JPH03204820A - エビ類の細菌性疾病予防ワクチン及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １粟上生机里分立 本発明は、クルマエビＣＰｅｎａｅｕｓ　ｊａｐｏｎｉ
ｃａｓ＞　　。

ウシエビＣＰｅｎａｅａｓ　ｒｎｏｎｏｄｏｎ）　、コ
ラライエビ＜Ｐｅｎａｅｕｓ　ｃｈｉｒＬｅｎｓｉｓ）
　、バナナエビＣＰｅｎａｅａｓｍｏｒｇｕｉｅｎｓｉ
ｓ）等のクルマエビ属やその他の属のエビ類のビブリオ
病やその他の細菌性疾病の発生を予防することを目的と
したワクチン及びその製造法に関する。

従来■吸血 近年、世界各国でクルマエビ属を中心としたエビ類の養
殖産業が発展してきている。しかし、養殖中にビブリオ
病やその他の細菌性疾病が多発し、甚大な被害をもたら
している。

これらの疾病に対する防除対策として、現在、抗菌剤の
錠剤を直接投与するかあるいは抗菌剤を飼料に添加して
投与する方法がとられている（日本水産学会誌第５１巻
第１６３９〜１６４３頁）。

しかし、抗菌剤を頻繁に投与すると、耐性菌が出現し、
治療効果が低下し、確実な効果をあげることができず、
このなめ有効な防除対策の確立が目下急務の問題となっ
てきている。

一方、ビブリオアンギュラルムを不活性化して養殖魚の
ビブリオ症ワクチンとすることは知られている（特公昭
５６−５３２８６号公報１、特公昭５６５３２８７号公
報、特開昭５８−５０００２６号公報等）。

しかしエビ類等の無を椎動物は、魚類等のを椎動物と相
違し、免疫グロブリン（抗体）を介した特異的免疫機構
が存在せず、そのためエビ類の細菌性疾病をワクチンに
より予防できるという可能性は一般に否定されていた。

それにもかかわらず、一部の研究者がワクチンの有効性
を検討しているが、いまだ実効を奏するには至っていな
い。

ｉ　　　″　　るための 本発明者らは、前記したようなエビ類の細菌性疾病の予
防をワクチンによって行うことを検討していたところ、
本発明者らが病気のクルマエビから分離したビブリオベ
ネウスＣＶｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）を不活性化し
てワクチンとして使用するとエビ類の細菌性疾病を予防
することができるという知見を得て、本発明を完成する
に至った。

すなわち、本発明は、 （１）不活性化したビブリオペネウスＣＶｉｂｒｉｏ　
ｐｅｎａｅａｓ）を有効成分として含有することを特徴
とするエビ類の細菌性疾病予防ワクチン、及び （３）ビプリオペネウスＣＶｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕ
ｓ）を海水ブイヨン培地で培養し、これにホルマリンを
加えるかまたは加熱処理してビブリオペネウスを死菌に
して不活性化し、これを有効成分とすることを特徴とす
るエビ類の細菌性疾病予防ワクチンの製造法 に関する。

ビブリオベネウス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅａｓ）は
、本発明者らが山口系及び熊本系などのクルマエビ養殖
場において瀕死状態の病エビ（成エビの第６１ｉＩ節筋
肉の白濁、エラ及びリンパ様器官の点状褐色斑等の症状
を伴って斃死する未知の疾病）から分離したビブリオ属
細菌の新種のものであって、その詳細は、日本水産学会
誌第５１巻第５号第７２１〜７３０頁（１９８５年）に
掲載されている。

ビブリオペネウスは病原菌であるので、これを工業技術
院微生物工業技術研究所（微工研）に寄託することはで
きないが、該菌は、本発明者らが保管しており、本願の
公告と同時に該菌を第３者に分譲する用意はある。

