JPH03239961A - アレルギー診断法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 不発明はアレルギー疾患の診断法に関する。

（従来の技術） 従来、アレルギー疾患の診断では、抗原を用いた皮膚試
験や誘発試験でアレルゲンの確認及び診断が行なわれて
いた。しかし、この生体（ｉｎ　ｖｉｖｏ）試験では患
者に苦痛が伴なう点や、ショックを起こさせるなどの問
題があった。近年、免疫グロフＪンＥ　（ＩｇＥ）が即
時型アレルギー疾患に関与することが明らかＫなった。

そこで抗原に特異的な血清中のＩｇＥを測定することに
より、アレルギー疾患の診断および原因抗原の確認を試
験管内で試験する方法が開発され、ラジオアレルゴソル
ベント試験法（Ｒａｄｉｏ　　ａｌｌｅｒｇｏ　　５ｏ
ｒｂｅｎｔ　　ｔｅｓｔ　。

ＲＡＳＴ法）として広く用ハられている。ＲＡＳＴ法は
、固相アレルゲン（アレルゲンデスク）及び二次抗体と
して放射性ヨード標識抗ヒト■ｇＥ抗体を用いている。

しかしＲＡＳＴ法は放射免疫分析法（ＲＩＡ）であるた
め使用施設の制限やその廃棄物の取扱いに問題がある。

そこで、より安了、簡便かつ正確な診断法、即ち原因ア
レルゲンの見落しを極力抑え、しかも同時に多項目を測
定するシステムが開発されており。

これに、特表昭５８−５０１６３７号公報、特開昭６０
−８９７５３号公報、特開昭６１−８２１６５号公報、
特開昭６２−２２７７０号公報など洗開示されている。

これは、　　ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ　　ｌｉｎｋｅ
ｄｉｍｍｕｎｏｓｏｌｂｅｎｔ　　ａｓｓａｙ　）法に
基づくアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体のプロフィール試験
法であり、具体的には、米国のマストイムノシステムズ
（ＭＡｓＴ　　Ｉｍｍｕｎｏ　　Ｓｙｓｔｅｍｓ　）社
がマスト（ＭＡＳＴ）アレルギー診断法として開発して
いる。

（発明が解決しようとする課頂） マストアレルギー診断法は３６攬類のアレルゲンが共有
結合したセルローズ糸を装着したマストペットチャンバ
ー（専用反応容器）を使用して行なわれる。マストペッ
トチャンバー内には陽性対照糸と陰性対照糸とがあり、
血清検体中の陰性対照糸への反応量を非特異的反応量と
して差引くことで、試験結果の信頼性の評価を行なう工
夫がなされている。

ところが総じて高濃度総ＩｇＥ検体血清の測定の場合に
、＠性対照糸の値が異常に高い検体が多々見られる。従
来当該検体の分析結果の処理法としてはそのまま陰性対
照糸値を差し引いて各アレルゲン特異的ＩｇＥ量を算出
するか、或いは陰性対照糸値が一定値以上の場合には検
体を希釈して再検査する方法がとられている。前者の場
合は真の各アレルゲン特異的ＩｇＥ量を求められない危
険性がある。一方後者の場合には操作性の問題が残り。

いずれの場合でも本質的な問題の解決になっていない。

本発明はこのような問題を解決するものであり、非特異
的反応の除去により、正確な同時多項自アレルギー診断
を行なう方法を提供しようとするものである。

１課題を＠決するための手段） 本発明に、検体血清中の複数のアレルゲン特異的ＩｇＥ
抗体を同時に測定する方法において、複数の異なったア
レルゲンを結合した複数の支持体部支び陰性対照の支持
体部を含むアレルゲン支持体と、検体血清とを、非イオ
ン系界面活性剤の存在下に反応させ１次いで、該支持体
を取り出し、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体と反応性のあ
る標識化抗藻を含有する溶液と反応させ、再び該支持体
を取り出し、最後に該支持体上の標識化抗体の存在また
は童を測定する。各工程を含むことを特徴とするアレル
ギー診断法に関する。

非特異的反応を起こす物質即ち陰性対照に吸着し易い物
質の本体は不明で現在鋭意究明中であるが９本発明者ら
は同時多項目測定のアレルギー診断法に於いて非特異的
反応の発生を防ぐ手段を徨、ヤ検討した結果、非イオン
系界面活性剤の添加が。

顕著な効果があることを見い出した。

非イオン界面活性剤としては９％にポリオキシエチレン
−ｐ−ｔ−オクチルフェノールの化学構造を持つものが
効果が顕著であり好ましい。

具体的ＫＦｉ、　　）リドｙＸ　（Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ　
）シリーズ、イブパールＣＡ　（Ｉｇｅｐａｌ　　ＣＡ
　）シリーズ。

ノニデットＰ　４０　（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ４０　）な
どが特に顕著な効果があった。

