JP2015137254A

JP2015137254A - エビにおけるビブリオ感染に対するワクチン及びその作製方法

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Publication number: JP2015137254A
Application number: JP2014009769A
Authority: JP
Inventors: 陳建初; Jiann Chu Chen; 林永慶; Yong Chin Lin
Original assignee: National Taiwan Ocean University NTOU
Current assignee: National Taiwan Ocean University NTOU
Priority date: 2014-01-22
Filing date: 2014-01-22
Publication date: 2015-07-30
Anticipated expiration: 2034-01-22
Also published as: JP5863839B2

Abstract

【課題】エビにおけるビブリオ感染に対するワクチン及びその作製方法の提供。【解決手段】本発明は特に、本発明のワクチンは、エビにおけるビブリオ感染に対する免疫の強化かつ延長を誘導する、熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞の混合物を含む。【選択図】図１

Description

本発明は、エビにおけるビブリオ感染に対するワクチン及びその作製方法に関する。

通常宿主動物が弱くなったときに発生するビブリオ感染によって引き起こされるビブリオ病は、二次の日和見感染とみなされており、ビブリオ病の発生は養殖池水中のビブリオ属細菌の増加と関連付けられている（Ｌｉｇｈｔｎｅｒｅｔａｌ．、１９９８；Ｌａｖｉｌｌａ−Ｐｉｔｏｇｏ、ｅｔａｌ．、１９９８）。エビ養殖システムにおいて報告されているビブリオ種には、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉ、Ｖ．ｄａｍｓｅｌｌａ、Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｌｏｇｅｉ、Ｖ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｉ、Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ、Ｖ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｅｌａｇｉｃｕｓ、Ｖ．ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓなどがある。したがって、疾病の発生防止がエビ養殖における主要な懸念となっている。一般的な感染後の臨床では抗生物質やその他治療薬が広く使用されている。しかしながら、これら治療薬剤の適用は抗生物質に対する耐性の広がりを引き起こし、抗生物質治療の有効性を低下させ、組織中における残留蓄積と環境に対する有害性を生じ、また公衆衛生の問題も生んでいる（ｋａｒｕｎａｓａｇａｒｅｔａｌ．、１９９４；Ｃａｂｅｌｌｏｅｔａｌ．、２００６）。

免疫刺激、植物及び微生物由来の原料のワクチン、プロバイオティクスなどの免疫学的予防は、病原性感染予防の有望で実行可能な方法となっている（Ｇａｔｅｓｓｏｕｐｅｅｔａｌ．、１９９９；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．、２００３；Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎｅｔａｌ．、１９９８；Ｐｅｒｅｉｒａｅｔａｌ．、２００９）。免疫刺激剤は先天免疫を誘導し、病原菌に対する抵抗力を高め、免疫抑制を緩和することが知られている一方、ワクチンでの予防投与は特定の病原菌に対して保護を提供する。ワクチンはホルマリン、エタノール、硫酸ナトリウム、亜硫酸アンモニウム、脂肪酸、加熱で病原菌を不活性化させて作製することができる（Ｈｏｓｓａｉｎｅｔａｌ．、２００９）。

現在に至るまで、エビの免疫系はまだ完全に理解されてはいない。これまでに、エビは他の無脊椎動物と同じように、循環する血球（無顆粒細胞（ＨＣ）、小顆粒細胞（ｓｅｍｉ−ＧＣ）、顆粒細胞（ＧＣ））が有害な微生物に対する自己防衛のための防御において重要な役割を果たす先天の免疫系のみに依存していると報告されている（Ｍａｒｔｉｎｅｔａｌ．、１９８５；Ｌｏｋｅｒｅｔａｌ．、２００４；Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．、２００６）。造血組織（ＨＰＴ）が血球の産生と供給を担っていることが知られている（ｖａｎｄｅＢｒａａｋｅｔａｌ．、２００２）。エビの免疫系は、ターン認識システム、フェノール酸化酵素前駆体（ｐｒｏＰＯ）活性化システム、抗微生物ペプチドとリゾチームの放出、及び食作用、結節形成、封入から構成される（Ｊｉｒａｖａｎｉｃｈｐａｉｓａｌｅｔａｌ．、２００６；Ｒｏｗｌｅｙｅｔａｌ．、２００７）。ｐｒｏＰＯは、内生のトリプシン様セリンプロテイナーゼによるセリンプロテイナーゼカスケードを通じたメラニン合成によって活性化され、フェノール酸化酵素（ＰＯ）となる（Ｃｅｒｅｎｉｕｓｅｔａｌ．、２００８；Ｓｏｅｄｅｒｈａｅｌｌｅｔａｌ．、１９９８）。呼吸バースト（ＲＢ）が食作用中に発生し、スーパオキシドアニオンとその他活性酸素種（ＲＯＳ）が放出される（Ｂｏｇａｎｅｔａｌ．、２０００）。スーパオキシドアニオンがスーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）によって消去され、抗酸化システムを通じて宿主自体に対する損傷を防止する（Ｆｒｉｄｏｖｉｃｈｅｔａｌ．、１９９５）。