ビブリオペネウスの分離は次のようにして行った。

前記の病エビを滅菌海水で十分洗浄し、７０％エタノー
ルで体表面を消毒した。そして、心臓、リンパ様器官お
よび筋肉の白濁部に白金耳を穿刺し、５０％天然濾過海
水普通寒天培地（普通寒天培地を５０％天然濾過海水で
溶解後滅菌）に塗抹して、２５°Ｃ１２４〜４８時間培
養し、出現したコロニーから菌株を採取した。そして得
られた分離菌について、前記の病エビと同じ病原性が再
現されることを確認した。分離菌は、エビ類に強い毒性
を示した（ＬＤｓ。＜１．３５ｘｌＯ”細胞／ｇ体重）
。

ビプリオベネウスの菌学的性状は、ＮａＣ］　２％加普
通寒天培地に２５°Ｃ１１８〜２４時間培養した菌を用
いて検査した。その結果は次のとおりである。

（ａ）形態 ダラム陰性、無芽胞、非抗酸性で、端在性の単鞭毛を有
し活発に運動する。大きさおよび形態は、通常０．８〜
１．ＯＸ３．０μ麟の短桿菌であるが、まれに１．２　
Ｘ　５．０μ麟程度の長稈状のものもみられる。

食塩２％加普通寒天平板上で２５°Ｃ１２４時間培養後
、直径約０．５ｍｍのコロニーを形成する。コロニーは
正円形、周縁円滑でやや隆起し、灰白色で、湿潤性の光
沢を呈する。

（ｂ）培地における生育状況 特記しない限り、培地の食塩濃度は２．０％とし、培養
温度は２５°Ｃで行った。

本国は食塩を１〜３％の割合に加えた（食塩０．５％で
は発育しない）肉汁寒天培地の平板および斜面上で２５
°Ｃ１２４時間培養すると、直径約０．５ａ＋１１１の
コロニーを形成する。コロニーは正円形、周縁円滑でや
や隆起し、灰白色で湿潤性の光沢を呈する。

拡散性色素は産生じない。

食塩を１〜３％の割合に加えた肉汁液体培地で２５゛Ｃ
１２４時間培養すると全層が混濁する良好な発育を示し
、上層に菌膜を形成する株と形成しない株とがある。

肉汁ゼラチンに穿刺培養すると、良好な発育を示し、ゼ
ラチンを液化する。

リドマス加脱脂乳中で培養すると培地が酸性になるとと
もに凝固する。

さらに、本面は遊走発育をせず、ＳＳ寒天、ＭａｃＣｏ
ｎｋｅｙ寒天、Ａｒｏｎｓｏｎ寒天およびブリリアント
寒天培地上に発育しないが、ＢＴＢティボール寒天寒天
上地上発育する。普通寒天培地上での発育と温度の関係
については、２０〜２５°Ｃでよく発育し、１０°Ｃで
の発育はやや悪く、５°Ｃおよび３５°Ｃ以上では発育
しない。塩分濃度は１．０〜３．０％ですべての株が発
育し、４．０％では発育できない株があり、０．５％以
下および５．０％以上では発育しない。本面はｐＨ６〜
ｌＯの範囲内で発育し、ノボビオシンならびに ｖｉｂｒｉｏｓｔａｔｉｃ　ａｇｅｎｔ　Ｏ／１２９に
感受性を有する。

（Ｃ）生理学的性質 ■硝酸塩の還元　　　　　　　　　＋註１）■ペプトン
からＮＨ３の生成　　　弱十■ＭＲテスト　　　　　　
　　　　＋ ■ＶＰテスト ■インドールの生成　　　　　　　十 〇硫化水素の生成 ■デンプンの加水分解　　　　　　十 ■クエン酸の利用 Ｓｉｍｍｏｎｓ’ｃｉｔｒａｔｅ　　　　　　　　　＋
Ｋｐ−ｃｉｔｒａｔｅ　　　　　　　　　　　　＋■色
素の生成　　　　　　　色素は産生しない［相］ウレア
ーゼ ■オキシダーゼ　　　　　　　　　＋ ■カタラーゼ　　　　　　　　　　＋ ■生育の範囲 （ｉ）ｐＨ５では生育せず、ｐＨ６〜１０の範囲でよく
生育する。

