JPH0327284A - 組み換えアビポックスウイルス - Google Patents
組み換えアビポックスウイルスInfo
- Publication number
- JPH0327284A JPH0327284A JP1160157A JP16015789A JPH0327284A JP H0327284 A JPH0327284 A JP H0327284A JP 1160157 A JP1160157 A JP 1160157A JP 16015789 A JP16015789 A JP 16015789A JP H0327284 A JPH0327284 A JP H0327284A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- virus
- recombinant
- strain
- dna
- avipox
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000700663 Avipoxvirus Species 0.000 title claims abstract description 23
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 93
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 17
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims abstract description 16
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 13
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 claims description 13
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 3
- 102000018897 Membrane Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 2
- 108010027796 Membrane Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 230000005727 virus proliferation Effects 0.000 claims 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 abstract description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 abstract description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 abstract description 6
- 241000272201 Columbiformes Species 0.000 abstract description 3
- 208000000666 Fowlpox Diseases 0.000 abstract description 3
- 244000144977 poultry Species 0.000 abstract description 3
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 abstract description 3
- 241000272525 Anas platyrhynchos Species 0.000 abstract 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 abstract 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 40
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 38
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 26
- 238000000034 method Methods 0.000 description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 21
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 13
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 13
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 10
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101100321817 Human parvovirus B19 (strain HV) 7.5K gene Proteins 0.000 description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 7
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 7
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 6
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 description 5
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 4
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 4
- 235000017166 Bambusa arundinacea Nutrition 0.000 description 3
- 235000017491 Bambusa tulda Nutrition 0.000 description 3
- 241001330002 Bambuseae Species 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 3
- 235000015334 Phyllostachys viridis Nutrition 0.000 description 3
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 3
- 239000011425 bamboo Substances 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 101100502522 Mus musculus Fcor gene Proteins 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- ZXRCAYWYTOIRQS-UHFFFAOYSA-N hydron;phenol;chloride Chemical compound Cl.OC1=CC=CC=C1 ZXRCAYWYTOIRQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 2
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 239000002023 wood Substances 0.000 description 2
- QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N (r)-(6-ethoxyquinolin-4-yl)-[(2s,4s,5r)-5-ethyl-1-azabicyclo[2.2.2]octan-2-yl]methanol;hydrochloride Chemical compound Cl.C([C@H]([C@H](C1)CC)C2)CN1[C@@H]2[C@H](O)C1=CC=NC2=CC=C(OCC)C=C21 QNRATNLHPGXHMA-XZHTYLCXSA-N 0.000 description 1
- 244000058084 Aegle marmelos Species 0.000 description 1
- 235000003930 Aegle marmelos Nutrition 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241001135931 Anolis Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 235000016068 Berberis vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 241000335053 Beta vulgaris Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001369 Brass Inorganic materials 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710115643 Cathelicidin-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000218645 Cedrus Species 0.000 description 1
- 241000511343 Chondrostoma nasus Species 0.000 description 1
- 206010010071 Coma Diseases 0.000 description 1
- 101150014767 EM gene Proteins 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 240000002989 Euphorbia neriifolia Species 0.000 description 1
- 101150013967 F13 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000700662 Fowlpox virus Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 101100109406 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) aga-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100327416 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cef-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 1
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 1
- 241000287462 Phalacrocorax carbo Species 0.000 description 1
- 235000010627 Phaseolus vulgaris Nutrition 0.000 description 1
- 244000046052 Phaseolus vulgaris Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L Phosphate ion(2-) Chemical compound OP([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 206010049190 Red blood cell agglutination Diseases 0.000 description 1
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000000376 autoradiography Methods 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000010951 brass Substances 0.000 description 1
- 210000001217 buttock Anatomy 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-L calcium bis(dihydrogenphosphate) Chemical compound [Ca+2].OP(O)([O-])=O.OP(O)([O-])=O YYRMJZQKEFZXMX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000007910 cell fusion Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000003711 chorioallantoic membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 150000004683 dihydrates Chemical class 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 235000021186 dishes Nutrition 0.000 description 1
- DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogenphosphate dodecahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O DGLRDKLJZLEJCY-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000003414 extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000035931 haemagglutination Effects 0.000 description 1
- 208000014617 hemorrhoid Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000007803 itching Effects 0.000 description 1
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- PZLXYMQOCNYUIO-UHFFFAOYSA-N lithium;hydrochloride Chemical compound [Li].Cl PZLXYMQOCNYUIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 229910000150 monocalcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019691 monocalcium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N orlistat Chemical compound CCCCCCCCCCC[C@H](OC(=O)[C@H](CC(C)C)NC=O)C[C@@H]1OC(=O)[C@H]1CCCCCC AHLBNYSZXLDEJQ-FWEHEUNISA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N sulphamethoxazole Chemical compound O1C(C)=CC(NS(=O)(=O)C=2C=CC(N)=CC=2)=N1 JLKIGFTWXXRPMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 1
- -1 thorium glutamate Chemical compound 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
- C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
- C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
- C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/16011—Orthomyxoviridae
- C12N2760/16111—Influenzavirus A, i.e. influenza A virus
- C12N2760/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
- C12N2760/00011—Details
- C12N2760/18011—Paramyxoviridae
- C12N2760/18111—Avulavirus, e.g. Newcastle disease virus
- C12N2760/18122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
〈産業上の利用分野)
本発明儲組み換えアビボックスウィルスに関し、ざらに
at tノ(は、アビポツクスウイルスの増舶に非必須
なDNA領域にニューカッスル病ウィルス山東のcDN
Aが組み込まれた組み換えアビポツクスウイルスに閏す
る。 《従来の技術》 近年、ワクブニアウイルスに外来性1) N Aを組み
込んだ組み換えワクチニ7ウイルスのfi築法が考案さ
れ、外来竹DNA,!:t,で、例えば感染好抗1東−
コードD NAを用いた組み換えワクチニアウイルスを
lLワクヂンとして利用する方法が提案されるJ、うに
へった{例えば特開昭58−129971″;;、特公
昭6 0−5 0 0 5 1 t.s h3,特公昭
615 0 1 9 5 7 Hi (=(と》。この
h法によれば、目的に応じて神々の外来+’II D
N八を組み込むここが可能であり、新しい牛ワクヂンの
製法ヒしてTi望視され(いる。 しかしながら、ワク1−ニアウイルスはその宿J−領域
が限定されているため、例えば、二一1−カツスル病の
よう4c鶏の病気に″IA=tる住ワクヂンの製造に組
み換えワクチニアウイルスの手法を応用リることははと
んど不Iil能の状態にあり、鶏用生ワクチンの製造の
ために(!、ワクチニアウイルスに代えてファウルボッ
クスウイルスに外来性1) N Aを組み込むh法がn
力tの示唆がなされ“Cいる(八vian Disea
ses Vol. 30. k1 . 2 4 〜27
〉。このような考え方で、最近組み換え7ビボックスウ
イルスの作wJ法が開発社きれた( V!I’lJSR
esearch Vol. 1 0, 343−35
6 (1 988) , Vaccine Vol.6
. 504−508 ( 1 908))。 fた、ニューカツスル病ウイルス《以下、N l.)
Vと称す)につい
at tノ(は、アビポツクスウイルスの増舶に非必須
なDNA領域にニューカッスル病ウィルス山東のcDN
Aが組み込まれた組み換えアビポツクスウイルスに閏す
る。 《従来の技術》 近年、ワクブニアウイルスに外来性1) N Aを組み
込んだ組み換えワクチニ7ウイルスのfi築法が考案さ
れ、外来竹DNA,!:t,で、例えば感染好抗1東−
コードD NAを用いた組み換えワクチニアウイルスを
lLワクヂンとして利用する方法が提案されるJ、うに
へった{例えば特開昭58−129971″;;、特公
昭6 0−5 0 0 5 1 t.s h3,特公昭
615 0 1 9 5 7 Hi (=(と》。この
h法によれば、目的に応じて神々の外来+’II D
N八を組み込むここが可能であり、新しい牛ワクヂンの
製法ヒしてTi望視され(いる。 しかしながら、ワク1−ニアウイルスはその宿J−領域
が限定されているため、例えば、二一1−カツスル病の
よう4c鶏の病気に″IA=tる住ワクヂンの製造に組
み換えワクチニアウイルスの手法を応用リることははと
んど不Iil能の状態にあり、鶏用生ワクチンの製造の
ために(!、ワクチニアウイルスに代えてファウルボッ
クスウイルスに外来性1) N Aを組み込むh法がn
力tの示唆がなされ“Cいる(八vian Disea
ses Vol. 30. k1 . 2 4 〜27
〉。このような考え方で、最近組み換え7ビボックスウ
イルスの作wJ法が開発社きれた( V!I’lJSR
esearch Vol. 1 0, 343−35
6 (1 988) , Vaccine Vol.6
. 504−508 ( 1 908))。 fた、ニューカツスル病ウイルス《以下、N l.)
Vと称す)につい
【は、そのヘマグルブニン・ノイフミ
ニダーt!(以十、H Nε称1)及び膜融合タンパク
質(以1・、Fタンパクnと称寸)を1−ドリろc [
) N Aが最百になって見い出された〔例えばジャー
ナル・Aブ・ジ■ネラル・ヴイ11[] ジ ー く
,ノ.Gen.Virol.> 6 7. 1
9 1 7 〜 1 9 27,198
(1,特開昭6 2−1 6 3 6 9 3月]。 しかしながら多くの1クイルス、特にN D Vのよう
なR N AウイルスU、変巽が起こりやt <、ワク
ブンの効かない変異ウイルスが出現4る危険竹を無視リ
ーることはできない,,特に単一の抗原遺伝−rのみを
挿入した組み換え9ワクヂンCは、ワクブンの無効な変
冑ウイルスの出現する危険度がJII!行ワクブンより
高いことも予想される。このため、抗原遺イムrεしで
1−INより、ウイルスの林間で保存竹の0い「タンパ
ク質遺イ6了(以下F13伝了と称t) (Viru
sRes. 7 241−255(1987),
V+rusRes. 8 217−232 (19
88),VirusRes. 5 343−356
(1986), J.Gan.Virol.67. 1
91 7〜l927(1986))を導入することを検
詞したが、単に抗原遺伍子を組み込んだ組み換えアビポ
ツクスウイルスを作製しても、実際にワクチンとしてイ
1効であるεは限らず、NDVのI”11仏子を組み込
んだ組み換えアじボックスウイルスでNOVの感染を紡
御し得るワクチンが製造できるかは、まったく不明の状
慝であった。また、近年ワクチニアウイルスにヒ1・・
パラインフル■ンlffff型ウイルスのF遺伍了を挿
入し!こところ組み換えウ、イルス感染III胞は、ぞ
”の組み込んだト瑣伝子の発現により、そのill胞ホ
竹が強まることが示唆された(J.Virol.61
3416−3423(1987〉)。このように「遺
伝子を導入した組み換えウイルスで【よウイルスによる
細胞融合などが起こりやすくなるなどの問題点があった
。 (発明lfi解決しようと寸る課題) そこで木発明名らは、かかる従来技術の下で、N l)
V由来の抗原二1−ドcDNAがゲノムl’) N
A中に組み込まれた増殖lJ1能な組み換え7ヒボック
スウイルスの構築をlj l= L説ふ検J4をil8
めた結果、NOVのc D N A ,好J、しくは0
26株の5ノ、うtκ弱毒株のcDNAより1タンパク
質をコードする領域を選択し7ビボックスウイルスの増
殖に41必須なグノムgAil&に組み込めば、増殖可
能6Ilみ換えアビポツクスウイルスが得られるこεを
見い出し、きらに、これらF遺伝子を含む組み換え7ピ
ボックスウイルスが感染WJ胞の融合を引き起こ3ヂ、
、かつ7ピボックスウイルスとN I) Vの両方の!
4染を防御し得るワクチンとしてイ−j効て・あるこε
を見い出し、本発明を完成寸るに至った。 (課題を解決するための手段) かくして本発明によれば、NDV出来の抗原を二』−ド
するcDNAをアビボゝソクスウイノレスの増輌に非必
須なグノム領域に、好ましくはブD t−ター機能を右
する() N Aと共に、発現可能な形で組み込:Lれ
た組み換えアビポツクスウイルスが提供される。 本発明においてNDV山東のc I) N Aを組み込
む!こめに供されるウイルス(よアビポツクスウイルス
に分頬される限りいかなる株でもよいが、鶏、七面島、
アじルf.κどの家禽類の細胞中で増舶’1+l能なも
のが好ましく、その具体例としてA 1” C GVR
−251.A”rCC VR−250,ATCC
VR−229,AT(;C VR−249.ATCC
VR−288,西ケ原株、洲水株などのごとぎフI
ウルボックスウイルスやノ7ウルボツクスウイルスと近
縁のウイルスであって、NP株(鶏胎化鳩痔島中町株)
なとのように鶏痘lEワクチン株tして使用されるウイ
ルスなどが例示される1.これらの株はいず^も市販さ
れCおり、容易に入手ずるこεができる。 またN l) V山来の1−タンパク質は、rA染I!
