵素を用いて性質を検討した。以
下に結果を示す。

（１）　　作用 （イ〉　５％ショＩｉに作用し、グルコースとフラク１
・−スに分解する．シ−１糖分子間での転移反応は起り
にくく、オリゴ糖の生或は極めて少ない。

第１図に示すように、５０％という高濃度で反応させて
も転移オリゴ糖の生或率は２０％にすぎない。

（１１）　　中性の単垢及びオリゴ糖についてはイス型
のコンホメーシッン（’ＣＩ）をとったとき、Ｃ２．Ｃ
３のＯＨがｅｑｕａｔｏｒｉａ目立にある糖質の存在下
、本酵素をシーＪｌｌｌＭに作用させると、還元未満の
Ｃｌ位の水酸基にフラクトシル基を転移し、アルドシル
フラクトシドを生或する．たとえばＤ−キシロース，Ｄ
−ガラクトース，Ｄ一およびＬ−フコース，Ｌ−ソルボ
ース．マルトオリゴ糖，イソマルトオリゴ糖．ラクトー
ス等によくフラクトシル基を転移し、キシロシルフラク
トシド，ガラクトシルフラクトシド，フコシルフラクト
シド．ソルポシルフラクトシド，マルトオリゴシルフラ
クトシド，イソマルトシルフラクトシド．ラクトシルフ
ラクトシドを生威する。

第２図にキシａ−ス存在下、等量のショ榎からなる５０
％基質に本酵素を４０℃で作用させた時のキシロシルフ
ラクトシドの虫戒率の経時変化を示す．第２図から明ら
かなように、用いたシーＪＭの７０％に相当する生或率
を示す． （ハ）　Ｄ−キシリトール，Ｄ−リビトール，Ｄ一ガラ
クチトール．Ｄ−ソルビトール，Ｄ−マルチトール，Ｄ
一エリスリトール等の糖アルコール存在下、ショ糖に作
用させると、フラクトシル基を糖アルコールに転移する
。

（二）　メタノール，エタノール，ブロパノールなどの
炭素数１０までの１級のアルキルアルコールの存在下、
ショ糖に作用させると、フラクトシル基をアルキルアル
コールに転移し、アルキルフラクトシドを生或する。

（ネ）　リボフラビン，ルチン，エスタリンの様な配糖
体ビタ名ンやビリドキシンの様な水＃Ｉ基を持つビタミ
ンの存在下、ショ糖に作用させると、ビタミンにフラク
トシル基を転移する。

（へ）　アデノシン．イノシンの様なヌクレオシド存在
下、ショｌｆａに作用させると、ヌクレオシドにフラク
トシル基を転移する。

（２）基質特異性 本酵素はシシ糖以外にエルロース，キシロシルフラクト
シド，ラフィノース，ネオケストース．スタキオースを
よ《分解するが、ｌ一ケスＦ・−ス，ニストース，イヌ
口ビオース，レバンビオースには作用しにくい。

（３）活性測定法 ４０％キシロースを含む２０％ショ糖溶液（５０１リン
酸緩衝液ｐＨ６．５）２００ｆｌｆｆに適宜希釈した酵
素液２００μｉを加え、４０℃１　１０分間作用させた
後、反応液の一部を沸騰水に入れ、酵素を熱失活させた
後、Ｆキットで遊離するグルコース及びフラクトース量
を求め、グルコース量？らフラク１−−ス量を差し引き
、転移したフラクトース量を算出する．１単位は１分間
に１μｍｏｌのフラク１・シル基を転移させる酵素量と
した。

（４）至適ｐＨと安定ｐＨ 作用至適ｐＨは酵素０．１一に０．　０　５　Ｍ緩衝液
（ｐＨ３−・８：マツキーベン緩衝液、８６０〜１ｌ：
コルソフ緩衝液）０．９−を加え、この内０．　２　ｍ
を２０％シジ糖，４０％キシロース溶液Ｏ、２ＩＩＪｆ
ｌと混ぜて活性を測定した，　ｐＨ安定性は酵素０．１
−に０．１Ｍの同緩衝液０．４ｍｆ）を加え、４０℃に
２時間保った後、１■ＯｄのｐＨ６．５の０．１Ｍリン
酸緩衝液を加え、その２００μ疋を用い残存活性を測定
した。

