CN108018215B

CN108018215B - 具有杀伤昆虫功能的基因及其在昆虫防治中的应用

Info

Publication number: CN108018215B
Application number: CN201610970429.2A
Authority: CN
Inventors: 袁弋; 黄武仁; 凌尔军; 吴凯
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2016-10-28
Filing date: 2016-10-28
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2036-10-28
Also published as: CN108018215A

Abstract

本发明涉及具有杀伤昆虫功能的基因及其在昆虫防治中的应用。本发明揭示了一种能够显著提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤能力的蛋白，即白僵菌分泌蛋白Gbj1。通过转基因育种，本发明将毒素基因导入白僵菌中，使其能高效过表达，从而提高该菌的毒力，实现了提高白僵菌防治有害昆虫效果的目的。

Description

具有杀伤昆虫功能的基因及其在昆虫防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明涉及一种对昆虫、特别是鳞翅目昆虫有杀虫效果的基因片段及其在昆虫防治上的应用。

背景技术

农业害虫是导致农作物减产或损失的主要因素，给农业造成重大的经济损失，甚至影响到当地人口的生存状况。为了对农业害虫进行有效的防治，人们通常使用广谱化学杀虫剂和生物杀虫剂，但两者在实际的应用中都存在局限性：化学杀虫剂会带来环境污染的问题，并导致抗药性昆虫的出现；而生物杀虫剂在环境中容易降解，在生产上需要重复施用，大大增加了生产成本。

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)是一种重要的害虫生防真菌，已被用于防治马尾松毛虫和玉米螟等重要害虫，取得良好的害虫持续控制效果。球孢白僵菌Beauveriabassiana属于子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、白僵菌属，是广谱性昆虫病原真菌，主要进行无性繁殖，产生分生孢子；可进行有性生殖并产生子实体，被鉴定为球孢虫草。在固体培养条件下，球孢白僵菌产生分生孢子。

球孢白僵菌是一种环境友好型的真菌杀虫剂，不仅可以应用于控制鳞翅目害虫，也可以应用于双翅目和同翅目害虫，如蚊子和蚜虫等的防治。但是，作为一种真菌杀虫剂，应用其进行防治时，一般还存在稳定性差，工业化生产难度大，防治效果低，对防治对象作用效果慢等局限性，这也是是微生物杀虫剂发展中有待解决的问题。此外，增强白僵菌的杀伤效力，也有助于缓解这些问题。

因此，在昆虫杀灭领域，还有必要研制以白僵菌为基础的、改进的昆虫杀灭制剂，以期获得环境友好、昆虫防治效果更为显著的昆虫杀灭产品，应用于现代化农业生产中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对昆虫、特别是鳞翅目昆虫有杀虫效果的基因片段及其在有害昆虫防治上的应用。

在本发明的第一方面，提供一种经改造的白僵菌(Beauveria)，该白僵菌中，白僵菌分泌蛋白Gbj1过表达或活性提高。

在一个优选例中，该经改造的白僵菌的基因组中，整合有外源的分泌蛋白Gbj1的编码基因。

在另一优选例中，所述的经改造的白僵菌，如下构建：将表达分泌蛋白Gbj1的过量表达分子(如表达载体)转入白僵菌中，从而上调白僵菌中分泌蛋白Gbj1的表达或活性。

在另一优选例中，所述的分泌蛋白Gbj1是SEQ ID NO:3所述氨基酸序列的多肽；或将SEQ ID NO:3所示氨基酸序列经过一个或多个(如1-15个；较佳地1-10个；更佳地1-5个，如3个、2个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽的功能的多肽；或SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽序列有90％以上同源性且具有SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽的功能的多肽。

在另一优选例中，所述的白僵菌分泌蛋白Gbj1的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2所示，或其简并的序列。

在另一优选例中，所述的白僵菌是球孢白僵菌。

在本发明的另一方面，提供一种提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤(或杀灭)能力的方法，其特征在于，所述方法包括：上调白僵菌分泌蛋白Gbj1的表达或活性。