I胞℃゛「0タンパク質という形で発現し、Austr
aJ+a−vtctoria株《以ド、AV株と称す》
tTどの強出様で【よ、N未端から約1/5のところe
切断され、F,F2εいう2つのポリベブチドになり、
こ1 のji裂によって感染ll!胞の融合活性が生じるのに
対し、1)26株なとの弱毒株で(ま、強ji株に存n
−するF,F2への開裂部位ri前の連続した塩基1 性アミノ酸残基が存イtt!ず、「。タンパク質昏よ「
1,F2八同裂しない。そのため感染細胞の融含活性か
はとんとなイ( Virus Research 7
241−255 (1987)).木発明においてN
I) V山来の1タンパク費を]一ドするcDNAL
L ,好ましく(よN l) Vの1)26株などの「
。タンパク質からF.F2への開裂の起こらない弱み1 株を用いて調yj1″ることができるがAVaなとを用
いて調製してもよい。AV株なと強渇株由来のF遺伝r
を利用リる場合、{=oタンパク質から1,,「2への
間裂部分直前を合成[.) N A等を用いて聞裂の起
こらない弱痛タイブに変換しで用いることがQfましい
。例えば、上記1)26株から調製されるcDNAは、
第3図に示!J′瑞囚配列の中の第43番目から第17
01番目までの1 65 9堪基対で構成されている。 4l:たAV株から調製されタC l) N Aも16
59勉基対から構成されており、開裂部位近傍を除いて
他の配列は相向恒が高い( Virus Resear
ch 7241−255 (1987))。 この様にNDV山来の「タンパク質を]一ドづるcDN
Aの配列は必ずしも一様ではないが、本発明においては
、上記2種類のcDNAと実質的に同一の機能をtJリ
るw!IPllにJ3いC修鋒きれたc l’) N
A ( [!l ノ5、塩基配列が置換、挿入、欠失し
たもの)であってもよい。もらろん、実費的に四一の機
能を有づるかぎり、?ミノ酸配列が異なる程度に修飾さ
れkbのであってbよいが、虹ましく【よ、D26株の
「クンバク質のようにl−’1+12へ開裂しない弱み
タイプのポリベプヂドを丁l−ドするC D N A
$ Qい。もちろんAVI1のごとき強島株のCDN八
を用い開裂部イ☆近傍を合成DNAeを用いて弱毒タイ
プのbのと直き換えて用いることも呵能て゛ある。 本発明を実施リるに当たっては、まずアビポツクスウイ
ルスの1?!殖にS:S須なD N A領域を組み込ん
だ第−の組み換えベクターが作製される。同領域内に7
ビボックスウィルス内″c機能リるブ0モーターが含ま
れているもの/fi好ましい。 増殆に調必須なL) NΔ領域の具体例とし(は、例え
ば第4図に示ψご1!:きlIII蜆酢索地図を示づア
L ホ”/ ’/ スウ−1’ A/ スN P a
D N A O) E C O r< T11indn
lll片(約5.0κbp)、8amHI断片(杓4、
O Kbp)、E C o R V − H i n
d m 断片(約1.8κbD)、13arn目I I
i l′i’ (約3.3κhp ) 、H i nd
ll[J4 (約5. 2KbE1 ) ’;Kトk相
同組み換えを起こす領域が例示される。 このような増殖に非必3f3なDNA領域は、例えば以
下のような千顔によって固定するここができる。未ザア
ビボツクスウィルスグノム中の{T AaのDNA断片
を挿入したハイブリッドブラスミド(ハ)と、7 [1
1′:一ターの支配十に検出容SA /.K酵素を]
一ドづるDNAを連粘したハイブリッドプラスミド0を
一Mlる。次にハイブリッドプラスミド■からブ目モー
ターおよび酵素をコードするDNAを完全に含むDNA
lli片を調製し、八イ1リツドプラスミド0のウイル
スDNA部分に挿入するここによりハイブリッドプラス
ミド0を[1−!j−る。 次いで予め7ビボックスウイルスを!.!I染さ往だ宿
1細胞にハイブリッドブラスミド■を移人づることk:
J、って、組み換えアピボックスウイルスの形成の右無
を!f認する。 組み換えアビポツクスウイルスが上記一連の操作によつ
(構築きれたかどうかの選択は常法に従って行えばJ;
(、例えば酵素をコードするDNAとしてβ−ガラク1
〜シダーぜ遺伝fを用いた場合に番;L ,組み換えア
ビポツクスウイルスのブラーク形成川培地にブラークが
認められた後にク0ロフヱノールレツドーβ−1〕−ガ
ラクトビラノシド(以上、C P R Gε称1)を含
むアガロース培地をΦ層し、37℃イン1コベーシコン
により赤く染まってくる1ラークを選択す゛れば良い。 このようにM束活性の検知を選択の手段としl、組み換
え7ビボックスウイルスが得られた場合は、ハイブリッ
ドIラスミド囚の構築に用いた7ヒボックスウイルス由
来の[)NA断J1が増殖にJ1必須なl) N A領
域であるこεを示している。 本発明で古うプロモーター機能をイiするDNAとは、
合成・天然をm1わfアビボックスウィルスが保イJリ
る転写の系でプロモーターどして有効に機能1ノ得るも
のなら如何なる3%リ配列のものでも長く、ブミジンキ
ナーげを″:1−ドするアビポツクスウイルス遺伝子の
プ1』〔一ターなどアビポツクスウイルス固イ1の1O
F:一ターはもちろんのこと、アごボックスウイルスJ
ス外のウイルス由来の1’) N Aや真核生物もしく
は原核生物山東のDNAであつ′ct)上記条例を満す
限り当然本充明に使用1I1能である。 これらプ日E一ターの具体例としては、例えばJour
nal or Virolooy. 5 1 66
2 〜669(1984)に例示されるようなワクブニ
アIクイルスのブ目モーター、具体的1,: i.t
7。5Kポリベブヂドを]一ドずるワクf−ニアウイル
ス}豐伝子のブ0{−ター 19Kポリベブヂドをコー
ドするワクチニアウイルス遺伝子の11」モーター 7
12KポリベブヂドをコードするりクブニアウイルスM
仏子のブロー[一ター、チミジンVナーゼを1ード4る
ワクチニアウイルス遺伝子のプ[1 ′E:一タ、28
Kポリベブチドをコードするワクヂニアウイルス遺伝子
の10T:一ターなどが例示される。 ブ[1モーターはその機能をイiしていれば、完全なブ
目モーターでも、一部を改度したブ口−t゛一ターでも
かまわない。 第一の組み換えベクターの作製については常法に従えば
良く、例えばアビポツクスウイルスの増蛸に非必拍なD
NA断片を適当なベクターに組み込んだ後、必戟に応じ
−C該断片中に存在する制限M木切断点を利用しその下
流k:制限酵素切断配列を飼加したプ口七一ターを組み
込め(【良い、,用いられるベクターの具体1jil.
!:Iノで、例えばpl3R322.E)BR325.
DBR327.pBR32B,pUc7.t)UC8.
pLJC9.1)IJC19などのごこきプラスミド
、λフ7−ジ、M13ファージなとのごときフ7−ジ、
pH C 79(ジーン、±1,291.1980年)
などのごときコスミドが例示きれる。 木発明においてU、次いで、第一の組み換えベクターの
ブOモーターの下流にN 11) Vの{−{Nを二コ
ードづるgA域を挿入しで第二の組み換えベクターが作
製される。挿入fJ法もまた常法に従えば良(例えば第
−のベクターの111 t一ターの下流に予め設GJら
れた&l1服M素切断点を利ffj シてN[)V山来
のc D N A断ハを挿入寸れば良い。 これら第一及び第二の組み換えベクターのI4築に当た
っては遺伝子操作の容易な大腸閑の系を用いれば良く、
使用寸るブラスミドベクターも目的に相応しいもの1−
ある限り特に限定きれるものではない。 本発nj k: 13いては、次に、予め7ピボックス
ウイルスを感染させた動物@養III胞に第二の組み換
えベクターを移入し、ベクターDNAとウィルスゲノム
DNAの問に相同組み換えを起こさせ、組み換えアビポ
ツクスウイルスを構築リる。ここで用いられる動物培a
m胞はアビポツクスウイルスが増殖IiJ能なものであ
ればJL < 、−fの具体例t1ノで、例λ,ば鳩胚
IHN芽+1l1[1 (JXF, OF Fト称=J
)などの鶏山来培ayis胞が挙げられ、また、発育鶏
卵漿尿膜なとも宿lt細胞の範略に当然含j、れる。 組み換えアビポツクスウイルスのv4築に当たっては常
法に従えば良く、例えば、DNAクーロニング第2 8
( 1) N A cloning Volume
ll ) 、実際的なアブ0−ブ(a pracf
:ical approach) p1.1 9 1−
2 1 1 、デイ.エム.グローバー(D.H.Gl
over) J&i, ( [ R Iプレス,オッ
クスフォード,ワシン1・ン)の記述に準じて7ビボッ
クスウイルスを感染させた宿JEII胞にリン酸力ルシ
ュウム共沈法により処理した第二の組み換えベクターを
移入さ1!、得られる組み換えウイルスを含むウイルス
集団を[agle M E M培地で培養された宿主細
胞に感染させ、!1,育して(るブラークを組み挟λウ
イルス候補株と4ればpい。これら候補株の内からND
VのFタンパク質を1−ドするl) N A llli
nが和み込まれlこウイルスを選沢クる方法について
番.↓、該D N Aをプ『1−1とするハイ1リダイ
1!一シ1ン法で候補株を純化したのち、Nl)V抗休
を111いるイムノアツレイを利川づれば良い。 (発明の効果〉 かくして本発明にまれば、アビポツクスウイルスの増殖
に刃二必須/7ゲノム領域にNOV由来の抗原]一ドc
DNAがブ0モーター機能を有するt) N A ,’
.共に発現再能な形で組み込まれた、家歳用生ワクチン
と1ノで利用01能な、組み換えアビポツクスウイルス
が得られる。 (実施例) 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明をさらに4体的
に説明寸る。 参考例1(非必須DNA領域の同定) (1) アビボツクスウイルスゲノムD N AのA
製7512培養フラス1に培養されたC E Fに、7
ビボックスウイルスNP株(鶏胎化pa沁島中町株、1
1木ノアーマシーネ1製)を1p.r.u./細胞にな
るように接種1ノだ637℃、5%C02イン4コベー
タ−で” 2 Its間培范後に、10%1・リブ1−
−スホスノエイト1口−ス( lcyptose ph
osphatebroth ) (デイフコ社)、0
.(.)3%し−グルタミン加イーグル([’aolc
) M E M培地を15一加えた。くの後4日間、
37℃、5%CO2イン4ユベーターで培!&後、j8
1&.−L清を3000団転で10分間遠心し、一E清
を同収した。その上冫^を25000同転〈約9800
0xg)1時間遠心し、沈消を回収した。培養土清の1
/10容吊のD N a s e反応バツファ一<50
sHl−リスl7,5、IIH MQL”,12)に
懸濁し、t)Nase fi(ベーリンガー・マンハ
イムネt)を9μg/II!になるように加え、37℃
、30分間反応させた。反応後、251HED丁A・2
Naを加え、室温で30分問おいたのち、ブ口テイナー
ビK(ベーリンガー・マンハイム社)を500μデl/
d,ドγシル硫酎ノ1・リウム( S D S )を1
%になるように加え、37℃で一晩反応さ1!た。これ
をおだやかにフ■ノール・ク[1 0小ルム処理後、エ
タノール沈殿c5t!、ウイルス(″)N八を0.5μ
g臀た。 (2) アビポツクスウイルスゲノム断I1を介むハ
イブリッドブラスミド0の作製(第5図参照)(自)
アビポツクスウイルスNP株D N Aの約5.0κb
+) Eco[’<T −H i ndl[[所片を含
むブラスミド( p N Z 1 8 0 H )の作
製2μクのpUc18(ファル7シアネ1製〉をE C
O I< 1:およびH i n d m ”’C消
化した後、7 .T−ノール・ク[1 [1ホルム(1
:1)で仙出し、二「タノール沈殿により開裂したD
tJ C 1 8をljJJ収した。 5′−末端リン酸をアルカリフオスファターゼ処理によ
り除去し、DNAを再びフェノール・ク1」[Jホルム
抽出後、Iタノール沈殿によって回収した。開裂した0
.2μJのpLJ C 1 8ε1μクの精製アビポツ
クスウイルス( N I)株)DNAのF coR I
一II i nd [n消化物を’J jJ − t
’ ニヨV)凍結し、」ンビテン1−な人I!薗TG1
を形質転換し、5−ブDE−4−クロ目−3−インドリ
ノレβ−1)−ガラク1−ビラノシド0.003%、イ
ソブ1]ビルーβ−D−ガラクトビラノシド0.03曲
、710tl’J/rdアンビシリン加のI− 8寒大
培地で15時間、37℃で塙孤した。寒天!8地上に牛
育した形質転換人膓菌のう’5 +il 」ロニーを杓
011’:I/−アンピシリシ加のL B液休J8 t
illぐ37℃、15IO間椙養し、どルンボイムどド
ーリーのh法〔ヌクレイツク・アシツド・リリー−チ,
7.1513・へ. (1979>)でプ゜)スミド
を抽出し、r eoR T&}l i ncimt”消
化後、0.6%アガロース電気泳紡によってもとの7ピ
ボックスウイルスON八 F’ e o R I一目i
ndlll断片と同じ長さの断片を持つハイブリッド!
ラスミドを検出し、これをpNZ180)lと命名した
.,なお、約5. Otlib F coR I−H
i nd nl断片のallI限酵素地図Li第4図(
のに示すとうりである,,pN718 0 Hはハイブ
リッドブラスミドの1.:相当する。 0 7ビボックスウイルスN P株D N Aの約4.
0κbpBamHIili片を含むブラスミド(pN7
1 60)の作製 (自)で用いたベクターpUc18をpLJ C 9に
変+Jiりること、またE. c o R丁−}1in
dlll断J7の代わりにN })株D N Aの約4
,0κbp 13 arnll 1断片を用いることL
ス外U(自)と同様に1ノでハイブリッドプラスミドを
得、ぞれをDNl160と命名した。なお、約4.OK
bp BarnH I断片の訓限酵A地図番ま第4図0
に示1とうりであり、pN7160はハイブリッド1ラ
スミド(ヘ)に相当する。 0 アビポツクスウイルスNPaDNAの約1.8Kb
p EcoRV−H t ndu[断片を含むブラスミ
ド(pNZ136s)の作製(自)で川いた約5。OK
bpF二GO八■一}l i n d m断J1の代わ
りにN P株1) N Aの約7. 3Kbp E c
oR IIIN片を用いる以外{ま(自)と同様(ニし
て、ハイブリッドを19、それをpN2136と命名し
た。さらに、pN7136をH i n d mで消化
した後、E C O R V rW分消化し、0。8%
ノ′ガ[J−ス電気泳a(ノ、隣接した約0.6κbp
Eco尺V断片と約1,2KbpF C O R V
− H i n d II Ii nよりなる約1.E
}Kill FcoRV−1−1 i ncjm断片を
回収した。 方、pUc18をflindlll,FCORIで消化
した後、フェノール;クロロホルム(1:1)で抽出し
、エタノール沈W2により開裂したp LJ 0 18
をアガロースゲル電気泳勤により同収(ノた。約168
κbp EE coRV− 1−1 i nd ff[
liハをDNAボリメレースにより平滑末端とした後、
リガーゼにより連結し、コンビテントな人賜薗rG1を
形質転換し、アンピシリン加の1 8寒天培地′c′選
択し、約1 . 8Kbp U coRV−11 i
nd IIIiHを含むブラス互ドをpNZ136sと
命名しlこ。 なお、約1.8Kbp EcoRV−Hi ndlU断
片の制限R素地図は第4図Oに示す通りであり、pI’
ll136Sl;t,ハイブリッドブラスミド(ハ)に
相ご′i?jる。 (3) ブ〇七一ター及びその支配下に検出′B易な
酵糸を:J−ド《1゛るD N八を連結しL:ハイブリ
ッドブラスミドOη(pN776)の作製(第6図参照
〉 ワク1ニアウイルスW R aの7.5KダルI−ンベ
ブf−ドをコードリ−るDNAのプ口t一ターを含むS
a I I − R s a I iFi j’+約
0. 26Kho (Cell,125.805〜81
3 (1981))をo LJ C9のSaJI−Sr
na1部分に組みこ^、だブラスミドをp(ノW P−
1と命名した。 10μグのo M A 0 0 1 ( Shirak
awaら、Gene,28. 127 − .
