JPH03215746A - 全血中の被検成分の定量方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、生物体液、例えは血漿又は血清中の被検成分
の定量用の乾式分析要素を用いて、全血中の被検成分の
濃度嬢又は活性値を定量分析する方法に間する。

［従来の技術］ 体液中、特に血液中の被検成分（７ナライト）の濃度又
は活性値を測定することは臨床医学上重要で、例えば、
疾患の診断や治療経過の追跡を行うのに利用されている
。最近は、その使用上の簡易性、迅速性、経済性から乾
式化学分析要素の使用が増大してきている．乾式化学分
析は、従来の溶液状の分析試薬を用いる湿式法による化
学分析と異なり、分析試薬を乾燥状態で導入した試験片
や多層分析要素を用いる化学分析である。乾式分析要素
は例えば、特公昭５３−２１６７７、特開昭５５−　１
６４３５６、特開昭６０−　２２２７６９等で知られて
いる。一例として、乾式多層分析要素は、透明支持体、
試薬層、展開層を有する構成である．透明支持体は、例
えば光透過性水不浸透性の薄い有機ボリマーシ一トであ
る。透明支持体の上に塗布された試薬層には、体液試料
中の被検成分と反応し、その被検成分の量に応した信号
の変化、例えば色素の発色による光学１度の変化、を示
す分析試薬が含まれる。展開層は、点着された体液試料
の量にほ；よ比例する面積Ｓこなるようにｈａ試料を一
様に広げろ。

乾式多層分析要素を用いて定量分析を行うには、体液試
料の適量を展開層の表面こ二点着（ａ下又はけ着）する
。展開層で一様に展開された体液試料は試薬層に達し、
そこで分析試薬と体液試料中の被検成分が反応して信号
の変化を与える。反応進行中、分析要素は一定の温度に
深たれる（インクヘーション）．適当な時間、反応を充
分に進行させた後で生じた信号の変化を読み取る。これ
は、信号が色素による発色の場合には、透明支持体側か
ら照射光を試薬層に照射し、特定波長で反射光量を測定
して発色の光学濃度を読み取る。読み取った信号の変化
は、予め求めておいた、信号の変化量と体液試料中の被
検成分の量との間係を示す検量線に基づいて被検成分の
量（濃度値又は活性値）に換算される（比色測定法）．
読み取る信号の変化は、液体試料を点着した一定時間後
の信号の絶対値でも、一定の時間における単位時間あた
りの変化量てもよい。

体液試料が血液である場合、従来提案された、あるいは
従来実用されている多くの乾式分析要素では、全血のを
そのまま試料とすることができず、分析前に血液から赤
血球を分離除去し血清又は血漿を得る操作（一般には、
遠心分離操作）を必要とし・た。乾式分析要業を使った
分析の特徴が簡易性、迅速性、経済性にあるにもかかわ
らず、分析操作前に、多くの労力と時間とＨａのコスト
を伴う赤血球の分離除去操作を必要とすることは、乾式
分析要素の有用性を半減させている。

乾式分析要素を用い、全血を試料として定量分析を行う
には、分析要素中で血液試料から赤血球に代表される血
球成分を河等かの手段又は反応で分離除去して血清又は
血漿を得ることと同時に、分離された赤血球の赤色の色
素が光学濃度の測定を妨害しないようにすることが要求
される。特公昭５３−　２１６７７には、血液中の血球
成分を分離除去するために分析要素中に濾過層を設ける
ことを開示している．しかし、分析要素中に設けられた
濾過層て全血から血球成分を分離除去して血清又は血漿
を得るには非常に時間がかかる。また、目的とする被検
成分の一部が濾過中に失われたり、濾過中に赤血球の溶
血が起り、分析が不正確になる恐れがある． 血液中の赤血球の分離除去と、それによって得られた血
漿中の被検成分の試薬層への拡散が速やかに行われる、
全血試料中の被検成分の定量分析に有用な乾式分析要素
が、特開昭６２−　１３８７５６で提案された．しかし
ながら、この分析要素では、血液試料の・＼マトクリッ
｝　ＩＩＩの大小によって、血漿中の目的とする被検成
分の濃度が同し血液試料でも分析結果に差が出て、やは
り正確な分析が行えないことが判明した。一方、特開昭
６４−　５４３５４では、測定のための照射光を遮断し
て赤血球の赤色の色素の影，響を回避するために、白色
の色料（ｐｉｇｍｅｎｔ）を含有させることが提案され
ている。分析要素中に赤血球の色素の影響を回避する遮
光層を設けるのは、正確な分析を行うためには有効であ
ると考えられる，しかしながら、色料によって遮光を調
整するには、製造の際に色料の粒径や分散状態のコント
ロールが必要となり、その分製造工程が複雑になり経費
もかかる．また遮光層を設けることて血球成分の分離が
充分に行えない場合や、それとは反対に分離した血ｇｌ
成分が充分に試薬層に供給されない場合があることが判
明した。

［発明が解決しようとする問題点］ 本発明の技術的課題は、乾式の多層分析要索を用いて、
全血試料中の血球成分の分離除去が速やかに行われ、し
かも分離した血球成分の有色色素によって分析が妨害ざ
れないような全血試料に含まれる被検成分の定量分析方
法を提供することてあり、それによって全血試料中の被
検成分の定量分析を、ヘマトクリット値に依存せずに迅
速かつ正確に行えるようにすることてある。

［問題点を解決するための手段］ 本発明の技術的課題は、 水不透過性光透過性支持体の上に、少なくとも全血中の
被検成分との反応の結果として検出可能な光学濃度変化
を与える呈色試薬層と全血から血球成分を分離除去して
前記試薬層に血漿を供給するための血球分離層とが、二
の順に積層されている多層分析要素を用いて比色測定法
により被検成分を定量する方法において、 ■血球分離層の最上層に全血試料を点着し、■前記血球
分離層により点着ざれた全血から分離ざれた血球成分の
有色色素の、前記支持体側から検出ざれろ反射光学１度
値が実質的に一定になった後に、 （■前記試薬層における反射光学濃度値又は単位時間当
りの反射光学濃度の変１ヒ量を前記支持体側から測定し
、 ■得られた反射光学濃度値又は単位時間当りの反射光学
濃度の変化量から全血中の被検成分の濃度値又は活性値
を比色測定法により求めることにより解決された。

