JPH0327284A - 組み換えアビポックスウイルス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

〈産業上の利用分野） 本発明儲組み換えアビボックスウィルスに関し、ざらに
ａｔ　ｔノ（は、アビポツクスウイルスの増舶に非必須
なＤＮＡ領域にニューカッスル病ウィルス山東のｃＤＮ
Ａが組み込まれた組み換えアビポツクスウイルスに閏す
る。 《従来の技術》 近年、ワクブニアウイルスに外来性１）　Ｎ　Ａを組み
込んだ組み換えワクチニ７ウイルスのｆｉ築法が考案さ
れ、外来竹ＤＮＡ，！：ｔ，で、例えば感染好抗１東−
コードＤ　ＮＡを用いた組み換えワクチニアウイルスを
ｌＬワクヂンとして利用する方法が提案されるＪ、うに
へった｛例えば特開昭５８−１２９９７１″；；、特公
昭６　０−５　０　０　５　１　ｔ．ｓ　ｈ３，特公昭
６１５　０　１　９　５　７　Ｈｉ　（＝（と》。この
ｈ法によれば、目的に応じて神々の外来＋’ＩＩ　Ｄ　
Ｎ八を組み込むここが可能であり、新しい牛ワクヂンの
製法ヒしてＴｉ望視され（いる。 しかしながら、ワク１−ニアウイルスはその宿Ｊ−領域
が限定されているため、例えば、二一１−カツスル病の
よう４ｃ鶏の病気に″ＩＡ＝ｔる住ワクヂンの製造に組
み換えワクチニアウイルスの手法を応用リることははと
んど不Ｉｉｌ能の状態にあり、鶏用生ワクチンの製造の
ために（！、ワクチニアウイルスに代えてファウルボッ
クスウイルスに外来性１）　Ｎ　Ａを組み込むｈ法がｎ
力ｔの示唆がなされ“Ｃいる（八ｖｉａｎ　Ｄｉｓｅａ
ｓｅｓ　Ｖｏｌ．　３０．　ｋ１　．　２　４　〜２７
〉。このような考え方で、最近組み換え７ビボックスウ
イルスの作ｗＪ法が開発社きれた（　Ｖ！Ｉ’ｌＪＳＲ
ｅｓｅａｒｃｈ　Ｖｏｌ．　　１　０，　３４３−３５
６　（１　９８８）　，　Ｖａｃｃｉｎｅ　Ｖｏｌ．６
．　５０４−５０８　（　１　９０８））。 ｆた、ニューカツスル病ウイルス《以下、Ｎ　ｌ．）　
Ｖと称す）につい

【は、そのヘマグルブニン・ノイフミ
ニダーｔ！（以十、Ｈ　Ｎε称１）及び膜融合タンパク
質（以１・、Ｆタンパクｎと称寸）を１−ドリろｃ　［
）　Ｎ　Ａが最百になって見い出された〔例えばジャー
ナル・Ａブ・ジ■ネラル・ヴイ１１［］　ジ　ー　く　
，ノ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．＞　　６　　７．　　　１
　　９　　１　　７　　〜　１　　９　　２７，１９８
（１，特開昭６　２−１　６　３　６　９　３月］。 しかしながら多くの１クイルス、特にＮ　Ｄ　Ｖのよう
なＲ　Ｎ　ＡウイルスＵ、変巽が起こりやｔ　＜、ワク
ブンの効かない変異ウイルスが出現４る危険竹を無視リ
ーることはできない，，特に単一の抗原遺伝−ｒのみを
挿入した組み換え９ワクヂンＣは、ワクブンの無効な変
冑ウイルスの出現する危険度がＪＩＩ！行ワクブンより
高いことも予想される。このため、抗原遺イムｒεしで
１−ＩＮより、ウイルスの林間で保存竹の０い「タンパ
ク質遺イ６了（以下Ｆ１３伝了と称ｔ）　　（Ｖｉｒｕ
ｓＲｅｓ．　　７　　２４１−２５５（１９８７），　
Ｖ＋ｒｕｓＲｅｓ．　　８　　２１７−２３２　（１９
８８），ＶｉｒｕｓＲｅｓ．　　５　　３４３−３５６
（１９８６），　Ｊ．Ｇａｎ．Ｖｉｒｏｌ．６７．　１
９１　７〜ｌ９２７（１９８６））を導入することを検
詞したが、単に抗原遺伍子を組み込んだ組み換えアビポ
ツクスウイルスを作製しても、実際にワクチンとしてイ
１効であるεは限らず、ＮＤＶのＩ”１１仏子を組み込
んだ組み換えアじボックスウイルスでＮＯＶの感染を紡
御し得るワクチンが製造できるかは、まったく不明の状
慝であった。また、近年ワクチニアウイルスにヒ１・・
パラインフル■ンｌｆｆｆｆ型ウイルスのＦ遺伍了を挿
入し！こところ組み換えウ、イルス感染ＩＩＩ胞は、ぞ
”の組み込んだト瑣伝子の発現により、そのｉｌｌ胞ホ
竹が強まることが示唆された（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６１　
　３４１６−３４２３（１９８７〉）。このように「遺
伝子を導入した組み換えウイルスで【よウイルスによる
細胞融合などが起こりやすくなるなどの問題点があった
。 （発明ｌｆｉ解決しようと寸る課題） そこで木発明名らは、かかる従来技術の下で、Ｎ　ｌ）
　Ｖ由来の抗原二１−ドｃＤＮＡがゲノムｌ’）　Ｎ　
Ａ中に組み込まれた増殖ｌＪ１能な組み換え７ヒボック
スウイルスの構築をｌｊ　ｌ＝　Ｌ説ふ検Ｊ４をｉｌ８
めた結果、ＮＯＶのｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　，好Ｊ、しくは０
２６株の５ノ、うｔκ弱毒株のｃＤＮＡより１タンパク
質をコードする領域を選択し７ビボックスウイルスの増
殖に４１必須なグノムｇＡｉｌ＆に組み込めば、増殖可
能６Ｉｌみ換えアビポツクスウイルスが得られるこεを
見い出し、きらに、これらＦ遺伝子を含む組み換え７ピ
ボックスウイルスが感染ＷＪ胞の融合を引き起こ３ヂ、
、かつ７ピボックスウイルスとＮ　Ｉ）　Ｖの両方の！
４染を防御し得るワクチンとしてイ−ｊ効て・あるこε
を見い出し、本発明を完成寸るに至った。 （課題を解決するための手段） かくして本発明によれば、ＮＤＶ出来の抗原を二』−ド
するｃＤＮＡをアビボゝソクスウイノレスの増輌に非必
須なグノム領域に、好ましくはブＤ　ｔ−ター機能を右
する（）　Ｎ　Ａと共に、発現可能な形で組み込：Ｌれ
た組み換えアビポツクスウイルスが提供される。 本発明においてＮＤＶ山東のｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａを組み込
む！こめに供されるウイルス（よアビポツクスウイルス
に分頬される限りいかなる株でもよいが、鶏、七面島、
アじルｆ．κどの家禽類の細胞中で増舶’１＋ｌ能なも
のが好ましく、その具体例としてＡ　１”　Ｃ　ＧＶＲ
−２５１．Ａ”ｒＣＣ　　ＶＲ−２５０，ＡＴＣＣ　　
ＶＲ−２２９，ＡＴ（；Ｃ　　ＶＲ−２４９．ＡＴＣＣ
　　ＶＲ−２８８，西ケ原株、洲水株などのごとぎフＩ
ウルボックスウイルスやノ７ウルボツクスウイルスと近
縁のウイルスであって、ＮＰ株（鶏胎化鳩痔島中町株）
なとのように鶏痘ｌＥワクチン株ｔして使用されるウイ
ルスなどが例示される１．これらの株はいず＾も市販さ
れＣおり、容易に入手ずるこεができる。 またＮ　ｌ）　Ｖ山来の１−タンパク質は、ｒＡ染Ｉ！
Ｉ胞℃゛「０タンパク質という形で発現し、Ａｕｓｔｒ
ａＪ＋ａ−ｖｔｃｔｏｒｉａ株《以ド、ＡＶ株と称す》