（ｉｉ）１０°Ｃでは生育は弱く、２０〜２５°Ｃ及び
３０°Ｃでよく生育し、３５℃以上では生育しない。

（ｉｉｉ）１．０〜３．０％の食塩に耐塩性を示す。

■酸素に対する態度 通性嫌気性（好気性、嫌気性いずれにも発育する） ［相］０−Ｆテスト ［相］下記の糖類から酸の生成の有無 なお、ガスは生成しない。

（１）　　Ｌ−アラビノース （２）Ｄ−キシロース （３）Ｄ−グルコース （４）Ｄ−マンノース （５）Ｄ−フラクトース （６）Ｄ−ガラクトース （７）麦芽糖 （８）　　ショ糖 （９）乳糖 ００）トレハロース （Ｉｔ）　　Ｄ−ソルビット ０２）Ｄ−マンニット ０３）　　イノジット ０４　　グリセリン　　　　　　　　＋０５）　　デン
プン　　　　　　　　　　　＋注１）は７菌株中１菌株
は−を示す。

（ｄ）　　さらに本面の特徴を示す。

生化学的性状の試験結果を示すと、次のとおりである。

オキシダーゼおよびカタラーゼを産生し、ブドウ糖を醗
酵的に分解する。ＩＭＶｉＣ反応は（＋、＋、−１十）
であり、硫化水素を産生ぜず、１株を除くすべての株が
硝酸塩を還元する。また、β−ガラクトシダーゼ産生性
、凝乳酵素産生性は陽性であるが、グルコン酸酸化性、
２．３−ブタンジオール脱水素酵素産生性は陰性である
。でん粉加水分解性、ゼラチン液化性およびトリブチリ
ン消化性は陽性であるが、アルギニン加水分解性、リジ
ン・アルギニン・オルニチン脱炭酸性は陰性である。ま
た、ウサギ血液に対して溶血性（β型）を示す。また、
チロシン、キサンチンを分解し、千ロジンを含有する培
地中にメラニン色素を産生ずる。

生化学的性状のうち、唯一の炭素源としての有機化合物
の利用性試験の結果、分離菌は乳酸、コハク酸、グルコ
ン酸、ブドウ糖、乳糖、ソルビットなどを利用するが、
ギ酸、マロン酸、アラニン、チロシン、アラビノースな
どを利用しない。

また、炭水化物からの酸産生性試験の結果、分離菌はブ
ドウ糖、フラクトース、白糖、乳糖、グリコーゲンなど
を分解し、酸を産生ずるがガスを産生じない。特に、ブ
ドウ糖を分解するがアセトインを産生じない（ＶＰ反応
陰性）。

方、アラビノース、ラフィノース、マンニット、イノシ
ントなどを分解しない。

これらの分離菌の形態学的、生物学的ならびに生化学的
性状をＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｓｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ、１
．Ｂｅｒｇｅｙ　　ｓ　　Ｍａｎｕａｌ　　ｏｆ　　Ｄ
ｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ
、　８ｔｈ　ｅｄ、および坂崎の記載〔納谷書店発行藤
野恒三部他編坂崎利−著「腸炎ビブリオとその類似細菌
」８３〜１１５頁（１９６７年）他〕の記載などと比較
した結果、分類学上の位置として、Ｖｉｂｒｉｏ属に同
定するのが妥当と思われる。すなわち、分離菌はダラム
陰性、無芽胞、の桿菌で端在性の単鞭毛をもち、運動性
を有する。