［問題点を解決するための手段の詳細な説明］本発明の
定量分析方法に用いられる多層分析要素としては、全血
からの血球成分の分離除去が、全血中の被検成分との反
応の結果としての試薬層での光学濃度変化が検出され始
める前に完了し、分離された血球成分の有色色索の透明
支持体側から検出される反射光学濃度が一定になり、分
離ざれた血球成分の有色色素が光学的に透明支持体側か
ら充分に検出され得るものが好ましい。また多層分析要
素において試薬層と血球分離層は、液体の一様通過が妨
げられない程度に、部分的に配置された接着剤により接
着され一体化されている構成のものが好ましい． 本発明の方法に用いられる乾式の多層分析要素は、基本
的には、全血試料中の被検成分との反応により被検成分
の量に応じた信号の変化を示す部分（分析要素の下地）
と全血試料から血球成分を分離除去して血漿を分析要素
の下地に供給する部分（血球分離層）とから構成されて
いる． このうち分析要素の下地は、これまで知られている血清
・血漿試料用の乾式の一体型多層分析要素を用いること
ができる。すなわち、透明支持体の上に、呈色試薬層、
展開層がこの順に積層一体化されているものである．支
持体と呈色試薬層との間には検出層又は吸水層を設けて
もよい。多層分析要素の支持体以外の層で分析要素とし
ての形状と機能を保持てきる場合には、支持体は必須で
はない、あるいは要素の内部の呈色の光学濃度を測定す
る際に支持体が呈色試薬層（又は検出層又は吸水層）か
ら剥離できるように構成されていてもよい。

透明支持体は水不透過性であることが好ましい．その材
料として好ましいものはポリエチレンテレフタレート、
ビスフェノールＡのポリカルボネート、セルロースエス
テルｉ（例、セルローストリアセテート、セルロースア
セテートブチレート）である。これらの支持体は表面に
親水性を持たせ、呈色試薬層、吸水層、検出層等の親水
性ボリマーハインダーを含む層との接着を強固にするた
めに、物理化学的活性化処理（例、コロナ放電処理）、
下塗り層を設ける等の親水化処理が施されていることが
好ましい。

試薬組成物には、被検成分の存在下に光学的に検出し得
る物質、例えば色素（染料）を生成し得る組成物（呈色
試薬絹成物〉を含む。試薬組成物の例として、ロイコ色
業の酸化によって色素を生成する試薬鞘成物（例、米国
特許４　０８９　７４７等に記載のトリアリールイミダ
ゾールロイコ色素、特開昭５９−１９３３５２等に記載
のジアリールイミダゾールロイコ色業）、ジアゾニウム
塩、酸化された時にカブラーとのカップリングにより色
素を生成する色原体化合物を含む鞘成物（例、４−アミ
ノアンチピリン類と、フェノール類又はナフトール類と
の絹合せ）、還元型補酵索と電子伝達剤の存在下で色素
を生成することのできる化合物からなる絹成物等を用い
ることができろ。また、酵禦活性を測定する分析要素の
場合には、例えば、ｐ−ニトロフェノール、ｐ−ニトロ
フェニルホスフエートのような有色物質を遊離し得る自
己顕色性基質を含む組成物を用いることもてきる．これ
らの試薬組成物の内容は全血試料中の被検成分に対応さ
せて選択される。

試薬絹成物は全成分を一つの層に含ませてもよく、また
複数の層に分けて含ませてもよい．例えば、試薬絹成物
の一部又は全部を含む親水性ボリマー溶液を支持体の親
水処理が施された面上に塗布・乾燥し、試薬絹成物の一
部又は全部を含む、親水性ボリマーを結合剤とする、実
質的に一様な層とする方法がある。親水性ボリマーとし
ては、例えばゼラチンおよびこれらの誘導体く例、フタ
ル化セラチン）、セルロース誘導体く例、ヒドロキシブ
口ピルセルロース）、アガロース、　アクリルアミド重
合体、メタクリルアミド重合体、アクリルアミト又はメ
タアクリルアミドと各種ビニル性モノマーとの共重合体
等を用いることができる．親水性ボリマーを結合剤とす
る試薬絹成物の一部又は全部を含む一様な層の上に、試
薬絹成物を含まない多孔性層を特開昭５５−　１６４３
５６に記載のような方法で接着させた後、試薬組成物の
一部又は全部を含む溶液又は分散液を多孔性に塗布して
試薬組成物を含ませる方法も採ることができる。

多孔性層の接着・積層は、接着層を介して行フてもよい
．接着層は水て膨潤したときに多孔性層を接着すること
ができるような親水性ボリマー例えばゼラチン、ゼラチ
ン誘導体、ポリアクリルアミト等からなることが好まし
い。また、この接着層に試薬朝成物の一部を含ませるこ
とも可能である。

多孔性層は、分析要素の下地において、展開層としても
作用するので、液体計量作用を有する層であることが好
ましい。液体計量作用とは、展開層の表面に点状に点看
ざれ供給された液体試料を、その中に含有している成分
を実質的に遍在させることなく、面の方向に単位面積当
りほぼ一定の割合で一様に広げる作用である。本発明の
力法に用いられる多層分析要索においては、血球分離層
を通過してきた血漿成分を面の方向に単位面積あたりほ
ぼ一定の割合で広げる作用を意味する。