非イオン系界面活性剤は、アレルゲン支持体と検体血清
の反応時に存在させれば、その添加方法に制限はなく１
例えば、検体血清に予め添加したり、支持体の洗浄液や
、希釈液等に添加しておいてもよい。これらの中でも予
め検体血清に添加する方法が効果が高く好ましく、その
場合検体血清に対して０．０１〜１．０％（重量／体積
）が最適である。また、これと同時に洗浄液や希釈液に
非イオン系界面活性剤を含有させておいてもよい。

洗浄液、希釈液としては、一般の免疫診断に使用するも
のを用いることができ１例えばライ−７２０（Ｔ’、ｖ
ｅｅｎ　２０　）　、　デオキンコール醗ナトリウム等
が用いられる。

次に本発明のアレルギー診断法を順次説明する。

まず、複数の異なったアレルゲンを結合した複数の支持
体部及び陰性対照の支持体部を含むアレルゲン支持体が
用意される。

該支持体としては、糸状９紙片状のセルロース類が好ま
しく９例えば特表昭５８−５０１６３７号公報及び特開
昭６０−８９７５３号公報に示されるように複数の糸よ
りなり、各県ごとに異なった種類のアレルゲンが固定さ
れ、それらの糸が一定の間隔を置かれて容器内に支持固
定された支持体や、長いセルロース紙片上に、互いにア
レルゲンのない領域によって分離された複数のアレルゲ
ンの帯又は島を形成することよりなる支持体等が使用さ
れる。

結合されるアレルゲンの種類や、固定化法に特に制限は
なく、固定化法としてはブロムシアン法や非特異吸着法
等の公知の方法が使用される。

アレルゲン支持坏ハ９次いで非イオン界面活性剤の存在
下に検体血清溶液と接触さぞ反応させる。

反応時間１、反応温度等は、検体血清中のアレルゲン特
異的ＩｇＥ抗体と、支持体上に固定されたアレルゲンが
充分に反応するよう適宜選択される。なお、検体血清は
希釈液等で希釈して使用して吃よい。

反応終了後、支持体を取り出し、洗浄液で残存する血清
等を充分に洗浄する。

次いで、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体と反応性のある標
識化抗体を含有する溶液に、前記支持体を接触させ、ア
レルゲン特異的ＩｇＥ抗体と標識化抗体を反応させる。

ここで標識化抗体とは、放射性同位元素による標識、酵
素による標識、螢光物質による標識等の方法で標識され
た抗体である。該抗体としては。

前記ＩｇＥ抗体と反応性の抗ＩｇＥ抗体であればよく、
これらは１例えばヒトのＩｇＥ抗体をヤギ、マウス、ウ
サギ等に免疫することにより製造される。

この標識化抗体と抗アレルゲンＩｇＥ抗体との反応の反
応温度１時間もまた。充分に反応が進行するように適宜
選択されればよい。

反応後、再度該支持体を取り出し充分に洗浄して未反応
の標識化抗体を除く。

そして、該支持体上でＩｇＥ抗体と反応し結合している
標識化抗体の存在または童を測定する。

測定方法は、標識の種類によシ異ｉす１例えばヨウ素１
２５（Ｉ”’）などの放射性同位元素で標識さｎている
場合にはガンマ−カウンターや、＠露用フィルムによる
分析が可能であり、＃素で標識されている場合には、基
質を加えて化学反応を生じさせ該酵素活性を不溶化した
発色生成物の色調べより測定したり、該化学反応が化学
発光の場合には曝露用フィルムやルミノメータを用いて
発光の強度を分析することが可能であり、また螢光標識
の場合には螢光計を用いて分析することが可能である。

該分析データにより、検体血清中のアレルゲン特異的Ｉ
ｇＥ抗体の種類、または種類及びその量を正罹に測定す
ることができ、その結果はアレルギー患者の診断に利用
できる。

（実施例） 本実施例は、マストイムノシステムズ社から市販されて
いるマストアレルギー診断システム（商品名：マストイ
ムノシステムズ）を使用して行すった。

該システムにおいては、第１図及び第２図に示すような
アレルゲン支持体固定容器１が使用される。該図に示さ
れるように、３６ａｌのアレルゲンが、固定されたセル
コース糸３が、はしご状例３６本配置され、その他、陽
性対照の１本のでルロース糸５及び陰性対照の１本のセ
ルロース糸６が、ポリスチレンカバースリップ２とポリ
スチレン製反応容器本体４の間に一定間隔で設置、固定
されている（以下、これを単に測定用チャンバーとする
）。

