JPH0324005A - バシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イスラエレンシス遺伝子生成物の新規な殺線虫用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明はバシラス・スリンギエンシス・バラエティ・イ
スラエレンシス遺伝子生成物の新規な殺線虫使用に間す
る． ［従来の技術］ 細菌バシラス・スリンギエンシスは微生物による昆虫防
除に広く用いられている．この細菌は、種々の昆虫に毒
性のあるデルタエンドトキシンと指定されるタンパク性
バラ胞子又は結晶を生産する．Ｗｉ取後、エンドトキシ
ンは腸ブロテアーゼによりブロトキシン型から活性毒素
型へ加工される．活性毒素は、腸上皮繍胞膜を破壊し、
イオン不均衡と細胞溶解を生ずる［ノウルズ・ビー・エ
ッチ（Ｋｎｏｗｌｅｓ，　　Ｂ．Ｈ．）ら、（１９８４
年）Ｆｅｂｓ　　１６８巻１　９　７　−　２　０２頁
；マッカーシー・ダアリ：１−（ＭｃＣａｒｔｈｙ，　
Ｗ．）ら、（１９８８年）　　Ｉｎ　Ｖｉｔｒｏ　Ｃｅ
ｌ１、　　Ｄｅｖｅ！ｏｐ．　　Ｂｉｏ１、２４巻５９
一６４頁Ｌ バシラス・スリンギエンシス●デルタエンドトキシンの
活性は、双翅目（Ｑｉｐｔｅｒａ）昆虫を包含する．特
定的には、バシラス・スリンギエンシス・バラエティ◆
イスラエレンシスはアエデス（Ａｅｄｅｓ）属とクレッ
クス（Ｃｕｌｅｘ）属を含めた蚊幼虫に致死的である［
ゴールドバーグ●エル・ジエイ（Ｇｏｌｄ−ｂｅｒｇ．
Ｌ．Ｊ．）及びマーガリット●ジエイ（Ｍａｒ８ａｌｉ
ｔｔ，Ｊ．）（１９７７年）Ｍｏｓｑｕｉｔｏ　ｎｅｗ
ｓ　３７巻３５５−３５８頁］．バシラス・スリンギエ
ンシス・バラエティ・イスラエレンシスは３主要型を含
み、これらは殺蚊活性で相乗性を示すことがわかった［
イバラ・ジヱイ・イー（Ｉｂａｒｒａ，　Ｊ．ε．）及
びフエデリツチ・ビー・エイ（ＦＩ！ｄｅｒｉｃｉ．　
Ｂ．Ａ．）（１！１８６年）　Ｊ．　　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ１６５巻５２７・５３３頁；ウー・ディー（
Ｗｕ，　Ｄ．）及びテヤンｅエフ●エヌ（Ｃｈａｎｇ，
　Ｆ．Ｎ．）（１９８５年）Ｆｅｂｓｌ９０巻２３２−
２３６頁コ． 殺蚊活性のほか、バシラス・スリンギエンシス●バラエ
ティ◆イスラエレンシスの高結晶製剤は反すうＩＪＪ物
寄生性線虫のトリコストロンギルス・コルブリフオルミ
ス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ　ｃｃｌｕｂｒ
ｉ゜ｆｏｒｍｉｓ）に対して殺卵性かつ殺幼虫性である
ことがわかった［ボトジャー・ケイ・ビー（８ｏｔｔｊ
ｅｒ．　Ｋ．Ｐ．）及びボーン−ｘル−ダブリュー（Ｂ
ｏｎｅ．　Ｌ．Ｗ．）（１９８７年）Ｊ．　Ｎｅｍａｔ
ｏｌｏｇｙ　１９巻２８２−２８６頁コ。しかし、双短
目活性と殺線虫活性との頚１以性が示されなかったこと
に注目する必要がある．事実、ボーン・エル・ダブリュ
ーらの（１９８５年）Ｅｘｐ．　Ｐａｒａｓｉｔｏ１、
６０巻３１４−３２２頁は、バシラス・スリンギエンシ
ス◆バラエティ◆イスラエレンシスのデルタ●エンドト
キシンが殺線虫活性をもっていないと報告している．更
に、ボトジャー・ケイ・ビーら、（ｌ９８５年）εｘｐ
．　Ｐａｒａｓｉｔｏ１、　６０巻２３９−２４４頁の
研究で、バシラス◆スリンギエンシスの３０菌株の殺線
虫活性を調べ、その結果バシラス・スリンギエンシス・
バラエティ◆イスラエレンシスは１４位となっている． ［発明が解決しようとするｔ！！［１ 現在、感受性のあるホストに相当な被害をもたらす多く
の線虫類を防除するための、より有効な手段をもつ必要
性がある． 本発明は、縄虫カエノルハブジチス・エレガンスに刻し
て活性をもったバシラス・スリンギエンシスからｒｉｊ
導ざれた遺伝子生成物に間する．この遺伝子生戊物は、
以前に双翅目昆虫、例えば蚊に対してのみ活性をもつこ
とが示されていた．遺伝子は、菌株８０５６７として確
認されるＢ．スリンギエンシス・バラエティ・イスラエ
レンシス（Ｂ．ｔ．１、）微生物から誘導された． 更に詳しくは、本発明ぱ線虫類に活性のある約１３０キ
ロダルトン（ｋｄ）のタンパクをコードしたＤＮＡの使
用に間する．ｗＡ虫防除用Ｂ．ｔ．＋．毒素の処方と使
用法が明らかにされている． ［課題を解決する手段〕 〈表の解説） 第１表．Ｈロ５６７からクローン化された約３．４　ｋ
ｂのＥｃｏＲ　Ｉ−｝１ｉｎｄｍ断片のＤＮＡ配列“．
配列上の星印は５′ＥｃｏＲＩ及び３’　Ｈｉｎｄｍ断
片の限界を表わしている．第２表．第１表に示す約３．
４　ｋｂのＥｃｏＲＩ　−Ｈｉｎｄｍ断片によフてコー
ドされたＢ．ｔ．ｉ．毒素の推定アミノ酸配列．訃末端
開始メチオニンが附加された．第３表．第直，２表に示
すＤＮＡ及びアミノ酸配列を複合したもの． 本発明の毒素遺伝子給源に使用されるＢ．ｔ．ｉ．分離
体は、Ｂ．ｔ．ｉ．ｉｌ株８０５６７として確認される