ブドウ糖を醗酵的に分解するが、ガスを産生せず、唯一
の炭素源としてのブドウ糖、フラクトース、麦芽糖を利
用する。また、オキシダーゼを産生じ、ｖｉｂｒｉｏｓ
ｔａｔｉｃ　ａｇｅｎｔ　Ｏ／１２９およびノボビオシ
ンに感受性を有する等の性質を示し、Ｂｅｒｔｅｙ’ｓ
　Ｍａｎｕａｌおよび坂崎によるＶｉｂｒｉｏ属細菌の
定義と完全に一致した。

また、分離菌の種としての位置関係を明確にするために
、Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉＬｌａｒｕｍ　ＮＣＭＢ　
６、Ｖ、ｐａｒａｈａｅｍｏＬｙｔｉｃｕｓ　ｂｉｏｔ
ｙｐｅ　ＩおよびＭｕｒｏｇａらがアユから分離したｎ
ｏｎ−ｃｈｏｌｅｒａ　ｖｉｂｒｉｏなど、既知のＶｉ
ｂｒｉｏ属細菌と同一条件下での性状試験を行い、数値
分類を試みたところ、Ｖ、ａｎＨｉＬｌａｒｕｍ　ＮＣ
ＭＢ　６及びＶ、ａｎｇｕｉＬＬａｒｕｍ　ＮＣＭＢ　
４０７　ＣＶ、ｉｃｈｔｈｙｏｄｅｒｍｉｓ）との間に
比較的高い相似性が認められた。しかし、分離菌と上記
菌種との５−ｖａｌｕｅは７４．９〜８０．５％であっ
たことから、同一種と断定するには無理があるように思
われる。次に、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ
Ｓｙｓｔｅｍａｔｔｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　、
　ｖｏｌ、１に掲げられたＶｉｂｒｚＯ属細菌２０種の
主要性状と分離菌のそれとを比較した。前記の数値分類
によって、分離菌との相似性が比較的高かったＶ、ａｎ
ｇｕｉＬａｒｕｍ　ｂｉｏｔｙｐｅ　ＩＩとは、３５°
Ｃでの発育性、アルギニン加水分解性、ブドウ糖からの
アセトイン産生性（ＶＰ反応）、乳糖利用性等の性状が
、またＶ、ａｎＢｉＬｌａｒｕｍ　ｂｉ。

ｔｙｐｅ　ＩＩとは、アミラーゼおよびリパーゼ産生性
、トレハロース・乳糖・グルコン酸・乳酸利用性など、
多くの点で異なる性質を示した。さらに、Ｖ。

ｃｈｏＬｅｒａｅをはしめ Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌに記載されたＶｉｂｒ
ｉｏ属細菌２０種のいずれとも、多（の性状を異にした
。

このほか、Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌに記載され
ていないいくつかの新しいＶｉｂｒｉｏ属細菌や病エビ
からしばしば分離されるＶｉｂｒｉｏ属細菌について生
物学的及び生化学的性状について検討したところいくつ
かの点で顕著に相違した。

このように本発明者らが病クルマエビから分離した細菌
の生物学的ならびに生化学的性状は、既知のＶｉｂｒｉ
ｏ属のそれとは異なった点が多く、該当する菌種はみい
だせなかった。したがって、本発明者らはこれを新種と
判断し、ビブリオペネウス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅ
ｕｓ）　　と命名した。

本発明のワクチンは、上記したビブリオベネウス（Ｖｉ
ｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）を５０％海水ブイヨン培地
で培養し、これを不活性化することによって製造される
。培養は２５°Ｃで２４時間程度振盪培養することが好
ましく、また不活性化処理は、培養液中にホルマリンを
０．５％程度加えるかあるいは加熱処理して死菌化する
ことによって行うことが好ましい。細菌数は約１０９細
胞／−程度が好ましい。