多孔性層としては、非繊維多孔性層、繊維質多孔性層の
いずれかを適用することができる。非繊維多孔性層とし
ては、特公昭５３−　２１６７７、米国特許３　９９２
　１５訳米国特許１　４２１　３４１等に記載のセルロ
ースエステル類（例、セルロースアセテート、セルロー
スアセテート／プチレート、硝酸セルロース）からなる
ブラッシュボリマーの層が好ましい。また、６−ナイロ
ン、６．６−ナイロン等のボリアミト、ポリエチレン、
ボリブロビレン等の微多孔性膜、特開昭６２−　２７０
０６に記載のボリスルホンからなる微多孔性膜も用いる
ことができる。

ｍａｔ質多孔性層を構成する材料としては、濾紙、不織
布、織物布地（例、平織布地）、編物布地（例、トリコ
ット編物布地）、ガラス繊維濾紙等を用いることができ
る。これらのうち、織物布地、編物布地が好ましい。織
物布地等は特間昭５７−　６６３５９に記載の物理化学
的処理（例、グロー放電処理）をしてもよい。

多孔性層には、展開面積、展開速度等を調整するため、
特開昭６０−　２２２７７０、特開昭６３−　２１９３
９７、特開昭６３−　１１２９９９、特開昭６２−　１
８２５６２に記載のような親水性高分子あるいは界面活
性剤を含有させてもよい。

従来の多層分析要素では、多孔性層に分散された二酸化
チタン、硫酸バリウム等の光反射性・光遮断性微粒子を
含有させるかあるいは光反射性・光遮断性微粒子を分散
含有するセラチン等の親水性ボリマーハインダー層を配
置することが行われるが、本発明の分析要素の下地には
必要がない。

多層分析要素の下地は、血清・血漿用分析要禦としても
使用できるものでもある。含有させる試薬組成物を選択
することにより、例えばＡＳＴ（アスバルテートアミノ
トランスフエラーゼ）、ＡＬＴ（アラニンアミノトラン
スフエラーゼ）、ＬＤＨ（乳酸脱水素酵素）、クしアチ
ンキナーゼ、アミラーゼ、コレステロール、ビリルビン
、尿酸用の分析要索の下地を得ろことができる。

血球分離層としては、繊維質多孔性層と非繊維質多孔性
層を網点印刷法（例、グラビア印刷法、スクリーン印刷
法）を利用した部分接着法により接着一体化したものが
有効である。グラビア印刷法を利用した部分接着法の代
表的な例は、高温に加熱し溶融状態のホットメルト型接
着剤を、繊ｍ＊多孔性層か非＊＄ｔ質多孔性層のどちら
か一方の表面に、グラビアローラーからの転写によりド
ット状に付着させた直後に両者を重ねてラミネートロー
ラーの間を通すことで接着一体化する方法である。

この方法としては、特開昭６２−　１３８７５６に記載
の方法が有効である．こうして得られる血球分離層は、
ｌＩ維質多孔性層と非織維質多孔性層が液体の通過が妨
げられない程度に部分的に配置された接着剤により接着
一体化されている。血球分離層は、繊維質多孔性層が上
側（全血試料を点着供給される側）になるように配置す
る。

血球分離層のＩ！維質多孔性層は、その面上に全血試料
が点着されたときに、展開層としても作用するので、液
体計量作用を有する層であることが好ましい。

織碓質多孔性層を構成する材料としては、濾紙、不織布
、織物布地（例、平織布地）、編物布地（例、トリコッ
ト編物布地）、カラス繊維濾紙等を用いることができる
。これらのうち、織物布地、編物布地が好ましい。織物
布地等は特開昭５７−　６６３５９に記載の物理化学的
処理（例、グロー放電処理）をしてもよい。

繊ｓｍｉｔ多孔性層には展開面積、展開速度を調整する
ために、親水性ボリマーや界面活性剤等を含ませてもよ
い。ただしこの場合、使用する親水性ボリマーや界面活
性剤は、層中で赤血球の溶血を起こさせないものから選
択される。また、織維質多孔性層には、血球分離を促進
するような親水性ボリマーや無機塩等を含ませてもよい
。

非繊維多孔性層としては、特公昭５３−　２１６７７、
米国特許３　９９２　１５８、米国特許１　４２１　３
４１等に記載のセルロースエステル類（例、セルロース
アセテート、セルロースアセテート／アチレート、硝酸
セルロース）からなるプラッシュボリマーの層が好まし
い。

また、６−ナイロン、６．６−ナイロン等のボリアミト
、ポリエチレン、ボリブロビレン等の微多孔性膜、特開
昭６２−　２７００６に記載のボリスルホンからなる微
多孔性膜も用いることができる。

非！ＩＩ’維質多孔性層が、相分離法により作られたい
わゆるブラッシュボリマーからなるメンプランフィルタ
ーである場合、厚さ方向の液体通過経路は、膜の製造の
際の自由表面側（光沢面）で最も狭くなっているのが普
通で、液体通過経路の断面を円に近似したときの孔径は
、自由表面の近くて最も小さくなっている。血球分離層
に使用される非繊維質多孔性層にはこの種のブラッシュ
ボリマーが好ましい。血球分離層にブラッシュボリマー
の膜を使用する場合、膜の光沢面が血球分離層の繊維質
多孔性層から遠い銅に向くように接着一体化される。こ
の構成にり、非繊維質多孔性層の厚さ方向の液体通過経
路は、血球分離層の繊維質多孔性層から遠くなるにつれ
て狭くなる。

血球分離層に使用される非繊維質多孔性層の有効孔径は
約０．８μ鋼から約３０μ躊の範囲が好ましい．本明細
嘗て言う有効孔径は、ＡＳＴＭ　　Ｆ−３１６−７０に
準拠した限界泡圧法（ハアルポイント法）により測定し
た孔径で示す。血球分離層の非繊維質多孔性層の有効孔
径は、大きすぎると全血試料からの血球成分の分離除去
が完全に行われず、血球成分の一部が多層分析要素の下
地に達してしまい、全血試料中の被検成分と、多層分析
要素の下地に含まれている試薬絹成物との反応が妨害ざ
れて正確な定量分析が行えない。一方、有効孔径が小さ
すぎると、非繊維質多孔性層中を移動中に赤血球に大き
なシェア（剪断歪）が掛かることて溶血が起こり、赤血
球中の成分が放出され、全血試料中の被検成分の濃度や
活性値が変化し、やはり正確な定量分析が行えない。