ｔＴどの強出様で【よ、Ｎ未端から約１／５のところｅ
切断され、Ｆ，Ｆ２εいう２つのポリベブチドになり、
こ１ のｊｉ裂によって感染ｌｌ！胞の融合活性が生じるのに
対し、１）２６株なとの弱毒株で（ま、強ｊｉ株に存ｎ
−するＦ，Ｆ２への開裂部位ｒｉ前の連続した塩基１ 性アミノ酸残基が存イｔｔ！ず、「。タンパク質昏よ「
１，Ｆ２八同裂しない。そのため感染細胞の融含活性か
はとんとなイ（　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ　７　
　２４１−２５５　（１９８７））．木発明においてＮ
　Ｉ）　Ｖ山来の１タンパク費を］一ドするｃＤＮＡＬ
Ｌ　，好ましく（よＮ　ｌ）　Ｖの１）２６株などの「
。タンパク質からＦ．Ｆ２への開裂の起こらない弱み１ 株を用いて調ｙｊ１″ることができるがＡＶａなとを用
いて調製してもよい。ＡＶ株なと強渇株由来のＦ遺伝ｒ
を利用リる場合、｛＝ｏタンパク質から１，，「２への
間裂部分直前を合成［．）　Ｎ　Ａ等を用いて聞裂の起
こらない弱痛タイブに変換しで用いることがＱｆましい
。例えば、上記１）２６株から調製されるｃＤＮＡは、
第３図に示！Ｊ′瑞囚配列の中の第４３番目から第１７
０１番目までの１　６５　９堪基対で構成されている。 ４ｌ：たＡＶ株から調製されタＣ　ｌ）　Ｎ　Ａも１６
５９勉基対から構成されており、開裂部位近傍を除いて
他の配列は相向恒が高い（　Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ　７２４１−２５５　（１９８７））。 この様にＮＤＶ山来の「タンパク質を］一ドづるｃＤＮ
Ａの配列は必ずしも一様ではないが、本発明においては
、上記２種類のｃＤＮＡと実質的に同一の機能をｔＪリ
るｗ！ＩＰｌｌにＪ３いＣ修鋒きれたｃ　ｌ’）　Ｎ　
Ａ　（　［！ｌ　ノ５、塩基配列が置換、挿入、欠失し
たもの）であってもよい。もらろん、実費的に四一の機
能を有づるかぎり、？ミノ酸配列が異なる程度に修飾さ
れｋｂのであってｂよいが、虹ましく【よ、Ｄ２６株の
「クンバク質のようにｌ−’１＋１２へ開裂しない弱み
タイプのポリベプヂドを丁ｌ−ドするＣ　Ｄ　Ｎ　Ａ　
＄　Ｑい。もちろんＡＶＩ１のごとき強島株のＣＤＮ八
を用い開裂部イ☆近傍を合成ＤＮＡｅを用いて弱毒タイ
プのｂのと直き換えて用いることも呵能て゛ある。 本発明を実施リるに当たっては、まずアビポツクスウイ
ルスの１？！殖にＳ：Ｓ須なＤ　Ｎ　Ａ領域を組み込ん
だ第−の組み換えベクターが作製される。同領域内に７
ビボックスウィルス内″ｃ機能リるブ０モーターが含ま
れているもの／ｆｉ好ましい。 増殆に調必須なＬ）　ＮΔ領域の具体例とし（は、例え
ば第４図に示ψご１！：きｌＩＩＩ蜆酢索地図を示づア
Ｌ　ホ”／　’／　スウ−１’　Ａ／　スＮ　Ｐ　ａ　
Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｏ）　Ｅ　Ｃ　Ｏ　ｒ＜　Ｔ１１ｉｎｄｎ
ｌｌｌ片（約５．０κｂｐ）、８ａｍＨＩ断片（杓４、
Ｏ　Ｋｂｐ）、Ｅ　Ｃ　ｏ　Ｒ　Ｖ　−　Ｈ　ｉ　ｎ　
ｄ　ｍ　断片（約１．８κｂＤ）、１３ａｒｎ目Ｉ　Ｉ
ｉ　ｌ′ｉ’　（約３．３κｈｐ　）　、Ｈ　ｉ　ｎｄ
ｌｌ［Ｊ４　（約５．　２ＫｂＥ１　）　’；Ｋトｋ相
同組み換えを起こす領域が例示される。 このような増殖に非必３ｆ３なＤＮＡ領域は、例えば以
下のような千顔によって固定するここができる。未ザア
ビボツクスウィルスグノム中の｛Ｔ　ＡａのＤＮＡ断片
を挿入したハイブリッドブラスミド（ハ）と、７　［１
　１′：一ターの支配十に検出容ＳＡ　／．Ｋ酵素を］
一ドづるＤＮＡを連粘したハイブリッドプラスミド０を
一Ｍｌる。次にハイブリッドプラスミド■からブ目モー
ターおよび酵素をコードするＤＮＡを完全に含むＤＮＡ
ｌｌｉ片を調製し、八イ１リツドプラスミド０のウイル
スＤＮＡ部分に挿入するここによりハイブリッドプラス
ミド０を［１−！ｊ−る。 次いで予め７ビボックスウイルスを！．！Ｉ染さ往だ宿
１細胞にハイブリッドブラスミド■を移人づることｋ：
Ｊ、って、組み換えアピボックスウイルスの形成の右無
を！ｆ認する。 組み換えアビポツクスウイルスが上記一連の操作によつ
（構築きれたかどうかの選択は常法に従って行えばＪ；
（、例えば酵素をコードするＤＮＡとしてβ−ガラク１
〜シダーぜ遺伝ｆを用いた場合に番；Ｌ　，組み換えア
ビポツクスウイルスのブラーク形成川培地にブラークが
認められた後にク０ロフヱノールレツドーβ−１〕−ガ
ラクトビラノシド（以上、Ｃ　Ｐ　Ｒ　Ｇε称１）を含
むアガロース培地をΦ層し、３７℃イン１コベーシコン
により赤く染まってくる１ラークを選択す゛れば良い。 このようにＭ束活性の検知を選択の手段としｌ、組み換
え７ビボックスウイルスが得られた場合は、ハイブリッ
ドＩラスミド囚の構築に用いた７ヒボックスウイルス由
来の［）ＮＡ断Ｊ１が増殖にＪ１必須なｌ）　Ｎ　Ａ領
域であるこεを示している。 本発明で古うプロモーター機能をイｉするＤＮＡとは、
合成・天然をｍ１わｆアビボックスウィルスが保イＪリ
る転写の系でプロモーターどして有効に機能１ノ得るも
のなら如何なる３％リ配列のものでも長く、ブミジンキ
ナーげを″：１−ドするアビポツクスウイルス遺伝子の
プ１』〔一ターなどアビポツクスウイルス固イ１の１Ｏ
Ｆ：一ターはもちろんのこと、アごボックスウイルスＪ
ス外のウイルス由来の１’）　Ｎ　Ａや真核生物もしく
は原核生物山東のＤＮＡであつ′ｃｔ）上記条例を満す
限り当然本充明に使用１Ｉ１能である。 これらプ日Ｅ一ターの具体例としては、例えばＪｏｕｒ
ｎａｌ　ｏｒ　Ｖｉｒｏｌｏｏｙ．　　５　１　　６６
２　〜６６９（１９８４）に例示されるようなワクブニ
アＩクイルスのブ目モーター、具体的１，：　ｉ．ｔ　
７。５Ｋポリベブヂドを］一ドずるワクｆ−ニアウイル
ス｝豐伝子のブ０｛−ター　１９Ｋポリベブヂドをコー
ドするワクチニアウイルス遺伝子の１１」モーター　７
１２ＫポリベブヂドをコードするりクブニアウイルスＭ
仏子のブロー［一ター、チミジンＶナーゼを１ード４る
ワクチニアウイルス遺伝子のプ［１　′Ｅ：一タ、２８
Ｋポリベブチドをコードするワクヂニアウイルス遺伝子
の１０Ｔ：一ターなどが例示される。 ブ［１モーターはその機能をイｉしていれば、完全なブ
目モーターでも、一部を改度したブ口−ｔ゛一ターでも
かまわない。 第一の組み換えベクターの作製については常法に従えば
良く、例えばアビポツクスウイルスの増蛸に非必拍なＤ
ＮＡ断片を適当なベクターに組み込んだ後、必戟に応じ
−Ｃ該断片中に存在する制限Ｍ木切断点を利用しその下