．この培養基は７８５２０テキサス州ブラウンスビル、
私書箱ｌ０３３、合衆国農務省研究所、綿昆虫研究所の
ハワード−Ｔ−ダルメイジ（Ｈｏｗａｒｄ　Ｔ．　Ｄｕ
ｌｍａｇｅ）から人手できる．この培養基は、この技術
で闇知の標準的な手法及び培地を使用して生育させるこ
とができる，　Ｂ．ｔ．ｉ．ＩＩ胞はｍｍ手法、例えば
遠心分離によって取入れられる．回収されたＢ．ｔ．ｉ
Ｊｌ胞は次いで標準方法によって原形貢に転化される．
次に一ｒ＆ＤＮＡを闇知の手順によって抽出する．生ず
る精！！　ＤＮＡは、適当な制限酵素での消化用の出発
材料である． 次にＢ．ｔ．ｉ．のジーンバンクが構築される．本発明
では、上記のように得られた精ａ８．ｔ．　ｉ．ＤＮＡ
を制限酵素εｃｏＲ　Ｉと旧ｎｄＩＩＩで消化させる＊
ＥＣｏＲＩ及び旧ｎｄＩ［［断片を１ｌｌ製後、Ｅｃｏ
Ｒ　Ｉ及び｝Ｉｉｎｄｍで開裂させた闇知の人手可能な
ブラスミドｐｔＪｃｌ９へ再結合させる． ８．ｔ．ｉ．ＯＮＡのジーンバンクを構築後、ジーンバ
ンクを選定するために［ｌＮＡブローブを構築する必要
がある．この技術で知られた手順によってブロー７に標
識を付け、ハイブリッドを形成させる．最終的な結果は
、陽性クローン、すなわち構築されたブローブとハイブ
リッド形或させたクローンの検出である． 代表的な陽性クローンからＮ−離された組換えブラスミ
ドは、約３．４キロベース（ｋｂ）のεｃｏＲ　［　−
Ｈｉｎｄ［　ＯＮＡ断片をもつことがわかフた．この３
．４ｋｂ　［）ＨＡ断片は、標準的なサンガー・ジデオ
キシ連鎖終結法によって配列決定された。

大ＩＩＩＩＷ中のクローン化Ｂ．ｔ．ｉ．遺伝子の効率
的な発現を容易にするためには、ＥｃｏＲ　１位置に合
成オリゴヌクレオチドを挿入して、ＡＴＧ出発コドンを
回復させ、シャイン＝ダルガーノ領域を導入する必要が
あった． ＢＡ．ｉ−１ｊｊｌ線虫遺伝子を含有する！Ｉ抱ホスト
を、任意慣用の栄養培地で生育させると、ＤＮＡ構遺体
が提供する選択的な利点のため、縞胞の全部又は実貢的
に全部がＢ．　ｔ．　ｌ　．遺伝子を保持するように、
栄養培地が選択培地となる．これらの繍胞を慣用の方法
で取り入れる．その代わりに、細胞を取り入れる前に処
理することもできる， 本発明の新規な遺伝子生成物は、試験された線虫に対し
て活性を示す．一般にぜん虫病と記述される群の病スは
、ぜん虫として知られる寄生虫による動物ホストの感染
によるものである．ぜん虫病は豚、羊、馬、牛、やぎ、
犬、猫、及び家禽のような家畜で優勢かつ深刻な経済問
題となっている．ぜん虫の中でも、線虫として記述され
る群の虫がさまざまな勘物種に広範囲の、しばしば深刻
な感染を引き起こす．上述の動物に感染する線虫類の最
も一般的な属は、ヘモンクス、トリコストロンギルス、
オステルタギア、ネマトジルス、コウオペリア、アスカ
リス、ブノストマム、オソフアゴストマム、カベルチア
、トリクリス、ストロンギルス、トリコネマ、ジクチオ
カウルス、カビラリア、ヘテラキス、トキソカラ、アス
カリジア、オキシウリス、アンシロストーマ、ウンシナ
リア、トキサスカリス、カエノルハブジチス、パラスカ
リスである．これらのあるもの、例えばネマトジルス、
コウオペリア及びオソフアゴストマムは、主に腸管を攻
撃し、ジクチオカウルスのような他のものは肺に見い出
される．なおも他の寄生虫は池の身体組織や器官に所在
している． 本発明の１１素は、バーサフアレンクス、クリコネメラ
、ジチレンクス、グロベデラ、へりコチレンクス、ヘテ
ロデラ、メロジオギネ、プラチレンクス、ラドルフォル
ス、ロテリンクス又はチレンクスの鷹から選ばれる土壌
線虫類と植物寄生虫の防除用殺線虫剤として有用である
． その代わりに、幾つかの植物寄生性線虫類は強制寄生虫
であるため、殺線虫ｅ．ｔ．毒素をコードした遺伝子を
植物細胞へ組込むと、線虫耐性植物を生ずる．植物ｍ胞
の工作法は十分に確立されていル［ネスター・イー・ダ
プリ：ｚ　−　（Ｎｅｓｔｅｒ，　Ｅ．Ｗ．）、ゴード
ン◆エム●ビー（Ｇｏｒｄｏｎ．　Ｍ．Ｐ．）、アマジ
ノ◆アール・エム（Ａｍａｓｉｎｏ，　Ｒ．Ｍ．）、及
びヤノフスキー◆エム−ｚフ（Ｙａｎｏｆｓｋｙ．　Ｍ
．Ｆ．）（１９８４年）　Ａｎｎ．Ｒｅｖ．　Ｐｌａｎ
ｔ　Ｐｈｙｓｉｏ１、　３５巻３８７−３９９頁を参照
］．本発明のＢ．ｔ．ｉ．毒素は、カプセル剤、丸塊、
又は錠剤のような単位適量形式で、又は噛乳類の駆虫薬
として使用する時は、液体飲薬として経口投与できる．
飲薬は通常、ベントナイトのような墾濶剤や湿潤剤等の
助剤を伴った水中におけろ活性成分の溶液、懸＋ｉ液又
は分散剤である．概して、飲薬は消泡剤をも含有する．
欽薬処方剤は一般に活性成分約ｏ．ｏｏｔないし０．５
重量２を含有する．好ましい飲薬処方剤はｏ．ｏｉない
し０．１重量工を含有している．カプセル剤と丸塊は漏
粉、滑石、ステアリン酸マグネシウム又は燐酸二カルシ
ウムのような担体賦形剤と混和した活性成分を含めてな
る．乾燥固体適量形式の毒素化合物を．投与したい場合
