JP2015137254A - エビにおけるビブリオ感染に対するワクチン及びその作製方法 - Google Patents
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Description
(a) ビブリオ菌の細胞を培養して増殖させる工程と、
(b) 増殖した細胞を採取し、採取した細胞を第1部分と第2部分に分ける工程と、
(c) 採取した細胞の第1部分を加熱により不活化し、熱不活化ビブリオ細胞を取得するとともに、採取した細胞の第2部分をホルマリンにより不活化し、ホルマリン不活化ビブリオ細胞を取得する工程と、
(d) 熱不活化ビブリオ細胞をホルマリン不活化ビブリオ細胞と混合し、エビにおけるビブリオ菌に対するワクチン組成物を得る工程と、
を含む。
ホワイトエビのバナメイエビが台湾基隆の海岸に隣接するUniversity Marine Animal Centerから実験室に提供された。エビはエアレーションした海水(塩分濃度35%)を入れた屋内のガラス繊維サーキュレータ水槽に入れられ、実験が開始されるまで3週間順応された。順応期間中、エビは1日2回体重3%のエビ用配合飼料(Tairou Feed Company、台湾台南市)で給餌された。
本実験では斃死したバナメイエビから分離したV.alginolyticusの病原菌株が使用された(Liu et al.、2004)。細菌はトリプティックソイブロス(TSBに2%のNaClを添加、Difco、米国メリーランド州スパークス市)で24時間にわたり28℃で培養された後、7155xgで20分間にわたり4℃で遠心分離された(Yeh et al.、2009)。上清が除去され、細菌ペレットが1.9×107 で海水(MS)中に再懸濁され、4.0×108コロニー形成単位(cfu)ml-1で各細菌懸濁液として免疫パラメータの調査と生菌攻撃試験用に調製された。Bioresource Collection and Resource Center(台湾新竹市)より取得された枯草菌(BCRC10448)が上述同様に培養され、細菌懸濁液が4.0×108cfu ml-1で生菌攻撃試験用に調製された。
前記細菌懸濁液(1.9×107 cfu ml-1)が4500xgで10分間、4℃で遠心分離され、細菌ペレットがMSで洗浄された後再度遠心分離され、培養液が除去された。最後に、ペレットが同量のMS中に再懸濁され、121℃で20分間オートクレーブ処理された。オートクレーブ後の細菌懸濁液が熱不活化処理に使用された。別の細菌懸濁液(1.9×107cfu ml-1)が遠心分離され、上述同様にペレットが取得された。MS中の細菌懸濁液に最終濃度1%ホルマリンとなるようにホルマリンが添加され、4℃で24時間インキュベートされた。前記細菌懸濁液が細菌ペレットを回収するために4500xgで10分間、4℃で遠心分離され、その後MSで洗浄後、再度遠心分離されて残留するホルムアルデヒドが除去された。ホルマリン処理後の細菌懸濁液がホルマリン不活化処理に使用された。
7つの研究が実施された。実験は特定の病原菌に対する一次暴露(PE)及び二次暴露(SE)を試験するための旧来の免疫付与に基づいて計画された(図1)。(1)対照エビ、MS−PEエビ、LVa−PEエビ、HVa−PEエビ、FVa−PEエビの免疫パラメータが0〜7日間にわたり調査された。(2)5日目に対照エビ、HVa−PEエビ、FVa−PEエビのHPTの血球細胞増殖及び分裂指数(mitotic index)が測定された。(3)対照エビ、7日HVa−PEエビ(HVaへの一次暴露を受けて7日後のエビ)、7日FVa−PEエビ(FVaへの一次暴露を受けて7日後のエビ)の抵抗力がLVaへのSE後に調査された。(4)対照エビ、7日HVa−PEエビ、7日FVa−PEエビの免疫パラメータがLVaへのSEの0.5〜7日後に調査された。(5)対照エビ、7日HVa−PEエビ、7日FVa−PEエビのHPTの血球細胞増殖及び分裂指数(mitotic index)がLVaへのSEの3日後に調査された。(6)LVaへのSEを受けた7〜35日HVa−PEエビと7〜35日FVa−PEエビの凝集、食作用、クリアランスが調査された。(7)LBs攻撃を受けた7〜28日HVa−PEエビと7〜28日FVa−PEエビの食作用及びクリアランスが調査された。エビの重量は10.21〜12.63gの範囲であり、平均は11.42±1.21g(平均±SD)であった。処理間に有意なサイズ差は見られなかった。脱皮間段階のエビのみが研究に使用された。脱皮段階は表皮の部分的収縮が識別できる尾肢を検査することで判定された(Chan SM et al.、1988)。実験期間中、水温26〜29℃、pH7.89〜8.27、塩分濃度33‰〜35‰、溶存酸素量(DO)5.68〜6.84mg L-1の範囲であった。