流ｋ：制限酵素切断配列を飼加したプ口七一ターを組み
込め（【良い、，用いられるベクターの具体１ｊｉｌ．
！：Ｉノで、例えばｐｌ３Ｒ３２２．Ｅ）ＢＲ３２５．
ＤＢＲ３２７．ｐＢＲ３２Ｂ，ｐＵｃ７．ｔ）ＵＣ８．
　ｐＬＪＣ９．１）ＩＪＣ１９などのごこきプラスミド
、λフ７−ジ、Ｍ１３ファージなとのごときフ７−ジ、
ｐＨ　Ｃ　７９（ジーン、±１，２９１．１９８０年）
などのごときコスミドが例示きれる。 木発明においてＵ、次いで、第一の組み換えベクターの
ブＯモーターの下流にＮ　１１）　Ｖの｛−｛Ｎを二コ
ードづるｇＡ域を挿入しで第二の組み換えベクターが作
製される。挿入ｆＪ法もまた常法に従えば良（例えば第
−のベクターの１１１　ｔ一ターの下流に予め設ＧＪら
れた＆ｌ１服Ｍ素切断点を利ｆｆｊ　シてＮ［）Ｖ山来
のｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ断ハを挿入寸れば良い。 これら第一及び第二の組み換えベクターのＩ４築に当た
っては遺伝子操作の容易な大腸閑の系を用いれば良く、
使用寸るブラスミドベクターも目的に相応しいもの１−
ある限り特に限定きれるものではない。 本発ｎｊ　ｋ：　１３いては、次に、予め７ピボックス
ウイルスを感染させた動物＠養ＩＩＩ胞に第二の組み換
えベクターを移入し、ベクターＤＮＡとウィルスゲノム
ＤＮＡの問に相同組み換えを起こさせ、組み換えアビポ
ツクスウイルスを構築リる。ここで用いられる動物培ａ
ｍ胞はアビポツクスウイルスが増殖ＩｉＪ能なものであ
ればＪＬ　＜　、−ｆの具体例ｔ１ノで、例λ，ば鳩胚
ＩＨＮ芽＋１ｌ１［１　（ＪＸＦ，　ＯＦ　Ｆト称＝Ｊ
）などの鶏山来培ａｙｉｓ胞が挙げられ、また、発育鶏
卵漿尿膜なとも宿ｌｔ細胞の範略に当然含ｊ、れる。 組み換えアビポツクスウイルスのｖ４築に当たっては常
法に従えば良く、例えば、ＤＮＡクーロニング第２　８
　（　１）　Ｎ　Ａ　　ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌｕｍｅ
　　ｌｌ　）　、実際的なアブ０−ブ（ａ　ｐｒａｃｆ
：ｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ）　ｐ１．１　９　１−
２　１　１　、デイ．エム．グローバー（Ｄ．Ｈ．Ｇｌ
ｏｖｅｒ）　Ｊ＆ｉ，　　（　［　Ｒ　Ｉプレス，オッ
クスフォード，ワシン１・ン）の記述に準じて７ビボッ
クスウイルスを感染させた宿ＪＥＩＩ胞にリン酸力ルシ
ュウム共沈法により処理した第二の組み換えベクターを
移入さ１！、得られる組み換えウイルスを含むウイルス
集団を［ａｇｌｅ　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地で培養された宿主細
胞に感染させ、！１，育して（るブラークを組み挟λウ
イルス候補株と４ればｐい。これら候補株の内からＮＤ
ＶのＦタンパク質を１−ドするｌ）　Ｎ　Ａ　ｌｌｌｉ
　ｎが和み込まれｌこウイルスを選沢クる方法について
番．↓、該Ｄ　Ｎ　Ａをプ『１−１とするハイ１リダイ
１！一シ１ン法で候補株を純化したのち、Ｎｌ）Ｖ抗休
を１１１いるイムノアツレイを利川づれば良い。 （発明の効果〉 かくして本発明にまれば、アビポツクスウイルスの増殖
に刃二必須／７ゲノム領域にＮＯＶ由来の抗原］一ドｃ
ＤＮＡがブ０モーター機能を有するｔ）　Ｎ　Ａ　，’
．共に発現再能な形で組み込まれた、家歳用生ワクチン
と１ノで利用０１能な、組み換えアビポツクスウイルス
が得られる。 （実施例） 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明をさらに４体的
に説明寸る。 参考例１（非必須ＤＮＡ領域の同定） （１）　　アビボツクスウイルスゲノムＤ　Ｎ　ＡのＡ
製７５１２培養フラス１に培養されたＣ　Ｅ　Ｆに、７
ビボックスウイルスＮＰ株（鶏胎化ｐａ沁島中町株、１
１木ノアーマシーネ１製）を１ｐ．ｒ．ｕ．／細胞にな
るように接種１ノだ６３７℃、５％Ｃ０２イン４コベー
タ−で”　２　Ｉｔｓ間培范後に、１０％１・リブ１−
−スホスノエイト１口−ス（　ｌｃｙｐｔｏｓｅ　ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅｂｒｏｔｈ　）　　（デイフコ社）、０
．（．）３％し−グルタミン加イーグル（［’ａｏｌｃ
　）　Ｍ　Ｅ　Ｍ培地を１５一加えた。くの後４日間、
３７℃、５％ＣＯ２イン４ユベーターで培！＆後、ｊ８
１＆．−Ｌ清を３０００団転で１０分間遠心し、一Ｅ清
を同収した。その上冫＾を２５０００同転〈約９８００
０ｘｇ）１時間遠心し、沈消を回収した。培養土清の１
／１０容吊のＤ　Ｎ　ａ　ｓ　ｅ反応バツファ一＜５０
ｓＨｌ−リスｌ７，５、ＩＩＨ　　ＭＱＬ”，１２）に
懸濁し、ｔ）Ｎａｓｅ　　ｆｉ（ベーリンガー・マンハ
イムネｔ）を９μｇ／ＩＩ！になるように加え、３７℃
、３０分間反応させた。反応後、２５１ＨＥＤ丁Ａ・２
Ｎａを加え、室温で３０分問おいたのち、ブ口テイナー
ビＫ（ベーリンガー・マンハイム社）を５００μデｌ／
ｄ，ドγシル硫酎ノ１・リウム（　Ｓ　Ｄ　Ｓ　）を１
％になるように加え、３７℃で一晩反応さ１！た。これ
をおだやかにフ■ノール・ク［１　０小ルム処理後、エ
タノール沈殿ｃ５ｔ！、ウイルス（″）Ｎ八を０．５μ
ｇ臀た。 （２）　　アビポツクスウイルスゲノム断Ｉ１を介むハ
イブリッドブラスミド０の作製（第５図参照）（自）　
アビポツクスウイルスＮＰ株Ｄ　Ｎ　Ａの約５．０κｂ
＋）　Ｅｃｏ［’＜Ｔ　−Ｈ　ｉ　ｎｄｌ［［所片を含
むブラスミド（　ｐ　Ｎ　Ｚ　１　８　０　Ｈ　）の作
製２μクのｐＵｃ１８（ファル７シアネ１製〉をＥ　Ｃ
　Ｏ　Ｉ＜　１：およびＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ　”’Ｃ消
化した後、７　．Ｔ−ノール・ク［１　［１ホルム（１
：１）で仙出し、二「タノール沈殿により開裂したＤ　
ｔＪ　Ｃ　１　８をｌｊＪＪ収した。 ５′−末端リン酸をアルカリフオスファターゼ処理によ
り除去し、ＤＮＡを再びフェノール・ク１」［Ｊホルム
抽出後、Ｉタノール沈殿によって回収した。開裂した０
．２μＪのｐＬＪ　Ｃ　１　８ε１μクの精製アビポツ
クスウイルス（　Ｎ　Ｉ）株）ＤＮＡのＦ　ｃｏＲ　Ｉ
　一ＩＩ　ｉ　ｎｄ　［ｎ消化物を’Ｊ　ｊＪ　−　ｔ
’　ニヨＶ）凍結し、」ンビテン１−な人Ｉ！薗ＴＧ１
を形質転換し、５−ブＤＥ−４−クロ目−３−インドリ
ノレβ−１）−ガラク１−ビラノシド０．００３％、イ
ソブ１］ビルーβ−Ｄ−ガラクトビラノシド０．０３曲