は、活性成分の所望量を含有するカプセル剤、丸塊又は
錠剤が普通に使用される．これらの適量形式は、澱粉、
乳糖、滑石、ステアリン酸マグネシウム、植物ゴム等の
ような適当な微粉砕増量剤、充填剤、崩壊剤及び／又は
結合剤に活性成分を密接均一に混合することによって調
製されろ．適当な単位ａ量処方剤は、処置されろ宿主動
物のＩｆｆ、感染程度及びｆＩｇＩ、宿主重量のような
因子に応じて、抗寄生虫剤の全重量及び含有量が大幅に
変わる． 動物飼料経由で活性化合物を投与する時は、これを餌に
よく分散させるか、トップドレッシングとして使用する
か、又はペレ・ットの形にして、これをＩ！ｋ終飼料に
添加するか、又は任意に別個に摂取させる．その代わり
に、駆虫薬化合物を非経口的に、例えば反すう胃内、筋
肉内、ヌ簀内、又は皮下注射によって動物に投与でき、
その場合活性成分は液体担体賦形剤に溶解又は分散され
る．非経口投与には、活性成分を好ましくは落花生油、
綿実油等のような植物．油種の受け入れられる賦形剤と
適当に混和する．ゾルケタール、グリセロール、ホルマ
ルを使用する有機調製剤や水性非経口処方剤のような他
の非経口賦形剤も使用される．活性化合物は投与のため
非経口処方剤に溶解又は懸濁される．このような処方剤
は一般に０．００５ないし５重量２の活性化合物を含有
する．動物飼料の一戒分として毒素を投与するか、又は
飲み水に溶解又は懸濁させるかすると、活゛性化合物が
不活性担体又は増量剤中に密接に分散された組成物類が
提洪される．不活性担体とは、抗寄生虫剤と反応しない
もの、及び動物に安全に投与できるものを意味している
．飼料投与用担体が動物飼料の一成分である（又はあり
うる）ような担体であるのが好ましい． 適当な組成物は、活性成分を比較的多量に存在させた飼
料プレミックス又は補充物を包含し、これらは動物への
直接給餌に適したもの、又は飼料への直接添加又は中間
的な希釈又は配合段階後の添加に適したものである．こ
のような絹成物に適した典型的な担体又は増量剤は、例
えば蒸留酒製造業者の乾燥穀類、コーンミール、カンキ
ツ類穀粉、発酵残留物、粉砕かき殻、小麦くず、糖蜜ソ
リュブル、トウモロコシ穂軸粉、食用豆粉飼料、大豆か
す、粉砕石灰石等を包含する． 本発明の遺伝子生成物は欧州特許出！Ｉ１第０２００３
４４号で明らかにされた手順に従って、植物の植物領域
を占有し、そこで生存、繁殖できるような微生物中に導
入することができる．線虫を宿した動物が、このような
植物を摂取すると、線虫に活性のある毒素が動物ホスト
中で利用可能となり、線虫の出没を防除する． 遺伝子の安定な維持及び発現を可能とするような条件下
に、毒素発現するＢ．ｔ．ｉ．遺伝子を微生物ホストに
導入するには、広範囲の方法が利用できろ．毒素遺伝子
発現用の転写翻訳調姉信号とその調節制御下の毒素遺伝
子、及び組込みを行なうためのホスト生物内の配列と相
同のＤＮＡ配列、また組込みや安定な保持が起こるため
の、ホスト内で機能的な複製系などを含んだＤＮＡ構造
体を用意することができる． 転写開始信号はブロモータと転写開始出発位置を包含し
よう．ある場合には、毒素の調節的発現を提供して、毒
素の発現が環境への放出後にのみ生ずるようにするのが
望ましいこともある．これはオペレータ、又はアクチベ
ータやエンハンサに結合する領域、によって達成でき、
これらは微生物の物理的又は化学的環境の変化によって
誘発できる．例えば、温度感受性ｖ４！Ｉｆｆ領域を使
用すると、生物は毒素を発現せずに実ｗＪ富で生育でき
、環境へ放出されると発現が始まる．他の手法は、実験
富で毒素の発現を抑制する特定的な栄養培地を使用し、
一方環境中での栄養培地は毒素発現を可能とするものを
使用できる．＊訳間始には、リポソーム結合位置と間始
コドンが存在しよう．メッセンジャーＲＮＡの安定性を
強化する配列を使用すると共に、特に活性ブロモータを
使用してメッセンジャーの発現を強化するために種々の
操作を使用できる。開始及び翻訳終結領域は停止コドン
、終結領域、及び任意にボリアデニル化信号を包含しよ
う． 転写の方向、すなわちコーディング又はセンス配列の５
′から３′への方向で、構造体は転写調節領域（これが
ある場合）とブロモータ（制御領域はブロモータの５′
又は３′のいずれかにある）、リボゾーム結合位置、間
始コドン、間始コドンと同調する開放読取り枠をもった
構造遺伝子、停止コドン、ポリアデニル化信号配列（使
用する場合〉、及び終結領域を包含しよう．二本鎖とし
てのこの配列はそれ自１木微生物ホストの形質転換に使
用できるが、通常マーカーを含めたＤＮＡ配列を伴って
おり、この第二のＤＮＡ配列はホストへの［ｌＮＡ導入
中に毒素発現構造体に結合させることができる． マーカーとは、変更又は形質転換されたホストの選定を
行なうための構造遺伝子のことである．マーカーは通常
、選択的利点を提供するもので、例えば抗生物質や重金
属への耐性などの殺生物耐性や、栄養素要求ホストに原
栄養性を与える相補性を提供する．変更されたホストが