(1984)) を 13 8 m H
I で消化後、(2)εl01様の操nによりβ
一万ラクI〜シダーゼ遭伝イ(約3.3Kbp)を回収
した。一方、0.31151のp tJ C 1 9を
B a rn目■で消化後、7丁ノール・クロロホルム
抽出し、−[タノール沈殿により[OJ収し、上記で:
JIJ製したβ−ガラクシトダ−t?12伝了とライゲ
ーシコンし、ハイブリッドブラスミドpNZ66を作製
した。 一方、40μグのpuwp−iをH p a II ,
U c o R Iで消化し、15%低融点アガロース
電気泳朔《70ボルト、6時fl¥1》により7.5K
プD [一ターを含む約0.26κbp (/)所I1
を分離し、(2)と(I1様の操作によりDNAを回収
した。このf) N A断片の接着末端をDNAポリメ
レースにより甲消末喘とした。0.3μびのpNZ66
を目inclIで消化し、ノエノール・クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿により同収し、L記約0.26κ
bpの7.5Kプロt一ター遺伝子をライグーシコンし
、得られたハイブリッドブラスミドをoNZ76と命名
したnoN77Bはハイブリッドブラスミド■に相当す
る。 (4) ハイブリッドブラスミド0εハイブリッドプ
ラスミド0からのハイブリッドブラスミド0の作製(第
7図参照) (d p N Z 1 8 0 H中のIE C O
R V 部位にワクナニ7ウイルス7.5K7OE−
ターとβガラクI−シダーゼDNAの連結Ffi片が仲
人されたハイブリッドブラスミド(pNZ1003)の
作製 10μ9のpN,776をH i ncU III,
Sma 1で消化後、0,7%低融点7ガ目一ス電気泳
動(40ボル1・、20時問)で約3。6 Kbpの断
ハを分離し、■ブージウムブ口マイド染(fiによりD
NA断片を確認後、ゲルを切り出し、フ],ノール処理
した後、エタノール沈殿によりDNA断ハを四収した。 it,1μHのO N 7 1 80 H 4r [c
o R V テ消化し、フェノール・クLl [コホ
ルム抽出し、エタノール沈殿により同収した。開裂され
たpNZ180N DNA0.3μgL萌配約3.6
KbDの断片(7.5KブrJ l−ター1) N A
とβ−ガラク1・シダーぜ遺伝゛tの連結断ハ》約0.
4μグを混合し、DNAポリメレースで接着末端を平滑
末端とし、フェノール・クロ1]ホルム仙出後、Iタノ
ール沈殿により回収した。同収され7:: o N A
をリガーピにJ;り連結し、ロンビj−ントな人腸菌「
01株を形質転換し、40μ?? / d 7ンビシリ
ンb11の113寒大鳩地で37℃、15峙間生介させ
た。 生育した人腸菌から、(2)だ同様な操作によりブラス
ミドを間収し、Ig3 8m目Iで消化し、0.5%ア
ガ口ース電気泳初でβ−ガラク1・シダーゼ逍伝子断j
’i’ (約3.3κbp )を含むハイブリッドブノ
スミドを選択しこれをpN71003口ε命名した。 lti pN7160中のXbaI部付にワクチニア
ウイルス7.5Kブo t一ターとβ−ガラク1・シダ
ーゼD N Aの辻粘断片が挿入されたハイブリッドブ
ラスミド(pNZ1004)の作製 (自)で用いたpN Z 1 8 0 H 4r !J
N Z 1 (i 0に置−.!!換え、frill
限M素F c o R VをX b a IにE’f
3 mえた他は、(自)と[1]様にしで、β−ガシク
1・シダーぜ遺伝子断11(約3.3κ1)p)を含む
ハイブリッドブラスミドを選択し、それをpNZ100
4と命名した。 (6 pNZ136SのFcoRVailllk:’
7クチニアウイルス7.5Kブ[]t一ターとβ−ガラ
ク1−シダーゼl) N Aの連結#igが挿入された
ハイ1リツドブラスミド(1)NZ1137)の作製 pN7136SをE c o RV−C消4kA&、[
coflTリンカー(宝酒造株式会討製)をリがー12
により連結し、フェノール・ク【J『】ホルム抽出、エ
タノール沈殿に,LりDNAを同収(ノた.,四収した
DNAをEcoRI.xbal’r消化後、2.0%ア
ガロースグル電気泳初に供し、約140b+lEcoR
T−Xba I断(1を
ニダーt!(以十、H Nε称1)及び膜融合タンパク
質(以1・、Fタンパクnと称寸)を1−ドリろc [
) N Aが最百になって見い出された〔例えばジャー
ナル・Aブ・ジ■ネラル・ヴイ11[] ジ ー く
,ノ.Gen.Virol.> 6 7. 1
9 1 7 〜 1 9 27,198
(1,特開昭6 2−1 6 3 6 9 3月]。 しかしながら多くの1クイルス、特にN D Vのよう
なR N AウイルスU、変巽が起こりやt <、ワク
ブンの効かない変異ウイルスが出現4る危険竹を無視リ
ーることはできない,,特に単一の抗原遺伝−rのみを
挿入した組み換え9ワクヂンCは、ワクブンの無効な変
冑ウイルスの出現する危険度がJII!行ワクブンより
高いことも予想される。このため、抗原遺イムrεしで
1−INより、ウイルスの林間で保存竹の0い「タンパ
ク質遺イ6了(以下F13伝了と称t) (Viru
sRes. 7 241−255(1987),
V+rusRes. 8 217−232 (19
88),VirusRes. 5 343−356
(1986), J.Gan.Virol.67. 1
91 7〜l927(1986))を導入することを検
詞したが、単に抗原遺伍子を組み込んだ組み換えアビポ
ツクスウイルスを作製しても、実際にワクチンとしてイ
1効であるεは限らず、NDVのI”11仏子を組み込
んだ組み換えアじボックスウイルスでNOVの感染を紡
御し得るワクチンが製造できるかは、まったく不明の状
慝であった。また、近年ワクチニアウイルスにヒ1・・
パラインフル■ンlffff型ウイルスのF遺伍了を挿
入し!こところ組み換えウ、イルス感染III胞は、ぞ
”の組み込んだト瑣伝子の発現により、そのill胞ホ
竹が強まることが示唆された(J.Virol.61
3416−3423(1987〉)。このように「遺
伝子を導入した組み換えウイルスで【よウイルスによる
細胞融合などが起こりやすくなるなどの問題点があった
。 (発明lfi解決しようと寸る課題) そこで木発明名らは、かかる従来技術の下で、N l)
V由来の抗原二1−ドcDNAがゲノムl’) N
A中に組み込まれた増殖lJ1能な組み換え7ヒボック
スウイルスの構築をlj l= L説ふ検J4をil8
めた結果、NOVのc D N A ,好J、しくは0
26株の5ノ、うtκ弱毒株のcDNAより1タンパク
質をコードする領域を選択し7ビボックスウイルスの増
殖に41必須なグノムgAil&に組み込めば、増殖可
能6Ilみ換えアビポツクスウイルスが得られるこεを
見い出し、きらに、これらF遺伝子を含む組み換え7ピ
ボックスウイルスが感染WJ胞の融合を引き起こ3ヂ、
、かつ7ピボックスウイルスとN I) Vの両方の!
4染を防御し得るワクチンとしてイ−j効て・あるこε
を見い出し、本発明を完成寸るに至った。 (課題を解決するための手段) かくして本発明によれば、NDV出来の抗原を二』−ド
するcDNAをアビボゝソクスウイノレスの増輌に非必
須なグノム領域に、好ましくはブD t−ター機能を右
する() N Aと共に、発現可能な形で組み込:Lれ
た組み換えアビポツクスウイルスが提供される。 本発明においてNDV山東のc I) N Aを組み込
む!こめに供されるウイルス(よアビポツクスウイルス
に分頬される限りいかなる株でもよいが、鶏、七面島、
アじルf.κどの家禽類の細胞中で増舶’1+l能なも
のが好ましく、その具体例としてA 1” C GVR
−251.A”rCC VR−250,ATCC
VR−229,AT(;C VR−249.ATCC
VR−288,西ケ原株、洲水株などのごとぎフI
ウルボックスウイルスやノ7ウルボツクスウイルスと近
縁のウイルスであって、NP株(鶏胎化鳩痔島中町株)
なとのように鶏痘lEワクチン株tして使用されるウイ
ルスなどが例示される1.これらの株はいず^も市販さ
れCおり、容易に入手ずるこεができる。 またN l) V山来の1−タンパク質は、rA染I!
I胞℃゛「0タンパク質という形で発現し、Austr
aJ+a−vtctoria株《以ド、AV株と称す》
tTどの強出様で【よ、N未端から約1/5のところe
切断され、F,F2εいう2つのポリベブチドになり、
こ1 のji裂によって感染ll!胞の融合活性が生じるのに
対し、1)26株なとの弱毒株で(ま、強ji株に存n
−するF,F2への開裂部位ri前の連続した塩基1 性アミノ酸残基が存イtt!ず、「。タンパク質昏よ「
1,F2八同裂しない。そのため感染細胞の融含活性か
はとんとなイ( Virus Research 7
241−255 (1987)).木発明においてN
I) V山来の1タンパク費を]一ドするcDNAL
L ,好ましく(よN l) Vの1)26株などの「
。タンパク質からF.F2への開裂の起こらない弱み1 株を用いて調yj1″ることができるがAVaなとを用
いて調製してもよい。AV株なと強渇株由来のF遺伝r
を利用リる場合、{=oタンパク質から1,,「2への
間裂部分直前を合成[.) N A等を用いて聞裂の起
こらない弱痛タイブに変換しで用いることがQfましい
。例えば、上記1)26株から調製されるcDNAは、
第3図に示!J′瑞囚配列の中の第43番目から第17
01番目までの1 65 9堪基対で構成されている。 4l:たAV株から調製されタC l) N Aも16
59勉基対から構成されており、開裂部位近傍を除いて
他の配列は相向恒が高い( Virus Resear
ch 7241−255 (1987))。 この様にNDV山来の「タンパク質を]一ドづるcDN
Aの配列は必ずしも一様ではないが、本発明においては
、上記2種類のcDNAと実質的に同一の機能をtJリ
るw!IPllにJ3いC修鋒きれたc l’) N
A ( [!l ノ5、塩基配列が置換、挿入、欠失し
たもの)であってもよい。もらろん、実費的に四一の機
能を有づるかぎり、?ミノ酸配列が異なる程度に修飾さ
れkbのであってbよいが、虹ましく【よ、D26株の
「クンバク質のようにl−’1+12へ開裂しない弱み
タイプのポリベプヂドを丁l−ドするC D N A
$ Qい。もちろんAVI1のごとき強島株のCDN八
を用い開裂部イ☆近傍を合成DNAeを用いて弱毒タイ
プのbのと直き換えて用いることも呵能て゛ある。 本発明を実施リるに当たっては、まずアビポツクスウイ
ルスの1?!殖にS:S須なD N A領域を組み込ん
だ第−の組み換えベクターが作製される。同領域内に7
ビボックスウィルス内″c機能リるブ0モーターが含ま
れているもの/fi好ましい。 増殆に調必須なL) NΔ領域の具体例とし(は、例え
ば第4図に示ψご1!:きlIII蜆酢索地図を示づア
L ホ”/ ’/ スウ−1’ A/ スN P a
D N A O) E C O r< T11indn
lll片(約5.0κbp)、8amHI断片(杓4、
O Kbp)、E C o R V − H i n
d m 断片(約1.8κbD)、13arn目I I
i l′i’ (約3.3κhp ) 、H i nd
ll[J4 (約5. 2KbE1 ) ’;Kトk相
同組み換えを起こす領域が例示される。 このような増殖に非必3f3なDNA領域は、例えば以
下のような千顔によって固定するここができる。未ザア
ビボツクスウィルスグノム中の{T AaのDNA断片
を挿入したハイブリッドブラスミド(ハ)と、7 [1
1′:一ターの支配十に検出容SA /.K酵素を]
一ドづるDNAを連粘したハイブリッドプラスミド0を
一Mlる。次にハイブリッドプラスミド■からブ目モー
ターおよび酵素をコードするDNAを完全に含むDNA
lli片を調製し、八イ1リツドプラスミド0のウイル
スDNA部分に挿入するここによりハイブリッドプラス
ミド0を[1−!j−る。 次いで予め7ビボックスウイルスを!.!I染さ往だ宿
1細胞にハイブリッドブラスミド■を移人づることk:
J、って、組み換えアピボックスウイルスの形成の右無
を!f認する。 組み換えアビポツクスウイルスが上記一連の操作によつ
(構築きれたかどうかの選択は常法に従って行えばJ;
(、例えば酵素をコードするDNAとしてβ−ガラク1
〜シダーぜ遺伝fを用いた場合に番;L ,組み換えア
ビポツクスウイルスのブラーク形成川培地にブラークが
認められた後にク0ロフヱノールレツドーβ−1〕−ガ
ラクトビラノシド(以上、C P R Gε称1)を含
むアガロース培地をΦ層し、37℃イン1コベーシコン
により赤く染まってくる1ラークを選択す゛れば良い。 このようにM束活性の検知を選択の手段としl、組み換
え7ビボックスウイルスが得られた場合は、ハイブリッ
ドIラスミド囚の構築に用いた7ヒボックスウイルス由
来の[)NA断J1が増殖にJ1必須なl) N A領
域であるこεを示している。 本発明で古うプロモーター機能をイiするDNAとは、
合成・天然をm1わfアビボックスウィルスが保イJリ
る転写の系でプロモーターどして有効に機能1ノ得るも
のなら如何なる3%リ配列のものでも長く、ブミジンキ
ナーげを″:1−ドするアビポツクスウイルス遺伝子の
プ1』〔一ターなどアビポツクスウイルス固イ1の1O
F:一ターはもちろんのこと、アごボックスウイルスJ
ス外のウイルス由来の1’) N Aや真核生物もしく
は原核生物山東のDNAであつ′ct)上記条例を満す
限り当然本充明に使用1I1能である。 これらプ日E一ターの具体例としては、例えばJour
nal or Virolooy. 5 1 66
2 〜669(1984)に例示されるようなワクブニ
アIクイルスのブ目モーター、具体的1,: i.t
7。5Kポリベブヂドを]一ドずるワクf−ニアウイル
ス}豐伝子のブ0{−ター 19Kポリベブヂドをコー
ドするワクチニアウイルス遺伝子の11」モーター 7
12KポリベブヂドをコードするりクブニアウイルスM
仏子のブロー[一ター、チミジンVナーゼを1ード4る
ワクチニアウイルス遺伝子のプ[1 ′E:一タ、28
Kポリベブチドをコードするワクヂニアウイルス遺伝子
の10T:一ターなどが例示される。 ブ[1モーターはその機能をイiしていれば、完全なブ
目モーターでも、一部を改度したブ口−t゛一ターでも
かまわない。 第一の組み換えベクターの作製については常法に従えば
良く、例えばアビポツクスウイルスの増蛸に非必拍なD
NA断片を適当なベクターに組み込んだ後、必戟に応じ
−C該断片中に存在する制限M木切断点を利用しその下
流k:制限酵素切断配列を飼加したプ口七一ターを組み
込め(【良い、,用いられるベクターの具体1jil.