本発明のワクチンは、このワクチン溶液にエビ類を浸漬
するかあるいはエビ類にこのワクチン溶液を噴霧するこ
とによって使用される。

ワクチン溶液は海水で１０倍乃至１０００倍に希釈して
使用することが好ましい。また、シェア期から族エビま
でのいかなる成長期や大きさのエビ類にも使用できる。

エビ類をワクチン溶液に浸漬する場合は、ワクチン溶液
を海水に１０％に希釈して５〜１０分、１％に希釈して
３０〜６０分、０．１％に希釈して６０分間浸漬するこ
とが一応の目安とされる。また噴霧する場合は、０．１
〜１０％に希釈した溶液を約１０９細胞度噴霧すること
が一応の目安とされる。

また、本発明のワクチンは経口投与によっても有効であ
り、その場合のワクチンの製造法ならびに使用法は下記
に示すとおりである。

すなわち、ビブリオ　ペネウス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｅｎ
ａｅｕｓ）を５０％海水ブイヨン培地で２５°Ｃ１２４
時間程度振盪培養後、培養液中にホルマリンを０．５％
程度加えるか、あるいは加熱処理して死菌化したのち遠
心分離を行って培養液を除去する。さらに、滅菌した５
０％海水で菌体を洗浄後、遠心分離を行って５０％海水
を除去し菌体を得る。

シェアからボストラーハまでの幼生用経口ワクチンの場
合は、卵黄を主とした幼生用餌料に、その０．０５〜１
．０％の割合（濡面重量）の上記菌体を混合後、この混
合物に６０°Ｃの温度下でゼラチンをコーティングした
後、スプレードライ法によって約５０μｍの微粒子とす
る。

この微粒子状にしたワクチンをエビ類の幼生１００尾あ
たり１日量として５〜１０■を数回に分けて３〜７日間
連続して経口投与する。

成エビ用経ロワクチンの場合は、卵黄にその１０％の割
合（濡面重量）の上記菌体を混合後、幼生用ワクチンの
場合と同じ方法でゼラチンをコーティングし、微粒子と
する。さらに、微粒子状にしたワクチンをエビ類の飼料
に０．５〜５％の割合で加えたのちペレット状にする。

ワクチンを混合したペレット飼料を１日量として、エビ
の体重の１〜３％の割合で５〜１０日間連続して経口投
与する。

このようにして処理すると、ワクチンが浸漬法および噴
霧法の場合にはエビ類のエラなどを介して、また経口投
与法の場合は消化管を介して体内に取り込まれ、血球細
胞の活性化及び抗菌性物質の産生を促して侵入したビブ
リオ菌やその他の病原菌から生体を防御する機能が促進
され、細菌感染を予防することができる。

この結果、ビブリオ病などの細菌性疾病による斃死率を
著しく低下させることができる。

次に実施例をあげて本発明をさらに具体的に説明するが
、本発明はこれに制限されるものではない。

実施例１の１（ワクチンの製造） 肉エキス３ｇ、ペプトンＬｏｇ、塩化ナトリウム５ｇを
５０％天然濾過海水１，０ＯＯｄ　（天然濾過海水５０
０戚＋蒸留水５００ｄ）に溶解し、ｐＨ７，２〜７．６
に調整したのち滅菌（１２１°Ｃ１１５分）して液体培
地とした。これにビブリオ　ペネウス（Ｖｉｂｒｉ。

ｐｅｎａｅｕｓ）を接種し、２５°Ｃで２０〜２４時間
振とう培養した。この時の細菌数は約１０９細胞／ｄに
達した。

ホルマリン死菌ワクチンの場合には、この振とう培養液
に０．５％の割合にホルマリンを加えて死菌としたのち
、ｐＨを７．０〜７，５に再調整した。

加熱死菌ワクチンの場合には、この振とう培養液を加圧
・加熱処理（１１５°Ｃ１１０分間）して死菌としたの
ち、ｐｉを７．０〜７．５に再調整した。

実施例１の２（経口ワクチンの製造） 実施例１の１の方法で作製したホルマリン死菌または加
熱死菌ワクチン液を遠心分離して培養液を除去し、滅菌
した５０％海水で菌体を洗浄後、再び遠心分離を行って
５０％海水を除去し、菌体を回収した。