在一个优选例中，所述方法包括：将表达分泌蛋白Gbj1的过量表达分子(如表达载体)转入白僵菌中，从而上调白僵菌中分泌蛋白Gbj1的表达或活性。

在另一优选例中，所述的有害昆虫包括(但不限于)：鳞翅目昆虫，双翅目昆虫或同翅目害虫。

在本发明的另一方面，提供一种白僵菌分泌蛋白Gbj1(是否可以这么命名)或其编码基因的用途，用于提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤(或杀灭)能力；或用于制备对于有害昆虫杀伤(或杀灭)能力提高的白僵菌。

在本发明的另一方面，提供一种用于杀伤有害昆虫的农药组合物，该农药组合物包括：

所述的经改造的白僵菌；和

农药学上可接受的载体或赋形剂。

在本发明的另一方面，提供一种杀伤(或杀灭)有害昆虫的方法，将所述的经改造的白僵菌、或所述的农药组合物施加于有害昆虫，或施加于被有害昆虫侵染的对象(如植物)。

在本发明的另一方面，提供一种提高植物的抵抗有害昆虫的能力的方法，所述方法包括：将白僵菌分泌蛋白Gbj1的编码基因转入植物中。

在一个优选例中，所述的方法包括：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有白僵菌分泌蛋白Gbj1的编码基因；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使白僵菌分泌蛋白Gbj1的编码基因转入植物细胞或组织或器官。

在另一优选例中，所述方法还包括：

(3)选择出转入了白僵菌分泌蛋白Gbj1的编码基因的植物细胞或组织或器官；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织或器官再生成植物。

本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

图1A、白僵菌分泌蛋白Gbj1的基因组DNA序列(SEQ ID NO:1)，其长度为452bp。

图1B、白僵菌分泌蛋白Gbj1的cDNA序列(SEQ ID NO:2)，其长度为390bp。

图1C、白僵菌分泌蛋白Gbj1的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，其长度为129aa。

具体实施方式

长期以来，本发明人一直致力于安全、有效的植物病原体防治生物制剂的开发。经过广泛的研究，揭示了一种能够显著提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤能力的蛋白，即白僵菌分泌蛋白Gbj1。

白僵菌在抵抗宿主免疫系统及获取宿主细胞营养的过程中离不开一类重要的物质——胞外分泌型蛋白。胞外分泌蛋白在病原微生物和昆虫宿主之间的相互作用过程中扮演着重要的角色，对于虫生致病真菌白僵菌来说，分泌蛋白的作用尤为重要。白僵菌细胞壁的形成、对宿主生理代谢的调控都需要借助分泌蛋白来完成。本发明通过对虫生真菌基因组学和比较转录组学的测序数据及研究结果进行分析，采用生物信息学的手段和方法对白僵菌胞外分泌型蛋白进行预测和鉴定，从而揭示了对白僵菌致病相关蛋白Gbj1，这种相关蛋白在通过生物技术手段进行过表达时，可显著提高白僵菌的毒力水平。

如本文所用，所述的“植物”没有特别的限制，只要所述“植物”是易于被植物病原体或有害昆虫(如鳞翅目昆虫)侵染的，如各种农作物、花卉植物、草本植物、木本植物、林业植物等。所述的植物比如可以是(不限于)：双子叶植物、单子叶植物、或裸子植物。更具体地，所述的植物包括(但不限于)：禾本科植物等。

如本文所用，所述的“有害昆虫”是指对白僵菌敏感、能被白僵菌杀伤或杀灭的任何病原体生物。例如但不限于：鳞翅目的昆虫，双翅目昆虫或同翅目害虫。

本发明中，所述的“白僵菌分泌蛋白Gbj1”具有SEQ ID NO:3所述的氨基酸序列。

本发明还包括Gbj1蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的Gbj1蛋白相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

任何一种Gbj1蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，Gbj1蛋白的生物活性片段的含义是指作为一种多肽，其仍然能保持全长的Gbj1蛋白的全部或部分功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50％的全长Gbj1蛋白的活性。在更优选的条件下，所述活性片段能够保持全长Gbj1蛋白的60％、70％、80％、90％、95％、99％、或100％的活性。