!:Iノで、例えばpl3R322.E)BR325.
DBR327.pBR32B,pUc7.t)UC8.
pLJC9.1)IJC19などのごこきプラスミド
、λフ7−ジ、M13ファージなとのごときフ7−ジ、
pH C 79(ジーン、±1,291.1980年)
などのごときコスミドが例示きれる。 木発明においてU、次いで、第一の組み換えベクターの
ブOモーターの下流にN 11) Vの{−{Nを二コ
ードづるgA域を挿入しで第二の組み換えベクターが作
製される。挿入fJ法もまた常法に従えば良(例えば第
−のベクターの111 t一ターの下流に予め設GJら
れた&l1服M素切断点を利ffj シてN[)V山来
のc D N A断ハを挿入寸れば良い。 これら第一及び第二の組み換えベクターのI4築に当た
っては遺伝子操作の容易な大腸閑の系を用いれば良く、
使用寸るブラスミドベクターも目的に相応しいもの1−
ある限り特に限定きれるものではない。 本発nj k: 13いては、次に、予め7ピボックス
ウイルスを感染させた動物@養III胞に第二の組み換
えベクターを移入し、ベクターDNAとウィルスゲノム
DNAの問に相同組み換えを起こさせ、組み換えアビポ
ツクスウイルスを構築リる。ここで用いられる動物培a
m胞はアビポツクスウイルスが増殖IiJ能なものであ
ればJL < 、−fの具体例t1ノで、例λ,ば鳩胚
IHN芽+1l1[1 (JXF, OF Fト称=J
)などの鶏山来培ayis胞が挙げられ、また、発育鶏
卵漿尿膜なとも宿lt細胞の範略に当然含j、れる。 組み換えアビポツクスウイルスのv4築に当たっては常
法に従えば良く、例えば、DNAクーロニング第2 8
( 1) N A cloning Volume
ll ) 、実際的なアブ0−ブ(a pracf
:ical approach) p1.1 9 1−
2 1 1 、デイ.エム.グローバー(D.H.Gl
over) J&i, ( [ R Iプレス,オッ
クスフォード,ワシン1・ン)の記述に準じて7ビボッ
クスウイルスを感染させた宿JEII胞にリン酸力ルシ
ュウム共沈法により処理した第二の組み換えベクターを
移入さ1!、得られる組み換えウイルスを含むウイルス
集団を[agle M E M培地で培養された宿主細
胞に感染させ、!1,育して(るブラークを組み挟λウ
イルス候補株と4ればpい。これら候補株の内からND
VのFタンパク質を1−ドするl) N A llli
nが和み込まれlこウイルスを選沢クる方法について
番.↓、該D N Aをプ『1−1とするハイ1リダイ
1!一シ1ン法で候補株を純化したのち、Nl)V抗休
を111いるイムノアツレイを利川づれば良い。 (発明の効果〉 かくして本発明にまれば、アビポツクスウイルスの増殖
に刃二必須/7ゲノム領域にNOV由来の抗原]一ドc
DNAがブ0モーター機能を有するt) N A ,’
.共に発現再能な形で組み込まれた、家歳用生ワクチン
と1ノで利用01能な、組み換えアビポツクスウイルス
が得られる。 (実施例) 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明をさらに4体的
に説明寸る。 参考例1(非必須DNA領域の同定) (1) アビボツクスウイルスゲノムD N AのA
製7512培養フラス1に培養されたC E Fに、7
ビボックスウイルスNP株(鶏胎化pa沁島中町株、1
1木ノアーマシーネ1製)を1p.r.u./細胞にな
るように接種1ノだ637℃、5%C02イン4コベー
タ−で” 2 Its間培范後に、10%1・リブ1−
−スホスノエイト1口−ス( lcyptose ph
osphatebroth ) (デイフコ社)、0
.(.)3%し−グルタミン加イーグル([’aolc
) M E M培地を15一加えた。くの後4日間、
37℃、5%CO2イン4ユベーターで培!&後、j8
1&.−L清を3000団転で10分間遠心し、一E清
を同収した。その上冫^を25000同転〈約9800
0xg)1時間遠心し、沈消を回収した。培養土清の1
/10容吊のD N a s e反応バツファ一<50
sHl−リスl7,5、IIH MQL”,12)に
懸濁し、t)Nase fi(ベーリンガー・マンハ
イムネt)を9μg/II!になるように加え、37℃
、30分間反応させた。反応後、251HED丁A・2
Naを加え、室温で30分問おいたのち、ブ口テイナー
ビK(ベーリンガー・マンハイム社)を500μデl/
d,ドγシル硫酎ノ1・リウム( S D S )を1
%になるように加え、37℃で一晩反応さ1!た。これ
をおだやかにフ■ノール・ク[1 0小ルム処理後、エ
タノール沈殿c5t!、ウイルス(″)N八を0.5μ
g臀た。 (2) アビポツクスウイルスゲノム断I1を介むハ
イブリッドブラスミド0の作製(第5図参照)(自)
アビポツクスウイルスNP株D N Aの約5.0κb
+) Eco[’<T −H i ndl[[所片を含
むブラスミド( p N Z 1 8 0 H )の作
製2μクのpUc18(ファル7シアネ1製〉をE C
O I< 1:およびH i n d m ”’C消
化した後、7 .T−ノール・ク[1 [1ホルム(1
:1)で仙出し、二「タノール沈殿により開裂したD
tJ C 1 8をljJJ収した。 5′−末端リン酸をアルカリフオスファターゼ処理によ
り除去し、DNAを再びフェノール・ク1」[Jホルム
抽出後、Iタノール沈殿によって回収した。開裂した0
.2μJのpLJ C 1 8ε1μクの精製アビポツ
クスウイルス( N I)株)DNAのF coR I
一II i nd [n消化物を’J jJ − t
’ ニヨV)凍結し、」ンビテン1−な人I!薗TG1
を形質転換し、5−ブDE−4−クロ目−3−インドリ
ノレβ−1)−ガラク1−ビラノシド0.003%、イ
ソブ1]ビルーβ−D−ガラクトビラノシド0.03曲
、710tl’J/rdアンビシリン加のI− 8寒大
培地で15時間、37℃で塙孤した。寒天!8地上に牛
育した形質転換人膓菌のう’5 +il 」ロニーを杓
011’:I/−アンピシリシ加のL B液休J8 t
illぐ37℃、15IO間椙養し、どルンボイムどド
ーリーのh法〔ヌクレイツク・アシツド・リリー−チ,
7.1513・へ. (1979>)でプ゜)スミド
を抽出し、r eoR T&}l i ncimt”消
化後、0.6%アガロース電気泳紡によってもとの7ピ
ボックスウイルスON八 F’ e o R I一目i
ndlll断片と同じ長さの断片を持つハイブリッド!
ラスミドを検出し、これをpNZ180)lと命名した
.,なお、約5. Otlib F coR I−H
i nd nl断片のallI限酵素地図Li第4図(
のに示すとうりである,,pN718 0 Hはハイブ
リッドブラスミドの1.:相当する。 0 7ビボックスウイルスN P株D N Aの約4.
0κbpBamHIili片を含むブラスミド(pN7
1 60)の作製 (自)で用いたベクターpUc18をpLJ C 9に
変+Jiりること、またE. c o R丁−}1in
dlll断J7の代わりにN })株D N Aの約4
,0κbp 13 arnll 1断片を用いることL
ス外U(自)と同様に1ノでハイブリッドプラスミドを
得、ぞれをDNl160と命名した。なお、約4.OK
bp BarnH I断片の訓限酵A地図番ま第4図0
に示1とうりであり、pN7160はハイブリッド1ラ
スミド(ヘ)に相当する。 0 アビポツクスウイルスNPaDNAの約1.8Kb
p EcoRV−H t ndu[断片を含むブラスミ
ド(pNZ136s)の作製(自)で川いた約5。OK
bpF二GO八■一}l i n d m断J1の代わ
りにN P株1) N Aの約7. 3Kbp E c
oR IIIN片を用いる以外{ま(自)と同様(ニし
て、ハイブリッドを19、それをpN2136と命名し
た。さらに、pN7136をH i n d mで消化
した後、E C O R V rW分消化し、0。8%
ノ′ガ[J−ス電気泳a(ノ、隣接した約0.6κbp
Eco尺V断片と約1,2KbpF C O R V
− H i n d II Ii nよりなる約1.E
}Kill FcoRV−1−1 i ncjm断片を
回収した。 方、pUc18をflindlll,FCORIで消化
した後、フェノール;クロロホルム(1:1)で抽出し
、エタノール沈W2により開裂したp LJ 0 18
をアガロースゲル電気泳勤により同収(ノた。約168
κbp EE coRV− 1−1 i nd ff[
liハをDNAボリメレースにより平滑末端とした後、
リガーゼにより連結し、コンビテントな人賜薗rG1を
形質転換し、アンピシリン加の1 8寒天培地′c′選
択し、約1 . 8Kbp U coRV−11 i
nd IIIiHを含むブラス互ドをpNZ136sと
命名しlこ。 なお、約1.8Kbp EcoRV−Hi ndlU断
片の制限R素地図は第4図Oに示す通りであり、pI’
ll136Sl;t,ハイブリッドブラスミド(ハ)に
相ご′i?jる。 (3) ブ〇七一ター及びその支配下に検出′B易な
酵糸を:J−ド《1゛るD N八を連結しL:ハイブリ
ッドブラスミドOη(pN776)の作製(第6図参照
〉 ワク1ニアウイルスW R aの7.5KダルI−ンベ
ブf−ドをコードリ−るDNAのプ口t一ターを含むS
a I I − R s a I iFi j’+約
0. 26Kho (Cell,125.805〜81
3 (1981))をo LJ C9のSaJI−Sr
na1部分に組みこ^、だブラスミドをp(ノW P−
1と命名した。 10μグのo M A 0 0 1 ( Shirak
awaら、Gene,28. 127 − .
(1984)) を 13 8 m H
I で消化後、(2)εl01様の操nによりβ
一万ラクI〜シダーゼ遭伝イ(約3.3Kbp)を回収
した。一方、0.31151のp tJ C 1 9を
B a rn目■で消化後、7丁ノール・クロロホルム
抽出し、−[タノール沈殿により[OJ収し、上記で:
JIJ製したβ−ガラクシトダ−t?12伝了とライゲ
ーシコンし、ハイブリッドブラスミドpNZ66を作製
した。 一方、40μグのpuwp−iをH p a II ,
U c o R Iで消化し、15%低融点アガロース
電気泳朔《70ボルト、6時fl¥1》により7.5K
プD [一ターを含む約0.26κbp (/)所I1
を分離し、(2)と(I1様の操作によりDNAを回収
した。このf) N A断片の接着末端をDNAポリメ
レースにより甲消末喘とした。0.3μびのpNZ66
を目inclIで消化し、ノエノール・クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿により同収し、L記約0.26κ
bpの7.5Kプロt一ター遺伝子をライグーシコンし
、得られたハイブリッドブラスミドをoNZ76と命名
したnoN77Bはハイブリッドブラスミド■に相当す
る。 (4) ハイブリッドブラスミド0εハイブリッドプ
ラスミド0からのハイブリッドブラスミド0の作製(第
7図参照) (d p N Z 1 8 0 H中のIE C O
R V 部位にワクナニ7ウイルス7.5K7OE−
ターとβガラクI−シダーゼDNAの連結Ffi片が仲
人されたハイブリッドブラスミド(pNZ1003)の
作製 10μ9のpN,776をH i ncU III,
Sma 1で消化後、0,7%低融点7ガ目一ス電気泳
動(40ボル1・、20時問)で約3。6 Kbpの断
ハを分離し、■ブージウムブ口マイド染(fiによりD
NA断片を確認後、ゲルを切り出し、フ],ノール処理
した後、エタノール沈殿によりDNA断ハを四収した。 it,1μHのO N 7 1 80 H 4r [c
o R V テ消化し、フェノール・クLl [コホ
ルム抽出し、エタノール沈殿により同収した。開裂され
たpNZ180N DNA0.3μgL萌配約3.6
KbDの断片(7.5KブrJ l−ター1) N A
とβ−ガラク1・シダーぜ遺伝゛tの連結断ハ》約0.