5つの処理があり、各処理が5つの異なる時間(0、0.5、1、3、5、7日)で実施された。(1)対照エビ、(2)MS投与エビ、(3)LVa、(4)HVa、(5)FVaがあった。8尾のエビが各処理に毎回使用された。各エビ頭胸部の腹部静脈洞(ventral sinus)に細菌懸濁液(LVa、HVa、またはFVa)20μlが1.9×107cfu ml-1の濃度で注射され、結果3.8×105cfuエビ-1となった。処置なしのエビが背景対照とされ、MS20μlの投与を受けたエビが陽性対照群とされた。0.5、1、3、5、7日後に血リンパが採取された。血リンパのサンプリング及び希釈血リンパの作製は先述された手順に従って行われた(Yeh et al.、2009)。簡単に説明すると、血リンパ(300μl)が各エビの腹部静脈洞から個別に採取され、2700μlの抗凝固液で希釈された。血リンパ抗凝固液混合物(希釈血リンパ)が4つの管に入れられた。管には500、1000、1000、500μlの希釈血リンパがそれぞれ入れられ、それぞれ(1)血球数とRB、(2)PO活性、(3)SOD活性、(4)リゾチーム活性を測定するために使用された。
3つの処理があり、各処理に5尾のエビを使用した。これらのエビは、(1)MS(対照)、(2)HVa、(3)FVaの投与を受けたものである。上述と同様の方法でエビにMS、HVa、またはLVaが注射された。5日後、エビがサンプルされ、有糸分裂を阻害するためそれぞれビンブラスチン(V1377、Sigma)が注射された。簡単に説明すると、エビは腹部静脈洞にビンブラスチン60μl(0.5mg ml-1)が注射され、通常の海水中にリリースされた(van de Braak et al.、2002)。12時間後、エビ頭胸部の背部にDavidsonの固定液3ml(30mlの95%エタノール、20mlの37%ホルムアルデヒド、10mlの酢酸、30mlの蒸留水)が注射された。HPTのサンプリング、固定、包埋、永久スライドの作製及びHPTの観察は先述された方法にしたがって行われた(van de Braak et al.、2002;Sirirustanaum et al.、2011;Bell et al.、1993)。
1つの生菌攻撃なしの処理と、3つの生菌攻撃処理の計4つの処理が行われた。PEの(1)MS投与、(2)HVa投与7日後、(3)FVa投与7日後のエビにSEとしてLVaの投与が行われ、これらが生菌攻撃ありの群とされた。各エビ頭胸部の腹部静脈洞に20μlのHVa(1.9×107 cfu ml-1)またはFVa(1.9×107 cfu ml-1)細菌懸濁液が注射され、結果3.8×105cfuエビ-1とされた。生菌攻撃ありの対照群として、エビに同量の滅菌MSが注射された。7日後、各エビ頭胸部の腹部静脈洞に個別に20μlのLVaが4.0×108cfu ml-1で注射され、結果8.0×106cfuエビ-1とされた。生菌攻撃なしの対照エビにはPEとして同量のMSが、SEとして同量のMSが注射された。各群には30尾のエビが含まれた。実験エビと対照エビ(10尾水槽-1)は海水20L(35‰)を含む40Lの水槽に保持され、3つ複製された。したがって、120尾[(3×3×10)+(1×3×10)]がこの研究に使用された。1日目は12時間ごとに、それ以降は7日目の実験終了まで1日1回エビの生残が調査された。
(1)MSが投与されたエビ(対照エビ)、(2)7日後のHVa投与エビ(7日HVa−PEエビ)、(3)7日後のFVa投与エビ(7日FVa−PEエビ)の3つの処理が行われ、それぞれの処理が5つの異なる期間(0.5、1、3、5、7日)で調査された。8尾のエビが各処理と期間に使用された。さらに、背景値を得るために処理なしの8尾のエビが使用された。実験エビには20μlのHVaまたはFVa(1.9×107 cfu ml-1)が個別に注射され、結果3.8×105cfuエビ-1が通常の海水にリリースされた。対照エビには20μlのMSが注射された。7日後、エビに個別に20μlのLVaが1.9×107cfu ml-1で注射され、結果3.8×105cfuエビ-1とされた。LVa攻撃の0.5、1、3、5、7日後に血リンパが個別に採取された。血リンパのサンプリングと希釈された血リンパの作製は上述と同様に行われた。