血球分離層に使用される非繊維質多孔性層においては、
その中を全血試料が移動する間に、赤血球に代表される
血球成分と血漿成分との間に移動速度の差が生じるよう
に、かつ赤血球の溶血が起こらない程度に、血球成分に
抵抗が掛かるように有効孔径を選ぶ必要がある。

上記の分析要素の下地と血球分離層を積層一体化するに
は、前述の、網点印刷法（例、グラビア印刷法、スクリ
ーン印刷法）を利用した部分接着法による接着一体化法
が好ましい。ホットメルト型接着材をグラビア印刷法で
用いる場合には、高温に加熱し溶融状態のホットメルト
型接着材を多層分析要素の下地と血球分離層のどちらに
転写してもよい。部分接着は多層分析要索の下地の多孔
性層と血球分離層の非Ｉｉ！維質多孔性層の間で行われ
るようにする。

本発明の分析方法に用いられる多層分析要素は、水不透
過性光透過性支持体（透明支持体）の上に全血試料中の
被検成分との反応の結果として検出可能な光学濃度変化
を与える呈色試薬層を備えた分析要素の下地の上に、全
血から血球成分を分離除去して呈色試薬層に血漿を供給
する機能を備えた血球分離層が積層・一体化されたもの
である。ただしこの分析要素においては、分離除去され
る血球成分の有色色素が、透明支持体側から実質的に検
出されないようにするための、いわゆる光遮光層又は光
反射層のような機能は備えていないことが特徴である． 前記のような構成の多層分析要索を用いて全血試料中の
被検成分の定量分析は、次のようにして行われる。

ヒトより採血した全血試料の一定量（例、２０μし）を
分析要素の透明支持体から最も遠い面である血球分離層
の最上層であるｗｉｔ維質多孔性層の表面に点着する。

点着された全血試料は、繊維質多孔性層において、面方
向にほぼ一様に広げられる。それと同時に、全血試料は
下方向へ移動して行くが、そこで血球分離層の繊維質多
孔性層と非繊維質多孔性層とが共同して働き、全血試料
は血球成分と血漿とに分離され、血球成分は血球分離層
の非繊維質多孔性層の下面までで完全に保持されてとど
まり、実質的に血漿のみが、下方に位置する分析要素の
下地の多孔性層へと移動していく。分析要素の下地の多
孔性層では、分離してきた血漿が供給されると、その量
に応して血漿を面方向にほぼ一定になるように広げる一 前記の多層分析要素において、全血試料中の血球成分が
血球分離層の非繊維質多孔性層の下面までで実質的に完
全に分離され、分析要素の下地の多孔性層には実質的に
全く到達しないことは、まことに不思議であって、未だ
その理由は明らかになっていない。ただそのメカニズム
が、血球成分をその大きさで分離する、いわゆる物理濾
過でないことは確かである。全血から血球成分を物理濾
過しようとすると、通常赤血球に大きなシェアがかかっ
て溶血が起こってしまう。しかし前記の多層分析要素で
は、後の実施例でも示すが、赤血球の溶血は観察ざれな
い。血球分離層での血球成分の分離除去は、全血試料を
血球分離層の繊維質多孔性層上に点着後速やかに完了す
る。血球成分の分離除去は、遅くとも全血試料点着後３
０秒以内には完了している。前記の多層分析要素には、
分離した血球成分の有色色素が透明支持体側から検出さ
れないようにするための、遮光の機能を備えていないの
で、全血試料点着後瞬時のうちに、血球成分の有色色素
（赤血球の赤色色業）が透明支持体側から光学的に検出
され始める。しかし、透明支持体から検出される血球成
分の有色色素の反射光学濃度は、血球成分の分離が完了
されると同時に、全血試料のへマトクリット値やその池
の個体差によって決定される絶対値で一定になって、そ
の後変化しないことが見い出された。このことは、まこ
とに意外な現象である。

血球成分の分離除去後、分析要素の下地の多孔性層内で
ほぼ一様に広げられた血漿中の被検成分は、分析要素の
下地に含まれている呈色試薬絹成物と反応して、分離さ
れた血球成分の有色色素の光学濃度とは独立に、光学的
に検出可能な信号の変化を示す。

前記の多層分析要素を用いて全血試料中の被検成分の定
量分析を行うには、透明支持体側から検出される分離し
た血球成分の有色色素の反射光学濃度が一定になった後
で、全血試料中の被検成分と試薬組成物との反応の結果
として生成した色の反射光学濃度を測定する。測定され
た光学濃度は、それをパラメータとして、予め同様の方
法で測定しておいた被検成分の量とそのパラメータとの
関係（通常は検量線）にもとづいて、点看した全血試料
中の被検成分の量を算出する、比色測定法のためのパラ
メータとして使われる。

その際、用いられるパラメータは、点看険一定時間にお
ける単位時間当りの反射光学１度の変化値又は点着後一
定時間後の反射光学濃度の絶対値いずれてもよい。パラ
メータが点着後一定時間における単位時間当りの光学濃
度の変化値の場合は、測定されるＩＩＩに何等補正を加
える必要はない。

方、パラメータが点看後一定時間後の光学濃度の絶対値
である場合には、分離された血球成分の有色色素の濃度
１１１分ハックグランドの値が上がっているので、点着
後、血球成分の有色色素による光学濃度の一定になった
絶対値を記憶しておき、測定された点着後一定時間後の
光学濃度の絶対値から差し引けばよい。また、点着後一
定時間後の光学濃度の絶対値をもとにその後に測定され
る光学濃度の値を補正する場合も、点着後、血球成分の
有色色素による光学濃度の一定になった絶対値を記憶し
ておき、各時間で測定された光学濃度の絶対値から差し
引いた後の値に対して補正を行えばよい。