4μグを混合し、DNAポリメレースで接着末端を平滑
末端とし、フェノール・クロ1]ホルム仙出後、Iタノ
ール沈殿により回収した。同収され7:: o N A
をリガーピにJ;り連結し、ロンビj−ントな人腸菌「
01株を形質転換し、40μ?? / d 7ンビシリ
ンb11の113寒大鳩地で37℃、15峙間生介させ
た。 生育した人腸菌から、(2)だ同様な操作によりブラス
ミドを間収し、Ig3 8m目Iで消化し、0.5%ア
ガ口ース電気泳初でβ−ガラク1・シダーゼ逍伝子断j
’i’ (約3.3κbp )を含むハイブリッドブノ
スミドを選択しこれをpN71003口ε命名した。 lti pN7160中のXbaI部付にワクチニア
ウイルス7.5Kブo t一ターとβ−ガラク1・シダ
ーゼD N Aの辻粘断片が挿入されたハイブリッドブ
ラスミド(pNZ1004)の作製 (自)で用いたpN Z 1 8 0 H 4r !J
N Z 1 (i 0に置−.!!換え、frill
限M素F c o R VをX b a IにE’f
3 mえた他は、(自)と[1]様にしで、β−ガシク
1・シダーぜ遺伝子断11(約3.3κ1)p)を含む
ハイブリッドブラスミドを選択し、それをpNZ100
4と命名した。 (6 pNZ136SのFcoRVailllk:’
7クチニアウイルス7.5Kブ[]t一ターとβ−ガラ
ク1−シダーゼl) N Aの連結#igが挿入された
ハイ1リツドブラスミド(1)NZ1137)の作製 pN7136SをE c o RV−C消4kA&、[
coflTリンカー(宝酒造株式会討製)をリがー12
により連結し、フェノール・ク【J『】ホルム抽出、エ
タノール沈殿に,LりDNAを同収(ノた.,四収した
DNAをEcoRI.xbal’r消化後、2.0%ア
ガロースグル電気泳初に供し、約140b+lEcoR
T−Xba I断(1を
【1−1収した.,またli1
様にしrpNZ136sをl coRVでi化後、ll
indllリンカー《宝酒造株式会社製》をリガーゼに
より連結し、フェノール・ク0 [1ホルム抽出、1L
.タノール沈殿により0N八を同収した。 回収したI) N Aをtlindlll−XbaIに
より消化した後、0.8%7ガロースゲル電気泳S)+
により約ぺ.3κbのf−1 i n d m−X b
a 1’ Kハを同収した。さらに、pUC1Bをl
−1ir+dll!,[coRIF8!i化後、2.0
%アガロースグル電気泳動により、ポリリンカ一部分(
/) 5 1 bnの断片を回収した。ここで得られた
約140bpのEcoRI−XbaI断片、約4.3κ
bpの11indlll−XbaI断JT1さらに5
1 bpのHindl[I −EcoRI’所片をリガ
ーゼにより連結し、実施例1の{4}εII■1様な操
竹に1、リブラスミドを抽出し、aIWi片が連結した
ブラスミドを検出し、これをpNZ136sI−た命名
した(第8図参照)。 7j,pN776を口i n d m、Srnc3Tr
消化後、(2)とIi’i1様に約3.6κhp断片を
回収した.,−1記pNZ136SI−をll i n
dlll. Sma Iで消化し、フェノール・クロロ
ホルムで抽出し、■タノール沈殿により同収した。この
両者をリガーゼにより連結し、]ンビテン1−な人腸菌
−rG1株を形質転換し、以十{2}と同様にして、ハ
イブリッドプラスミドを選択し、これをpNZ1137
と命名した。 (5)組み換えアビポツクスウイルスの作製25a2培
養フラスコに培養されたCEFにアビポツクスウイルス
NP株を0. 05D.lu./Ill胞になるように
接挿した。(4)で得たハイブリッドブシスミド50μ
lを、2.2−の滅菌水に溶解し、これに1%へベス、
0.6%地化ノ゛トリウムの混合液を2.5d,70s
Mリン酸水索2ナトリウム12水和物と70mHリン酸
水素2tl−リウム2水和物を′8診混合し/,− !
fi T#J液を50μl加えた水溶液を作製した。こ
れを15IIlのJ−ユープ(ファルコン剥製)に・)
つし、スターラーでFft#¥し<lがら2Mの煽化カ
ルシウム水溶F&300μlをこれに漬F L, I)
N八一リン酸カルシウム共洗物を作り、そのO. !5
lIl.をウイルス接fil45分後の感染CEFJ二
に滴下した。37℃、5%C゛02インキ1ベーターに
30分間静nし、5%牛胎児血清、0.03%]−一一
−グルタミン、10%トリプトースフA−スノ1イ1・
ブロースを含むイーグルM E M4.5dを加えた。 その3i間後、培養液を交換し、3日間、37℃、5%
CO2インキュベーター中で培養し、@養II胞ごε3
度凍結融解し、組み換え体を含むウイルス液を4!?l
こ。 +61CPRGによる組み換え体の選択10lJべ1・
りllI′Iに培養されたCビFに(5)で青たウイル
ス液を接種し、2時間後、0.8%バクトア〃−《デイ
フ」ネj製〉、5%牛胎児血清、0.03%[−グルタ
ミン、10%トリブトースノAスフエイトブ[l−スを
含んだ、フェノールレット不含イーグルMFMを10I
I!積ib、37′c,5%C02インキュベーターで
3Flt@差し、これに、」記ε同成分のフェノールレ
ッド不含イーグルMEMを10耐重居し、さらに、37
℃、5%C02インキコ−−ベーターで3目間培養した
。 これに、0.8%バクトアガー、0.03%1−グルタ
ミン、10%トリ11一一スノAスノエイトブ【1−ス
、0.03%CPI<G(ベーリンガー・マンハイム剥
製〉を含むフfノールレツド不含イーグルMEMを10
d重層し、37℃、5%CO2イン↑ユーベーターで6
時間培養した。組み換えウイルスはβ−ガラクトシダー
ゼをR現し、CP R G {S”赤変さQるので、組
み換え体ブラークのまわりのアガ〜、lIJ胞とも赤色
に発色し、容易にA−組み換え体ε区別が可ILであっ
た。この赤他ブラークから生或した組み換え体を滅薗パ
スツールビベットで単閣した。得られた組み換え体につ
ぎ、それぞれ第1表に示すごとく命名した。 第1表 (71 組み換えアごボックスウイルスのゲノム1)
N Aの解析 (6)で得られたそれぞれの組み換えアビポツクスウイ
ルスをブラ〜ク純化しt:のi)、10l:IIべl−
リIIn [培蓄サれたCEFに1 1). r.u.
/細飽となるように接種した。以下、…tlililI
1の方法でウイルスON八を単離した。各組み換えウイ
ルスDNA2μクを[3 a lTi it IまたL
N{indll[ニT消{1、0、5 % ? カ口−
ス電気泳!IJ (25V.’2011.V間)でl
giハを分離し、#Jヂンの方法(ジA7−ナル・A1
・モレ1ユラー・パイA口ジイ,98,503−・(1
979))で、ナイロンメンブレンにD N Aを移し
た後、80℃、減圧下でDNAをナイ0ンメンプレンに
固定しlこ.4倍S[:「(0.6M NaCJ.0
.08M TrisHC i (pH7. 8)
, 4mH El)’rA) ・− 1
0倍Denhardト−0.1%SDSで68℃、2
1Li [FS1 51!! ff後、 IRsET−
10 イ!’. Denhardt −0. 1
%SDS−0.1%Na4P2 07 −5011
g/d.変性サケ精子DNAとニツクトランスレーシコ
ンによつ’c32pre:識したβ−ガラクトシダービ
1) N Aを加えて68℃、14時間ハイプリダイゼ
ーシコンした。洗浄、乾燥後、ナイ口ンメンブレンとX
線フイルムを重ね、オートラジオグラフイ一を{jない
、バンドの存在を確認1ノ、これらの組み換えウイルス
が所定の場所にβ−ガラクLシダーぜ遺伝子を持つここ
を確認した。 {0}非必須1) N A領域の同定 以上の結果から、pNZ180Hの作製に用いたEco
RI−Hindll断バ(約5.0κI)I))、ON
1 160作成に用いたBary目−IT所)−1(約
4,OKbp)及びII)NZ136Sのイ1成に用い
たVeoRV−H i ndm断片(約1.8κbp
>はウイルスのJ(’l殖にU3 a m11 1非必
須な領域であることが理解されよ・). また」二記ε同様の丁法に、Lり、N I1株1) N
Aの口aml−II断片(約3. 3KbF) )
、In i nd[l[断ハ(約5.2Kbi))も増
1l/Jに非必須な領域であることが確認された。なお
、これらの断J1のfil+限酵素地図は第4一に示ず
Lうりである。 さらに、(41で作戒したハイブリッドプラスミド1)
N Z 1 0 0 3 H、D N Z 1 0
0 4およびpNZ1137は、いずれもウイルスの増
舶に実必’jA ’j:1) N A fi Itを含
んでいるので、本発明にお0る第一の組み換えベクター
・として利川で津るこたが坤解きれJ、う。 実18 1M 1 N D V (7) F遺伝子D
N A &含ム第= (7)組み換えベクター( p
N Z 5 0 0 3 )の作製《第1mおよび第
2図参照〉 (1) ブロt一ター及びその支配下に1二遺伝子D
NAを連結したハイブリッドブラスミド(pNZ98)
の作11J(第1図参照〉NDVのFおよびH N逍伝
子のcDNAを含むIラスミドX L ilN−1 0
H ( Virus RCsearch, 724
1−255 (1987))を東京人学教養学部、川
書l1正大助教授より入手した。このプラスミドの塩基
配列をM13ファージを用いたfイY,44シ法で分析
し、既知のF M伝子の配列(Virus Resea
rch, 5− 343−356 ( 1 986》
)との対比寺から「遺伝子のcDNAは弟3図に示す第
4311目から第17011目までの1659塩基対で
あることを解明した。この解明は川喜口]助教授によっ
て?iわれだ。 ここで得られたc I) N Aが]一ドヴるアミノ酸
l.i、AVaの「タンパク質のアミノ酸配列タ95%
1ス土のホモロジーを脊ダるものであったが、F。から
F1,F2 への111uffi{DがAVat’GJ
、一八rg−^rg−Gln−Lys−Arg−Phe
−口C一の^ra−Phc間であるのに対し、l) 2
6 aでIよ−G ly−1−ys−G l r+−
Gly−Arg−Leu− 1 1e−の^rg−I、
Qu間であり(ただし1)26株GI F oがら’1
,’2へ間裂しない〉、rJri裂郎位釣前の達続
しだ鶏基竹アミノ酸残基がないことが明かどなった。 ブラスミドX L Ill−1 0 1−1 4 μ
9をXbalで消化後、0N八ボリメレースで#e谷末
喘をキ1i滑未喘とし、フェノール・ク0 0ホルムで
抽出後、■クノール沈殿により回収した。回敗されl(
″.1) N Aを[3 a m H Tで部分消化後
、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約2.1K
bpのト遺伝子を完全に含むlliJ:を回収した。一
方参書例1の(3)ぐ作製したプ[1モーター及びその
女配下に検出容易なM’lAを:I−ドザるl) N八
を連結したハイブリッドプラスくド(ロ)《pNZ76
)をB a m目1とSma 1で消化し、l a c
i 遺{li −rn5分を除イた約3。O KbI
) ノ[3 a rn Ll .ISmaI断片を回収
した。この約3.0κl)Dの断片ε萌述の約2.1K
bpの断片をリガーゼにより連結し、」ンビデン1−な
大m菌−rGl株を形質転換した。5 0 tt. g
/ M!.のアンビシリンを含むL− [13寒天培地
−Lで生育してぎたコロニーよりプラスミドを調製し、
υ1限MIAによる切断で目的のク目一ンを確認(J、
そのブラスミドをpNZ98’ と命名した。ブンスミ
ドpNZ98’には、[遺伍了仝ff< f7) G.
t カ、Ll N It伝f(7)5’ 末端約300
bl)&含む。この部分を除去サるためにDNZ98’
をSma■とKpnIで消化し、約4150bDのS
m a I − K t> n 1 l9i片ヲ0 .
8 % 7 カITI − ス’jル電気泳仙により
回11!t,た。また、1111様に、pNZ98’を
SfTIa T , A V a INテ消化し、約6
50blllのSrnaI AVa[l!?igを1
.5%アガ1]一スグル1有気沫初によりII!I収し
た。これら2つの所J;を混合し、l)NAポリメレー
スにより接着末端を平滑末端とした後、リガーゼにょり
連帖し、lンピデントな人膓菌丁G1株を形質転換した
650μ7/dのアンビシリンを含む1−13寒大培地
十に生育した=1[1二一よりブラスミドを[Jし、i
!lII1限酵索Srna1で再びt.7J断eきるも
のを選択し、このブラスミドをDNZ98と命名した。 (2} アビポツクスウイルスゲノム断片を含むハイ
ブリッドブラスミドp N Z 1 8 0 }−4
Lハイブリッドブラスミドp N Z 9 8かIら第
−二の組み換えベクター(DNZ5003)の作!j(
第2図参照) 参乙例1の{4)で用いたブラスミド13 N 7 7
6の代りにpN798を用い、It i ndll.