選定されるだけでなく、野外で競合的であるように、相
補性を使用するのが好ましい．構造体の開発に、またホ
ストの変更に、一つ以上のマーカーを使用できる．野外
で他の野性型微生物に対する競合的利点を提供すること
によって、生物を更に変更できる．例えば、金属キレー
ト剤、例えばシデロフォア類の発現用遺伝子を、毒素発
現用の構造遺伝子と一緒にホストへ導入できる．この方
法で、シデロフォアの強化された発現が毒素生産ホスト
に競合的利点を提供するため、ホストは野性型微生物と
効果的に競合し、環境中で安定した生態的地位を占める
ようになる． 機能的な複製系が存在しない場合、構造体はホスト内の
配列と相同な、少なくとも５０塩基対（ｂｐ）、好まし
くは約１００　ｂｐ，及び通常約ｔ，ｏｏｏ　ｂｐまで
の配列を包含しよう．こうして合法的な組換えの可能性
が強化されるため、遺伝子はホストへ組み込まれ、ホス
トによって安定に保持される．毒素遺伝子が相補性を提
供する遺伝子並びに競合的利点を提供する遺伝子に近接
しているのが望ましい．従って、毒素遺伝子が失われる
場合、生ずる生物は相補性遺伝子及び／又は競合的利点
を提供する遺伝子も失う可能性が強く、このため無傷の
構造体を保持している遺伝子と環境中で競合できなくな
る． ｍＷ、バクテリオファージ、シアノバクテリア、藻類、
カビ等のような広範囲の微生物ホストから多数の転写Ｆ
Ａ節領域が人手できる．種々の転写調節領域はｔｒｐ遺
伝子、Ｉａｃ遺伝子、ｇａｌ遺伝子、ラムダ左及び右ブ
ロモータ、Ｔａｃブロモータ、及びホスト中で！！Ｒ能
的な場合は毒素遺伝子と間連して天然に生ずるブロモー
タを包含する．例として合衆国特許第４　，　３３２　
，　８９８号、第４，３４２．８３２号、及び第４，３
５６，２７０％　ｌｔ　ＩＩ　’Ｉｌｌ　（７）　；−
　Ｊ：−　−　ｎ結領域は、普通は転写開始領域と関連
する終結領域か、又は異なる転写間始領域（二つの領域
がホスト内で適合的で機能的である限りにおいて）であ
りうる．安定なエビゾーム保持又は褪込みを所望する場
合は、ホスト中で機能的な複製系をもったプラスミドが
使用ざれよう．７１［製系は染色体、ホストや別のホス
ト内に通常存在するエビゾーム要素、又はホスト内で安
定なウイルスの複製系から誘導される．　ｐ８Ｒ３２２
、ｐＡｃＹｃ１８４、ＲＳＦＩＯＩＯ、ｐＲＯｌ６１４
等のような多数のブラスミドが人手できる．例として、
オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら、（１９８２年）　Ｊ，８ａ
ｃｔｅｒｉｏ１、　１５０巻６０６９頁、及びバグダサ
リアン（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ）ら、（１９８１年）
　Ｇｅｎｅ　１６巻２３７頁、並びに合衆国特許第４，
３５６　．　２７０号、３１Ｅ４，３６２．８１７号、
及び第４，３７１．６２５号を参照のこと． ８．ｔ．ｉ．遺伝子は開始領域の調節制御下にあるよう
に、転写翻訳間始領域と転写翻訳終結領域との間に導入
できろ．この構造体はプラスミドに含有され、プラスミ
ドは少なくとも一つの複製系を包含するが、一つ以上を
包含でき、その場合一つの＊ａ系はプラスミドの開発中
にクローニング用に使用され、第二の複製系は最終ホス
トでの機能発揮に必要である．更に、すでに述べた一つ
以上のマーカーが存在できる．組込みを望む場合は、プ
ラスミドはホストゲノムと相同の配列を含むのが望まし
い． 形質転換体は、通常、未変更生物や運搬生物が存在する
時は、それらに対して所望生物を選定できるように、慣
用の方法に従って選定手法を使用して単離できる．次に
形質転換体を殺虫活性のために試験できる． 以下は本発明実施の最善の態様を含めた手順を例示した
実施例である．これらの実施例は限定的に労えられては
ならない．池に注意がなければ、百分率はすべて重量、
溶媒混合物割合はすべて容量による． 実８Ｉ！例Ｉ　　Ｂ．ｔ．ｉ．Ｉｆｆ株｝１０５８７の
培養Ｂ．ｔ．ｉ．ＥＩ株Ｈ［ｌ５８７の二次培養基又は
出発培養基を使用して、しＢ培地として知られる次の培
地に接種する． トリブトン　　　　　　ｔｏ　ｇ 酵母エキス　　　　　　５ｇ Ｎｌ（１　　　　　　　　　　５　ｇ ５Ｎ　ＮａＯＨ　　　　　　　　０．６　ｍｌ水　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１０００．０　　＋ｓ
ｌ標準的な微生物手法として、上の培地は接種に先立っ
て滅菌され、接種は無菌手順を用いて行なわれる． 詳繍な手順は以下のとおりである． 無菌のＰＩ＋ｌＹＥ培地（水１リットル中ペブトン５Ｌ
　酵母エキス０．１２、Ｍａｉｌ　０．５ｔ：　ｐ８　
７．５に調整〉を含有する一連の１５０履１エレンマイ
ヤーフラスコに、Ｂ．ｔ．ｉ．Ｍ　＊　ＨＯ５６７のベ
トリ皿培養基から接種する．フラスコを回転振どう機（
２００　ｒｐｍ）上で一夜３０℃で培養する．この出発
培養基から、７．５　１Ｉｌｌを用いて、２リットルフ