第1の管から希釈血リンパ一滴が血球計に置かれ、位相差倒立顕微鏡(Leica DMIL、Leica Microsystems、ドイツヴェッツラー)を使用してHC、GC(semi−GCを含む)及び全血球数(THC)が測定された。残りの希釈血リンパ混合物は後の試験に使用された。
3つの処理が各処理5尾のエビで実施された。エビはPEとして(1)MS、(2)HVa、(3)FVaの投与を7日間受けた。8尾のエビが各処理と時間に使用された。エビに20μlのHVaまたはFVa(1.9×107 cfu ml-1)が個別に注射され、結果3.8×105cfuエビ-1が通常の海水(35% 塩分濃度)に7日間リリースされた。エビはSEとしてLVaが投与され、3日後エビがサンプリングされ、有糸分裂を阻害するために個別にビンブラスチン(V1377、Sigma)が注射された。後続のビンブラスチン注射、HPT固定、スライド染色、永久スライドの作製、細胞増殖と分裂指数の観察に係る手順は2.6節の説明と同様に実施された。
LVaへのSEのため、3つの処理があり、7、14、21、28、35日間PEとして(1)MS、(2)HVa、(3)FVaの投与を受けた後、SEとしてLVa(3.8×105cfuエビ-1)の投与を3時間受けたエビが、凝集された「細菌クラスタ」、食作用及びクリアランス観察のための実験に使用された。50μlの血リンパがサンプリングされ、50μlの抗凝固液とそっと混合された後、100μlの固定液(1%パラホルムアルデヒド)が添加され、30分間インキュベートされた。固定血球がサイトスピン(Thermo、英国シャンドン)を1000rpmで10分間使用してスライドガラス上で拡散された。スライドガラスがLiu氏A溶液で30秒間、Liu氏B溶液で60秒間染色された後、流水で30秒間洗浄された。異なる処理のV.alginolyticusの細胞が上述と同様に染色された。貪食能とクリアランス能力の実験が先述された方法(Tayag CM et al.、2010)に従って実施された。貪食能は貧食率(PR)として定義され、PR(%)=[(貪食性血球)/(合計血球)]×100で表された。食作用係数(PI)は、PI=[(貪食性血球によって貪食される細菌)/(貪食性血球)]で表された。対照エビ(MS)における細菌コロニー数が対照群として表され、HVa投与エビ及びFVa投与エビのコロニーがテスト群とされた。クリアランス能力は「100−[(テスト群のcfu)/(対照群のcfu)]×100」で表された。LBsの比較のために、3つの処理が行われた。エビに(1)MS、(2)HVa、(3)FVaを投与した7、14、21、28日後に、LBs攻撃(3.8×105cfuエビ-1)を3時間受けたエビが食作用とクリアランス観察の実験に使用された。貪食能、食作用係数、クリアランス能力は先述されたものと同様に実施された。
細菌懸濁液(1.9×107cfu ml-1)が4500xg、4℃で10分間遠心分離され、細菌ペレットがMSで洗浄され、再度遠心分離されて培養液が除去された。最後に、ペレットが同量のMSで再懸濁され、121℃で20分間オートクレーブ処理された。オートクレーブ後の細菌懸濁液が熱不活化処理に使用された。別の細菌懸濁液(1.9×107cfu ml-1)が遠心分離され、上述と同様にペレットが取得された。MS中の細菌懸濁液に最終濃度1%ホルマリンまでホルマリンが添加され、4℃で24時間インキュベートされた。前記細菌懸濁液が細菌ペレットを回収するために4500xgで10分間、4℃で遠心分離され、その後MSで洗浄後、再度遠心分離されて残留するホルムアルデヒドが除去された。ホルマリン処理済みの細菌懸濁液がホルマリン不活化処理に使用された。FVaとHVaの混合物がFVa(1.9×107cfu ml-1)1分量にHVa(1.9×107cfu ml-1)1分量を追加して2分量のFVa+HVa混合物(1.9×107cfu ml-1)を取得することで作製された。
すべてのデータに一元配置分散分析(ANOVA)が行われた。有意な差が0.05レベルで示された場合、多重比較(テューキー)検定を使用してSASコンピュータソフトウェア(SAS Institute、米国ノースカロライナ州ケーリー)で処理間の有意差が調査された。比率データ(抵抗試験)は分析の前に逆正弦変換を使用して正規化(normalized)された。統計的有意差はpが<0.05であることが要求された。