実施例１ ノニデットＰ４０（ポリオキシエチレンｐ−ｔ−オクチ
ルフェノール）のイオン交換水溶！（２，５重量％）を
調整し、検体血清的１．３−に対して。

最終濃度０．０５係（重量７休積）となるように１滴加
え、混合した。該検体血清を用いて以下に示すようにマ
ストイムノシステムズの操作手順に従って実施した。

まず、測定用チャンバーを検体血清で溝たし。

室温で２４時間インキュベートした。次いで検体血清を
排出し、チャンバー内を洗浄板（塩化ナトリウム、チメ
コサール及びトウエーン２０を含む０、２　Ｍ　！ｊ）
酸緩衝液）で３回洗浄し、酵素標識抗体溶液（ヤギ抗ヒ
トＩｇＥ抗体を西洋わさびパーオキシターゼで標識した
抗体を含むリン酸緩衝液）を充填し室温で４時間インキ
ュベートした。その後酵素標識抗体溶液を排出し、洗浄
液で３回洗浄した。次いで、ルミノール水溶液をチャン
バーに満たし９発光反応を測定するため、直ちに専用フ
ォトカセットへ装着し、専用インスタントフィルムを装
着して約１０分間露光した。その後６０秒間インスタン
トフィルムを現傷し、マストデンシトメーター（反射光
濃度測定計）にて各アレルゲンの発光強度を透過電圧と
して測定した。対照としてノニデツ）Ｐ４０無添加の同
一の検体血清でのマスト法を行ない（比較例）９両者を
比較検討７した。結果を第１表に示す。なお、第１表に
おいて冬アレルゲンの透過電圧は、陰性対照により子マ
ストクラスによる判定 ４（３，５Ｖより犬）・・・陽性（高）３（１，９〜３
．５ｖ　＞・・・陽性（中）２（０，６７〜１．９　Ｖ
　）・・・陽性（低〜中）１（０，１８〜０．６７　Ｖ
　）・・・擬陽性（低）−（０，０６〜０．１８　Ｖ　
）・・・疑場性（極めて低）０（０，０６Ｖ未、ＩＩ　
）・・・陰性（検出不可）第１表から明らかなように比
較例（界面活性剤無添加）の対照区では陰性対照糸での
非特異的々反応がみられる（透過電圧１．２７Ｖとごス
トクラλ スｔと同等であることを示している）が実施例１（界面
活性剤添加）では陰性対照奉での非特異的反応が認めら
れず（透過電圧０．３７　Ｖとマストクラス−）顕著な
添加効果が認められた。更に、比較例の無添加法では陰
性対照糸の非特異的反応のためブタ草類、ライムギ、オ
オムギ、大豆などのアレルゲン特異的ＩｇＥ陽性反応を
見落し、誤った診断をすることになる。

実施例２ 界面活性剤としてノニデノトＰ４０の代りにトリトンＸ
１００を使用した以外、実施ｇＡＪ　１と同様に比較検
討した結果、実施例１と同様洗、非特異的反応のみられ
ない優れた添加効果が得られた。

実施例３ 非イゴン系界面活性剤の添加！１度の影響を検討した。

同一の検体血清を用い、ノニデソトＰ４０の添加＃度を
０１０１％、Ｏ，ＯＳ％、０．１％、０．５％（重量／
体ｆｆ）の４レベルについて各２回ずつ実験した。まず
同じ添加！１度で得られた２回の各アレルゲンの透過電
圧のデータについて、１回目縦軸、２回目横軸とし念散
布図を作成し、相関係数、傾き及び切片を求めた。次に
異なった添加濃度同士での比較を行なうため、まず各濃
度における２回の測定データの平均値を出し、これらの
平均値を用いて、縦軸高濃度側、横軸低濃度側として、
前記と同様散布図を作成し、相関係数、傾き及び切片を
求めた。結果を第２表に示す。このデータから明らかな
ように０．０１〜０．５％の添加濃度においても頌著で
、安定な非特異的反応抑制の効果があった。

第　　　２　　　表 は、その分解図である。

符号の説明 １・・・アレルゲン支持体固定容器 ２・・・ポリスチレンカバースリップ ３・・・アレルゲン固定セルロース糸 ４・・・ポリスチレン製反応容器本坏 ５・・・両性対照セルロース糸 ６・・・陰性対照セルロース糸 （発明の効果） 本発明の方法によれば、同時に多項目を測定するアレル
ギー診断法において、非特異的反応が抑ｔ（１されるた
め、正確な診断を行なうことができる。

【図面の簡単な説明】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、検体血清中の複数のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を
   同時に測定する方法において、複数の異なつたアレルゲ
   ンを結合した複数の支持体部及び陰性対照の支持体部を
   含むアレルゲン支持体と、検体血清とを、非イオン系界
   面活性剤の存在下に反応させ、次いで、該支持体を取り
   出し、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体と反応性のある標識
   化抗体を含有する溶液と反応させ、再び該支持体を取り
   出し、最後に該支持体上の標識化抗体の存在または量を
   測定する、各工程を含むことを特徴とするアレルギー診
   断法。 ２、アレルゲン支持体がセルロース類である請求項１記
   載のアレルギー診断法。 ３、アレルゲン支持体が、複数の糸よりなり、各糸ごと
   に異なつたアレルゲンが被覆されるものである請求項１
   又は２記載のアレルギー診断法。 ４、非イオン系界面活性剤がポリオキシエチレンｐ−ｔ
   −オクチルフエノールの化学構造をもつものである請求
   項１、２又な３記載のアレルギー診断法。 ５、非イオン系界面活性剤を予め検体血清中に添加する
   請求項１〜４のいずれかに記載のアレルギー診断法。