シェア期からボストラーバ期までの幼生用経口ワクチン
の場合には、卵黄を含む幼生用餌料に、その０．０５〜
０．５％の割合（濡面重量として）の上記菌体を混合後
、この混合物に６０°Ｃの温度下でゼラチンをコーティ
ングしたのち、スプレードライ法によって直径約５０μ
ｍの微粒子とした。

成エビ用経ロワクチンの場合は、卵黄にその１０％の割
合（濡面重量として）の上記ホリマリン死菌または加熱
死菌洗浄菌体を混合後、この混合物に６０゛Ｃの温度下
でゼラチンをコーティングしたのち、スプレードライ法
によって直径約５０μ端の微粒子とした。さらに、この
微粒子状のワクチンをエビ類の飼料に０．５〜５％の割
合で加えたのちペレット状にした。

実施例２（ワクチンによる感染予防効果）実施例１の１
の方法で作製しワクチンを海水に１％の割合で加えて攪
拌し、細菌数１０’細胞／戚を含有するワクチン溶液を
作製した。

このワクチン希釈液にクルマエビを約６０分間浸漬し、
その後水槽で３０日間飼育した。

また、別に、このワクチン希釈液をクルマエビにワクチ
ン希釈液が直接当たるようにして約１０秒間噴霧し、そ
の後水槽で３０日間飼育した。

また、クルマエビに、ワクチンを投与せず、水槽で３０
日間飼育したものを対照とした。

なお、これらの浸漬区、噴霧（スプレー）区及び対照区
は平均体重２０ｇのクルマエビを１区当り約２０尾ずつ
用いた。各区のクルマエビは、前記のようにして３０日
間飼育後、クルマエビ１尾当り病原菌（ビブリオ　ベネ
ウスの強毒株）２．０×１０３細胞を筋肉内に接種し、
接種後１０日間飼育して各区の斃死状況を調べ生残率を
求めた。

本試験を異なる時期に２回実施した。その結果を第１表
及び第１図に示す。

この結果から判るように、ワクチンを投与していない対
照区のクルマエビは、病原菌を接種後１０日間で７７．
８〜８０％が斃死し、斃死したエビの心臓からは接種し
た病原菌が再分離された。これに対し、浸漬区およびス
プレー区では、それぞれ２７．３〜３０．０％、３６．
４〜３７．５％の斃死率にとどまり、対照区にくらべて
ワクチン区の方が有意に高い生残率を示した（Ｐ　＜０
．０１）。

また、本発明のワクチンに用いたビブリオペネウスＣＶ
ｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）は細胞壁外層に存在する
リポ多糖の質と量が他の細菌と異なるために、他の菌種
以上にエビ類の非特異的生体防御機能を高めることがで
きる。本発明者らは、ビブリオペネウス（Ｖｉｂｒｉｏ
　ｐｅｎａｅｕｓ＞　とビブリオ属の他種およびビブリ
オ属以外の細菌をワクチンとして用い、感染防御効果を
比較したところ、ビブリオペネウスはどの菌種よりも高
い予防効果を有するとともに、ビブリオペネウス以外の
細菌による感染症をも予防することが可能であることを
見出した。実施例３にその一例を示す。

実施例３〔本発明のワクチンとエビ由来のビブリオアン
ギュラルム（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉＬＬａｒｕｍ）
ワクチン七の比較〕 ビブリオペネウス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）お
よびビブリオアンギュラルム（Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕ
ｉｌｌａｒｕｍ）の各々を実施例１と同様に５０％海水
ブイヨンで２５°Ｃ１２４時間振とう培養後、ホルマリ
ンを０．５％の割合に加えて死菌とし、これをワクチン
として用いた。