多層分析要素に透明支持体がないもの、あるいは支持体
を剥離除去するものである場合には、透明支持体を通し
ての要素内の色の反射測光のかわりに、呈色試薬層、吸
水層、検出層等の全血試料が点着される血球分離層と反
対側の層から反射測光すればよい。

本発明の分析方法に所要の全血試料の量は、例えば、約
５μＬから約３０μし、好ましくは約８μＬから約１５
μＬの範囲である。本発明の分析方法では、点着された
全血から血球分離層により分離された血球成分の有色色
素の、前記支持体側から検出される反射光学濃度値が実
質的に一定になった（長くとも約３０秒、通常は約２０
秒以内）後に、約２０℃から約４０℃の範囲内の、好ま
しくは３７℃近傍の、実質的に一定の温度でインクベー
ションしながら、豹！分から約１０分の時間範囲で、試
薬層における反射光学濃度値又は単位時間当りの反射光
学濃度の変化量を支持体側から測定し、比色法の原理で
被検成分の濃度値又は活性値を求める。本発明の分析方
法は、特開昭６０−　１２５５４３、特開昭６０−　２
２０８６２、特開昭６１−　２９４３６７、特開昭５８
−　１６１８６７等に記載の化学分析装置により容易な
操作で高精度の定量分析を実施できる． ［発明の効果コ 本発明の定量分析方法により、光遮蔽層又は光反射層を
備えていない多層分析要素を用いて、全血試料中の被検
成分の定量分析をヘマトクリット値に依存せず、数分（
約２分〜約ｌＯ分）という短時間で正確に行うことがで
きる。ざらに本発明の定量分析方法に用いる多層分析要
素の下地に含有させる試薬絹成物を被検成分に対応する
試薬成分に変えるだけで、全血試料中の種々の被検成分
の定量分析に適用することができる。

本発明の好ましい実施態様は次のとおりである。

（１）水不透過性光透過性支持体の上に、少なくとも全
血中の被検成分との反応の結果として検出可能な光学濃
度変化を与える呈色試薬層と全血から血球成分を分離除
去して前記試薬層に血漿を供給するための血球分離層と
が、この順に積層されている多層分析要素を用いて比色
測定法により被検成分を定量する方法において、 ■血球分離層の最上層に全血試料を点着し、■前記血球
分離層により点着された全血から分離された血球成分の
有色色素の、前記支持体側から検出される反射光学濃度
値が実質的に一定になった後に、 ■前記試薬層における反射光学濃度値又は単位時間当り
の反射光学濃度の変化量を前記支持体側から測定し、 ■得られた反射光学濃度値又は単位時間当りの反射光学
濃度の変化量から全血中の被検成分の濃度値又は活性値
を比色測定法により求めることによる全血中の被検成分
を定量する方法． （２）前記分析要素が、全血からの血球成分の分離除去
が、全血中の被検成分との反応の結果としての試薬層で
の光学濃度変化が検出され始める前に完了している分析
要素である（１）に記載の方法。

（３）前記分析要素が、分離された血球成分の有色色素
が光学的に支持体側から充分に検出され得る分析要素で
ある（１）に記載の方法． （４）前記分析要素が、全血からの血球成分の分離除去
が完了後、分離された血球成分の有色色素の支持体側か
ら検出される光学濃度が実質的に一定になる分析要素で
ある（１）に記載の方法。

（５）前記分析要素の試薬層と血球分離層が、液体の一
様な通過が妨げられない程度に部分的に配置された接着
剤により接着され一体化されている分析要素である（１
）に記載の測定法。

［実施例１］ＡＳＴ活性１直定量用多層分析要素１−１
　　分析要素の下地の作製 ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μＩのポリエチレ
ンテレフタレー｝（ＰＥＴ）無色透明平滑シートの上に
下記の成分被覆量の発色試薬層を乾燥後の厚さが１５μ
Ｉになるように塗布し、乾燥させて発色試薬層を形成し
た。

発色試薬層の被覆量（ｌＩＩ＋２当り）脱イオンゼラチ
ン　　　　　　　　　　　２０ｇｐ−ノニルフエノキシ
ボリグリシドール（平均ＩＯグリシトール単位含有）　
　　　　　１．５ｇベルオキシダーセ　　　　　　　　
　　１５０００　Ｉ　ＵＦ　Ａ　Ｄ　（７５ピシφ７デ
ニシ争ジヌクレオチＦ）　　　　　　　　　　　　　　
２２ｎ＋ｇＴＰＰ（チ７ミシ・ビ０本スフェート）（コ
カｈ番キシラーモ）９３１ｔｌｇビルビン故オキシダー
ゼ　　　　　　　１３０００　１　Ｕ２−（３．５−シ
メトキノー４−ヒＦキシフェニル）−４−フェネｆト５
−［４−（ジメヂル？ミノ）フェ：ル］イミ９ソール（
ロイ　コ色業）　　　２８０ａ＋ｇ（稀ＮａＯＨ水溶液
でｐＨ７．５に調整した水溶液を塗布）次に発色試薬層
の上に下記の成分被覆量の接着層を乾燥後の厚さが３μ
鱈こなるように水溶液から塗布し、乾燥させて接着層を
形成した。

接着層の被覆量（Ｉ１２当り） 脱イオンセラテン　　　　　　　　　　　　４．Ｏｇｐ
−ノニルフェノキシボリグリシトール（平均１０グリシ
トール単位含有）　　　　　４３０１ａｇＬ−アスパラ
ギン酸ナトリウム　　　　　　２５０ｍｇ次に接着層の
上に約３０ｇ／Ｉ２の割合で水を供給して全面をほぼ一
様に湿潤させ、ＰＥＴ製７ロード織物布地（厚さ約１５
０μ閑、空隙体積９．８μＬ／Ｉｌｌ２）を軽く圧力を
かけてラミネートして接着させ、乾燥させた。