ラスコ内のＬＢプロス３００　ｍｌに接種する．　ＬＢ
プロスフラヌコを出発培養基と同じ条件下に培養するが
、数時間後に取り入れる．６００ｎ＋ｍでの光学瀾度は
１．０である． 上の手順は、この技術で周知の手順によって大発酵容器
に容易に規模拡大できる． 上の発酵で得られるｅ．ｔ．＋．ｍ胞は、この技術で闇
知の手順によって単離できる．しばしば用いられる手順
は、取り入れられた発酵プロスを分離技術、例えば遠心
分趨にかけることである．実施例２　新規なＢ．ｔ．　
ｉ　．遺伝子のクローニング実施例ｌで得られる収！ｉ
Ｂ．ｔ．ｉ．！Ｉ胞は、次のように原形質に転化された
． １０ｍＭ｝リス（ｐｔ＋　８．０）、ｌ　ｍＭエチレン
ジアミン四酢酸（ε［）ＴＡ）、１００　１ｇＭ　Ｎａ
（ｌ、２０％（ｗ／ｖ）庶糖及び５０直ｇ／ｍｌリゾチ
ームからなる１０　ｍｌ中で繍胞を約２時間ｔｉｌｔ，
．た．次に８Ｂｖ／ｖ）ドデシルｆｉｔ酸ナトリウム（
５０５）２０　ｍｌを添加した．混合物を、透明になる
まで（約ｌＯ分間）６８℃に加熱した．次に５Ｍ　Ｎａ
ＣＩ３　ｍｌ４注意ぶかく混合し、混合物を４℃で一夜
放置した．これを３９．０００　ｘｇで２０分間遠心分
離した．全繍胞０８４を含有する上澄み分画をフエノー
ルークロロホルムで２回抽出し、エタノールで沈殴させ
、標準方法を用いる塩化セシウム密度勾配遠心分社で抽
出した． この精１！　ＤＮＡの適当ｔ　（１００−２００μｇ）
を制限酵素ＥｃｏＲ　ＩとＨｉｎｄｍで消化させ、次に
０．８ｚアガロースゲル上の電気泳動によって分画した
．ゲルの３．４−３．５　ｋｂｆｌ域をＤＮＡ回収用に
選択した．　ＨＤ５６７　ＤＮＡのこのＥｃｏＲ　Ｉ及
びＨｉｎｄｍ断片を適当なゲルスライスから電気溶離し
、精製した．次に、ＥｃｏＲ　Ｉ及びＨｉｎｄｍで閏裂
させて、アガロースゲルｔｔ気泳勤で同様に精製した周
知の入手可能なブラスミドｌ）ＵＣ１９の試料へ、これ
を再結合させ゛た．この組換え再結合混合物を用いて、
カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン●クロ
ーニング◆システムズ社から人手した大ｎＭＦＩＩ株８
８３を形質転換させて、１００μｇｌｍ　ｌアンビシリ
ン耐性にした．次に、ＨＤ５６７ＤＮＡの約３．４　ｋ
ｂ断片のシーンバンクを、特異的ハイブリッド形成ブロ
ー７を用いることにより、殺蚊毒素タンパクをコードし
た所望遺伝子について選定した． ハイブリッド形成ブローブは、アブライド・バイオシス
テムズ社（カリフォルニア州フォスターシティ）のＤＮ
Ａ合成機で合成ざれた．このブローブの配列は次のとお
りである． （５’　）ＣＣＣＡＣＣＴＧＣＡＧＧＡＴＣＴＧＴＣＴ
ＴＡＡＣＣＧＴＡＣＴＴＡＧＣＧＣＧＧＴＧＣＴＴＣＣ
Ｔ（３　’　）このオリゴヌクレオテドが合成されたら
、アブライド・バイオシステムズ社で記述された手順に
従って、合成カラムからこれを取り出し、標準手順に従
ってポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ〉によ
って精製した．この精製オリゴヌクレオチドに、ポリヌ
クレオチドキナーゼと［λ−３２Ｐ］ＡＴＰを用いて標
識を付し、精製し、遺伝子とのハイブリッド形成によっ
て所望遺伝子を運搬する組換えクローンの検出に使用し
た．関心のあるハイブリッド形成用クローンは、元来、
池の多くの集落と共にプレート上にあり、これを拾い上
げて低集落密度にプレートし、ハイブリッド形成一選定
手暉を繰り返して、他の集落を含まないまでに精製した
．この純粋なクローンを用いてブラスミドをつくると、
約３．４　ｋｂのεｃｏＲ　Ｉ　−｝１ｉｎｄｍ　ＤＮ
Ａ断片をもつことがわかった．絹換えブラスミドはｐｅ
ｔ　Ｉ　３．８２−５と指定される． この断片を標準サンガージデオキシ連鎖終結法によって
配列決定した．この遺伝子配列を第Ｉ、表に示す，　Ｂ
．ｔ．ｉ．毒素遺１云子のメチオニンｒＷＩ始コドンが
ＥｃｏＲ　Ｔ　・Ｈｉｎｄｍ　ＤＮＡ断片によってコー
ド化されないことを指摘しておきたい．　ＨＤ５８７で
ＥｃｏＲ　１位置からすぐ５゛側に間始コドンが存在す
ることは、８．ｔ．ｉ．毒素遺伝子のＮ一末端領域を包
含するＨＤ５６７からの約６５０　ｂｐのＣｌａＴ−Ｐ
ｓｔｌ断片をクローニングし、ＥｃｏＲ　Ｔ位置までの
Ｄ　Ｎ　Ａ’シークエンシングによって決定された． Ｂ．ｔ．ｉ．毒素遺伝子を含有するブラスミドｐｅＴＩ
　３，８２−５は、周知の標準手順を用いて、形質転換
ホスト微生物から除去できる．例えば大ｉ！薗菌株８８
３（ｐ８Ｔ　Ｉ　３，８２−５）ヲ透ＢＥ　ｍ　ＩＩ物
イソビ’）’Ｊ：／ｒａｖｉ度勾配手順にかけると、ｐ
８Ｔ　１　３，８２・５が回収される．大ＦＩＡＭＭ株
８８３（ｐ８Ｔ　Ｉ　３．８２−５）（７）　二次培養
基は、６１６０４合衆国イリノイ州ビオリア、ノースユ
ニバーシティ・ストリー｝　１８１５番地、北部研究セ
ンター　農業研究サービス特許培養基保存機間（　Ｎ　
Ｒ　Ｒ　Ｌ）の永久保存施設に１９８７年９月１７日に