試験は実施例２と同様に浸漬区、スプレー区、対照区を
設けて実施し、平均体重１８ｇのクルマエビをワクチン
１種類につき３０尾ずつ用いた。

上記のワクチン（細菌数約１０９細胞／ｄ）を、浸漬区
では海水中に１％の割合に加えて攪拌した液（細菌数約
１０７細胞／−）にクルマエビを６０分間浸漬後、水槽
で３０日間飼育した。スプレー区では、スプレーを用い
てワクチンを約１０秒間直接クルマエビに噴霧したのち
、水槽で３０日間飼育した。

対照区のクルマエビにはワクチンを投与せず、他の区と
同じ方法で３０日間飼育した。

３０日間飼育した各区３０尾のクルマエビのうち１５尾
ニハ、１尾当りビフ゛リオペネウスＣＶｉｂｒｉｏ　ｐ
ｅｎａｅｕｓ）の３．８Ｘ１０３細胞を、また残りの１
５尾には、１尾当りビブリオアンギュラルム（Ｖｉｂｒ
ｉｏ　ａｎｇｕｉＬｌａｒｕｍ）の７．３Ｘ１０’細胞
をいずれも筋肉内接種し、接種後１０日間飼育して各区
の斃死状況を調べ生残率を求めた。

試験の結果を第２表に示す。すなわち、ビブリオペネウ
スＣＶｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）ワクチンを浸漬法
およびスプレー法によって投与したクルマエビに対し、
ワクチン投与３０日後にビブリオペネウスＣＶｉｂｒｉ
ｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）またはビブリオアンギュラルム（
Ｖｉｂｒｉｏ　ａｎｇｕｉＬＬａｒｕｍ）の生菌を筋肉
内に接種した場合、６６．７〜８６．７％の高い生残率
を示したが、ビブリオアンギュラルム（Ｖｉｂｒｉｏ　
ａｎｇｕｉＬＬａｒｕｍ）ワクチンを投与したクルマエ
ビに上記の生菌を筋肉内接種した場合の生残率は低く　
（１３，３〜５３．３％）、ワクチンを投与していない
対照区との間に有意の差は認められなかった。

実ｔｊ例４（ウシエビの幼生に経口ワクチンを投与した
場合の生残率） 実施例１の２の方法で、ビブリオ　ペネウス（Ｖｉｂｒ
ｉｏ　ｐｅｎａｅａｓ）のホルマリン死菌を濡面重量に
して０．０５〜５％加えた幼生用経口ワクチンをウシエ
ビのシェア期からミシス期までの期間に、幼生１００尾
当り１日量として８■を４回に分けて５日間連続投与し
た。

試験は、海水１２を入れたビーカー８個にシェア期のウ
シエビを１００尾ずつ収容して、１試験区当り２００尾
とし、４つの試験区を設けて実施した。ホルマリン死菌
を１区には０．０５％、２区には０．５％、３区には５
％添加した幼生用経口ワクチンを上記の量投与し、４区
は対照区としてホルマリン死菌を無添加の餌料を５日間
与えた。６日目に各区の生残屋敷を調べ、斃死した幼生
については細菌検査を行った。

試験の結果を第３表に示す。すなわち、ビブリオ　ベネ
ウス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅａｓ）経口ワクチンを
投与したウシエビ幼生の生残率は２４，０〜３８，５％
であったのに対して、ワクチンを投与していない対照区
の生残率は１〜３区にくらべて有意に低く、１６．５％
であった（Ｐ＜０．０１）。また、斃死した幼生の細菌
検査の結果、経ロワクチン投与区よりも対照区の方が細
菌の検出率が高かった。

以下余白 実施例５（クルマエビに経口ワクチンを投与した場合の
感染予防効果） 実施例１の２の方法で、ビブリオ　ベ不ウス（Ｖｉｂｒ
ｉｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）のホルマリン死菌をゼラチンで
コーティングした微粒子をペレット飼料に０．５〜５％
添加（ホルマリン死菌添加率にして０．０５〜０．５％
）した成エビ用経ロワクチンをクルマエビに、体重の１
％の割合で７日間連続して経口投与した。