次にこの布に下記の絹成のＡＳＴ検出試薬組成物の水溶
液を１００ＩＩＩＬ／ｌ２の割合でほぼ一様に塗布し、
乾燥させて含漫ざせてＡＳＴ活性定量用多層分析要素の
下地を完成した。

ＡＳＴ検出試薬絹成物の水溶液の組成 トリスヒドロキシメチルアミノメタン　　３．７ｇ燐酸
ｌカリウム　　　　　　　　　　　　　４．４８α−ケ
トグルタル＠　　　　　　　　　　　　　４．０ｇヒト
口キシブ口ピルメチルセルロース （メトキシ基２８〜３０％、ヒト口キシブロボキシ基７
〜！２％含有；２％水溶液の２０℃での粘度５０ｃｐｓ
）８．７ｇ オクチルフエノキシボリエトキシエタノール（平均ｌＯ
オキシエチレン単位含有） 塩化マグネンウム オキザ口′＃散デカルボキシラーゼ アスコルビン酸オキシダーゼ 水 （ＩＮａｃ＋Ｈ水溶液でｐ｝１７．５に調整した）１−
２　血球成分分離層の調製 ５０デニール相当のＰＥＴ紡績糸を３６ゲージ編みした
トリコット編物布地（厚さ約２５０μＩＷ）に、下記Ｈ
成の水溶液を含浸し、乾燥させた。

ボリエチレングリコール（平均分子量５万）　　２．ｏ
８四硼酸ナトリウム　　　　　　　　　　　　２，Ｏｇ
水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　９６ｇ次に上記含漫済みトリコット編物布地を温
度８０℃に加熱し、その表面に温度１３０゜Ｃに加熱し
溶融したホットメルト型接着剤を、グラビア印刷法によ
りグラビアローラーからの転写によりドット状に付看さ
せた。グラビアローラーのドットパターンは、トット直
径０．３ｍｍの円、トットの中心間距１１０．６ｌ、ト
ット面積率約２０％である。付着した接着剤の量は約：
２ｇ／ｍ２であった。ついで、接着剤が転写された直後
の高温の布地の表面に、有効孔径３．０μ組２７８ ２．３ｇ ２０万ＩＵ ｌ８万ＩＵ ８８０ｇ 厚さ１４０μ濯、空隙率約８０％のセルロースアセテー
トメンプランフィルタの非光沢面を向かい合わせてラミ
ネートローラーの間を通し、両者をラミネートして接着
一体化（部分接着）し血球分離層を作製した． １−３多層分析要素の完成 この血球分１ｗＮを　１−２の工程と同様のグラビア印
刷法による部分接着法により　１１の工程で作製した分
析要素の下地の上に接着し、一体化させた。

１−２の工程と同様にして、血球分離層のメンプランフ
ィルタの表面に加熱し溶融したホットメルト型接着剤を
グラビア印刷法によりドット状に付着させた後、直ちに
１−１の工程で作製した分析要素の下地のブロードａｔ
物布地面側と向かい合わせ、両者をラミネートローラー
の閘を通し、ラミネートして接着一体１ヒした。

完成した多層分析要素を１辺２５ｍｓ＋の正方形チップ
に裁断し、特開昭５７−　６３４５２に記載の有機ボリ
マー製スライド枠に収めてＡＳＴ活性値定量分析用多層
分析スライトを完成した。

［実施例２］　ＡＬＴ活性値定量用多層分析要素２−１
　　分析要素の下地の作製 ゼラチン下塗りされている厚さ１８０μｍのＰＥＴ無色
透明平滑シートの上に下記の成分被覆量の発色試薬層を
乾燥後の厚さが１５μｍになるように塗布し、乾燥させ
て発色試薬層を形成した。

発色試薬層の被覆量（ｌＩｌ２当り） 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　　２０ｇｐ−ノ
ニルフエノキシボリグリシトール（平均ｌＯクリシトー
ル単位含有）　　　　　　１．５ｇベルオキシダーゼ　
　　　　　　　　１５０００　１　ＵＦＡＤ（万ビシΦ
？チニシ・シヌク１オチＦ）　　　　　　　　　　　　
　　２２ｔｓｇＴＰＰ（チ１ミシ争ビ０本スフェート）
（コカ７１１４シラー”）　　　　　　　９３１ｇビル
ビン酸オキシダーゼ　　　　　　　１３０００ＩＵ２−
（３．５−；メトキシ−４−仁日シフェニル）−４−フ
ェネチト５−［４−（ジメチル？ミノ）フェニｈ］イミ
９ソール（ロイ　コ色素）　　　２８０ｍｇ（稀ＮａＯ
Ｈ水溶液でｐＨ６．５に調整した水溶液を塗布）次に発
色試薬層の上に下記の成分被覆量の接着層を乾燥後の厚
さが３μｍになるように水溶液から塗布し、乾燥させて
接着層を形成した。

接着層の被覆量（ｌｍ２当り） 脱イオンゼラチン　　　　　　　　　　　　４．Ｏｇｐ
−ノニルフエノキシボリグリシトール（平均ｌＯグリシ
トール単位含有）　　　　　１６０１Ｉｇ（稀ＮａＯＨ
水溶液でｐＨ７．０シた水溶液を塗布した）次に接着層
の上に約３０ｇｌＩＩ２の割合で水を供給して全面をほ
ぼ一様に湿潤させ、ＰＥＴ製ブロート織物布地（厚さ約
１５０μ顧、空隙体積９．８μＬＩＩＩ１２）を軽く圧
力をかけてラミネートして接着させ、乾燥させた。

次にこの布に下記の組成のＡＬＴ検出試薬組成物の水溶
液を１０Ｏｎ＋Ｌ／ｍ２の割合でほぼ一様に塗布し、乾
燥させて含浸させてＡＬＴ活性定量用多層分析要素の下
地を完成した。