在本发明中，术语“Gbj1蛋白”指具有Gbj1蛋白活性的SEQ ID NO:3序列的多肽。该术语还包括具有与Gbj1蛋白相同功能的、SEQ ID NO:3序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：若干个(通常为1-50个，较佳地1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加或缺失一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括Gbj1蛋白的活性片段和活性衍生物。

多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与Gbj1蛋白DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗Gbj1蛋白的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他多肽，如包含Gbj1蛋白或其片段的融合蛋白。

本发明还提供了编码本发明Gbj1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸序列。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所示的编码区序列相同或者是简并的变异体(图1)。如本文所用，“简并的变异体”在本发明中是指编码具有SEQ ID NO:3的蛋白质，但与SEQ ID NO:1所示的编码区序列有差别的核酸序列。

编码SEQ ID NO:3的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码所述多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及上述多核苷酸的变异体，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的多肽的功能。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加有变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上，更好是95％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的多肽与SEQ ID NO:3所示的成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

应理解，虽然本发明的Gbj1基因优选获自白僵菌，但是获自其它生物的与白僵菌Gbj1基因高度同源(如具有80％以上，如85％、90％、95％、甚至98％序列相同性)的其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，例如BLAST。

本发明的Gbj1蛋白核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明中，Gbj1蛋白多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。术语“重组表达载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。

所述的Gbj1基因在农业上的应用方式包括但不限于：可将所述的Gbj1基因转录翻译成一种融合蛋白；或可将所述的Gbj1基因与植物启动子构建的多核苷酸组合物转入植物体内表达形成抗性植物；或可将所述的Gbj1基因与已知的杀虫真菌嵌合，增强其杀虫活性。

在本发明的优选实施例中，将所述的Gbj1基因转化入白僵菌中，从而提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤能力。将所述的Gbj1基因转化入白僵菌中可使用农杆菌转化的方法等。获得的转化子可以用常规方法培养，过表达Gbj1基因所编码的多肽。

本发明还提供了一种经改造的白僵菌(Beauveria)，该白僵菌中，白僵菌Gbj1过表达或活性提高。较佳地，该白僵菌的基因组中，整合有外源的Gbj1的编码基因。

本发明提供了所述的Gbj1蛋白的用途，用于提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤(或杀灭)能力。所述的有害昆虫例如但不限于鳞翅目害虫。

本发明还提供了一种农药组合物，其含有安全有效量(0.00005-10％(w/w))的本发明所述的Gbj1蛋白、或所述的宿主细胞或宿主细胞表达产物；以及农药学上可接受的载体或赋形剂。

本发明中，术语“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。

本发明中，“农药学上可接受的”的成分是适用于农业用途而对人或动物(除植物病原体或有害昆虫以外)、植物没有过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。

本发明中，“农药学上可接受的载体”是用于将本发明的经改造的白僵菌传送给植物病原体或有害昆虫的可接受的溶剂、悬浮剂或赋形剂。农药学上可接受的载体可以是液体或固体，较佳的是能够较高程度保持本发明的经改造的白僵菌的活力的载体。

所述农药组合物的剂型可以是多种多样的，包括但不限于：水溶液，悬浮剂，可湿粉剂，可乳化浓缩物，乳液，可喷洒溶液，水性分散系，粉剂，颗粒剂，或微胶囊。应理解，只要能够将本发明所述的经改造的白僵菌在保持全部或部分活力的前提下递送到有害昆虫(或带有有害昆虫的植物)上的剂型都是可取的。优选那些易于递送的剂型，例如，所述农药组合物是液体喷洒剂、或喷雾剂。

在本发明中，所述的辅剂是一种辅助成分，在组合物中起辅助调节功能，比如其可以是一种表面活性剂、附着助剂或其它类型助剂。例如蛋白稳定剂也可以作为一种辅剂。

浓缩型的农药组合物中，所述的经改造的白僵菌含量较高，而稀释型农药和实际使用的组合物中活性成分含量较低。此外，还可以包含其他合适的化学剂、增效剂、微量元素、稳定剂、粘合剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、渗透剂、溶剂、充填剂等常用组分。本发明农药组合物中还可以含有其它活性杀虫剂或杀微生物剂。