寄託された．培養基は受託晴間により、呼出し番号ＮＲ
ＲＬ　８−１８２５２と指定された．寄託物は、これを
明らかにした特許の許可により、一般に入手可能とされ
る．また、本出願又はその子孫の対応特許出願が提出さ
れている国々の外国特許法で要求されるとおりに、寄託
物は人手可能とされる．しかし、寄託物が人手可能とさ
れるからといって、行政行為によって付与された特許権
を損わしめて本発明の実施する権利を構成するものでは
ないことを理解すべきである． 更に、本培養基寄託物は、ブタペスト微生物寄託条約の
規定に従って保存され、一般の人々に入手可能とされる
．すなわち、寄託物の試料提供に対する最も最近の請求
後少なくとも５年間、かつどんな場合も、寄託期日から
少なくとも３０年間か、又は培養基を開示して発行ざれ
ろ特許の権利行使可能な朋間中、これらの寄託物は、生
育可能で汚染されていない状態に筺つために必要なあら
ゆるｆｆ２慮をもって保存されろ．要求を受けた受託施
設が、寄託物の状態のために試料を供給できない場合に
は、寄託者は寄託物を補充する義務を認めるものである
．本培養基寄託物の一般への人手可能性に間するすべて
の制限は、これらを開示した特許の付与に際して永久に
取り除かれる．すでに明らかにざれたように、Ｂ．ｔ．
ｉ．！ｌ素遺伝子をコードしたヌクレオチド配列を第１
表に示す．推定アミノ酸配列を第２表に示す．　ＤＮＡ
とアミノ酸の配列を複合させたものを第３表に示す．こ
の技術で周知のように、タンパクのアミノ酸配列は、Ｄ
ＮＡのヌクレオチド配列によって決定される．遺伝暗号
の重剰性のため、すなわちタンパクをつくるのに使用さ
れるアミノ酸のほとんどに対して一つ以上の暗号化ヌク
レオチドトリブレット（コドン〉を使用できるため、一
つの特定アミノ酸に対して異なるヌクレオチド配列がコ
ードできる．このため、遺Ｉ２：＠号を次のように描く
ことができる． フエニルアラニン（Ｐｈｅ）　　　ＴＴＫロイシン（Ｌ
ｅｕ）　　　　　　　　ＸＴＹイソロイシン（Ｉｌｅ）
　　　　　ＡＴＭメチオニン（Ｎｅｔ）　　　　　　Ａ
ＴＧバリン（Ｖａｌ）　　　　　　　　　ＧＴＬセリン
（Ｓｅｒ）　　　　　　　　　ＱＲＳブロリン（Ｐｒｏ
）　　　　　　　　ＣＣＬスレオニン（Ｔｈｒ）　　　
　　　ＡＣＬアラニン（Ａｌａ）　　　　　　　　ＧＣ
Ｌチロシン（Ｔｙｒ）　　　　　　　ＴＡκヒスチジン
（Ｈｉｓ）　　　　　　　ＣＡＫグルタミン（Ｇｌｎ）
　　　　　　　ＣＡＪアスパラギン（Ａｓｎ）　　　　
　ＡＡκリジン（Ｌｙｓ）　　　　　　　　　ＡＡｊア
スパラギン酸（Ａｓｐ）　　　　ＧＡＫグルタミン酸（
Ｇｌｕ）　　　　　ＧＡＪシステイン（Ｃ！／Ｓ）　　
　　　　ＴＧＫトリブトファン（Ｔｒｐ）　　　　ＴＧ
Ｇアルギニン（Ａｒｇ）　　　　　　ＷＧＺグリシン（
Ｇｌｙ）　　　　　　　　ＧＧＬ終　結　１言　号　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ＴＡＪ
解読法：各三文字のデオキシヌクレオチドの三つ組は、
左側に５１末端、右側に３′末端をもつ伝令ＨＡのトリ
ヌクレオチドに対応する。本明細書に記載のＤＮＡはす
べて、ウラシルにはチミンを置き換えた、ｍＲＮＡの配
列に対応する配列の［）ＮＡ鎖のものである．文字はデ
オキシヌクレオチド配列を形成するプリン又はビリミジ
ン塩基を示す．Ａ＝アデニン Ｇ＝グアニン Ｃ＝シトシン Ｔ＝チミン ＹがＡまたはＣの場合は、Ｘ＝Ｔ又はＣ．ＹがＣまたは
Ｔの堝合は、Ｘ＝Ｃ　． ＸがＣの塙合は、Ｙ＝Ａ，　Ｇ．　Ｃ又はＴ．ＸがＴの
場合は、Ｙ＝Ａ又はＧ． ２がＡ又はＧの堝合は、υ＝Ｃ又はＡ．２がＣ又はＴの
場合は、Ｖ＝Ｃ． υがＣの場合は、Ｚ＝Ａ．　Ｇ．　ＣＭはＴ．ＶがＡの
場合は、Ｚ＝Ａ又はＧ． ＳがＡ，　Ｇ．　Ｃ又はＴの場合は、ＱＲ＝ＴＣ　．又
はその代わりにＳがＴ又はＣの場合は、ＱＲ＝ＡＧ．Ｊ
＝Ａ又はＧ κ：Ｔ又はＣ Ｌ＝Ａ，　　Ｔ，　　Ｃ又はＧ． 門＝Ａ，　　Ｃ又はＴ． 上記は、８．ｔ．毒素の新規なアミノ酸配列が、このタ
ンパクの同じアミノ酸配列をコードした同等なヌクレオ
チド配列によって調製できることを示す．従って、本発
明はこのような同等なヌクレオチド配列を包含する．更
に、アミノ酸配列の変更がタンパクの二次構造を変更し
ないならば、確認された構造及び機能のタンパクが、こ
のような変更によって構築できることが示された［カイ
ザー・イー・ティー（Ｋａｉ３ｅｒ，ε．Ｔ．）及びケ
ズディ・エフ・ジエイ（Ｋｅｚｄｙ．　Ｆ．Ｊ．）（１
９８４年）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２３巻２４９−２５５頁
］．このように、本発明はタンパクの二次横道を変更し
ないような本明細書に記載のアミノｉ＆配列の変異体、
又は構造が変更される場合、生物活性がある程度１！ｉ
！持されるような変異体を包含する． 実施例３　　Ｂ．ｔ．ｉ．毒素遺伝子の二次クａ−ニン