試験は、海水１００２を入れた水槽４個に平均体重９．
２ｇのクルマエビを５０尾ずつ収容し、４つの試験区を
設けて実施した。ホルマリン死菌を１区には０．０５％
、２区には１．０％、３区には５％添加した成エビ用経
ロワクチンの上記量を７日間投与し、その後は市販の飼
料を与え３０日間飼育した。４区は対照区とし、ホルマ
リン死菌を除いた以外はワクチン投与区と同一の飼料を
７日間与え、その後は市販の飼料を投与して３０日間飼
育した。３０日間飼育後、１試験区４０尾のクルマエビ
について、１尾当り病原菌（ビブリオ　ペネウスの強毒
株）の１．２Ｘ１０３細胞を筋肉内に接種し、接種後１
０日間飼育して各区の斃死状況を調べ生残率を求めた。

試験の結果を第４表に示す。すなわち、ワクチンを投与
しない対照区のクルマエビは、病原菌を接種後１０日間
で８５．０％が斃死し、斃死したエビの心臓からは接種
した病原菌が再分離された。これに対し、ビブリオ　ベ
ネウス（Ｖｉｂｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕ、ｓ）のホルマリ
ン死菌を０．０５〜０．５％含有する経ロワクチン投与
区の斃死率は、３７．５〜４７．５％にとどまり、対照
区にくらべてワクチン区の方が有意に高い生残率を示し
た（Ｐ＜０．０１）。

以下余白 光遭廊じ九果 本発明では、本発明者らが病エビから分離したビブリオ
菌の新菌種であるビブリオ　ベネウス（Ｖｉｂｒｉｏ　
ｐｅｎａｅｕｓ）を不活性化し、これをエビ類の細菌性
疾病の予防ワクチンとして用いることによって、エビ類
の細菌性疾病を効率よく予防することができる。

とくに、本発明に用いたビブリオ　ペネウス（Ｖｉｂｒ
ｉｏ　Ｐｅｎａｅｕｓ）は、その細胞壁外層に他の細菌
とは異なる質および量のリボ多糖を有するために、エビ
類の血球やその他の生体防御機能をより強く刺激し活性
化させる。活性化されたこれらの機能は、を椎動物の免
疫グロブリンのようにワクチンに用いた当該細菌による
感染症のみを予防するといった特異的なものではなく、
比較的多くの細菌に対して賞食作用や抗菌作用を発揮す
る。したがって、本発明のワクチンを予めエビ類に投与
しておくことによって、養殖産業上問題となっている種
々の細菌性疾病による被害を軽減することが可能であり
、生産性の向上が期待できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例２により、本発明のワクチン投与３０
日後のクルマエビに病原菌ビブリオ　ペネウス（Ｖｉｂ
ｒｉｏ　ｐｅｎａｅｕｓ）を接種したのちのクルマエビ
の生残率の推移を示す。 図において ・−はワクチン投与群を、−〇−は対照を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）不活性化したビブリオペネウス（ＶｉｂｒｉｏＰ
   ｅｎａｅｕｓ）を有効成分として含有することを特徴と
   するエビ類の細菌性疾病予防ワクチン。
2. （２）エビ類の細菌性疾病がエビ類のビブリオ病である
   請求項（１）に記載の細菌性疾病予防ワクチン。
3. （３）ビブリオペネウス（ＶｉｂｒｉｏＰｅｎａｅｕｓ
   ）を海水ブイヨン培地で培養し、これにホルマリンを加
   えるかまたは加熱処理してビブリオペネウスを死菌にし
   て不活性化し、これを有効成分とすることを特徴とする
   請求項（１）または（２）に記載のエビ類の細菌性疾病
   予防ワクチンの製造法。