在制备农药组合物时，合适的固体稀释剂包括但不限于：硅藻土，玉米壳，磷酸三钙，软木粉，高岭土、膨润土或硅镁土等粘土，和水溶性聚合物。

此外，固体组合物还可以含有一种或多种相容性润湿剂，分散剂，乳化剂或色素，这些成分在固态时也可起稀释剂的作用。

这样的固体组合物可以是粉剂，颗粒剂或可湿粉剂的形式。通常通过研磨获得粉剂，通过造粒或压片获得颗粒剂、片剂或砖型剂。

液体组合物的形式可以是溶液，悬浮液和乳液，也可以将其包在天然或合成聚合物中，并可以包含润湿剂、分散剂或乳化剂。这样的乳液、悬浮液或溶液可用水性、有机或水-有机稀释剂来制备水溶性聚合物(以及上述稀释剂的混合物)。此外，所述稀释剂中可含有例如以上所述离子型或非离子型的润湿剂、分散剂或乳化剂或它们的混合物。

各种制剂的原理都是已知的，并在例如以下文献中有所描述：Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie"化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986；van Valkenburg，“农药剂型”，Marcel Dekker N.Y.,第2版，1972-73；K.Martens，“喷雾干燥手册”，第3版，G.Goodwin Ltd.London。

用于本发明组合物的所需的配制辅剂，(例如惰性物质，表面活性剂，溶剂和其他添加剂)，也是已知的，其描述例如：Watkins“杀虫粉剂稀释剂和载体手册”第2版，DarlandBooks,Caldwell N.J.；H.v.Olphen，“粘土胶体化学导引”第2版，J.Wiley&Sons,N.Y.,Marsden,“溶剂指南”第2版，Interscience,N.Y.1950；McCutcheon’s，“除垢剂和乳化剂年刊”，MC Publ.Corp.，Ridgewood N.J.；Sisley和Wood，“表面活性剂百科全书”，Chem.Publ.Co.Inc.，N.Y.1964；Schonfelt，“Grenzflachenaktive Athylenoxidaddukte”表面活性环氧乙烷加成产物，Wiss.Verlagsgesell.，Stuttgart 1976；Winnacker-Kuchler，“Chemische Technologie"化学技术，Vol.7，C.Hauser Verlag Munich，第4版，1986。

可湿粉剂可均匀分散于水。除活性物质之外，可湿粉剂还可包含润湿剂，分散剂，稀释剂等无环境公害的物质。粉剂的制备可以是：将活性物质与精细粉碎后的滑石、高岭土、膨润土之类天然粘土或硅藻土等固体物质一同研磨。颗粒剂的制备可以是用活性物质喷涂吸附于惰性物质颗粒，或将活性物质溶液通过粘合剂(例如聚乙烯醇、聚丙烯酸钠，或矿物油)施加于载体(例如砂、高岭土或惰性物质颗粒)表面。如果欲与化肥混合施用，则可将合适的活性物质象制备化肥颗粒那样制备成颗粒。

在本发明的一个优选方式中，所述的农药组合物是一种白僵菌细胞培养物或经加工细胞培养物(如细胞破碎上清液，其中包含另本发明的蛋白)。所述的农药组合物经验证具有良好的效果。

本发明还提供了一种杀灭有害昆虫的方法，包括将所述的经改造的白僵菌施加于有害昆虫或携带有害昆虫的对象(如植物)。

本发明还涉及一种提高植物抵抗有害昆虫能力的方法，该方法包括将编码本发明Gbj1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸转入植物中，从而使得所述植物具有更优良的抵抗有害昆虫的能力。

作为本发明的一种优选方式，将编码本发明Gbj1蛋白或其保守性变异多肽的多核苷酸转入植物中的方法如下：

(1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有Gbj1蛋白的DNA编码序列；

(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使该Gbj1蛋白DNA编码序列转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；

(3)选择出转入所述Gbj1蛋白DNA编码序列的植物细胞或组织；和

(4)将步骤(3)中的植物细胞或组织再生成植株。

其中，可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施此方法。

通过所述的提高植物抵抗有害昆虫能力的方法获得的转基因植物及其杂交后代也包括在本发明内。

本发明针对于白僵菌防治效果低，作用时间长，毒力比较小的特点，寻找出有实用价值的毒素基因进行克隆，最终找到了有效的基因。本发明解决了微生物杀虫剂在实际应用中的局限性。通过转基因育种，本发明将毒素基因导入白僵菌中，使其能高效过表达，从而提高该菌的毒力，实现了提高白僵菌防治有害昆虫效果的目的。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实验用菌株和质粒