、７１０ｔｌ’Ｊ／ｒｄアンビシリン加のＩ−　８寒大
培地で１５時間、３７℃で塙孤した。寒天！８地上に牛
育した形質転換人膓菌のう’５　＋ｉｌ　」ロニーを杓
０１１’：Ｉ／−アンピシリシ加のＬ　Ｂ液休Ｊ８　ｔ
ｉｌｌぐ３７℃、１５ＩＯ間椙養し、どルンボイムどド
ーリーのｈ法〔ヌクレイツク・アシツド・リリー−チ，
７．１５１３・へ．　　（１９７９＞）でプ゜）スミド
を抽出し、ｒ　ｅｏＲ　Ｔ＆｝ｌ　ｉ　ｎｃｉｍｔ”消
化後、０．６％アガロース電気泳紡によってもとの７ピ
ボックスウイルスＯＮ八　Ｆ’　ｅ　ｏ　Ｒ　Ｉ一目ｉ
ｎｄｌｌｌ断片と同じ長さの断片を持つハイブリッド！
ラスミドを検出し、これをｐＮＺ１８０）ｌと命名した
．，なお、約５．　Ｏｔｌｉｂ　Ｆ　ｃｏＲ　Ｉ−Ｈ　
ｉ　ｎｄ　ｎｌ断片のａｌｌＩ限酵素地図Ｌｉ第４図（
のに示すとうりである，，ｐＮ７１８　０　Ｈはハイブ
リッドブラスミドの１．：相当する。 ０　７ビボックスウイルスＮ　Ｐ株Ｄ　Ｎ　Ａの約４．
０κｂｐＢａｍＨＩｉｌｉ片を含むブラスミド（ｐＮ７
１　６０）の作製 （自）で用いたベクターｐＵｃ１８をｐＬＪ　Ｃ　９に
変＋Ｊｉりること、またＥ．　ｃ　ｏ　Ｒ丁−｝１ｉｎ
ｄｌｌｌ断Ｊ７の代わりにＮ　｝）株Ｄ　Ｎ　Ａの約４
，０κｂｐ　１３　ａｒｎｌｌ　１断片を用いることＬ
ス外Ｕ（自）と同様に１ノでハイブリッドプラスミドを
得、ぞれをＤＮｌ１６０と命名した。なお、約４．ＯＫ
ｂｐ　ＢａｒｎＨ　Ｉ断片の訓限酵Ａ地図番ま第４図０
に示１とうりであり、ｐＮ７１６０はハイブリッド１ラ
スミド（ヘ）に相当する。 ０　アビポツクスウイルスＮＰａＤＮＡの約１．８Ｋｂ
ｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｈ　ｔ　ｎｄｕ［断片を含むブラスミ
ド（ｐＮＺ１３６ｓ）の作製（自）で川いた約５。ＯＫ
ｂｐＦ二ＧＯ八■一｝ｌ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ断Ｊ１の代わ
りにＮ　Ｐ株１）　Ｎ　Ａの約７．　３Ｋｂｐ　Ｅ　ｃ
ｏＲ　ＩＩＩＮ片を用いる以外｛ま（自）と同様（ニし
て、ハイブリッドを１９、それをｐＮ２１３６と命名し
た。さらに、ｐＮ７１３６をＨ　ｉ　ｎ　ｄ　ｍで消化
した後、Ｅ　Ｃ　Ｏ　Ｒ　Ｖ　ｒＷ分消化し、０。８％
ノ′ガ［Ｊ−ス電気泳ａ（ノ、隣接した約０．６κｂｐ
Ｅｃｏ尺Ｖ断片と約１，２ＫｂｐＦ　Ｃ　Ｏ　Ｒ　Ｖ　
−　Ｈ　ｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ　Ｉｉ　ｎよりなる約１．Ｅ
｝Ｋｉｌｌ　ＦｃｏＲＶ−１−１　ｉ　ｎｃｊｍ断片を
回収した。 方、ｐＵｃ１８をｆｌｉｎｄｌｌｌ，ＦＣＯＲＩで消化
した後、フェノール；クロロホルム（１：１）で抽出し
、エタノール沈Ｗ２により開裂したｐ　ＬＪ　０　１８
をアガロースゲル電気泳勤により同収（ノた。約１６８
κｂｐ　ＥＥ　ｃｏＲＶ−　１−１　ｉ　ｎｄ　ｆｆ［
ｌｉハをＤＮＡボリメレースにより平滑末端とした後、
リガーゼにより連結し、コンビテントな人賜薗ｒＧ１を
形質転換し、アンピシリン加の１　８寒天培地′ｃ′選
択し、約１　．　８Ｋｂｐ　Ｕ　ｃｏＲＶ−１１　ｉ　
ｎｄ　ＩＩＩｉＨを含むブラス互ドをｐＮＺ１３６ｓと
命名しｌこ。 なお、約１．８Ｋｂｐ　ＥｃｏＲＶ−Ｈｉ　ｎｄｌＵ断
片の制限Ｒ素地図は第４図Ｏに示す通りであり、ｐＩ’
ｌｌ１３６Ｓｌ；ｔ，ハイブリッドブラスミド（ハ）に
相ご′ｉ？ｊる。 （３）　　ブ〇七一ター及びその支配下に検出′Ｂ易な
酵糸を：Ｊ−ド《１゛るＤ　Ｎ八を連結しＬ：ハイブリ
ッドブラスミドＯη（ｐＮ７７６）の作製（第６図参照
〉 ワク１ニアウイルスＷ　Ｒ　ａの７．５ＫダルＩ−ンベ
ブｆ−ドをコードリ−るＤＮＡのプ口ｔ一ターを含むＳ
　ａ　Ｉ　Ｉ　−　Ｒ　ｓ　ａ　Ｉ　ｉＦｉ　ｊ’＋約
０．　２６Ｋｈｏ　（Ｃｅｌｌ，１２５．８０５〜８１
３　（１９８１））をｏ　ＬＪ　Ｃ９のＳａＪＩ−Ｓｒ
ｎａ１部分に組みこ＾、だブラスミドをｐ（ノＷ　Ｐ−
１と命名した。 １０μグのｏ　Ｍ　Ａ　０　０　１　（　Ｓｈｉｒａｋ
ａｗａら、Ｇｅｎｅ，２８．　　　１２７　　−　．　
　　　（１９８４））　　を　１３　　８　　ｍ　　Ｈ
　　Ｉ　　で消化後、（２）εｌ０１様の操ｎによりβ
一万ラクＩ〜シダーゼ遭伝イ（約３．３Ｋｂｐ）を回収
した。一方、０．３１１５１のｐ　ｔＪ　Ｃ　１　９を
Ｂ　ａ　ｒｎ目■で消化後、７丁ノール・クロロホルム
抽出し、−［タノール沈殿により［ＯＪ収し、上記で：
ＪＩＪ製したβ−ガラクシトダ−ｔ？１２伝了とライゲ
ーシコンし、ハイブリッドブラスミドｐＮＺ６６を作製
した。 一方、４０μグのｐｕｗｐ−ｉをＨ　ｐ　ａ　ＩＩ　，
Ｕ　ｃ　ｏ　Ｒ　Ｉで消化し、１５％低融点アガロース
電気泳朔《７０ボルト、６時ｆｌ￥１》により７．５Ｋ
プＤ　［一ターを含む約０．２６κｂｐ　（／）所Ｉ１
を分離し、（２）と（Ｉ１様の操作によりＤＮＡを回収
した。このｆ）　Ｎ　Ａ断片の接着末端をＤＮＡポリメ
レースにより甲消末喘とした。０．３μびのｐＮＺ６６
を目ｉｎｃｌＩで消化し、ノエノール・クロロホルム抽
出し、エタノール沈殿により同収し、Ｌ記約０．２６κ
ｂｐの７．５Ｋプロｔ一ター遺伝子をライグーシコンし
、得られたハイブリッドブラスミドをｏＮＺ７６と命名
したｎｏＮ７７Ｂはハイブリッドブラスミド■に相当す
る。 （４）　　ハイブリッドブラスミド０εハイブリッドプ
ラスミド０からのハイブリッドブラスミド０の作製（第
７図参照） （ｄ　　ｐ　Ｎ　Ｚ　１　８　０　Ｈ中のＩＥ　Ｃ　Ｏ
　Ｒ　Ｖ　部位にワクナニ７ウイルス７．５Ｋ７ＯＥ−
ターとβガラクＩ−シダーゼＤＮＡの連結Ｆｆｉ片が仲
人されたハイブリッドブラスミド（ｐＮＺ１００３）の
作製 １０μ９のｐＮ，７７６をＨ　ｉ　ｎｃＵ　ＩＩＩ，　
Ｓｍａ　１で消化後、０，７％低融点７ガ目一ス電気泳
動（４０ボル１・、２０時問）で約３。６　Ｋｂｐの断
ハを分離し、■ブージウムブ口マイド染（ｆｉによりＤ
ＮＡ断片を確認後、ゲルを切り出し、フ］，ノール処理
した後、エタノール沈殿によりＤＮＡ断ハを四収した。 ｉｔ，１μＨのＯ　Ｎ　７　１　８０　Ｈ　４ｒ　［ｃ
　ｏ　Ｒ　Ｖ　テ消化し、フェノール・クＬｌ　［コホ
ルム抽出し、エタノール沈殿により同収した。開裂され
たｐＮＺ１８０Ｎ　　ＤＮＡ０．３μｇＬ萌配約３．６
ＫｂＤの断片（７．５ＫブｒＪ　ｌ−ター１）　Ｎ　Ａ
とβ−ガラク１・シダーぜ遺伝゛ｔの連結断ハ》約０．
４μグを混合し、ＤＮＡポリメレースで接着末端を平滑
末端とし、フェノール・クロ１］ホルム仙出後、Ｉタノ