異なる期間の対照エビとMS投与エビにおいてHC、GC、THC、PO活性、RB、SOD活性、リゾチーム活性に有意な差は見られなかった。LVa投与エビのHC、GC、THCは0.5日後に減少し、1日後に最低レベルに達した後、0.5〜7日間にわたり背景値より低いままであった。HVa投与エビのHC、GC、THCは1〜5日間増加した後、7日後に背景値に戻った。FVa投与エビのHC、GC、THCは0.5日後に減少したが、その後増加し、5日目に最高レベルまで増加した(図2)。
5日目の対照エビ、HVa投与エビ、FVa投与エビのH&E染色HPT光学写真が取得された(データ未表示)。HVa投与エビとFVa投与エビの増殖細胞割合が有意に増加した(図5A)。5日目の対照エビ、HVa投与エビ、FVa投与エビのPI染色HPTの蛍光写真が取得され、HVa投与エビとFVa投与エビで有糸分裂細胞の数が多いことが観察された(データ未表示)。HPTにおける分裂細胞比率で表される分裂指数は、対照エビのそれよりHVa投与エビとFVa投与エビで有意に高かった(図5B)。
生菌攻撃なしの対照エビすべてが生残した。対照的に、生菌攻撃群では0.5日後に斃死の発生が開始した。3〜7日目でHVa投与エビとFVa投与エビ間に生残率に有意な差は見られなかった。しかし、5〜7日目でFVa投与エビのほうが(83.3%)HVa投与エビ(70%)より生残率が高かった。対照エビの生残率は生菌攻撃後4〜7日目で40%とずっと低かった(図6)。
SEとしてのLVa後0.5〜7日目に対照エビの免疫パラメータが減少した。7日HVa−PEエビの免疫パラメータはSEとしてのLVa後の3〜7日目に徐々に増加したが、背景値よりも低い値のままであった。7日FVa−PEエビのHC、GC、THCはSEとしてのLVa後0.5〜1日目より低かったが、その後増加し、SEとしてのLVa後3〜7日目に背景値と同様になった。7日FVa−PEエビのPO、RB、SOD、リゾチーム活性はSEとしてのLVa後1日目に増加し、SEとしてのLVa後0.5〜7日目に値は背景値と同様になった(図7、図8)。
SEとしてのLVa後、SE後3日目の対照エビ、7日HVa−PEエビ、7日FVa−PEエビのH&E染色HPTの光学写真を図10Aに示す。SEとしてのLVa後、7日FVa−PEエビの増殖細胞割合は7日HVa−PEエビと対照エビのそれより有意に高かった(図10B)。SEとしてのLV後の対照エビ、7日HVa−PEエビ、7日FVa−PEエビのPI染色HPTの蛍光写真を図10Cに示す。FVa投与エビにおいて有糸分裂細胞(矢印)の数が多いことが観察された。SEの3日後7日FVa−PEエビの分裂指数は対照エビと7日HVa−PEエビよりも有意に高かった(図10D)。
対照エビ、7日HVa−PEエビ、7日FVa−PEエビの血球染色の後、3時間後のLVa投与を図11Aから図11Cに示す。HVa及びFVa処理において、細菌が凝集して細菌クラスタを形成した後、血球に付着した。両方の処理において、HCとSGCによる細菌クラスタの貪食が観察された(図11D、図11E)。同様の細菌凝集と貪食性HC及びSGCの現象が14日HVa−PEエビと14日FVa−PEエビの両方(図11F、図11G)、及び21日HVa−PEエビと21日FVa−PEエビの両方(図11H、11I)で観察された。LVa、HVa、FVaのインタクトがLiu染色法(Liu’s staining)により確認された。
HVaとFVa(CFU比1:1)の組み合わせ混合物の投与を受けたエビの血リンパにおけるクリアランス能力を図13に示す。エビは7つの群に振り分けられ、HVaとFVa(CFU比1:1)の組み合わせ混合物が注射された。その後各群が組み合わせ混合物(HVa+FVa)の投与を受けてからそれぞれ7、14、21、28、35、42日後にLVaに暴露された。LVaへの暴露の3時間後にクリアランス能力の分析用にエビから血リンパが採取された。血リンパ中のLVa残留量が少ないということは、クリアランス能力の高さを示唆している。図13に示すように、HVaとFVaの組み合わせ混合物は処理から42日目まで40%のクリアランス能力を示した。図12Cに示すようにHVa投与エビとFVa投与エビの結果が28日より後より高い能力を維持していないことと比較して、HVaとFVaの組み合わせ混合物により誘導されたエビの免疫は向上され、延長されている(保護期間が28日間に対して42日間と1.5倍より長くなっている)。