最近一部の研究で、昆虫およびエビにおいて先天免疫系内の特異的記憶の存在、またはある形態の適応免疫が発生する可能性が示唆されている（Ｒｏｗｌｅｙｅｔａｌ．、２００７；Ａｒａｌａ−Ｃｈａｖｅｓｅｔａｌ．、２０００；Ｋｕｒｔｚｅｔａｌ．、２００４；Ｋｕｒｔｚｅｔａｌ．、２００５；Ｒｏｔｈｅｔａｌ．、２００９）。適応免疫または特異的免疫記憶の存在に基づき、真骨魚類及びエビ向けにいくつかの商用ワクチンが開発されている（Ｓｏｍｍｅｒｓｅｔｅｔａｌ．、２００５；Ｐｏｗｅｌｌｅｔａｌ．、２０１１）。さらに、甲殻類では、「代替的適応免疫」で重要な役割を果たす、Ｄｓｃａｍとも呼ばれるダウン症候群細胞接着分子（免疫グロブリンスーパーファミリーに属する）が観察された（Ｃｈｏｕｅｔａｌ．、２００９；Ｃｈｏｕｅｔａｌ．、２０１１；Ｗａｔｔｈａｎｓｕｒｏｒｏｔｅｔａｌ．、２０１１）。一部の報告では、ホルマリン不活化ビブリオ菌（Ｖｉｂｒｉｏｓｐ．）でのワクチン投与がクルマエビの稚エビ養殖におけるビブリオ病に対して有効であったことが示されている（Ｔｅｕｎｉｓｓｅｎｅｔａｌ．、１９９８；Ｐｅｒｅｉｒａｅｔａｌ．、２００９；Ｉｔａｍｉｅｔａｌ．、１９８９；Ｉｔａｍｉｅｔａｌ．、１９９１；Ｉｔａｍｉｅｔａｌ．、１９９２；Ａｌａｂｉｅｔａｌ．、１９９９）。しかしながら、ホルマリン不活化病原菌を投与されたエビの作用機作および特定の病原菌に二次感染したエビの免疫応答についてはあまりまたは全く知られていない。エビの免疫応答パターンを調査し、ビブリオ感染に対する改良型エビ用ワクチン開発がやはり必要とされている。

本発明の目的は、エビにおけるビブリオ感染に対するワクチン及びその作製方法を提供することにある。

本研究において、熱不活化Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＨＶａ）またはホルマリン不活化Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＦＶａ）への一次暴露（ｐｒｉｍａｒｙｅｘｐｏｓｕｒｅ）の後、続いて生Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＬＶａ）の二次暴露（ｓｅｃｏｎｄａｒｙｅｘｐｏｓｕｒｅ）を受けたホワイトエビの免疫応答パターンを理解するために実験を行った。一次暴露後、ＨＶａ投与エビは１日目に免疫応答のより早い高まりを示し、一方ＦＶａ投与エビは５日目に免疫応答のより遅い高まりを示し、そして二次暴露後、ＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビの両方がワクチンの効果を示し、そのうちＦＶａ投与エビはＬＶａに対するより高い耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、免疫パラメータのより早い回復、及びＨＰＴのより高い増殖と分裂指数（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）を示すことが分かった。したがって、ビブリオ感染からエビを保護するためのワクチンとしてＨＶａとＦＶａの両方を使用することができ、中でも驚くべきことにＨＶａは、「ワクチン」としてだけでなく、特異的認識および記憶の誘導を促進する「免疫活性化物質」または「アジュバント」としても使用することができる。ＦＶａとＨＶａの組み合わせ混合物が予期せずしてビブリオ感染に対する免疫応答の向上と延長を誘導する（クリアランス能力（ｃｌｅａｒａｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）は４０％超、かつワクチン後４２日間以上持続）ことが示された。