第３図に示すごとく、至適ｐｌ｛は６．５−・−６．　
８付近であり、この処理ではｒｘｌ｛　５．５から１０
の範囲で安定である。

（５）至適温度と温度安定性 至適温度は各温度で１０分間反応させ活性を測定した。

温度安定性は酵素液を各温度に３０分間保持した後、１
０分間冷却後、残存活性を測定した。第４図に示すごと
く、本酵素の全適温度は５５℃付近であり、６０℃でも
７２％の残存活性を有する。

（６）阻害、活性化 本酵素は１ｌｌｌＭの銀，水銀，銅の存在で９０％以上
阻害され、１−の亜鉛，錫の存在で４０〜５０％阻害を
受ける．その他の１０−Ｍのカルシウム，バリウム．マ
グネシウム，マンガン，ストロンチウム，ｌｍＨのニッ
ケル，カド漬ニウム，鉄の存在では殆ど阻害は受けなか
った。また、１０−ラウリル硫酸ナトリウム，２００−
リポースで９０％以上阻書される。システイン残基に特
異的に作用ｆ　？）　０．　１　１１Ｍ（７）　Ｐ−ク
ロロマーキュリ安息香酸の存在では阻害きれない。

本酵素は本酵素の有効な受容体となるキシロースやガラ
クトースの存在により活性化される。

ＳＮ｛還元試薬であるジチオスレイトール，還元型グル
タチオンは本酵素の安定化に効果はなかった。また、カ
ルシウム，マグネシウムにも安定性を高める効果は見ら
れない。

（７）分子景 ＳＤＳ−ディスクゲル電気泳動およびゲル濾過法により
測定したところ、フラクシジンＡの分子量は５２，００
０±２，５　Ｏ　０であり、フラクシッンＢは５８．０
００±２．５００であった．（８）等電点 アンホライン電気泳動法により調べた結果、等電点はフ
ラクションＡは４．３、フラクシ３ンＢは４．６であっ
た。

（９）結晶構造および元素分析 本酵素については未だ結晶標品が得られていないが、電
気泳動で単一なバンドを示す標品をそれぞれ得ている。

第３表にこれまで報告されているかびのβ〜フラクトフ
ラノシダーゼの基質特異性をショ糖の分解速度を１００
としたときの相対速度で示す。第４表にレバンシュクラ
ーゼおよびかびのβ−フラクトフラノシダーゼの受容体
特異性を示す。

第３表に示すように、本酵素はラフィノースをよく分解
するが、１一ケストースを分解しにくいこと、従来、報
告されているかびの酵素とは異なりシ＝Ｊ糖間でのフラ
クトシル基転移反応を触媒しにくいこと、第４表に示す
ように、受容体特異性が幅広《ガラクトース，ラクトー
ス等にフラクトシル基を転移する。以上のことより本酵
素は従来報告されているβ−フラクトフラノシダーゼと
は明らかに異なる新規なβ−フラクトフラノシダーゼで
ある。

尚、フラクションＢの部分精製品についても酵素の安定
性．金属塩の影響．基質特異性および受容体特異性など
を調べた結果、フラクションＡとほぼ同じ結果が得られ
ている。