Sma Tで消化する代りにl−1 i n d旧,
[coR’[で消化りる他【よ、参考例1の(4)の(
電でハイブリッドブラスミドl) N Z 1 0 0
3 1−1を作製したのとfil棟にし(、ワクシニ
アウイルス7.5Kプ「1モーターと「遺伝子の連結断
I1が挿入された第二の組み換えベクター(II)NZ
5003冫をfI−製した。 実塘例2 NOVのEM伝子1’) N Aを含む第
二の組み換えベクター( pN 7 50 0 4 )
の作製(第2図参照〉 fJ考VA1(7)(4)IF用いた1ラスミドl)
N Z 7 6 (7)代り(二pNZ98を用い、l
−1 i nd m. Sma Tr fl化4る代り
に}−1indlff,EcoRIで消化りる他【よ、
参考I941の(4)の0て゛ハイブリッド1ラスミド
pNZ1004を作製したのと同様にしてワクシニアウ
イルス7.5K7ロモータ〜ε「遺伍r O)連結所片
が挿入された第二の組み換えベクター(pNZ5004
)を作製した。 実FA M 3 N D V +7) F ffiイ
b子DNAを含む第二の組み換えベクター(DNZ51
37) の作y!(第2図参照) ブラスミドpNZ98を1i i ndI[[.Eco
R1で消化しワクシニアウイルス7.!−)KI口t〜
〜ターと[遺伝子が連結した約2,IKbpの11 i
ndlll. FcoR Tlli片を0.8%アノ
J口〜スゲル電気泳動により同収した。一方−、参考B
it 1の(4)の0で用いたブラスミドpN/136
81−を同様にH i ndll[,EcoR Tて・
消化し、フ■ノル・ク[1 0ホルムで抽出し、エタノ
ール沈殿により同収しk:。この両者をリガーげに.J
、り)l1!枯し、コンビiン1−な人#J薗TG1松
を形質転撲し、1!?られたアンビシリン耐性株より1
ラスミドを調製し、ワクシニアウィルス7.5Kブ目モ
ーターこF遺伝子の連結断ハ−がアビボックスウィルス
ゲノム断片の一部に+11人ざれたハイブリッドブラス
ミドt)NZ5137を選択した。このブラスミドD
N 7 51 3 7 i.t第二の組み換えベクター
ぐあ6。 実M In 4 N +’) VのF遺伝子を含む組
み換え7どボックスウイルスの作製 参考例1の(5)で用いたハイブリッドブラスミドに代
λ,(実滴例1、2及び3で得た第二の組み換えベクタ
ーを用いるこL以外41,参κ例1の{5)t同様にし
て、N D Vのト遺伝子を含む引み操えアビボックス
ウィルス液を得た。 実施例5 ブラークハイブリッドダtC−シjンによる
組み換え体の選択 10cm+のべ1・り0■に18 養’i:5れtc
C F 「−に実施例4で4!f 7,:ウイルス液を
接秤し、2時間後0.8%バクト7ガー 5%牛胎児血
γL,0.03%グノレタミン、10%1・リプ1〜−
スフAスノ王一トゾo−スを含んだ、イーグルMEMを
10d積層し、37”C.5%C02イン↓−77ベー
ターで3目間培養し、これに、上記?:.I7II成分
を含んだイーグルM F Mを10dΦ腑し、きらに3
7℃,5%C02インキコベータ〜で3日間培谷した,
2これに、0.8%バクトアガー、0.03%1−−−
グルタミン3 10%トリブ1・−スフォスフ1イ1−
ブn一ス、0.01%中ffl1を含むイーグルMEM
を1 0IIeTF)l、37℃.5%CO2−i’
ンキュベーター゛C12時間J8蓬し感染細胞を染鉋し
た.,ベトリ冊より寒天培地を除去し4℃に保存1ノベ
1−り■の底に残った細胞表向に滅菌し,!ごノーイロ
ンメンブレンを押えつけでウィルス苓一移し、0.5N
Na011で10分、1M1・リス塩酸WWJil
lit’5分σ)処即を3回繰返した後、1.5M
NaCI0.5Mt−リスj!酸緩11i)giで・5
分処理した。2倍SSC (1倍SSCu、0.15M
NaCJ!,0.015MC31−1,(011)
(c00Na > 3)で飽和させ、B O ℃、2
flI lffl ffl キ−J 61 A:。l.
I’isFr(0.6M Na(JJ 、
0. 08M Tr i s−HCJ.
,118 EDTAf)lj7. 8i10 イ
tS!)enhardtO.1%SDSで68℃、2時
間処j!1口,た.,4倍SET−10倍Der+ha
rdt−0. 1%S D S0.1%lll41:
)207−50μ!?/++d変竹サケ精子1) N
Aとニツクトランスレーシ1ンによって32PT:標識
したN l) VのFタンパク質をコードするc I)
N Aを加えて68℃,14時間ハイブリダイゼーシ
]ンした。8%.浄後、ナイ1lンメンIレンとX線フ
イルムを重ね、A−1・ラジオグソフイを{iい、スポ
ットの存イ1をi12し、4℃に保持してあった寒大培
地にX線フイルムを岨t)スポットと合致するブンーク
がF)1仏一fを含む組み換え体とIb1定し滅菌バス
ツールビベツ1・で単離した。この組み換え体のプラー
クは、いずれの場合も約600個のブラークが出現した
10aRべ1・り1111 1枚あたり31!J出現し
た(約0.5%)。 得られた組み換えウイルスについて、pNZ5003を
用いたものについてはfNZ5003、以F Iri1
様にpN75004、及びpNZ5137を用い!、:
bのについてはくれぞれfNZ5004及びfNZ51
37と命名した。 実滴例6 NDVの1遺伝子を含む組み換え7ビボッ
クスウイルスの純化 尖滴例5で単離したプラークを1耐のイーグルMEMI
,.llIL,、200μ4!ヲ1 0an2ヘt”.
JI1nにj8養されたCE[に接秤した.,2時間後
、0.8%バクト7ガー 5%生胎児血清、0.03%
L−グルタミン、10%Eリブ1・−スホスフ■イトブ
ロースを含んだイーグルM E M 10M1を積膚し
、37℃で、5%CO2イン[1べ一タ−で3日間培養
した。これに、上記と同成分を含んだイーグルM IE
Mを10d中居し、きらに37℃、5%CO2イン−
1]ベーターC31】問塙薮した。これに、0、8%バ
クl・アガー0。03%1.−グルタミン、10%トリ
71−−スホスフエイトブD−スを含むイーグルM E
Mを10M!.重膚し、37℃,5%CO2インキコ
ベーターで6時間培養した。組み換え体グラークは、実
施f%415と同様にX線フイルムにスボツ1・を/1
じた。 以上とIul lmの操作をくり返1,:,’:により
間度組み換え体の純化を行った。 その結果f N 7 5 0 0 3においては、実施
例5で、1枚あたり約600個のブラークがでた10C
M2ベトリfil 1 0枚あたりに組み換え体ブラー
クが約20個(約0.3%)出現したが、1同[Iのブ
ラーク純化で4J約2009Aのブラークが出現し!、
:ベトリ皿3枚に組み換え体1ラークが約’100IJ
(約17%)出現した。2回[]のプラーク純化”′C
′(よ、ほとんど寸べてのブラークlメ、組み換え体r
tb ツ7,:。またfN75004、及びl’NZ
5137についてもほぼ同様の結果であった。 実施例7 組み換え体の細胞での発蜆 (蛍光抗体法) 組織培養川Jヤンバースライドに培差したC Eトに、
口、o. i. 1、0又l.lO.1の本発明ウイル
ス株( T N Z 5 0 0 3 . f N Z
5 0 0 4 .fNZ5 137)を接秤し、3
7℃.5%C02イン4ユベーター″c2時間I8養後
に、10%1・リブトース小ス7エイトブロース《fイ
フ」社》、?.03%l−グルタミン加イーグルM E
M培地を加えた。その後、2目間、37℃.5%CO
2イン1ユベーターぐ培養後、培地を除き、P B S
(リンPli!IW/I生理食塩水)で洗い、風乾した
後、冷7セトンで20分間処L!IIIJm胞を固定し
た。 次抗体として抗NDV・ニワトリ抗体、二次抗体とし《
イソヂオシアン酸フルオレヒイン結合抗ニワトリIaG
抗体を使用する蛍光抗体でチェックし、組み換え7ピボ
ックスウイルスがNDVの1タンパク質■1−産能を持
つこたを1認した。 実施例8 組み換え体のm胞での発j1l!(解索抗体
法〉 10cmのベトリ皿に培養きれたC E 「に実施例6
で1!fたウイルス液を接秤し、2 111間後0.8
%バク1・アガー 5%牛胎児血清、0、03%し−グ
ルタミン、10%l−り1トースホスフ−[イ1−ブ[
1−スを含んだイーグルMEMを10,d積居し、37
℃、5%C02インt]ベーターで3目間培養し、これ
に1−記とIII+1成分のイーグルMEMを10一φ
層し、さらに37℃,5%C02インキlIベーターぐ
3 LI IWI J3差した。 べl・り冊より寒天培地を除去し、べ!−り皿の底に残
った細胞表mIに滅菌したナイ口ンメンブレンを即λつ
け【”ウィルス1ノークおよび細1泡を移した。2%ス
tムミルクを含むlens(リン酸緩衝生i[1a水)
r 3 0 f) lffl処i1!L,/’,16
,1次抗体トして抗Nl)V・ニワトリ抗体を室温で1
旧間反応ざt!た。反応後、p [I S 11’洗浄
し、2次抗体としてピチオン化抗ニワトリ10G抗体を
室温で1時間反応さt!た。反応後、P B S ′C
:洗re v,、小−スフデイツシ]パー;4 =1シ
ダ−1!結合7じジン・ビオブン複合物を室温(・30
分間反応きぜた。反応後、0 . 0 !.i%4−ク
l:1 n−1−−J− ) ト− ル、0.3%H2
02を含む8m旧一リスfla FI1211 & W
hC DI+8 . 0 )で発色させた。』ス土のM
−素抗体法でブ−丁ツクし、騨1み換え7ビボックスウ
ィノレスがN D Vの1タンパク質生産能を持つこと
を確1xシた。 実施例9 組み換えウィルスの免疫効果と感染訪御能 釦み換えウイルスを150rJ2のフラスコ5枚に18
養したC E Fで37℃48時間培条した。 C F F L12 [iiI X [,融解の後、細
1a浮遊液を集め、2. 0001″l)In ′c−
1 5分+51遠心し、1−清を採集した。十清130
af!に20%グルタミン酸Jトリウム液を4011
0%サツカ目一ス液30一とを加え、2MIづつ分注し
た。凍結乾燥は1.5時聞の予備凍結の後、減11下で
30時間行なった。乾燥ワクブ−ン1バイアノレを30
%グリヒリン11μ!EI甲a塩水10dに溶解し、穿
刺用針で1羽あたり0.01aeを78齢SPF餡の右
側賓膜に接秤した。接トは後′R痘状態を観察し、ニュ
ーカッスル病(Nl)V)17)赤血球凝1抑&lJ(
J,(−F、H I .’:称リ)抗体を測定したのり
、強毒鶏痘ウイルス西ケ原株と涛粂NDV4k藤株を攻
撃しワクIンの免疫効宋を測定した。 二7L一カツスル病の(−II反ゐは被検血清の2侶段
階希釈?llI25μlに、4h血球凝集単位を含むN
l) V抗原を?9闇加えて混和【ノ10分間静置感
作漫、0.5%m赤崩LR液50μlを加え室温に45
分躍き、赤血球凝集を観察した。1−11価は血球凝集
抑制が認められた血消の最高希釈倍数で表現した。 ワクヂンの効果は第2表に示す。本発明のワクチンを1
g秤したニワ1・りは通常のfノクヂンε同様の善!f
I允kiを認め、鶏1ウィルス強78株の攻撃に対し発
痒はしなかった(接秤3周間後)。史にニコ−一カツス
ル病に対する巾相抗休が−1−胃しH I抗休i.i
,1−デr L/ %いにもかかわらず強悪N V D
の攻撃に対して’6 1 0 0%が耐過生存した(接
掃2′8間後)。 これらの結果から、木発明のワクJンはjilNと−J
一カツスル病とを同時に免疫iU I岨Q:ワクf−ン
であることが示ざれた。 第2表 5羽のI6l清をプールして測定した。 F l]V 4− : 3週IWI後、発痘1!6M
C:3週間後、″R.痘を認めず Nf)V +:2E間後、発痘を認めた:2週間後、
允痘を認めf
様にしrpNZ136sをl coRVでi化後、ll
indllリンカー《宝酒造株式会社製》をリガーゼに
より連結し、フェノール・ク0 [1ホルム抽出、1L
.タノール沈殿により0N八を同収した。 回収したI) N Aをtlindlll−XbaIに
より消化した後、0.8%7ガロースゲル電気泳S)+
により約ぺ.3κbのf−1 i n d m−X b
a 1’ Kハを同収した。さらに、pUC1Bをl
−1ir+dll!,[coRIF8!i化後、2.0
%アガロースグル電気泳動により、ポリリンカ一部分(
/) 5 1 bnの断片を回収した。ここで得られた
約140bpのEcoRI−XbaI断片、約4.3κ
bpの11indlll−XbaI断JT1さらに5
1 bpのHindl[I −EcoRI’所片をリガ
ーゼにより連結し、実施例1の{4}εII■1様な操
竹に1、リブラスミドを抽出し、aIWi片が連結した
ブラスミドを検出し、これをpNZ136sI−た命名
した(第8図参照)。 7j,pN776を口i n d m、Srnc3Tr
消化後、(2)とIi’i1様に約3.6κhp断片を
回収した.,−1記pNZ136SI−をll i n
dlll. Sma Iで消化し、フェノール・クロロ
ホルムで抽出し、■タノール沈殿により同収した。この
両者をリガーゼにより連結し、]ンビテン1−な人腸菌
−rG1株を形質転換し、以十{2}と同様にして、ハ
イブリッドプラスミドを選択し、これをpNZ1137
と命名した。 (5)組み換えアビポツクスウイルスの作製25a2培
養フラスコに培養されたCEFにアビポツクスウイルス
NP株を0. 05D.lu./Ill胞になるように
接挿した。(4)で得たハイブリッドブシスミド50μ
lを、2.2−の滅菌水に溶解し、これに1%へベス、
0.6%地化ノ゛トリウムの混合液を2.5d,70s
Mリン酸水索2ナトリウム12水和物と70mHリン酸
水素2tl−リウム2水和物を′8診混合し/,− !
fi T#J液を50μl加えた水溶液を作製した。こ
れを15IIlのJ−ユープ(ファルコン剥製)に・)
つし、スターラーでFft#¥し<lがら2Mの煽化カ
ルシウム水溶F&300μlをこれに漬F L, I)
N八一リン酸カルシウム共洗物を作り、そのO. !5
lIl.をウイルス接fil45分後の感染CEFJ二
に滴下した。37℃、5%C゛02インキ1ベーターに
30分間静nし、5%牛胎児血清、0.03%]−一一
−グルタミン、10%トリプトースフA−スノ1イ1・
ブロースを含むイーグルM E M4.5dを加えた。 その3i間後、培養液を交換し、3日間、37℃、5%
CO2インキュベーター中で培養し、@養II胞ごε3
度凍結融解し、組み換え体を含むウイルス液を4!?l
こ。 +61CPRGによる組み換え体の選択10lJべ1・
りllI′Iに培養されたCビFに(5)で青たウイル
ス液を接種し、2時間後、0.8%バクトア〃−《デイ
フ」ネj製〉、5%牛胎児血清、0.03%[−グルタ
ミン、10%トリブトースノAスフエイトブ[l−スを
含んだ、フェノールレット不含イーグルMFMを10I
I!積ib、37′c,5%C02インキュベーターで
3Flt@差し、これに、」記ε同成分のフェノールレ
ッド不含イーグルMEMを10耐重居し、さらに、37
℃、5%C02インキコ−−ベーターで3目間培養した
。 これに、0.8%バクトアガー、0.03%1−グルタ
ミン、10%トリ11一一スノAスノエイトブ【1−ス
、0.03%CPI<G(ベーリンガー・マンハイム剥
製〉を含むフfノールレツド不含イーグルMEMを10
d重層し、37℃、5%CO2イン↑ユーベーターで6
時間培養した。組み換えウイルスはβ−ガラクトシダー
ゼをR現し、CP R G {S”赤変さQるので、組
み換え体ブラークのまわりのアガ〜、lIJ胞とも赤色
に発色し、容易にA−組み換え体ε区別が可ILであっ
た。この赤他ブラークから生或した組み換え体を滅薗パ
スツールビベットで単閣した。得られた組み換え体につ
ぎ、それぞれ第1表に示すごとく命名した。 第1表 (71 組み換えアごボックスウイルスのゲノム1)
N Aの解析 (6)で得られたそれぞれの組み換えアビポツクスウイ
ルスをブラ〜ク純化しt:のi)、10l:IIべl−
リIIn [培蓄サれたCEFに1 1). r.u.