ール沈殿により回収した。同収され７：：　ｏ　Ｎ　Ａ
をリガーピにＪ；り連結し、ロンビｊ−ントな人腸菌「
０１株を形質転換し、４０μ？？　／　ｄ　７ンビシリ
ンｂ１１の１１３寒大鳩地で３７℃、１５峙間生介させ
た。 生育した人腸菌から、（２）だ同様な操作によりブラス
ミドを間収し、Ｉｇ３　８ｍ目Ｉで消化し、０．５％ア
ガ口ース電気泳初でβ−ガラク１・シダーゼ逍伝子断ｊ
’ｉ’　（約３．３κｂｐ　）を含むハイブリッドブノ
スミドを選択しこれをｐＮ７１００３口ε命名した。 ｌｔｉ　　ｐＮ７１６０中のＸｂａＩ部付にワクチニア
ウイルス７．５Ｋブｏ　ｔ一ターとβ−ガラク１・シダ
ーゼＤ　Ｎ　Ａの辻粘断片が挿入されたハイブリッドブ
ラスミド（ｐＮＺ１００４）の作製 （自）で用いたｐＮ　Ｚ　１　８　０　Ｈ　４ｒ　！Ｊ
　Ｎ　Ｚ　１　（ｉ　０に置−．！！換え、ｆｒｉｌｌ
限Ｍ素Ｆ　ｃ　ｏ　Ｒ　ＶをＸ　ｂ　ａ　ＩにＥ’ｆ　
３　ｍえた他は、（自）と［１］様にしで、β−ガシク
１・シダーぜ遺伝子断１１（約３．３κ１）ｐ）を含む
ハイブリッドブラスミドを選択し、それをｐＮＺ１００
４と命名した。 （６　　ｐＮＺ１３６ＳのＦｃｏＲＶａｉｌｌｌｋ：’
７クチニアウイルス７．５Ｋブ［］ｔ一ターとβ−ガラ
ク１−シダーゼｌ）　Ｎ　Ａの連結＃ｉｇが挿入された
ハイ１リツドブラスミド（１）ＮＺ１１３７）の作製 ｐＮ７１３６ＳをＥ　ｃ　ｏ　ＲＶ−Ｃ消４ｋＡ＆、［
ｃｏｆｌＴリンカー（宝酒造株式会討製）をリがー１２
により連結し、フェノール・ク【Ｊ『】ホルム抽出、エ
タノール沈殿に，ＬりＤＮＡを同収（ノた．，四収した
ＤＮＡをＥｃｏＲＩ．ｘｂａｌ’ｒ消化後、２．０％ア
ガロースグル電気泳初に供し、約１４０ｂ＋ｌＥｃｏＲ
Ｔ−Ｘｂａ　Ｉ断（１を

【１−１収した．，またｌｉ１
様にしｒｐＮＺ１３６ｓをｌ　ｃｏＲＶでｉ化後、ｌｌ
ｉｎｄｌｌリンカー《宝酒造株式会社製》をリガーゼに
より連結し、フェノール・ク０　［１ホルム抽出、１Ｌ
．タノール沈殿により０Ｎ八を同収した。 回収したＩ）　Ｎ　Ａをｔｌｉｎｄｌｌｌ−ＸｂａＩに
より消化した後、０．８％７ガロースゲル電気泳Ｓ）＋
により約ぺ．３κｂのｆ−１　ｉ　ｎ　ｄ　ｍ−Ｘ　ｂ
　ａ　１’　Ｋハを同収した。さらに、ｐＵＣ１Ｂをｌ
−１ｉｒ＋ｄｌｌ！，［ｃｏＲＩＦ８！ｉ化後、２．０
％アガロースグル電気泳動により、ポリリンカ一部分（
／）　５　１　ｂｎの断片を回収した。ここで得られた
約１４０ｂｐのＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ断片、約４．３κ
ｂｐの１１ｉｎｄｌｌｌ−ＸｂａＩ断ＪＴ１さらに５　
１　ｂｐのＨｉｎｄｌ［Ｉ　−ＥｃｏＲＩ’所片をリガ
ーゼにより連結し、実施例１の｛４｝εＩＩ■１様な操
竹に１、リブラスミドを抽出し、ａＩＷｉ片が連結した
ブラスミドを検出し、これをｐＮＺ１３６ｓＩ−た命名
した（第８図参照）。 ７ｊ，ｐＮ７７６を口ｉ　ｎ　ｄ　ｍ、Ｓｒｎｃ３Ｔｒ
消化後、（２）とＩｉ’ｉ１様に約３．６κｈｐ断片を
回収した．，−１記ｐＮＺ１３６ＳＩ−をｌｌ　ｉ　ｎ
ｄｌｌｌ．　Ｓｍａ　Ｉで消化し、フェノール・クロロ
ホルムで抽出し、■タノール沈殿により同収した。この
両者をリガーゼにより連結し、］ンビテン１−な人腸菌
−ｒＧ１株を形質転換し、以十｛２｝と同様にして、ハ
イブリッドプラスミドを選択し、これをｐＮＺ１１３７
と命名した。 （５）組み換えアビポツクスウイルスの作製２５ａ２培
養フラスコに培養されたＣＥＦにアビポツクスウイルス
ＮＰ株を０．　０５Ｄ．ｌｕ．／Ｉｌｌ胞になるように
接挿した。（４）で得たハイブリッドブシスミド５０μ
ｌを、２．２−の滅菌水に溶解し、これに１％へベス、
０．６％地化ノ゛トリウムの混合液を２．５ｄ，７０ｓ
Ｍリン酸水索２ナトリウム１２水和物と７０ｍＨリン酸
水素２ｔｌ−リウム２水和物を′８診混合し／，−　！
ｆｉ　Ｔ＃Ｊ液を５０μｌ加えた水溶液を作製した。こ
れを１５ＩＩｌのＪ−ユープ（ファルコン剥製）に・）
つし、スターラーでＦｆｔ＃￥し＜ｌがら２Ｍの煽化カ
ルシウム水溶Ｆ＆３００μｌをこれに漬Ｆ　Ｌ，　Ｉ）
Ｎ八一リン酸カルシウム共洗物を作り、そのＯ．　！５
ｌＩｌ．をウイルス接ｆｉｌ４５分後の感染ＣＥＦＪ二
に滴下した。３７℃、５％Ｃ゛０２インキ１ベーターに
３０分間静ｎし、５％牛胎児血清、０．０３％］−一一
−グルタミン、１０％トリプトースフＡ−スノ１イ１・
ブロースを含むイーグルＭ　Ｅ　Ｍ４．５ｄを加えた。 その３ｉ間後、培養液を交換し、３日間、３７℃、５％
ＣＯ２インキュベーター中で培養し、＠養ＩＩ胞ごε３
度凍結融解し、組み換え体を含むウイルス液を４！？ｌ
こ。 ＋６１ＣＰＲＧによる組み換え体の選択１０ｌＪべ１・
りｌｌＩ′Ｉに培養されたＣビＦに（５）で青たウイル
ス液を接種し、２時間後、０．８％バクトア〃−《デイ
フ」ネｊ製〉、５％牛胎児血清、０．０３％［−グルタ
ミン、１０％トリブトースノＡスフエイトブ［ｌ−スを
含んだ、フェノールレット不含イーグルＭＦＭを１０Ｉ
Ｉ！積ｉｂ、３７′ｃ，５％Ｃ０２インキュベーターで
３Ｆｌｔ＠差し、これに、」記ε同成分のフェノールレ
ッド不含イーグルＭＥＭを１０耐重居し、さらに、３７
℃、５％Ｃ０２インキコ−−ベーターで３目間培養した
。 これに、０．８％バクトアガー、０．０３％１−グルタ
ミン、１０％トリ１１一一スノＡスノエイトブ【１−ス
、０．０３％ＣＰＩ＜Ｇ（ベーリンガー・マンハイム剥
製〉を含むフｆノールレツド不含イーグルＭＥＭを１０
ｄ重層し、３７℃、５％ＣＯ２イン↑ユーベーターで６
時間培養した。組み換えウイルスはβ−ガラクトシダー
ゼをＲ現し、ＣＰ　Ｒ　Ｇ　｛Ｓ”赤変さＱるので、組
み換え体ブラークのまわりのアガ〜、ｌＩＪ胞とも赤色
に発色し、容易にＡ−組み換え体ε区別が可ＩＬであっ
た。この赤他ブラークから生或した組み換え体を滅薗パ
スツールビベットで単閣した。得られた組み換え体につ
ぎ、それぞれ第１表に示すごとく命名した。 第１表 （７１　　組み換えアごボックスウイルスのゲノム１）
　Ｎ　Ａの解析 （６）で得られたそれぞれの組み換えアビポツクスウイ
ルスをブラ〜ク純化しｔ：のｉ）、１０ｌ：ＩＩべｌ−
リＩＩｎ　［培蓄サれたＣＥＦに１　１）．　ｒ．ｕ．
／細飽となるように接種した。以下、…ｔｌｉｌｉｌＩ
１の方法でウイルスＯＮ八を単離した。各組み換えウイ
ルスＤＮＡ２μクを［３　ａ　ｌＴｉ　ｉｔ　ＩまたＬ
Ｎ｛ｉｎｄｌｌ［ニＴ消｛１、０、５　％　？　カ口−
　ス電気泳！ＩＪ　（２５Ｖ．’２０１１．Ｖ間）でｌ
ｇｉハを分離し、＃Ｊヂンの方法（ジＡ７−ナル・Ａ１