／′ ／ 第３表 第４表 シ＝！糖 ラフィノース スタキオース ネオケストース ｌ−ケストース ニストース ツラノース 本酵素 １００ ６７。７ ｌ５。６ ５３．５ ｏ．ｏｉ ０ ０ Ａ Ｉ００ ５２ Ｎ．０ ９９ ５８ Ｎ．Ｄ Ｂ １００ ６ ２ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．ロ Ｃ １００ ０．０２ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ ５２ ０．０エ Ａ：　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｏｘａｌｉｃｕｍ，　
Ｂ：　Ｐｅｎｉｃ口目ｕｌｌＩｓｐ．　Ｋ２５Ｃ：ハ握
猛０上堕加盈虹ＡＴＣＣ　２０６１１（フラクトース転
移活性） Ｎ．ロ：データなし ／′ シ＝１糖 １一ケストース ラフィノース Ｄ−グルコース ロ−フラクトース Ｄ．ガラクトース Ｄ−キシロース し−アラビノース Ｌ−ソルボース し−ラムノース Ｄ−ソルビトール Ｄ−マンニトール Ｄ−キシリトール マルトース イソマルトース ラクトース メタノール エタノール 十 ＋ Ｎ．Ｉ） Ｎ．Ｄ Ｎ．ロ 十 Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ ＋ 十 ＋ ト Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｏ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ 十 ＋ ＋ 十 Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｏ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｏ Ｎ．Ｏ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｏ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ 十 十 十 Ｎ．Ｄ 十 十 十 十 十 十 Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｏ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ ＋ 十 ｆ Ｎ．Ｄ Ｎ．Ｄ ：転移生戒物を生威せず ＋：転移生底物を生威、 Ｎ．Ｄ　Ｈデータなし Ａ：　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｎ皇凶１巨址Ｔ−１Ｂ
：　Ｐｅｎｉｃｉｌｌｔｕｍ　ｓｐ．　Ｋ２５Ｃ：　鼓
Ｒ』ｕハｎｉＥｅｒ＾ＴＣＣ　２０６１１ロ：　　Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　　ｌｅｖａｎ　　
ｓｕｅｒａｓｅなお、本酵素は菌体外酵素であり、培養
液に酵素を蓄積する。また、シ＝１糖による誘導酵素で
はなく、培地にシーＩｍを添加することなく、他の炭素
源を用いて培養が可能である。さらに、レバンシュクラ
ーゼと異なり培養液中にレバンを生産することがないこ
とから酵素の回収は容易であり、実用的にも有用である
． 前述したように、本酵素はアルドースの存在下、シ．！
糖，ラフィノース或いはスタキオースに作用させると、
アルドシルフラクトシドを生或、蓄積する。反応を行な
うにあたり、本酵素の性質を考慮して目的とするアルド
シルフラクトシドの生或聾が最大となるような条件を選
定すべきである。

ここでアルトースとしてはβ−フラクトフラノシダーゼ
のフラク１・シル基転移反応によりシ』糖若しくはラフ
ィノース以外のアルドシルフラクトシドを新たに生威し
得るアルドースであり、すなわちグルコース若しくはメ
リビオース以外のアルドースである単糖あるいはオリゴ
糖が望ましい。

たとえばＤ−キシロース．Ｄ−ガラクトース，　　Ｌ一
アラビノース，Ｌ−ソルポース，Ｌ−フコース，マルト
ース，セロビオース，キシロビオース，イソマルトース
，ラクトース，マルトトリオース，イソマルトトリオー
ス，バノース，イソバノース等が適している．反応に用
いるアルドースは１つに限らず複数でも可能であり、こ
れらの混合物でもよく、澱粉，アラビノガラクタン，キ
シログルカンの様な多糖類の部分加水分解物でもよい。

目的とするアルドシルフラクトシドを生或させるために
は、そのアルドース（受容体分子）とショ糖．ラフィノ
ースもしくはスタキオース（供与体分子）とを共存せし
めた基質溶液に新規なβフラクトフラノシダーゼを反応
させればよい。反応時の受容体分子と供与体分子のモル
比は１：５から５：１が望ましく、基質濃度はｌＯから
５０ｗ／ｗ％が望ましい。反応時のｐｌｌ及び温度はβ
−フラクトフラノシダーゼが作用しアルドシルフラク１
・シドを生威するような範囲であればよく、ｐＨ５．５
から７。Ｏ，温度４０から６０℃の範囲が選ばれる。酵
素の添加量は１から５０単位／ｇショ糖の範囲で使用さ
れ、反応時間は０。ｌから１００時間の範囲が選ばれる
。