/細飽となるように接種した。以下、…tlililI
1の方法でウイルスON八を単離した。各組み換えウイ
ルスDNA2μクを[3 a lTi it IまたL
N{indll[ニT消{1、0、5 % ? カ口−
ス電気泳!IJ (25V.’2011.V間)でl
giハを分離し、#Jヂンの方法(ジA7−ナル・A1
・モレ1ユラー・パイA口ジイ,98,503−・(1
979))で、ナイロンメンブレンにD N Aを移し
た後、80℃、減圧下でDNAをナイ0ンメンプレンに
固定しlこ.4倍S[:「(0.6M NaCJ.0
.08M TrisHC i (pH7. 8)
, 4mH El)’rA) ・− 1
0倍Denhardト−0.1%SDSで68℃、2
1Li [FS1 51!! ff後、 IRsET−
10 イ!’. Denhardt −0. 1
%SDS−0.1%Na4P2 07 −5011
g/d.変性サケ精子DNAとニツクトランスレーシコ
ンによつ’c32pre:識したβ−ガラクトシダービ
1) N Aを加えて68℃、14時間ハイプリダイゼ
ーシコンした。洗浄、乾燥後、ナイ口ンメンブレンとX
線フイルムを重ね、オートラジオグラフイ一を{jない
、バンドの存在を確認1ノ、これらの組み換えウイルス
が所定の場所にβ−ガラクLシダーぜ遺伝子を持つここ
を確認した。 {0}非必須1) N A領域の同定 以上の結果から、pNZ180Hの作製に用いたEco
RI−Hindll断バ(約5.0κI)I))、ON
1 160作成に用いたBary目−IT所)−1(約
4,OKbp)及びII)NZ136Sのイ1成に用い
たVeoRV−H i ndm断片(約1.8κbp
>はウイルスのJ(’l殖にU3 a m11 1非必
須な領域であることが理解されよ・). また」二記ε同様の丁法に、Lり、N I1株1) N
Aの口aml−II断片(約3. 3KbF) )
、In i nd[l[断ハ(約5.2Kbi))も増
1l/Jに非必須な領域であることが確認された。なお
、これらの断J1のfil+限酵素地図は第4一に示ず
Lうりである。 さらに、(41で作戒したハイブリッドプラスミド1)
N Z 1 0 0 3 H、D N Z 1 0
0 4およびpNZ1137は、いずれもウイルスの増
舶に実必’jA ’j:1) N A fi Itを含
んでいるので、本発明にお0る第一の組み換えベクター
・として利川で津るこたが坤解きれJ、う。 実18 1M 1 N D V (7) F遺伝子D
N A &含ム第= (7)組み換えベクター( p
N Z 5 0 0 3 )の作製《第1mおよび第
2図参照〉 (1) ブロt一ター及びその支配下に1二遺伝子D
NAを連結したハイブリッドブラスミド(pNZ98)
の作11J(第1図参照〉NDVのFおよびH N逍伝
子のcDNAを含むIラスミドX L ilN−1 0
H ( Virus RCsearch, 724
1−255 (1987))を東京人学教養学部、川
書l1正大助教授より入手した。このプラスミドの塩基
配列をM13ファージを用いたfイY,44シ法で分析
し、既知のF M伝子の配列(Virus Resea
rch, 5− 343−356 ( 1 986》
)との対比寺から「遺伝子のcDNAは弟3図に示す第
4311目から第17011目までの1659塩基対で
あることを解明した。この解明は川喜口]助教授によっ
て?iわれだ。 ここで得られたc I) N Aが]一ドヴるアミノ酸
l.i、AVaの「タンパク質のアミノ酸配列タ95%
1ス土のホモロジーを脊ダるものであったが、F。から
F1,F2 への111uffi{DがAVat’GJ
、一八rg−^rg−Gln−Lys−Arg−Phe
−口C一の^ra−Phc間であるのに対し、l) 2
6 aでIよ−G ly−1−ys−G l r+−
Gly−Arg−Leu− 1 1e−の^rg−I、
Qu間であり(ただし1)26株GI F oがら’1
,’2へ間裂しない〉、rJri裂郎位釣前の達続
しだ鶏基竹アミノ酸残基がないことが明かどなった。 ブラスミドX L Ill−1 0 1−1 4 μ
9をXbalで消化後、0N八ボリメレースで#e谷末
喘をキ1i滑未喘とし、フェノール・ク0 0ホルムで
抽出後、■クノール沈殿により回収した。回敗されl(
″.1) N Aを[3 a m H Tで部分消化後
、0.8%アガロースゲル電気泳動に供し、約2.1K
bpのト遺伝子を完全に含むlliJ:を回収した。一
方参書例1の(3)ぐ作製したプ[1モーター及びその
女配下に検出容易なM’lAを:I−ドザるl) N八
を連結したハイブリッドプラスくド(ロ)《pNZ76
)をB a m目1とSma 1で消化し、l a c
i 遺{li −rn5分を除イた約3。O KbI
) ノ[3 a rn Ll .ISmaI断片を回収
した。この約3.0κl)Dの断片ε萌述の約2.1K
bpの断片をリガーゼにより連結し、」ンビデン1−な
大m菌−rGl株を形質転換した。5 0 tt. g
/ M!.のアンビシリンを含むL− [13寒天培地
−Lで生育してぎたコロニーよりプラスミドを調製し、
υ1限MIAによる切断で目的のク目一ンを確認(J、
そのブラスミドをpNZ98’ と命名した。ブンスミ
ドpNZ98’には、[遺伍了仝ff< f7) G.
t カ、Ll N It伝f(7)5’ 末端約300
bl)&含む。この部分を除去サるためにDNZ98’
をSma■とKpnIで消化し、約4150bDのS
m a I − K t> n 1 l9i片ヲ0 .
8 % 7 カITI − ス’jル電気泳仙により
回11!t,た。また、1111様に、pNZ98’を
SfTIa T , A V a INテ消化し、約6
50blllのSrnaI AVa[l!?igを1
.5%アガ1]一スグル1有気沫初によりII!I収し
た。これら2つの所J;を混合し、l)NAポリメレー
スにより接着末端を平滑末端とした後、リガーゼにょり
連帖し、lンピデントな人膓菌丁G1株を形質転換した
650μ7/dのアンビシリンを含む1−13寒大培地
十に生育した=1[1二一よりブラスミドを[Jし、i
!lII1限酵索Srna1で再びt.7J断eきるも
のを選択し、このブラスミドをDNZ98と命名した。 (2} アビポツクスウイルスゲノム断片を含むハイ
ブリッドブラスミドp N Z 1 8 0 }−4
Lハイブリッドブラスミドp N Z 9 8かIら第
−二の組み換えベクター(DNZ5003)の作!j(
第2図参照) 参乙例1の{4)で用いたブラスミド13 N 7 7
6の代りにpN798を用い、It i ndll.
Sma Tで消化する代りにl−1 i n d旧,
[coR’[で消化りる他【よ、参考例1の(4)の(
電でハイブリッドブラスミドl) N Z 1 0 0
3 1−1を作製したのとfil棟にし(、ワクシニ
アウイルス7.5Kプ「1モーターと「遺伝子の連結断
I1が挿入された第二の組み換えベクター(II)NZ
5003冫をfI−製した。 実塘例2 NOVのEM伝子1’) N Aを含む第
二の組み換えベクター( pN 7 50 0 4 )
の作製(第2図参照〉 fJ考VA1(7)(4)IF用いた1ラスミドl)
N Z 7 6 (7)代り(二pNZ98を用い、l
−1 i nd m. Sma Tr fl化4る代り
に}−1indlff,EcoRIで消化りる他【よ、
参考I941の(4)の0て゛ハイブリッド1ラスミド
pNZ1004を作製したのと同様にしてワクシニアウ
イルス7.5K7ロモータ〜ε「遺伍r O)連結所片
が挿入された第二の組み換えベクター(pNZ5004
)を作製した。 実FA M 3 N D V +7) F ffiイ
b子DNAを含む第二の組み換えベクター(DNZ51
37) の作y!(第2図参照) ブラスミドpNZ98を1i i ndI[[.Eco
R1で消化しワクシニアウイルス7.!−)KI口t〜
〜ターと[遺伝子が連結した約2,IKbpの11 i
ndlll. FcoR Tlli片を0.8%アノ
J口〜スゲル電気泳動により同収した。一方−、参考B
it 1の(4)の0で用いたブラスミドpN/136
81−を同様にH i ndll[,EcoR Tて・
消化し、フ■ノル・ク[1 0ホルムで抽出し、エタノ
ール沈殿により同収しk:。この両者をリガーげに.J
、り)l1!枯し、コンビiン1−な人#J薗TG1松
を形質転撲し、1!?られたアンビシリン耐性株より1
ラスミドを調製し、ワクシニアウィルス7.5Kブ目モ
ーターこF遺伝子の連結断ハ−がアビボックスウィルス
ゲノム断片の一部に+11人ざれたハイブリッドブラス
ミドt)NZ5137を選択した。このブラスミドD
N 7 51 3 7 i.t第二の組み換えベクター
ぐあ6。 実M In 4 N +’) VのF遺伝子を含む組
み換え7どボックスウイルスの作製 参考例1の(5)で用いたハイブリッドブラスミドに代
λ,(実滴例1、2及び3で得た第二の組み換えベクタ
ーを用いるこL以外41,参κ例1の{5)t同様にし
て、N D Vのト遺伝子を含む引み操えアビボックス
ウィルス液を得た。 実施例5 ブラークハイブリッドダtC−シjンによる
組み換え体の選択 10cm+のべ1・り0■に18 養’i:5れtc
C F 「−に実施例4で4!f 7,:ウイルス液を
接秤し、2時間後0.8%バクト7ガー 5%牛胎児血
γL,0.03%グノレタミン、10%1・リプ1〜−
スフAスノ王一トゾo−スを含んだ、イーグルMEMを
10d積層し、37”C.5%C02イン↓−77ベー
ターで3目間培養し、これに、上記?:.I7II成分
を含んだイーグルM F Mを10dΦ腑し、きらに3
7℃,5%C02インキコベータ〜で3日間培谷した,
2これに、0.8%バクトアガー、0.03%1−−−
グルタミン3 10%トリブ1・−スフォスフ1イ1−
ブn一ス、0.01%中ffl1を含むイーグルMEM
を1 0IIeTF)l、37℃.5%CO2−i’
ンキュベーター゛C12時間J8蓬し感染細胞を染鉋し
た.,ベトリ冊より寒天培地を除去し4℃に保存1ノベ
1−り■の底に残った細胞表向に滅菌し,!ごノーイロ
ンメンブレンを押えつけでウィルス苓一移し、0.5N
Na011で10分、1M1・リス塩酸WWJil
lit’5分σ)処即を3回繰返した後、1.5M
NaCI0.5Mt−リスj!酸緩11i)giで・5
分処理した。2倍SSC (1倍SSCu、0.15M
NaCJ!,0.015MC31−1,(011)
(c00Na > 3)で飽和させ、B O ℃、2
flI lffl ffl キ−J 61 A:。l.
I’isFr(0.6M Na(JJ 、
0. 08M Tr i s−HCJ.
,118 EDTAf)lj7. 8i10 イ
tS!)enhardtO.1%SDSで68℃、2時
間処j!1口,た.,4倍SET−10倍Der+ha
rdt−0. 1%S D S0.1%lll41:
)207−50μ!?/++d変竹サケ精子1) N
Aとニツクトランスレーシ1ンによって32PT:標識
したN l) VのFタンパク質をコードするc I)
N Aを加えて68℃,14時間ハイブリダイゼーシ
]ンした。8%.浄後、ナイ1lンメンIレンとX線フ
イルムを重ね、A−1・ラジオグソフイを{iい、スポ
ットの存イ1をi12し、4℃に保持してあった寒大培
地にX線フイルムを岨t)スポットと合致するブンーク
がF)1仏一fを含む組み換え体とIb1定し滅菌バス
ツールビベツ1・で単離した。この組み換え体のプラー
クは、いずれの場合も約600個のブラークが出現した
10aRべ1・り1111 1枚あたり31!J出現し
た(約0.5%)。 得られた組み換えウイルスについて、pNZ5003を
用いたものについてはfNZ5003、以F Iri1
様にpN75004、及びpNZ5137を用い!、:
bのについてはくれぞれfNZ5004及びfNZ51
37と命名した。 実滴例6 NDVの1遺伝子を含む組み換え7ビボッ
クスウイルスの純化 尖滴例5で単離したプラークを1耐のイーグルMEMI
,.llIL,、200μ4!ヲ1 0an2ヘt”.