・モレ１ユラー・パイＡ口ジイ，９８，５０３−・（１
９７９））で、ナイロンメンブレンにＤ　Ｎ　Ａを移し
た後、８０℃、減圧下でＤＮＡをナイ０ンメンプレンに
固定しｌこ．４倍Ｓ［：「（０．６Ｍ　　ＮａＣＪ．０
．０８Ｍ　　ＴｒｉｓＨＣ　　ｉ　（ｐＨ７．　　８）
　　，　　４ｍＨ　　　Ｅｌ）’ｒＡ）　　・−　１　
０倍Ｄｅｎｈａｒｄト−０．１％ＳＤＳで６８℃、２　
１Ｌｉ　［ＦＳ１　５１！！　ｆｆ後、　ＩＲｓＥＴ−
１０　イ！’．　　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　　−０．　　１
　　％ＳＤＳ−０．１％Ｎａ４Ｐ２　０７　−５０１１
ｇ／ｄ．変性サケ精子ＤＮＡとニツクトランスレーシコ
ンによつ’ｃ３２ｐｒｅ：識したβ−ガラクトシダービ
１）　Ｎ　Ａを加えて６８℃、１４時間ハイプリダイゼ
ーシコンした。洗浄、乾燥後、ナイ口ンメンブレンとＸ
線フイルムを重ね、オートラジオグラフイ一を｛ｊない
、バンドの存在を確認１ノ、これらの組み換えウイルス
が所定の場所にβ−ガラクＬシダーぜ遺伝子を持つここ
を確認した。 ｛０｝非必須１）　Ｎ　Ａ領域の同定 以上の結果から、ｐＮＺ１８０Ｈの作製に用いたＥｃｏ
ＲＩ−Ｈｉｎｄｌｌ断バ（約５．０κＩ）Ｉ））、ＯＮ
１　１６０作成に用いたＢａｒｙ目−ＩＴ所）−１（約
４，ＯＫｂｐ）及びＩＩ）ＮＺ１３６Ｓのイ１成に用い
たＶｅｏＲＶ−Ｈ　ｉ　ｎｄｍ断片（約１．８κｂｐ　
＞はウイルスのＪ（’ｌ殖にＵ３　ａ　ｍ１１　１非必
須な領域であることが理解されよ・）． また」二記ε同様の丁法に、Ｌり、Ｎ　Ｉ１株１）　Ｎ
　Ａの口ａｍｌ−ＩＩ断片（約３．　３ＫｂＦ）　）　
、Ｉｎ　ｉ　ｎｄ［ｌ［断ハ（約５．２Ｋｂｉ））も増
１ｌ／Ｊに非必須な領域であることが確認された。なお
、これらの断Ｊ１のｆｉｌ＋限酵素地図は第４一に示ず
Ｌうりである。 さらに、（４１で作戒したハイブリッドプラスミド１）
　Ｎ　Ｚ　１　０　０　３　Ｈ、Ｄ　Ｎ　Ｚ　１　０　
０　４およびｐＮＺ１１３７は、いずれもウイルスの増
舶に実必’ｊＡ　’ｊ：１）　Ｎ　Ａ　ｆｉ　Ｉｔを含
んでいるので、本発明にお０る第一の組み換えベクター
・として利川で津るこたが坤解きれＪ、う。 実１８　１Ｍ　１　　Ｎ　Ｄ　Ｖ　（７）　Ｆ遺伝子Ｄ
　Ｎ　Ａ　＆含ム第＝　（７）組み換えベクター（　ｐ
Ｎ　Ｚ　　５　０　０　３　）の作製《第１ｍおよび第
２図参照〉 （１）　　ブロｔ一ター及びその支配下に１二遺伝子Ｄ
ＮＡを連結したハイブリッドブラスミド（ｐＮＺ９８）
の作１１Ｊ（第１図参照〉ＮＤＶのＦおよびＨ　Ｎ逍伝
子のｃＤＮＡを含むＩラスミドＸ　Ｌ　ｉｌＮ−１　０
　Ｈ　（　Ｖｉｒｕｓ　ＲＣｓｅａｒｃｈ，　　７２４
　１−２５５　（１９８７））を東京人学教養学部、川
書ｌ１正大助教授より入手した。このプラスミドの塩基
配列をＭ１３ファージを用いたｆイＹ，４４シ法で分析
し、既知のＦ　Ｍ伝子の配列（Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅｓｅａ
ｒｃｈ，　５−　　３４３−３５６　（　１　９８６》
）との対比寺から「遺伝子のｃＤＮＡは弟３図に示す第
４３１１目から第１７０１１目までの１６５９塩基対で
あることを解明した。この解明は川喜口］助教授によっ
て？ｉわれだ。 ここで得られたｃ　Ｉ）　Ｎ　Ａが］一ドヴるアミノ酸
ｌ．ｉ、ＡＶａの「タンパク質のアミノ酸配列タ９５％
１ス土のホモロジーを脊ダるものであったが、Ｆ。から
Ｆ１，Ｆ２　への１１１ｕｆｆｉ｛ＤがＡＶａｔ’ＧＪ
、一八ｒｇ−＾ｒｇ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ
−口Ｃ一の＾ｒａ−Ｐｈｃ間であるのに対し、ｌ）　２
　６　ａでＩよ−Ｇ　ｌｙ−１−ｙｓ−Ｇ　ｌ　ｒ＋−
Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−　１　１ｅ−の＾ｒｇ−Ｉ、
Ｑｕ間であり（ただし１）２６株ＧＩ　Ｆ　ｏがら’１
　　，’２へ間裂しない〉、ｒＪｒｉ裂郎位釣前の達続
しだ鶏基竹アミノ酸残基がないことが明かどなった。 ブラスミドＸ　Ｌ　Ｉｌｌ−１　０　１−１　　４　μ
９をＸｂａｌで消化後、０Ｎ八ボリメレースで＃ｅ谷末
喘をキ１ｉ滑未喘とし、フェノール・ク０　０ホルムで
抽出後、■クノール沈殿により回収した。回敗されｌ（
″．１）　Ｎ　Ａを［３　ａ　ｍ　Ｈ　Ｔで部分消化後
、０．８％アガロースゲル電気泳動に供し、約２．１Ｋ
ｂｐのト遺伝子を完全に含むｌｌｉＪ：を回収した。一
方参書例１の（３）ぐ作製したプ［１モーター及びその
女配下に検出容易なＭ’ｌＡを：Ｉ−ドザるｌ）　Ｎ八
を連結したハイブリッドプラスくド（ロ）《ｐＮＺ７６
）をＢ　ａ　ｍ目１とＳｍａ　１で消化し、ｌ　ａ　ｃ
　ｉ　遺｛ｌｉ　−ｒｎ５分を除イた約３。Ｏ　ＫｂＩ
）　ノ［３　ａ　ｒｎ　Ｌｌ　．ＩＳｍａＩ断片を回収
した。この約３．０κｌ）Ｄの断片ε萌述の約２．１Ｋ
ｂｐの断片をリガーゼにより連結し、」ンビデン１−な
大ｍ菌−ｒＧｌ株を形質転換した。５　０　ｔｔ．　ｇ
／　Ｍ！．のアンビシリンを含むＬ−　［１３寒天培地
−Ｌで生育してぎたコロニーよりプラスミドを調製し、
υ１限ＭＩＡによる切断で目的のク目一ンを確認（Ｊ、
そのブラスミドをｐＮＺ９８’　と命名した。ブンスミ
ドｐＮＺ９８’には、［遺伍了仝ｆｆ＜　ｆ７）　Ｇ．
ｔ　カ、Ｌｌ　Ｎ　Ｉｔ伝ｆ（７）５’　末端約３００
ｂｌ）＆含む。この部分を除去サるためにＤＮＺ９８’
をＳｍａ■とＫｐｎＩで消化し、約４１５０ｂＤのＳ　
ｍ　ａ　Ｉ　−　Ｋ　ｔ＞　ｎ　１　ｌ９ｉ片ヲ０　．
　８　％　７　カＩＴＩ　−　ス’ｊル電気泳仙により
回１１！ｔ，た。また、１１１１様に、ｐＮＺ９８’を
ＳｆＴＩａ　Ｔ　，　Ａ　Ｖ　ａ　ＩＮテ消化し、約６
５０ｂｌｌｌのＳｒｎａＩ　　ＡＶａ［ｌ！？ｉｇを１
．５％アガ１］一スグル１有気沫初によりＩＩ！Ｉ収し
た。これら２つの所Ｊ；を混合し、ｌ）ＮＡポリメレー
スにより接着末端を平滑末端とした後、リガーゼにょり
連帖し、ｌンピデントな人膓菌丁Ｇ１株を形質転換した
６５０μ７／ｄのアンビシリンを含む１−１３寒大培地
十に生育した＝１［１二一よりブラスミドを［Ｊし、ｉ
！ｌＩＩ１限酵索Ｓｒｎａ１で再びｔ．７Ｊ断ｅきるも
のを選択し、このブラスミドをＤＮＺ９８と命名した。 （２｝　　アビポツクスウイルスゲノム断片を含むハイ
ブリッドブラスミドｐ　Ｎ　Ｚ　１　８　０　｝−４　
Ｌハイブリッドブラスミドｐ　Ｎ　Ｚ　９　８かＩら第
−二の組み換えベクター（ＤＮＺ５００３）の作！ｊ（
第２図参照） 参乙例１の｛４）で用いたブラスミド１３　Ｎ　７　７