グと発現 ＨＤ５６７からの約１３０　ｋｄ　Ｂ．ｔ．ｉ．毒素遺
伝子のコード領域を含有する約３．４　ｋｂ　ＥｃｏＲ
Ｉ　−｝１ｉｎｄｍ断片を、ｔａｃブロモータ含有発現
ベクターｐｋｋ２２３−３（ファーマシア）のεｃｏＲ
Ｉ−Ｈｌｎｄｍ位置にクローン化した．Ａ丁Ｇ出発コド
ンを回復させ、シャイン＝ダルガーノ領域を導入するた
めに、３２−ｍａｒ合成オリゴヌクレオチド（Ａ）をε
ｃｏＲ　１位置に挿入した．生ずるブラスミＦ　ｐＭＹ
Ｃ−３８３ヲ大ｍ薗ＪＭＩＯＩＣ：導入すると、大膓菌
ＭＲ３８３が得られた．この′ブラスミド／ホストの組
み合わせによる８，ｔ．ｉ．毒素の発現は、ポリアクリ
ルアミドーＳＤＳゲル上のその確認によって確証される
． （Ａ）　　ＧＡＡＴＴＣＴＧＣＡ　ＧＴＡＡＧＧＡＧＧ
Ｔ　ＧＴＡＴＡＴＡＡＴＧ　ＡＡＥｃｏＲ　１位置に導
入された合成オリゴヌクレオチドで、シャイン＝．ダル
ガーノｆＩ域は下線で、また開始コドンは太線で示され
ている． 実施例４　大ｍＮ内バシラス●スリンギエンシス遺伝子
生成物クローンｐＭＹＣ・３８３のカエノルハブジチス
ーエレガンスに対する 活性 シンプキン（Ｓｉ−ｐｋｉｎ）及びコーノレズ（Ｃｏ　
ｌｅｓ）［Ｊ　．Ｃｈｅａｐ．　Ｔｅｃｈ．　Ｂｉｏｔ
ｅｃｈｎｏ１、　３１巻６６−６９頁、１９８１年］の
記述のとおりに、Ｓ一基本培地１　ｍｌ、アンビシリン
０．０５　ｍｇ，及びコレステロール０．０１　ｔａｇ
を含有するコーニング（ニューヨーク州コーニング、コ
ーニング・グラス◆ワークス）！！の２４穴組織培養基
プレートでＣ．エレガンスを培餐した．各穴とも、約１
０”細胞の大％ＩＮ菌株ＯＰ−５０（ウラシル栄養要求
株）をも含有した．それぞれ約１００−２００の線虫を
穴に接種し、２０℃で培養した．ブラスミドｐＭＹＣ−
３８３の遺伝子発現生成物を含有する大腸Ｗ菌株ＪＭＩ
ＯＩの１００μ１試科を、各穴につき細胞数１０”−１
０３｛Ｈの最終濃度範囲で連続希釈により添加した＊　
８．ｔ−ｉ、遺伝子なしの発現ベクター１００μ１試料
を同じ範囲で、他の穴に添加して対照として役立たせた
．すべての実験を二重に行ない、２度くり返した．各穴
を毎日検査し、その結果は次のとおりである． ±』二九山：（慧 ｌＯ容　　全線虫生存　　　生存線虫＜ｔＸ１０７　　
　全線虫生存　　　生存線虫＜ＬＸｔｏ”　　　全線虫
生存　　　生存線虫＜１１１０’　　　全線虫生存　　
　線虫５ｏｚ生存１０’　　　全線虫生存　　　全線虫
生存１０’　　　全線虫生存　　　全線虫生存１４４時
間後、線虫は対照、処置穴とも、ふ化を開始し、死亡率
については両群の間に有意の差はなかった． ｌＯａ　　　全線虫生存 ｔｏ７　　　全線虫生存 ｌＯ６　　　全線虫生存 ｔＯＳ　　　全線虫生存 １０ｍ　　　全線虫生存 １０３　　　全線虫生存 生存線虫なし 生存線虫なし 線虫５０！生存 先線虫生存 全線虫生存 全線虫生存 職龍市麺５む開 殖月誼ミ註開暮こ職 軍車車市考ぶ誼 孝Ｓ赳館車蕎茨社 財針董ぶ託職車 社關お邦社４ｂ 本１友お交劃鮎詩 １Ｅ１３職開車醋 紐關車５月む塁貧 ｅＭ本Ｉ茨む圓職 考ξ開番友誼井井 郭社郭龍紐車 財重亜誼職職 開路貼１（却月含Ｅ ３云車む■帥■ ８『烟工 ＜一　　ＣＪＬＩ ぺ：Ｉ　　　Ｅ４＋： 号！２，２ 誼旨ぢ巳 （！ｌ（！ｌ　　　ＣＪＱＩ ２二　〇上 ＬＩＬＩ　　　＜ｔｓ Ｉ星郭 む月　台ヨ ＩＩＩ８ト　　ロ０ ８た　で１ さ七　さぁ ベト　　ベ− ベΦ　　ベー ベー　　トの 短５醋 ロ昇　さシ Ｅ＠の　　Ｑ０ 郭龍 路財 む七　ｉ七 −ｕＩ１１８Ｅ−Ｉ ａｍ　　　ＣＪＬＪ りＩｌ＋８　　　ベト 井蕩耳柔Ｅ開會Ｅ社 市木已左社Ｅ，５　Ｃ左 財開本車そ左車 モ＝　已１ｉ”　．ｇ　　８た　８四　急エ朴柔ＥｇＳ
本市肘 車毒票蓬五一本 ８と　ｉ々暑Ｃ　閣這　ｄ４　悶謡 漿昶ｊＥ車本關 車おおＵヨ職昶 車開交ｇｎＩ本 誼赳む車眠車 社隷市本路蓄茨 車ｊａ水本開職 基ま賀龍詩路本 』Ｅ車市紐純紐 １１　百讐　鱈ユ ０＞　　リベ　　ベＨ Ｍ２ｊｆｆ井 苔１車本 ２３ｄ４　覧這 お車本 ８対む上　８ｐ ＬｌＯ　　べｆ：４Ｅ−ＩＢ−１ 車財運ｉ Ｅ−ＩＱＩ　　Ｅ−１レ　　じｈ べψ　ＱΦ　Ｕ一 リベ　　＜の　　りの 罷財〈己 市市ジ２ 目３首市 号虞　其渭　２＝ ６鼠勾弁ロ上 トｌ−ＩＣ！ＪＩ１１：ヘト 卒！　ぎ〔ｄ一 勾２　号汐号３

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、バシラス・スリンギエンシス遺伝子生成物クローン
   ｐＭＹＣ−３８３で生産される毒素の線虫防除有効量に
   線虫を接触させることを含めてなる、線虫防除法。 ２、毒素遺伝子が、植物へ、又は植物の植物領域を占有
   し、そこで生存、増殖できる別の微生物へ遺伝的に組み
   込まれる、特許請求の範囲第１項による方法。 ３、該毒素が、バーサフアレンクス（Ｂｕｒｓａｐｈａ
   −ｌｅｎｃｈｕｓ）、クリコネメラ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍ
   ｅｌｌａ）、ジチレンクス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）
   、グロベデラ（Ｇｌｏｂｅｄｅｒａ）、ヘリコチレンク
   ス（Ｈｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）、ヘテロデラ（
   Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ）、メロジオギネ（Ｍｅｌｏｄｉ
   ｏｇｙｎｅ）、プラチレンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈ
   ｕｓ）、ラドルフォルス（Ｒａｄｏｌｐｈｏｌｕｓ）、
   ロテリンクス（Ｒｏｔｅｌｙｎｃｈｕｓ）又はチレンク
   ス（Ｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の属の線虫に対して活性をも
   っている、特許請求の範囲第２項による方法。 ４、バシラス・スリンギエンシス遺伝子生成物クローン
   ｐＭＹＣ−３８３から得られるバシラス・スリンギエン
   シス遺伝子生成物を含有する植物。 ５、線虫がヘモンクス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓ）、トリ
   コストロンギルス（Ｔｒｉｃｈｏｓｔｒｏｎｇｉｌｕｓ
   ）、オステルタギア（Ｏｓｔｅｒｔａｇｉａ）、ネマト
   ジルス（Ｎｅｍａｔｏｄｉｒｕｓ）、コウオペリア（Ｃ
   ｏｏｐｅｒｉａ）、アスカリス（Ａｓｃａｒｉｓ）、ブ
   ノストマム（Ｂｕｎｏｓｔｏｍｕｍ）、オソフアゴスト
   マム（０ｅｓｏｐｈａｇｏｓｔｏｍｕｍ）、カベルチア
   （Ｃｈａｂｅｒｔｉａ）、トリクリス（Ｔｒｉｃｈｕｒ
   ｉｓ）、ストロンギルス（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ）、ト
   リコネマ（Ｔｒｉｃｈｏｎｅｍａ）、ジクチオカウルス
   （Ｄｉｃｔｙｏｃａｕｌｕｓ）、カビラリア（Ｃａｐｉ
   ｌｌａｒｉａ）、ヘテラキス（Ｈｅｔｅｒａｋｉｓ）、
   トキソカラ（Ｔｏｘｏｃａｒａ）、アスカリジア（Ａｓ
   ｃａｒｉｄｉａ）、オキシウリス（Ｏｘｙｕｒｉｓ）、
   アンシロストーマ（Ａｎｃｙｌｏｓｔｏｍａ）、ウンシ
   ナリア（Ｕｎｃｉｎａｒｉａ）、トキサスカリス（Ｔｏ
   ｘａｓｃａｒｉｓ）、カエノルハブジチス（Ｃａｅｎｏ
   ｒｈａｂｄｉｔｉｓ）、パラスカリス（Ｐａｒａｓｃａ
   ｒｉｓ）、バーサフアレンクス（Ｂｕｒｓａｐｈａｌｅ
   ｎｃｈｕｓ）、クリコネメラ（Ｃｒｉｃｏｎｅｍｅｌｌ
   ａ）、ジチレンクス（Ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）、グロ
   ベデラ（Ｇｌｏｂｅｄｅｒａ）、ヘリコチレンクス（Ｈ
   ｅｌｉｃｏｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）、ヘテロデラ（Ｈｅｔ
   ｅｒｏｄｅｒａ）、メロジオギネ（Ｍｅｌｏｄｉｏｇｙ
   ｎｅ）、プラチレンクス（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）
   、ラドルフォルス（Ｒａｄｏｌｐｈｏｌｕｓ）、ロテリ
   ンクス（Ｒｏｔｅｌｙｎｃｈｕｓ）、又はチレンクス（
   Ｔｙｌｅｎｃｈｕｓ）の属から選ばれる、特許請求の範
   囲第１項による方法。 ６、線虫が、カエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅ
   ｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓｅｌｅｇａｎｓ）又はハエモン
   クス・コントルツス（Ｈａｅｍｏｎｃｈｕｓｃｏｎｔｏ
   ｒｔｕｓ）である、特許請求の範囲第５項による方法。 ７、線虫の寄生している動物宿主に対して、バシラス・
   スリンギエンシス遺伝子生成物クローンｐＭＹＣ−３８
   ３の線虫防除有効量を投与することを含めてなる、該動
   物宿主の処置法。 ８、線虫がヘモンクス、トリコストロンギルス、オステ
   ルタギア、ネマトジルス、コウオペリア、アスカリス、
   ブノストマム、オソフアゴストマム、カベルチア、トリ
   クリス、ストロンギルス、トリコネマ、ジクチオカウル
   ス、カビラリア、ヘテラキス、トキソカラ、アスカリジ
   ア、オキシウリス、アンシロストーマ、ウンシナリア、
   トキサスカリス、カエノルハプジテス、及びパラスカリ
   スの属から選ばれる、特許請求の範囲第７項による方法
   。 ９、毒素遺伝子が植物へ、又は植物の植物領域を占有し
   、そこで生存、増殖できる別の微生物へ遺伝的に組み込
   まれる、特許請求の範囲第７項による方法。