ＡＬＴ検出試薬絹成物の水溶液の朝成 トリスヒドロキシメチルアミノメタン　　２．２ｇ燐酸
１カリウム　　　　　　　　　　　　　４．５ｇα−ケ
トグルタル酸　　　　　　　　　　　　４．０８し−ア
ラニン　　　　　　　　　　　　　　　２７．５ｇヒト
口キシブ口ピルメチルセルロース （メトキシ基２８〜３０％、ヒドロキシブロボキシ基７
〜１２％含有；２％水溶液の２０℃での粘度５０ｃ匹）
８．７ｇ オクチルフェノキシボリエトキシエタノール（平均１０
オキシエチレン単位含有）２７ｇ塩１ヒマグネシウム　
　　　　　　　　　　　２゜４ｇ水　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　８８０ｇ（ＩＮａ
０１｛水溶液でｐＨ７．５に調整した）１−３　多層分
析要索の完成 実施例１の１−２の工程と同様にして血球分離層を作製
し、二の血球分離層と２−１の工程で作製したＡＬＴ活
性測定用分析要素の下地とを実施例ｌの１３の工程と同
様にして部分接着法で積層一体化して多層分析要素を完
成し、分析要素裁断してスライト枠に収めてＡＬＴ活性
値定量用多層分析スライドを完成した。

得られたＡＳＴ活性測定用分析要業（実施例ｌ）及びＡ
ＬＴ活性測定用分析要素（実施例２）は、透明支持体、
発色試薬層、ブロード織物布地層がこの順に積層一体化
ざれた下地の上に、メンプランフィルタ層、トリコット
編物布地層がこの順に積層一体化ざれた構成の血球分離
層がこの順に一体に積層された構成である。

部分接着法により積層一体化されたメンプランフィルタ
層とトリコット編物布地層とは協同して、検体としてト
リコット編物布地の上に点着供給される全血試料から血
球成分を分離除去する。このときトリコット編物布地層
は展開層としても作用し、供給された全血試料を面の方
向に単位面積当りほぼ一定量の割合で広げる．プロート
織物布地層は血球分離層を通過してきた血漿中の（実施
例ｌでは）ＡＳＴの、（実施例２ては）ＡＬＴそれぞれ
の存在量に応じてピルヒン酸を生成するＡＬＴ又はＡＳ
Ｔ検出試薬組成物を含有する反応層として作用する。こ
のときブロート織物布地層は展開層としても作用し、血
球分離層を通過してきた血漿を面の方向に単位面積当り
ほぼ一定量の割合で広げる．発色試薬層は、血球分離層
を通過してきた血漿成分中のく実施例ｌ）ではＡＳＴの
、（実施例２）てはＡＬＴの存在量に応してブロード織
物布地層で生成したビルビン酸を過酸化水素を経て色素
に変換し蓄積する層として作用する。色素は透明支持体
を通して光学的に検出される。

実施例１と実施例２の多層分析要素のトリコット編物布
地層の表面に全血試料を点着したとき、全血中の赤血球
に代表される血球成分はメンプランフィルタ層までで実
質的に完全に分離除去され、ブロード織物布地層には到
達しないことが観察された。しかしながら前記の多層分
析要索は分離した血球成分の赤色色素が測光する透明支
持体側から検出されないようにするための光遮蔽層を備
えていないので、透明支持体側から上層で分離された血
球成分の赤色邑素の赤色が見えた。

しかしながら以下に示すように、分離した血球成分の赤
色色素が透明支持体劃から見えることは、全血試料の２
へＳＴ及び．へＬＴの活性値を定量するにあたってなん
ら不都合ではないことが明らかである。

［性能評Ｗｉ試験１］ 透明支持体側から検出される分離した血球成分の赤色色
素の光学濃度の変化と試料液中の被検成分による発色の
光学濃度の変化を測定した。

第１表に記載の試料液（■■・・・コントロール血清、
■（■・・・全血）を調製／用意した。

第１表 、Ｄ　　　　　　　０　　　　　　　　　０■ ４０ ５４０ 試料液 各２０μＬを実施例１の多層分析要索のトリコット編物
布地層の上にそれぞれ点着し、各分析要素を密閉された
インクヘータの中で３７℃に深持した際の光学濃度の変
化を波長６４０ｎｍの可視光で測定した。測定された光
学濃度圃の変化を示したのが第１図である。またその際
、点着後３．５分から５分までの光学濃度値変化を求め
、その結果を第２表に示す。

第　　２　　表 第１図から明かなように、分離ざれた血球成分の赤色色
素の透明支持体側から検出される光学濃度は点着後瞬時
（約ｌθ秒以内）に変化し終り、その後は透明支持体側
から検出される分離した血球成分の赤色色業の光学濃度
は変化しない（試料■■）。

試料液中のＡＳＴによる発色は、透明支持体側から検出
される血球成分の赤色色業の光学濃度が変化し終り一定
になった後に始まる（試料■■）。それ故第２表に示さ
れているように血球成分の有無にかかわらず、試料液中
のＡＳＴの活性量が等しければ一定時間での光学濃度値
変１ヒは等しくなる。

実施例２のＡ　Ｌ　Ｔ活性値定量用多層分析要素を用い
た同様な性能評１ｉ！ｉ試験でも同様な結果が得られた
。

［性能評価試験２］ 実施例ｌと実施例２の多層分析要素を用いて全血試量中
のそれぞれＡＳＴとＡＬＴの活性値の定量精度を評価す
るための測定を行なった。

７％Ｈ　Ｓ　Ａ水溶液に異なる量のＡＳＴ及びＡＬＴを
加えてＡＳＴ，ＡＬＴ活性埴の異なる７％ＨＳＡ溶液を
調製した。別にヒト全血を遠心分離し、得られた血漿の
一定量を前記７％ＨＳＡ中ＡＳＴ、Ａ　Ｌ　Ｔ溶液と置
き換え、ついてこれを再び血球成分と冫二合して、ヘマ
トクリット値４０％でＡＳＴ、Ａ　Ｌ　Ｔ活性値が異な
る全血試料を調製した．こうして調製された全血試料各
２０μＬを実施例ｌと実施例２の多層分析要索のトリコ
ット編物布地層の上にそれぞれ点看し、各分析要素を密
閉インクベータ中で３７℃に保持した際の点着後３．５
分から５分までの光学濃度変化を求めた。結果を第２図
、第３図及び第３表に示す， 第３表におけるＡＳＴ．ＡＬＴ活性値は使用した全血試
料を遠心分離後得られた血漿成分について溶液法によっ
てそれぞれ求めた値である。