　６の代りにｐＮ７９８を用い、Ｉｔ　ｉ　ｎｄｌｌ．
　Ｓｍａ　Ｔで消化する代りにｌ−１　ｉ　ｎ　ｄ旧，
［ｃｏＲ’［で消化りる他【よ、参考例１の（４）の（
電でハイブリッドブラスミドｌ）　Ｎ　Ｚ　１　０　０
　３　１−１を作製したのとｆｉｌ棟にし（、ワクシニ
アウイルス７．５Ｋプ「１モーターと「遺伝子の連結断
Ｉ１が挿入された第二の組み換えベクター（ＩＩ）ＮＺ
５００３冫をｆＩ−製した。 実塘例２　　ＮＯＶのＥＭ伝子１’）　Ｎ　Ａを含む第
二の組み換えベクター（　ｐＮ　７　５０　０　４　）
の作製（第２図参照〉 ｆＪ考ＶＡ１（７）（４）ＩＦ用いた１ラスミドｌ）　
Ｎ　Ｚ　７　６　（７）代り（二ｐＮＺ９８を用い、ｌ
−１　ｉ　ｎｄ　ｍ．　Ｓｍａ　Ｔｒ　ｆｌ化４る代り
に｝−１ｉｎｄｌｆｆ，ＥｃｏＲＩで消化りる他【よ、
参考Ｉ９４１の（４）の０て゛ハイブリッド１ラスミド
ｐＮＺ１００４を作製したのと同様にしてワクシニアウ
イルス７．５Ｋ７ロモータ〜ε「遺伍ｒ　Ｏ）連結所片
が挿入された第二の組み換えベクター（ｐＮＺ５００４
）を作製した。 実ＦＡ　Ｍ　３　　Ｎ　Ｄ　Ｖ　＋７）　Ｆ　ｆｆｉイ
ｂ子ＤＮＡを含む第二の組み換えベクター（ＤＮＺ５１
３７） の作ｙ！（第２図参照） ブラスミドｐＮＺ９８を１ｉ　ｉ　ｎｄＩ［［．Ｅｃｏ
Ｒ１で消化しワクシニアウイルス７．！−）ＫＩ口ｔ〜
〜ターと［遺伝子が連結した約２，ＩＫｂｐの１１　ｉ
　ｎｄｌｌｌ．　ＦｃｏＲ　Ｔｌｌｉ片を０．８％アノ
Ｊ口〜スゲル電気泳動により同収した。一方−、参考Ｂ
ｉｔ　１の（４）の０で用いたブラスミドｐＮ／１３６
８１−を同様にＨ　ｉ　ｎｄｌｌ［，ＥｃｏＲ　Ｔて・
消化し、フ■ノル・ク［１　０ホルムで抽出し、エタノ
ール沈殿により同収しｋ：。この両者をリガーげに．Ｊ
、り）ｌ１！枯し、コンビｉン１−な人＃Ｊ薗ＴＧ１松
を形質転撲し、１！？られたアンビシリン耐性株より１
ラスミドを調製し、ワクシニアウィルス７．５Ｋブ目モ
ーターこＦ遺伝子の連結断ハ−がアビボックスウィルス
ゲノム断片の一部に＋１１人ざれたハイブリッドブラス
ミドｔ）ＮＺ５１３７を選択した。このブラスミドＤ　
Ｎ　７　５１　３　７　ｉ．ｔ第二の組み換えベクター
ぐあ６。 実Ｍ　Ｉｎ　４　　Ｎ　＋’）　ＶのＦ遺伝子を含む組
み換え７どボックスウイルスの作製 参考例１の（５）で用いたハイブリッドブラスミドに代
λ，（実滴例１、２及び３で得た第二の組み換えベクタ
ーを用いるこＬ以外４１，参κ例１の｛５）ｔ同様にし
て、Ｎ　Ｄ　Ｖのト遺伝子を含む引み操えアビボックス
ウィルス液を得た。 実施例５　ブラークハイブリッドダｔＣ−シｊンによる
組み換え体の選択 １０ｃｍ＋のべ１・り０■に１８　養’ｉ：５れｔｃ　
Ｃ　Ｆ　「−に実施例４で４！ｆ　７，：ウイルス液を
接秤し、２時間後０．８％バクト７ガー　５％牛胎児血
γＬ，０．０３％グノレタミン、１０％１・リプ１〜−
スフＡスノ王一トゾｏ−スを含んだ、イーグルＭＥＭを
１０ｄ積層し、３７”Ｃ．５％Ｃ０２イン↓−７７ベー
ターで３目間培養し、これに、上記？：．Ｉ７ＩＩ成分
を含んだイーグルＭ　Ｆ　Ｍを１０ｄΦ腑し、きらに３
７℃，５％Ｃ０２インキコベータ〜で３日間培谷した，
２これに、０．８％バクトアガー、０．０３％１−−−
グルタミン３　１０％トリブ１・−スフォスフ１イ１−
ブｎ一ス、０．０１％中ｆｆｌ１を含むイーグルＭＥＭ
を１　０ＩＩｅＴＦ）ｌ、３７℃．５％ＣＯ２−ｉ’　
ンキュベーター゛Ｃ１２時間Ｊ８蓬し感染細胞を染鉋し
た．，ベトリ冊より寒天培地を除去し４℃に保存１ノベ
１−り■の底に残った細胞表向に滅菌し，！ごノーイロ
ンメンブレンを押えつけでウィルス苓一移し、０．５Ｎ
　　Ｎａ０１１で１０分、１Ｍ１・リス塩酸ＷＷＪｉｌ
ｌｉｔ’５分σ）処即を３回繰返した後、１．５Ｍ　　
ＮａＣＩ０．５Ｍｔ−リスｊ！酸緩１１ｉ）ｇｉで・５
分処理した。２倍ＳＳＣ　（１倍ＳＳＣｕ、０．１５Ｍ
　　ＮａＣＪ！，０．０１５ＭＣ３１−１，（０１１）
（ｃ００Ｎａ　＞　３）で飽和させ、Ｂ　Ｏ　℃、２　
ｆｌＩ　ｌｆｆｌ　ｆｆｌ　キ−Ｊ　６１　Ａ：。ｌ．
Ｉ’ｉｓＦｒ（０．６Ｍ　　　　Ｎａ（ＪＪ　　、　　
０．　　　０８Ｍ　　　　Ｔｒ　　ｉ　　ｓ−ＨＣＪ．
，１１８　　　ＥＤＴＡｆ）ｌｊ７．　　８ｉ１０　イ
ｔＳ！）ｅｎｈａｒｄｔＯ．１％ＳＤＳで６８℃、２時
間処ｊ！１口，た．，４倍ＳＥＴ−１０倍Ｄｅｒ＋ｈａ
ｒｄｔ−０．　　１％Ｓ　Ｄ　Ｓ０．１％ｌｌｌ４１：
）２０７−５０μ！？／＋＋ｄ変竹サケ精子１）　Ｎ　
Ａとニツクトランスレーシ１ンによって３２ＰＴ：標識
したＮ　ｌ）　ＶのＦタンパク質をコードするｃ　Ｉ）
　Ｎ　Ａを加えて６８℃，１４時間ハイブリダイゼーシ
］ンした。８％．浄後、ナイ１ｌンメンＩレンとＸ線フ
イルムを重ね、Ａ−１・ラジオグソフイを｛ｉい、スポ
ットの存イ１をｉ１２し、４℃に保持してあった寒大培
地にＸ線フイルムを岨ｔ）スポットと合致するブンーク
がＦ）１仏一ｆを含む組み換え体とＩｂ１定し滅菌バス
ツールビベツ１・で単離した。この組み換え体のプラー
クは、いずれの場合も約６００個のブラークが出現した
１０ａＲべ１・り１１１１　１枚あたり３１！Ｊ出現し
た（約０．５％）。 得られた組み換えウイルスについて、ｐＮＺ５００３を
用いたものについてはｆＮＺ５００３、以Ｆ　Ｉｒｉ１
様にｐＮ７５００４、及びｐＮＺ５１３７を用い！、：
ｂのについてはくれぞれｆＮＺ５００４及びｆＮＺ５１
３７と命名した。 実滴例６　　ＮＤＶの１遺伝子を含む組み換え７ビボッ
クスウイルスの純化 尖滴例５で単離したプラークを１耐のイーグルＭＥＭＩ
，．ｌｌＩＬ，、２００μ４！ヲ１　０ａｎ２ヘｔ”．
ＪＩ１ｎにｊ８養されたＣＥ［に接秤した．，２時間後
、０．８％バクト７ガー　５％生胎児血清、０．０３％
Ｌ−グルタミン、１０％Ｅリブ１・−スホスフ■イトブ
ロースを含んだイーグルＭ　Ｅ　Ｍ　１０Ｍ１を積膚し
、３７℃で、５％ＣＯ２イン［１べ一タ−で３日間培養
した。これに、上記と同成分を含んだイーグルＭ　ＩＥ
　Ｍを１０ｄ中居し、きらに３７℃、５％ＣＯ２イン−
１］ベーターＣ３１】問塙薮した。これに、０、８％バ
クｌ・アガー０。０３％１．−グルタミン、１０％トリ
７１−−スホスフエイトブＤ−スを含むイーグルＭ　Ｅ
　Ｍを１０Ｍ！．重膚し、３７℃，５％ＣＯ２インキコ
ベーターで６時間培養した。組み換え体グラークは、実
施ｆ％４１５と同様にＸ線フイルムにスボツ１・を／１
じた。 以上とＩｕｌ　ｌｍの操作をくり返１，：，’：により
間度組み換え体の純化を行った。 その結果ｆ　Ｎ　７　５　０　０　３においては、実施