現在の研究結果から、HVaとFVaの両方がV.alginolyticusへのSEからエビを保護するワクチンとして使用できる。一次免疫パターン、二次免疫パターン、高められた食作用、免疫誘発の強さに基づきFVaはよりよい候補であり、一方HVaは一次免疫における早期の増加、二次免疫パターンにおける若干の向上、高められた食作用、免疫誘発の若干の強さに基づき、免疫刺激剤とワクチンの両方としての二面性を示した。したがって、HVaは特異的認識および記憶の誘導を促進する「免疫活性化物質」または「アジュバント」として使用することができる。FVaとHVaの組み合わせ混合物は免疫応答を調節し、エビ養殖産業においてビブリオ病に対する免疫力を高めるための「ワクチン成分」として有効に作用する。
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Claims (10)
- エビにおいてビブリオ菌により引き起こされる感染に対するワクチン組成物であって、前記ビブリオ菌の熱不活化細胞(熱不活化ビブリオ細胞)と前記ビブリオ菌のホルマリン不活化細胞(ホルマリン不活化ビブリオ細胞)を含み、そのうち、前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞が、エビにおいてビブリオ菌に対し特異的な免疫を誘導するために有効な量で存在することを特徴とする、ワクチン組成物。
- 前記ビブリオ菌が、V.alginolyticus、V.anguillarum、V.campbelli、V.damsella、V.fischeri、V.harveyi、V.logei、V.mediterrani、V.ordalii、V.orientalis、V.parahaemolyticus、V.pelagicus、V.splendidus、V.vulnificusを含む群より選択されたことを特徴とする、請求項1に記載のワクチン組成物。
- 前記ワクチン組成物が、注射または浸漬での投与用であることを特徴とする、請求項1または2に記載のワクチン組成物。
- 前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞がワクチン組成物中に合計で105−109CFU/mlの量で存在することを特徴とする、請求項1乃至3のいずれかに記載のワクチン組成物。
- 前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞が、前記ワクチン組成物中にCFU比0.1:1〜1:0.1で存在することを特徴とする、請求項1乃至4のいずれかに記載のワクチン組成物。
- 前記エビが、バナメイエビ(Litopenaeus vannamei)、ブラックタイガーエビ(Penaeus monodon)、クルマエビ(Marsupenaeus japonicas)、コウライエビ(Fenneropenaeus chinensis)、インドエビ(F. indicus)、ヨシエビ(Metapenaeus ensis)、レッドテールシュリンプ(F. penicillatus)、オニテナガエビ(Macrobrachium rosenbergii)を含む群より選択されたことを特徴とする、請求項1乃至5のいずれかに記載のワクチン組成物。
- ビブリオ菌のホルマリン不活化細胞(ホルマリン不活化ビブリオ細胞)から作製されたワクチンの免疫を向上するためのアジュバンドとしての前記ビブリオ菌の熱不活化細胞(熱不活化ビブリオ細胞)の使用。
- 前記熱不活化ビブリオ細胞が前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞と混合され、前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞単独と比較して、前記ビブリオ菌に対してより強化かつ延長された免疫応答を誘導できる混合物を形成することを特徴とする、請求項7に記載の使用。
- 前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞を混合して混合物を形成する工程を含むことを特徴とする、請求項1乃至6のいずれかにおいて定義されるワクチン組成物の作製方法。
- 前記混合物にアジュバントとしての追加成分を追加する工程を含まないことを特徴とする、請求項9に記載の方法。
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