实施例中，所用大肠杆菌为E.coli Top10。

实施例中，所用农杆菌为AGL-1，由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所提供。

球孢白僵菌菌株有野生型球孢白僵菌Beauveria bassiana ARSEF 2860：由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所提供。

实施例中，所用质粒载体有pDHt-bar(敲除)，pDHt-gpdA-ben(过表达质粒)。

pDHt-bar由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所提供。pDHt-bar为在pDHt/SK基础上，插入了bar(草铵膦)的抗性筛选基因。

pDHt-gpdA-ben由中国科学院上海生命科学院植物生理生态研究所提供。pDHt-gpdA-ben为在pDHt/SK基础上，插入了强启动子gpdA，并且，插入了ben(苯菌灵)的抗性筛选基因。

pDHt-Bar-KO的构建：以白僵菌基因组DNA为模板，PCR扩增目标基因上下游片段约1200bp大小的片段，上游臂：引物为BBA_01016-UF：5’-CCGCTCGAGGATGAAAAGGTTGCTAACACAGTCG-3’(SEQ ID NO:6)，BBA_01016-UR：5’CGCGGATCCACCAACTTCCAGATTTCT TTCCGAC-3’(SEQ ID NO:7)；下游臂：BBA_01016-DF：5’–GGACTAGTAGTAAGACAGACCGACAAGC-3’(SEQ IDNO:8)，BBA_01016-DR：5’CGAGCTCACTAAAGTAAGCCACAGTAAGC-3’(SEQ ID NO:9)，上游片段引入Xho I、BamH I酶切位点，下游片段引入Spe I、Sac I酶切位点。上下游片段均插入质粒pDHt/SK带筛选标记基因Bar(草铵膦抗性基因)的两边，插入连接方法参考分子克隆实验指南，重组的质粒命名为pDHt-Bar-KO。

实施例1、球孢白僵菌DNA提取及PCR扩增Gbj1

Gbj1基因组序列见SEQ ID NO:1，cDNA序列见SEQ ID NO:2，多肽序列见SEQ IDNO:3。

1、球孢白僵菌DNA提取

对球孢白僵菌菌株，采用常规的酚-氯仿方法进行提取。

2、PCR扩增

通过PCR扩增Gbj1的DNA序列。

模板：用上述提取的DNA为模板。

引物序列如下：

上游引物：

ATGCAGTTCACCGCGCTCTTCCTCT(SEQ ID NO:4)；

下游引物：

TCAAGACGTGCCTGAGCAGCCGACA(SEQ ID NO:5)。

PCR反应体系(50μL)：

PCR反应条件：

95℃预变性5min；

95℃30sec，55℃30sec，72℃1min，30个循环；

72℃10min。

4℃保存。

3、连接质粒

PCR产物纯化后测定DNA的浓度，按照适当的比例与T-Vector在含有连接酶的缓冲液中4℃过夜连接。

4、大肠杆菌转化

取出冻存于-80℃的Top10感受态细胞(100μL每管)，置于冰上解冻。加入10μL转化产物，轻轻混匀，置冰上30min。42℃热激90s，迅速置于冰上冷却3～5min。加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，37℃，150rpm振荡45-60min。将上述菌液8000rpm离心2min，弃上清。用100μL LB重悬菌体后涂布于含有抗生素的LB平板上。待菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37℃培养过夜。

挑取转化子，经常规PCR验证后，提取质粒。

实施例2、农杆菌的转化

目的质粒为pDHt-gpdA-ben-Gbj1，其构建方法为：将前述实施例1中获得的含有Gbj1的T-Vector进行酶切，切出Gbj1目的片段，插入到pDHt-gpdA-ben质粒的EcoR I/Not I酶切位点中。