例５で、１枚あたり約６００個のブラークがでた１０Ｃ
Ｍ２ベトリｆｉｌ　１　０枚あたりに組み換え体ブラー
クが約２０個（約０．３％）出現したが、１同［Ｉのブ
ラーク純化で４Ｊ約２００９Ａのブラークが出現し！、
：ベトリ皿３枚に組み換え体１ラークが約’１００ＩＪ
（約１７％）出現した。２回［］のプラーク純化”′Ｃ
′（よ、ほとんど寸べてのブラークｌメ、組み換え体ｒ
　ｔｂ　ツ７，：。またｆＮ７５００４、及びｌ’ＮＺ
５１３７についてもほぼ同様の結果であった。 実施例７　組み換え体の細胞での発蜆 （蛍光抗体法） 組織培養川Ｊヤンバースライドに培差したＣ　Ｅトに、
口、ｏ．　ｉ．　１、０又ｌ．ｌＯ．１の本発明ウイル
ス株（　Ｔ　Ｎ　Ｚ　５　０　０　３　．　ｆ　Ｎ　Ｚ
　５　０　０　４　．ｆＮＺ５　１３７）を接秤し、３
７℃．５％Ｃ０２イン４ユベーター″ｃ２時間Ｉ８養後
に、１０％１・リブトース小ス７エイトブロース《ｆイ
フ」社》、？．０３％ｌ−グルタミン加イーグルＭ　Ｅ
　Ｍ培地を加えた。その後、２目間、３７℃．５％ＣＯ
２イン１ユベーターぐ培養後、培地を除き、Ｐ　Ｂ　Ｓ
（リンＰｌｉ！ＩＷ／Ｉ生理食塩水）で洗い、風乾した
後、冷７セトンで２０分間処Ｌ！ＩＩＩＪｍ胞を固定し
た。 次抗体として抗ＮＤＶ・ニワトリ抗体、二次抗体とし《
イソヂオシアン酸フルオレヒイン結合抗ニワトリＩａＧ
抗体を使用する蛍光抗体でチェックし、組み換え７ピボ
ックスウイルスがＮＤＶの１タンパク質■１−産能を持
つこたを１認した。 実施例８　組み換え体のｍ胞での発ｊ１ｌ！（解索抗体
法〉 １０ｃｍのベトリ皿に培養きれたＣ　Ｅ　「に実施例６
で１！ｆたウイルス液を接秤し、２　１１１間後０．８
％バク１・アガー　５％牛胎児血清、０、０３％し−グ
ルタミン、１０％ｌ−り１トースホスフ−［イ１−ブ［
１−スを含んだイーグルＭＥＭを１０，ｄ積居し、３７
℃、５％Ｃ０２インｔ］ベーターで３目間培養し、これ
に１−記とＩＩＩ＋１成分のイーグルＭＥＭを１０一φ
層し、さらに３７℃，５％Ｃ０２インキｌＩベーターぐ
３　ＬＩ　ＩＷＩ　Ｊ３差した。 べｌ・り冊より寒天培地を除去し、べ！−り皿の底に残
った細胞表ｍＩに滅菌したナイ口ンメンブレンを即λつ
け【”ウィルス１ノークおよび細１泡を移した。２％ス
ｔムミルクを含むｌｅｎｓ（リン酸緩衝生ｉ［１ａ水）
　ｒ　３　０　ｆ）　ｌｆｆｌ処ｉ１！Ｌ，／’，１６
，１次抗体トして抗Ｎｌ）Ｖ・ニワトリ抗体を室温で１
旧間反応ざｔ！た。反応後、ｐ　［Ｉ　Ｓ　１１’洗浄
し、２次抗体としてピチオン化抗ニワトリ１０Ｇ抗体を
室温で１時間反応さｔ！た。反応後、Ｐ　Ｂ　Ｓ　′Ｃ
：洗ｒｅ　ｖ，、小−スフデイツシ］パー；４　＝１シ
ダ−１！結合７じジン・ビオブン複合物を室温（・３０
分間反応きぜた。反応後、０　．　０　！．ｉ％４−ク
ｌ：１　ｎ−１−−Ｊ−　）　ト−　ル、０．３％Ｈ２
０２を含む８ｍ旧一リスｆｌａ　ＦＩ１２１１　＆　Ｗ
ｈＣ　ＤＩ＋８　．　０　）で発色させた。』ス土のＭ
−素抗体法でブ−丁ツクし、騨１み換え７ビボックスウ
ィノレスがＮ　Ｄ　Ｖの１タンパク質生産能を持つこと
を確１ｘシた。 実施例９　組み換えウィルスの免疫効果と感染訪御能 釦み換えウイルスを１５０ｒＪ２のフラスコ５枚に１８
養したＣ　Ｅ　Ｆで３７℃４８時間培条した。 Ｃ　Ｆ　Ｆ　Ｌ１２　［ｉｉＩ　Ｘ　［，融解の後、細
１ａ浮遊液を集め、２．　０００１″ｌ）Ｉｎ　′ｃ−
１　５分＋５１遠心し、１−清を採集した。十清１３０
ａｆ！に２０％グルタミン酸Ｊトリウム液を４０１１　
０％サツカ目一ス液３０一とを加え、２ＭＩづつ分注し
た。凍結乾燥は１．５時聞の予備凍結の後、減１１下で
３０時間行なった。乾燥ワクブ−ン１バイアノレを３０
％グリヒリン１１μ！ＥＩ甲ａ塩水１０ｄに溶解し、穿
刺用針で１羽あたり０．０１ａｅを７８齢ＳＰＦ餡の右
側賓膜に接秤した。接トは後′Ｒ痘状態を観察し、ニュ
ーカッスル病（Ｎｌ）Ｖ）１７）赤血球凝１抑＆ｌＪ（
Ｊ，（−Ｆ、Ｈ　Ｉ　．’：称リ）抗体を測定したのり
、強毒鶏痘ウイルス西ケ原株と涛粂ＮＤＶ４ｋ藤株を攻
撃しワクＩンの免疫効宋を測定した。 二７Ｌ一カツスル病の（−ＩＩ反ゐは被検血清の２侶段
階希釈？ｌｌＩ２５μｌに、４ｈ血球凝集単位を含むＮ
　ｌ）　Ｖ抗原を？９闇加えて混和【ノ１０分間静置感
作漫、０．５％ｍ赤崩ＬＲ液５０μｌを加え室温に４５
分躍き、赤血球凝集を観察した。１−１１価は血球凝集
抑制が認められた血消の最高希釈倍数で表現した。 ワクヂンの効果は第２表に示す。本発明のワクチンを１
ｇ秤したニワ１・りは通常のｆノクヂンε同様の善！ｆ
Ｉ允ｋｉを認め、鶏１ウィルス強７８株の攻撃に対し発
痒はしなかった（接秤３周間後）。史にニコ−一カツス
ル病に対する巾相抗休が−１−胃しＨ　Ｉ抗休ｉ．ｉ　
，１−デｒ　Ｌ／　％いにもかかわらず強悪Ｎ　Ｖ　Ｄ
の攻撃に対して’６　１　０　０％が耐過生存した（接
掃２′８間後）。 これらの結果から、木発明のワクＪンはｊｉｌＮと−Ｊ
一カツスル病とを同時に免疫ｉＵ　Ｉ岨Ｑ：ワクｆ−ン
であることが示ざれた。 第２表 ５羽のＩ６ｌ清をプールして測定した。 Ｆ　ｌ］Ｖ　　４−　：　３週ＩＷＩ後、発痘１！６Ｍ
Ｃ：３週間後、″Ｒ．痘を認めず Ｎｆ）Ｖ　　＋：２Ｅ間後、発痘を認めた：２週間後、
允痘を認めｆ

【図面の簡単な説明】

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）アビポツクスウイルスの増殖に非必須なゲノム領
   域にニユーカツスル病ウィルス由来の膜融合タンパク質
   をコードするｃＤＮＡの全部又は一部を組み込んだ組み
   換えアビポツクスウイルス。
2. （２）該ｃＤＮＡがプロモーターの支配下にある特許請
   求の範囲１項記載の組み換えアビポツクスウイルス。
3. （３）該ｃＤＮＡが第３図のアミノ酸配列またはそれと
   実質的に同一機能を有するポリペプチドをコードするも
   のである特許請求の範囲第１項または第２項記載の組み
   換えアビポツクスウイルス。
4. （４）該ｃＤＮＡが第３図の塩基配列またはそれと実質
   的に同一の機能を持つ塩基配列を有するものである特許
   請求の範囲第１項または第２項記載の組み換えアビポツ
   クスウイルス。
5. （５）特許請求の範囲第１項、第２項、第３項または第
   ４項記載の組み換えアビポツクスウイルスから成る鶏用
   ワクチン。
6. （６）特許請求の範囲第１項または第２項記載の組み換
   えアビポツクスウイルスから成る、鶏にフアウルボツク
   スウイルス及びニューカツスル病ウィルスに対する免疫
   を与える鶏用ワクチン。