第３表 ■ ２０ ８８６ ０．１４ ２．９１ 第３表のデータ及び第２図、第３図のグラフから、全血
試料点看後、分離した血球成分の赤色色素の透明支持体
（測光面）側から検出される反射光学濃度値が一定にな
った後に透明支持体側から測定される発色の反射光学濃
度の単位時間当りの変化量は、実施例ｌのＡ　Ｓ　Ｔ活
性定量用多層分析要素では全血試料中のＡＳＴの活性鎖
に、実施例２のＡ　Ｌ　Ｔ活性定量用多層分析要禦では
全血試料中のＡＬＴの活性値に良好な相間を持つことが
明らかになった。

［性能評価試験３コ 実施例１と実施例２の多層分析要素を使って性能評価試
験】と同様の測定をすることで全血試量中のそれぞれＡ
ＳＴとＡＬＴの活性量を求める場合に全血試料のへマト
クリット値が定量分析にとの程度の影響を与えるかを評
価する試験を下記の測定を行った。

７％ＨＳＡ水溶液に異なる量のＡＳＴ及びＡ　ＬＴを加
えてＡＳＴ，ＡＬＴ活性値の異なる７％ＨＳＡ溶液を３
種類調製した。別にヒト全血を遠心分離し、得られた血
漿の一定量を前記７％ＨＳＡ中ＡＳＴ．ＡＬＴ溶液と置
き換え、ついでこれを再び血球成分と混合することより
、ＡＳＴ．ＡＬＴ活性値が異なる全血試料を調製した。

次にこの全血試料を遠心分離した後、得られた血漿の適
当量を添加し又は取り去ることにより、ＡＳＴ及びＡＬ
Ｔ活性がそれぞれ異なりへマトクリット値が２５％、４
０％、５５％である全血試料を調製した。

こうして調製された全血試料各２０μＬを実施例１と実
施例２の多層分析要素のトリコット編物布地層の上にそ
れぞれ点看し、各分析要素を密閉インク・＼一夕中で３
７℃に保持した際の点着後３．５分から５分までの光学
濃度変化を求めた。結果を第２図、第３図及び３１！３
表に示す。得られた光学濃度変化は、第２図及び第３図
の光学濃度値とＡＳＴ又はＡＬＴの活性値との関係から
、ＡＳＴ及びＡＬＴの活性値に換算した。結果を第４表
に示す。

なお第４表でヘマトクリット｛ｌｉｉＯ％とは、血球成
分を含まない血漿試料についての結果てある。

第 ４ 表 ０ ７２ ４６２ ２５ ７６ ４６４ ２５ １７０ １７４ ４０ １７０ １６８ Ｏ ４２８ ５５ 第４表のデータからから実施例１と実施例２の多層分析
要素では、全血試料点着後、分離した血球成分の赤色色
秦の透明支持体く測光面）側から検出される反射光学濃
度値が一定になった後に透明支持体側から測定される発
色の反射光学濃度値は、その値をもとに同様の測定法で
求めておいた光学濃度変化と活性値との関係（性能評価
試験３の第２図、第３図）から算出したＡＳＴ及びＡＬ
Ｔの活性ＩＩＩは、ＡＳＴ及びＡＬＴの各活性ＩＩＩに
おいて、ヘマトクリット値にかかわらずほぼ一定の値を
示すことが明らかになった。

血球成分の中心である赤血球中の活性値が、血漿成分中
の活性値に対して．ＡＳＴで約８０培、ＡＬＴで約１５
倍であることを考えれば、第４表のデータは、実施例１
及び実施例２の多層分析要業中で赤血球の溶血が実質的
に起こっていないこども示している。

【図面の簡単な説明】

第１図は、第１表の試料液各２０μＬを実施例ｌの多層
分析要素にそれぞれ点着し、各分析要素を密閉インクヘ
ータ中で３７℃に塚持し、測光面（透明支持体）側から
測定される反射光学濃度値を波長６４０ｎｍの可視光で
測定した際の反射光学濃度の変化を示すグラフ（検量線
）である。■■■■は試料濠の番号を示す。 第２図は、全血試料中のＡＳＴ活性値と実施例１の多層
分析要素の発色の反射光学濃度の１分当りの変化量との
関係を示すグラフ（検量線）である。 第３図は、全血試料中のＡＬＴ活性値と実施例２の多層
分析要素の発色の反射光学１度の１分当りの変化量との
関係を示すグラフ（検量線）である。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. （１）水不透過性光透過性支持体の上に、少なくとも全
   血中の被検成分との反応の結果として検出可能な光学濃
   度変化を与える呈色試薬層と全血から血球成分を分離除
   去して前記試薬層に血漿を供給するための血球分離層と
   が、二の順に積層されている多層分析要素を用いて比色
   測定法により被検成分を定量する方法において、 （１）血球分離層の最上層に全血試料を点着し、
2. （２）前記血球分離層により点着された全血から分離さ
   れた血球成分の有色色素の、前記支持体側から検出され
   る反射光学濃度値が実質的に一定になった後に、
3. （３）前記試薬層における反射光学濃度値又は単位時間
   当りの反射光学濃度の変化量を前記支持体側から測定し
   、
4. （４）得られた反射光学濃度値又は単位時間当りの反射
   光学濃度の変化量から全血中の被検成分の濃度値又は活
   性値を比色測定法により求めることを特徴とする全血中
   の被検成分を定量する方法。