将保存于-80℃的农杆菌感受态AGL-1取出，置于冰上融化。加0.5～1μg目的质粒于感受态中，轻轻混匀，冰浴30min。液氮速冻5min，37℃温育5min，立即冰浴2min。加入1mL液体YEB，28℃，150rpm培养3h。8000rpm离心2min，弃上清，收集菌体。用100μL液体YEB重悬菌体并均匀涂布在YEB平板上(含50μg/mL Carb和50μg/mL Kan)，28℃静置培养2天。

挑取转化子于4mL液体YEB(含50μg/mL Carb和50μg/mL Kan)中，28℃，220rpm培养过夜。PCR验证转化子是否为阳性，最后将阳性菌液保存于-80℃(含15％的甘油)。该阳性菌株为过表达菌株OE。

实施例3、白僵菌Gbj1高效表达菌的构建

1、球孢白僵菌分生孢子悬浮液的制备

从培养10天左右的PDA平板上刮取适量的真菌分生孢子加入无菌的含0.05％Tween-20液体中，充分混匀，并将孢子悬液稀释至10⁹conidia/mL浓度，水悬液一般现配现用。

2、菌株构建

取含有目的质粒的AGL-1农杆菌(菌液OD600达到0.5-0.8)，与制备好的野生型白僵菌分生孢子孢悬液等体积混合，充分混匀后涂布于IM固体平板上，28℃静置培养2天。与共培养的IM平板等体积的M-100培养基(1％Agar，噻孢霉素600μg/ml和400μg/ml草胺膦或苯菌灵)覆盖于IM平板上。25℃培养5～10天至抗性菌落出现。

挑取抗性菌落(白僵菌菌落)并转移到同样的抗性培养基平板上，进行第二次筛选。

从二筛平板上挑出抗性菌落(转化子)，抽提基因组进行PCR，并测序进行验证，正确整合入了外源的Gbj1的即为Gbj1高表达的菌株。

实施例4、白僵菌Gbj1基因敲除菌株KO的构建

通过AGL-1介导的白僵菌转化方法将pDHt-Bar-KO转入白僵菌，具体方法与过表达的操作类似。

实施例5、白僵菌Gbj1回补菌株Comp的构建

在得到KO敲除突变株后，将含有pDHt-gpda-Ben-Gbj1质粒的AGL-1转化KO突变株，从而实现补回基因的操作目的，获得回补菌株Comp。

实施例6、白僵菌菌株毒力测定

1、供试虫准备

挑选大小一致的五龄家蚕，记录每头的平均重量。

把供试虫放在冰上进行麻醉处理，分别采用浸泡法和注射法测定野生型白僵菌菌株和转化子白僵菌菌株的杀虫毒力。

2、测试方法

A.浸泡法

用家蚕幼虫(五龄起蚕)，白僵菌菌悬液配制浓度为1×10⁷conidia/mL，供试家蚕在白僵菌悬液里浸泡1min，每次处理30只虫，平行三个处理组，每隔12小时记录死亡虫数。

上述的白僵菌菌悬液分为：

Wt组：野生型白僵菌菌悬液；

Ko组：野生型白僵菌基础上，敲除了Gbj1基因的白僵菌的菌悬液；

Comp组：野生型白僵菌基础上，敲除了Gbj1基因、但又利用农杆菌转入Gbj1基因的回补菌株；

OE组：野生型白僵菌基础上，利用农杆菌转入Gbj1基因、从而过表达Gbj1的白僵菌；

同样的家蚕幼虫，浸泡于灭菌的溶解孢子的缓冲液，作为对照组 (Control)。

B.注射法

白僵菌菌悬液浓度为1×10⁶conidia/mL，使用微量注射器分别吸取供试的一系列药剂，家蚕置于冰上麻醉处理后，从家蚕的腹部侧方刺入其体壁内，然后往昆虫尾部方向插入，缓慢的注射定量药剂，停留3秒后，缓慢拔出注射器，供试昆虫再置于冰上5～10分钟，然后取出，按正常的方法进行饲养，每只试虫注射50μL，每次处理30只虫，平行三个处理组，每隔12小时记录死亡虫数。