この様にして製造した反応液は、一般には酵素を加熱失
活させ、活性炭脱色，イオン交換樹脂を用いて脱塩，脱
免して混合液を得る。更に、活性炭カラムクロマトグラ
フＫ一などのクロマト操作により高純度に精製して目的
とずるアルドシルフラクトシドを得ることができる。

〔実施例〕

次に実施例について述べる。

実施例１ 普通寒天斜面培地にアルスロバクター・エスビ−　Ｋ−
１（ＦＥＲＭ　Ｐ−１０７３６）を接種し、３７℃で２
日間培養後、その１白金耳をとり、１．２％酵母エキス
，０．８％ポリベプトン，４％可溶性澱粉，０．４％（
Ｎ　Ｈ４）ｔＨ　Ｐ　Ｏａ．０．　１％Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ
ａ　・７　ＨｚＯ（ｐＨ　７．　０　）の組或からなる
液体培地（６０ｍ培地／５００ｄ肩付きフラスコ）ニ植
菌し、３７゛ｃで２日間通気振盪培養した．これを種菌
とし、間組威からなる液体培地に分注し、３７℃で５日
間通気振盪壇養した。培養終了後、培養液を遠心分離し
、上清（粗酵素液）を約１．１１得た。本液には一あた
り３０単位のβ−フラクトフラノシダーゼを含有してい
た。

実施例２ １．２％酵母エキス，０．８％ポリベプトン，４％ラク
トース，０．４％（　Ｎ　Ｈ　ｎ）Ｊ　Ｐ　Ｏ　＜−０
．　１％ＭｇＳＯ．・７　８ｇＯ　（ｐＨ　７。Ｏ）を
培地とし、５００ｄ！容坂口フラスコに６０１！Ｉ．分
注し、これに同培地で２日間前培養した種菌を４Ｉｌｉ
づつ植菌し、３７゛ｃで２日間前培養した．これを種菌
とし、１２ｆの５％コーンステーブリカー，３％ショｍ
，０．４％（Ｎ　Ｈａ）ｚＨ　Ｐ　Ｏａ．０。１％Ｍ　
ｇ　Ｓ　Ｏ＜　　・７　ＨｚＯ（ｐＨ　７．０）からな
る培地に植菌し、ｐＨを７に調整しながら２５時間通気
撹拌培養した。培養終了後、培養液を遠心分離して菌体
を除去し、粗酵素液１２１を得た．この液の活性はｄあ
たり５０単位であった。

実施例３ ラクトース５ｋｇとシａ　１１１１　５　ｋｇを予め水
に溶かし、ｐＨを６．５とし、実施例２の粗酵素液をシ
ッＷｉｇあたり５単位加え固形分濃度を４０％とし、５
０℃で５時間反応せしめてラクトシルフラクトシドを３
０％含む反応液を得た。

反応液は活性炭カラムクロマトグラフィーに供しオリゴ
糖をカラムに吸着させアルコール濃度を順次高くするこ
とにオリゴ糖を溶出させ、ｉ５％アルコール画分を濃縮
することにより純度９８％のラクトシルフラクトシドを
２．　７　ｋｇ得た．実施例４ ガラクトース２０｝ｃｇとシ＝１ｔｌ！１０ｋｇを水に
予め溶解し、ｐｌｌを６．５とし、これに実施例２の粗
酵素液をシー！糖１ｇあたり１０単位添加し、固形分濃
度を４０％とし５０℃で１５時間反応させてガラク１・
シルフラクトシドを２０％含有する反応液を得た． 反応液を活性炭カラムクロマトグラフィーにかけ単糖を
除去し、シッ糖を含む純度８５％のガラクトシルフラク
トシドを５ｋｇ得た。さらに、このものをα−グルコシ
ダーゼでシ−Ｉ糖を分解後、活性炭力ラムクロマトグラ
フィーを行ない純度９８％のガラクトシルフラクトシド
３．８ｋｇを得た。