JI1nにj8養されたCE[に接秤した.,2時間後
、0.8%バクト7ガー 5%生胎児血清、0.03%
L−グルタミン、10%Eリブ1・−スホスフ■イトブ
ロースを含んだイーグルM E M 10M1を積膚し
、37℃で、5%CO2イン[1べ一タ−で3日間培養
した。これに、上記と同成分を含んだイーグルM IE
Mを10d中居し、きらに37℃、5%CO2イン−
1]ベーターC31】問塙薮した。これに、0、8%バ
クl・アガー0。03%1.−グルタミン、10%トリ
71−−スホスフエイトブD−スを含むイーグルM E
Mを10M!.重膚し、37℃,5%CO2インキコ
ベーターで6時間培養した。組み換え体グラークは、実
施f%415と同様にX線フイルムにスボツ1・を/1
じた。 以上とIul lmの操作をくり返1,:,’:により
間度組み換え体の純化を行った。 その結果f N 7 5 0 0 3においては、実施
例5で、1枚あたり約600個のブラークがでた10C
M2ベトリfil 1 0枚あたりに組み換え体ブラー
クが約20個(約0.3%)出現したが、1同[Iのブ
ラーク純化で4J約2009Aのブラークが出現し!、
:ベトリ皿3枚に組み換え体1ラークが約’100IJ
(約17%)出現した。2回[]のプラーク純化”′C
′(よ、ほとんど寸べてのブラークlメ、組み換え体r
tb ツ7,:。またfN75004、及びl’NZ
5137についてもほぼ同様の結果であった。 実施例7 組み換え体の細胞での発蜆 (蛍光抗体法) 組織培養川Jヤンバースライドに培差したC Eトに、
口、o. i. 1、0又l.lO.1の本発明ウイル
ス株( T N Z 5 0 0 3 . f N Z
5 0 0 4 .fNZ5 137)を接秤し、3
7℃.5%C02イン4ユベーター″c2時間I8養後
に、10%1・リブトース小ス7エイトブロース《fイ
フ」社》、?.03%l−グルタミン加イーグルM E
M培地を加えた。その後、2目間、37℃.5%CO
2イン1ユベーターぐ培養後、培地を除き、P B S
(リンPli!IW/I生理食塩水)で洗い、風乾した
後、冷7セトンで20分間処L!IIIJm胞を固定し
た。 次抗体として抗NDV・ニワトリ抗体、二次抗体とし《
イソヂオシアン酸フルオレヒイン結合抗ニワトリIaG
抗体を使用する蛍光抗体でチェックし、組み換え7ピボ
ックスウイルスがNDVの1タンパク質■1−産能を持
つこたを1認した。 実施例8 組み換え体のm胞での発j1l!(解索抗体
法〉 10cmのベトリ皿に培養きれたC E 「に実施例6
で1!fたウイルス液を接秤し、2 111間後0.8
%バク1・アガー 5%牛胎児血清、0、03%し−グ
ルタミン、10%l−り1トースホスフ−[イ1−ブ[
1−スを含んだイーグルMEMを10,d積居し、37
℃、5%C02インt]ベーターで3目間培養し、これ
に1−記とIII+1成分のイーグルMEMを10一φ
層し、さらに37℃,5%C02インキlIベーターぐ
3 LI IWI J3差した。 べl・り冊より寒天培地を除去し、べ!−り皿の底に残
った細胞表mIに滅菌したナイ口ンメンブレンを即λつ
け【”ウィルス1ノークおよび細1泡を移した。2%ス
tムミルクを含むlens(リン酸緩衝生i[1a水)
r 3 0 f) lffl処i1!L,/’,16
,1次抗体トして抗Nl)V・ニワトリ抗体を室温で1
旧間反応ざt!た。反応後、p [I S 11’洗浄
し、2次抗体としてピチオン化抗ニワトリ10G抗体を
室温で1時間反応さt!た。反応後、P B S ′C
:洗re v,、小−スフデイツシ]パー;4 =1シ
ダ−1!結合7じジン・ビオブン複合物を室温(・30
分間反応きぜた。反応後、0 . 0 !.i%4−ク
l:1 n−1−−J− ) ト− ル、0.3%H2
02を含む8m旧一リスfla FI1211 & W
hC DI+8 . 0 )で発色させた。』ス土のM
−素抗体法でブ−丁ツクし、騨1み換え7ビボックスウ
ィノレスがN D Vの1タンパク質生産能を持つこと
を確1xシた。 実施例9 組み換えウィルスの免疫効果と感染訪御能 釦み換えウイルスを150rJ2のフラスコ5枚に18
養したC E Fで37℃48時間培条した。 C F F L12 [iiI X [,融解の後、細
1a浮遊液を集め、2. 0001″l)In ′c−
1 5分+51遠心し、1−清を採集した。十清130
af!に20%グルタミン酸Jトリウム液を4011
0%サツカ目一ス液30一とを加え、2MIづつ分注し
た。凍結乾燥は1.5時聞の予備凍結の後、減11下で
30時間行なった。乾燥ワクブ−ン1バイアノレを30
%グリヒリン11μ!EI甲a塩水10dに溶解し、穿
刺用針で1羽あたり0.01aeを78齢SPF餡の右
側賓膜に接秤した。接トは後′R痘状態を観察し、ニュ
ーカッスル病(Nl)V)17)赤血球凝1抑&lJ(
J,(−F、H I .’:称リ)抗体を測定したのり
、強毒鶏痘ウイルス西ケ原株と涛粂NDV4k藤株を攻
撃しワクIンの免疫効宋を測定した。 二7L一カツスル病の(−II反ゐは被検血清の2侶段
階希釈?llI25μlに、4h血球凝集単位を含むN
l) V抗原を?9闇加えて混和【ノ10分間静置感
作漫、0.5%m赤崩LR液50μlを加え室温に45
分躍き、赤血球凝集を観察した。1−11価は血球凝集
抑制が認められた血消の最高希釈倍数で表現した。 ワクヂンの効果は第2表に示す。本発明のワクチンを1
g秤したニワ1・りは通常のfノクヂンε同様の善!f
I允kiを認め、鶏1ウィルス強78株の攻撃に対し発
痒はしなかった(接秤3周間後)。史にニコ−一カツス
ル病に対する巾相抗休が−1−胃しH I抗休i.i
,1−デr L/ %いにもかかわらず強悪N V D
の攻撃に対して’6 1 0 0%が耐過生存した(接
掃2′8間後)。 これらの結果から、木発明のワクJンはjilNと−J
一カツスル病とを同時に免疫iU I岨Q:ワクf−ン
であることが示ざれた。 第2表 5羽のI6l清をプールして測定した。 F l]V 4− : 3週IWI後、発痘1!6M
C:3週間後、″R.痘を認めず Nf)V +:2E間後、発痘を認めた:2週間後、
允痘を認めf
Claims (6)
- (1)アビポツクスウイルスの増殖に非必須なゲノム領
域にニユーカツスル病ウィルス由来の膜融合タンパク質
をコードするcDNAの全部又は一部を組み込んだ組み
換えアビポツクスウイルス。 - (2)該cDNAがプロモーターの支配下にある特許請
求の範囲1項記載の組み換えアビポツクスウイルス。 - (3)該cDNAが第3図のアミノ酸配列またはそれと
実質的に同一機能を有するポリペプチドをコードするも
のである特許請求の範囲第1項または第2項記載の組み
換えアビポツクスウイルス。 - (4)該cDNAが第3図の塩基配列またはそれと実質
的に同一の機能を持つ塩基配列を有するものである特許
請求の範囲第1項または第2項記載の組み換えアビポツ
クスウイルス。 - (5)特許請求の範囲第1項、第2項、第3項または第
4項記載の組み換えアビポツクスウイルスから成る鶏用
ワクチン。 - (6)特許請求の範囲第1項または第2項記載の組み換
えアビポツクスウイルスから成る、鶏にフアウルボツク
スウイルス及びニューカツスル病ウィルスに対する免疫
を与える鶏用ワクチン。
Priority Applications (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1160157A JP2781605B2 (ja) | 1989-06-22 | 1989-06-22 | 組み換えアビポックスウイルス |
CA002019215A CA2019215A1 (en) | 1989-06-22 | 1990-06-18 | Recombinant avipoxvirus |
AU57642/90A AU635036B2 (en) | 1989-06-22 | 1990-06-20 | Recombinant avipoxvirus |
EP19900306806 EP0404576A3 (en) | 1989-06-22 | 1990-06-21 | Recombinant avipoxvirus |
KR1019900009304A KR910001061A (ko) | 1989-06-22 | 1990-06-22 | 재조합 아비폭스비루스 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP1160157A JP2781605B2 (ja) | 1989-06-22 | 1989-06-22 | 組み換えアビポックスウイルス |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH0327284A true JPH0327284A (ja) | 1991-02-05 |
JP2781605B2 JP2781605B2 (ja) | 1998-07-30 |
Family
ID=15709103
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP1160157A Expired - Lifetime JP2781605B2 (ja) | 1989-06-22 | 1989-06-22 | 組み換えアビポックスウイルス |
Country Status (5)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0404576A3 (ja) |
JP (1) | JP2781605B2 (ja) |
KR (1) | KR910001061A (ja) |
AU (1) | AU635036B2 (ja) |
CA (1) | CA2019215A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR930701588A (ko) * | 1990-07-02 | 1993-06-12 | 스튜어트 알. 슈터 | 재조합 구두 바이러스 백신 |
WO1994019014A1 (en) * | 1993-02-26 | 1994-09-01 | Syntro Corporation | Recombinant fowlpox virus s-fpv-043 and uses thereof |
US5925358A (en) * | 1993-02-26 | 1999-07-20 | Syntro Corporation | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
US6136318A (en) * | 1993-02-26 | 2000-10-24 | Cochran; Mark D. | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof |
EP1512693B1 (en) * | 1993-03-31 | 2008-11-19 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Novel polypeptide, DNA coding for said polypeptide, recombinant vector containing said DNA, recombinant virus prepared using said vector, and use thereof |
EP0905140B9 (en) * | 1996-03-29 | 2009-05-13 | Zeon Corporation | Novel fused protein, gene therefor, recombinant vector, recombinant virus, and its use |
TW200502402A (en) * | 2002-12-06 | 2005-01-16 | Wyeth Corp | Escape mutants of newcastle disease virus as marker vaccines |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62163693A (ja) * | 1985-12-18 | 1987-07-20 | ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド | ニユ−カツスル病ウイルス遺伝子クロ−ン |
JPH01157381A (ja) * | 1987-09-16 | 1989-06-20 | Nippon Zeon Co Ltd | 組み換えアビポックスウイルス |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA1340203C (en) * | 1987-09-16 | 1998-12-15 | Noboru Yanagida | Recombinant apivoxvirus |
FR2632863B2 (fr) * | 1987-10-29 | 1990-08-31 | Transgene Sa | Virus du fowlpox recombinant et vaccins derives de ces virus |
KR940001265B1 (ko) * | 1988-12-29 | 1994-02-18 | 닛뽕 제온 가부시끼가이샤 | 프로모터, 그를 함유하는 플라스미드 및 재조합 아비폭스비루스 |
-
1989
- 1989-06-22 JP JP1160157A patent/JP2781605B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
1990
- 1990-06-18 CA CA002019215A patent/CA2019215A1/en not_active Abandoned
- 1990-06-20 AU AU57642/90A patent/AU635036B2/en not_active Ceased
- 1990-06-21 EP EP19900306806 patent/EP0404576A3/en not_active Withdrawn
- 1990-06-22 KR KR1019900009304A patent/KR910001061A/ko not_active Application Discontinuation
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS62163693A (ja) * | 1985-12-18 | 1987-07-20 | ブリティッシュ・テクノロジー・グループ・リミテッド | ニユ−カツスル病ウイルス遺伝子クロ−ン |
JPH01157381A (ja) * | 1987-09-16 | 1989-06-20 | Nippon Zeon Co Ltd | 組み換えアビポックスウイルス |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU5764290A (en) | 1991-01-03 |
EP0404576A3 (en) | 1991-05-22 |
AU635036B2 (en) | 1993-03-11 |
EP0404576A2 (en) | 1990-12-27 |
JP2781605B2 (ja) | 1998-07-30 |
CA2019215A1 (en) | 1990-12-22 |
KR910001061A (ko) | 1991-01-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Yao et al. | Induction of apoptosis in vitro by the 17-kDa nonstructural protein of infectious bursal disease virus: possible role in viral pathogenesis | |
Jia et al. | Roles of African swine fever virus structural proteins in viral infection | |
KR0179994B1 (ko) | 칠면조의 재조합 포진바이러스 및 이로부터 유도된 생존상태의 벡터 백신 | |
Pallister et al. | A single gene encoding the fiber is responsible for variations in virulence in the fowl adenoviruses | |
JPH04503904A (ja) | 組換えポックスウイルス宿主選択系 | |
EA004796B1 (ru) | Инфекционные клоны вируса ньюкаслской болезни, вакцины и диагностические анализы | |
MXPA03010427A (es) | Particulas del tipo del virus corona que comprenden genomas funcionalmente eliminados. | |
RU2130971C1 (ru) | Рекомбинантный вектор на основе вируса оспы птиц, рекомбинантный вектор для вакцинации домашней птицы | |
JP3159476B2 (ja) | 組換えマレック病ウィルス | |
JPH084508B2 (ja) | 組み換えワクチニアウイルス | |
JPH08501931A (ja) | コロナウイルスに対するワクチン接種用組成物および方法 | |
JPH09511914A (ja) | ペスチウイルス株のヌクレオチド配列、それらの配列によりコードされるポリペプチド、ならびにペスチウイルス感染の診断および予防のためのそれらの使用 | |
UA123682C2 (uk) | Вірус качиного ентериту та його застосування | |
JPH06509235A (ja) | 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス組換えポックスウイルスワクチン | |
JP2000509268A (ja) | Celoウイルス | |
JPH0327284A (ja) | 組み換えアビポックスウイルス | |
EP0117063A1 (en) | Methods and materials for development of parvovirus vaccine | |
JPH03164181A (ja) | 豚コレラウイルスワクチン | |
JP2818836B2 (ja) | Cho細胞において増殖可能な組換えワクシニアウイルスを用いる方法 | |
JP3375347B2 (ja) | マレック病に対する組換えワクチン | |
HU219312B (en) | Recombinant feline herpesvirus vaccine | |
JP3529134B2 (ja) | 組換えネコヘルペスウイルスのベクターワクチン | |
US5789567A (en) | Chicken infectious anemia virus vaccine | |
Molitor et al. | KBSH parvovirus: comparison with porcine parvovirus | |
JPH03228680A (ja) | 感染性気管支炎ウイルスワクチン |