上述的白僵菌菌悬液分为：

Wt组：野生型白僵菌菌悬液；

同样的家蚕幼虫，注射灭菌的溶解孢子的缓冲液，作为对照组(Control)。

3、数据统计与分析

根据调查数据，测定供试虫的重量变化或者校正死亡率。计算方法如下：

其中，P1为死亡率，K为死亡虫数，N为处理总虫数；

P2为校正死亡率，P1为处理死亡率，P0空白对照死亡率。

用SPSS(Ver.19.0)软件进行统计分析，计算各处理的致死中时间(LT50)LC50、LC95和95％置信限等值，评价供试药剂对靶标昆虫的毒性。

4、浸泡法毒力测定结果

浸泡法测定不同处理白僵菌的毒力效果的结果见表1。

表1

从表1的结果可以看出，在用浸泡法进行白僵菌菌株毒力测定时，从第3天的结果来看，基因敲除菌株KO处理的家蚕没有死亡，而使用本发明的序列进行过表达菌株OE毒力明显高于野生型菌株(WT)、回补菌株Comp也有一定的致病性。

接种孢子4天后，各处理的致病性均有所增强，其中使用本发明的序列进行过表达菌株OE的致死率最高，达到84.46％，而敲除了该序列的菌株致死率只有24.46％。

在第5天检查时，过表达菌株处理的家蚕死亡率已经达到100％，明显高于基因敲除菌株，也高于野生型菌株。从本实验可以看出，通过过表达Gbj1基因，可以提高菌株的致病性和速效性。

5、注射法毒力测定结果

注射法测定不同处理白僵菌的毒力效果的结果如表2。

表2

从表2中可以看出，过表达Gbj1基因的菌株，在接种当天就有一定的致死效果，在接种2天致死率就达到95.5％，而敲除该基因的菌株，接种2天死亡率才有31.1％，过表达菌株毒力显著高于基因敲除菌株，也显著高于野生型菌株(62.23％)。

因此，从注射法研究菌株毒力也表明，本发明的基因序列可以显著增加菌株的毒力水平。

实施例7、针对棉铃虫的白僵菌菌株毒力测定

1、供试虫准备

挑选大小一致的五龄棉铃虫，并记录每头的平均重量。

把供试棉铃虫放在冰上进行麻醉处理，采用注射法测定野生型白僵菌菌株和转化子白僵菌菌株的杀虫毒力。

2、测试方法

注射法：同家蚕注射方法。

3.实验结果

注射法测定不同处理白僵菌对棉铃虫的毒力效果的结果如表3。

表3

从表3中可以看出，过表达Gbj1基因的菌株，在接种1天就有一定的致死效果，在接种2天致死率就达到78.9％，而敲除该基因的菌株，接种2天死亡率才有11.1％，过表达菌株毒力显著高于基因敲除菌株，也显著高于野生型菌株(40.0％)。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 具有杀伤昆虫功能的基因及其在昆虫防治中的应用