〔発明の効果〕

本発明によれば、新規な糖転移活性の強いβフラクトフ
ラノシダーゼを効率よく得ることができる．さらに、こ
の酵素を用いることによってアルドシルフラクトシドを
効率よく安価に製造することができる． キシロシルフラクトシド，イソマルトシルフラクトシド
は抗う蝕性の性質を有し、さらにラクトシルフラクトシ
ドはビフィズス菌増殖因子としての活性を有しているこ
とにより、これらのアルドシルフラクトシドは有用な甘
味料として実用化が期待される。

したがって、β−フラクトフラノシダーゼとその製法な
らびに該酵素を用い℃アルドシルフラクトシドを製造ず
る方法を提供する本発明は産業上極めて有用である。

【図面の簡単な説明】

第１図はβ−フラクトフラノシダーゼの反応経過（５０
％ショ糖、１００．Ｕ／ｇ基質）を示すグラフ、第２図
は受容体としてキシロース存在下の本酵素の反応経過（
２５％ショ糖、ＩＯＵ／ｇ基質）を示すグラフ、第３図
Ａ，Ｂは本酵素の圭適ｐ１｛（第３図Ａ）及びｐＨ安定
性（第３図Ｂ）を示すグラフ、第４図Ａ，Ｂは本酵素の
全適温度（第４図Ａ）及び温度安定性（第４図Ｂ）を示
すグラフである。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、下記の性質を有する新規なβ−フラクトフラノシダ
   ーゼ。 （１）本酵素は受容体として各種単糖、糖アルコール、
   アルキルアルコール、配糖体、オリゴ糖等の存在下ショ
   糖に作用させると、フラクトシル基を受容体分子に転移
   させ、その受容体特異性は極めて広い。 （２）本酵素はショ糖、エルロース、キシロシルフラク
   トシド、ラフィノース、ネオケストース、スタキオース
   をよく分解するが、１−ケストース、ニストース、イヌ
   ロビオース、レバンビオースには作用しにくい。 （３）本酵素は４０℃にてｐＨ６．５〜６．８が至適で
   あり、ｐＨ５．５〜１０で安定である。 （４）本酵素はｐＨ６．５において至適温度は５５℃で
   あり、６０℃でも７０％以上の残存活性を示す。 （５）本酵素は銀、水銀、亜鉛、銅、錫の存在で阻害を
   受ける。 （６）本酵素の分子量は５２，０００±２，５００およ
   び５８，０００±２，５００（ディスクゲル電気泳動お
   よびゲル濾過法による）である。 （７）本酵素の等電点はｐＨ４．３および４．６（アン
   フオライン電気泳動法による）である。 ２、アルスロバクター属に属し、請求項１記載の性質を
   有する新規なβ−フラクトフラノシダーゼの生成能を有
   する微生物を培養し、培養物中に該酵素を蓄積せしめ、
   これを採取することを特徴とする新規なβ−フラクトフ
   ラノシダーゼの製造法。 ３、アルスロバクター属に属する新規なβ−フラクトフ
   ラノシダーゼの生産菌がアルスロバクター・エスピーＫ
   −１（ＦＥＲＭＰ−１０７３６）である請求項２記載の
   製造法。 ４、アルスロバクター属に属する新規なβ−フラクトフ
   ラノシダーゼの生産菌を、炭素源としてショ糖、マルト
   ース、ラクトースおよび可溶性澱粉のいずれかを含む培
   地で培養する請求項２記載の製造法。 ５、アルドースの存在下、ショ糖もしくはラフィノース
   に請求項１記載の新規なβ−フラクトフラノシダーゼを
   作用させることを特徴とするアルドシルフラクトシドの
   製造法。