<130> 166477

<160> 9

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 452

<212> DNA

<213> 球孢白僵菌

<400> 1

atgcagttca ccgcgctctt cctctccctc attgctgtcg ccagcgcggc tcccgccgag 60

ctcgtcagcc gtgccgccac cacctgcggc acagtctact acactgcgaa ccaggtcaac 120

gccgcatctc aggcagcttg caactacgtc aagagcggcg gcaccgctgg cagttccacc 180

taccctcaca agtacaacaa ctacgagggc ttcaacttcc ccgtcagcgg tccctactac 240

gagttcccca tcaagtctgg tggtgtctac actggcggtt tgtctccctc tctctaaagc 300

gccgatgacg attcagacca cagttctaat gtatcgcagg ctccccaggt gccgatcgtg 360

tcatcatcaa cgccgggtgc gcccaggctg gtgccatcac ccacaccggc gccagcggca 420

acaactttgt cggctgctca ggcacgtctt aa 452

<210> 2

<211> 390

<212> DNA

<213> 球孢白僵菌

<400> 2

atgcagttca ccgcgctctt cctctccctc attgctgtcg ccagcgcggc tcccgccgag 60

ctcgtcagcc gtgccgccac cacctgcggc acagtctact acactgcgaa ccaggtcaac 120

gccgcatctc aggcagcttg caactacgtc aagagcggcg gcaccgctgg cagttccacc 180

taccctcaca agtacaacaa ctacgagggc ttcaacttcc ccgtcagcgg tccctactac 240

gagttcccca tcaagtctgg tggtgtctac actggcggct ccccaggtgc cgatcgtgtc 300

atcatcaacg ccgggtgcgc ccaggctggt gccatcaccc acaccggcgc cagcggcaac 360

aactttgtcg gctgctcagg cacgtcttaa 390

<210> 3

<211> 129

<212> PRT

<213> 球孢白僵菌

<400> 3

Met Gln Phe Thr Ala Leu Phe Leu Ser Leu Ile Ala Val Ala Ser Ala

1 5 10 15

Ala Pro Ala Glu Leu Val Ser Arg Ala Ala Thr Thr Cys Gly Thr Val

20 25 30

Tyr Tyr Thr Ala Asn Gln Val Asn Ala Ala Ser Gln Ala Ala Cys Asn

35 40 45

Tyr Val Lys Ser Gly Gly Thr Ala Gly Ser Ser Thr Tyr Pro His Lys

50 55 60

Tyr Asn Asn Tyr Glu Gly Phe Asn Phe Pro Val Ser Gly Pro Tyr Tyr

65 70 75 80

Glu Phe Pro Ile Lys Ser Gly Gly Val Tyr Thr Gly Gly Ser Pro Gly

85 90 95

Ala Asp Arg Val Ile Ile Asn Ala Gly Cys Ala Gln Ala Gly Ala Ile

100 105 110

Thr His Thr Gly Ala Ser Gly Asn Asn Phe Val Gly Cys Ser Gly Thr

115 120 125

Ser

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 4

atgcagttca ccgcgctctt cctct 25

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 5

tcaagacgtg cctgagcagc cgaca 25

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 6

ccgctcgagg atgaaaaggt tgctaacaca gtcg 34

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 7

cgcggatcca ccaacttcca gatttctttc cgac 34

<210> 8

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 8

ggactagtag taagacagac cgacaagc 28

<210> 9

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> misc_feature

<223> 引物

<400> 9

cgagctcact aaagtaagcc acagtaagc 29

Claims

1.一种经改造的白僵菌，其特征在于，该白僵菌的基因组中整合有外源的分泌蛋白Gbj1的编码基因，其白僵菌分泌蛋白Gbj1过表达或活性提高；所述的白僵菌分泌蛋白Gbj1是SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。

2.如权利要求1所述的经改造的白僵菌，其特征在于，该白僵菌如下构建：将表达分泌蛋白Gbj1的过量表达分子转入白僵菌中，从而上调白僵菌中分泌蛋白Gbj1的表达或活性。

3.如权利要求1所述的经改造的白僵菌，其特征在于，所述的白僵菌分泌蛋白Gbj1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或其简并的序列。

4.如权利要求1所述的经改造的白僵菌，其特征在于，所述的白僵菌分泌蛋白Gbj1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，或其简并的序列。

5.如权利要求1所述的经改造的白僵菌，其特征在于，所述的白僵菌是球孢白僵菌。

6.一种提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤能力的方法，其特征在于，所述方法包括：上调白僵菌分泌蛋白Gbj1的表达或活性；所述的白僵菌分泌蛋白Gbj1是SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括：将表达分泌蛋白Gbj1的过量表达分子转入白僵菌中，从而上调白僵菌中分泌蛋白Gbj1的表达或活性。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的有害昆虫包括：鳞翅目昆虫，双翅目昆虫或同翅目害虫。

9.一种白僵菌分泌蛋白Gbj1或其编码基因的用途，用于提高白僵菌对于有害昆虫的杀伤能力；或用于制备对于有害昆虫杀伤能力提高的白僵菌；所述的白僵菌分泌蛋白Gbj1是SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的多肽。

10.一种用于杀伤有害昆虫的农药组合物，其特征在于，该农药组合物包括：

权利要求1-5任一所述的经改造的白僵菌；和

农药学上可接受的载体或赋形剂。

11.一种杀伤有害昆虫的方法，其特征在于，将权利要求1-5任一所述的经改造的白僵菌、或权利要求10所述的农药组合物施加于有害昆虫，或施加于被有害昆虫侵染的对象。