したがって、一態様において、本発明はエビにおいてビブリオ菌により引き起こされる感染に対するワクチン組成物を提供する。前記ワクチン組成物は、前記ビブリオ菌の熱不活化細胞（熱不活化ビブリオ細胞）と、前記ビブリオ菌のホルマリン不活化細胞（ホルマリン不活化ビブリオ細胞）を含み、そのうち、前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞が、エビにおいてビブリオ菌に特異的な免疫を誘導する有効量で存在する。

別の一態様において、本発明は、ビブリオ菌に特異的な免疫を誘導するためにエビに投与するワクチン組成物作製のための熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞の混合物の使用を提供する。

さらに別の一態様において、本発明はホルマリン不活化ビブリオ細胞から作製されたワクチンの免疫を向上するためのアジュバントとしての熱不活化ビブリオ細胞の使用を提供する。

さらに別の一態様において、本発明は、ビブリオ菌に特異的な免疫を誘導する有効量で、熱不活化ビブリオ細胞をホルマリン不活化ビブリオ細胞と混合して混合物を形成する工程を含む、ワクチン組成物の作製方法を提供する。

本発明の１つ以上の実施形態の詳細を以下の説明で示す。本発明のその他の特徴及び利点は以下のいくつかの実施形態の詳細な説明及び添付の請求の範囲から明らかになるであろう。

本発明の上述の一般的な説明と、以下に述べる詳細な説明は、添付図面と併せて参照することによってより理解されるであろう。本発明を説明する目的で、現在好適な実施例を図面に示す。しかしながら、本発明は示された正確な配置及び手段に限定されないと理解すべきである。

一次暴露（ＰＥ）で熱不活化Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＨＶａ）の投与を受けたエビ、ホルマリン不活化Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＦＶａ）の投与を受けたエビ、及び対照実験用の海水（ＭＳ）の暴露を受けたエビと、ＨＶａとＦＶａの投与の７日後に生Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ（ＬＶａ）の二次暴露（ＳＥ）を受けたエビの７〜３５日ＨＶａ−ＰＥと７〜３５日ＦＶａ−ＰＥエビ、及び７〜２８日ＨＶａ−ＰＥエビと７〜２８日ＦＶａ−ＰＥエビの両方におけるＬＶａと生枯草菌（ＬｉｖｅＢａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ、ＬＢｓ）に対する食作用及びクリアランスを示す、実験計画図である。対照エビと、海水（ｍａｒｉｎｅｓａｌｉｎｅ、ＭＳ）、ＨＶａ、ＦＶａ、ＬＶａを投与されたエビの０日、０．５日、１日、３日、５日、７日後の無顆粒細胞（ＨＣ）（Ａ）、顆粒細胞（ＧＣ）（ｓｅｍｉ−ＧＣを含む）（Ｂ）、全血球数（ＴＨＣ）（Ｃ）を示すグラフである。各棒が６尾のエビからの平均と標準誤差（ＳＥ）を表す。異なる文字（ａ、ｂ、ｃ）が付された同じ時間のデータは処理間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。異なる文字（ｘ、ｙ、ｚ）が付された同じ処理のデータは異なる経過時間（日数）間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。対照エビと、海水（ＭＳ）、ＨＶａ、ＦＶａ、ＬＶａを投与されたエビの０日、０．５日、１日、３日、５日、７日後のフェノール酸化酵素（ＰＯ）活性（Ａ）、呼吸バースト（ＲＢ）（Ｂ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性（Ｃ）、リゾチーム活性（Ｄ）を示すグラフである。統計情報は図２を参照。ＨＶａ、ＦＶａ、ＬＶａを投与されたエビの０．５日、１日、３日、５日、７日後の相対免疫パラメータ（％）を示すグラフである。ＨＶａ投与エビにおける異なる文字（ａ、ｂ、ｃ）が付されたデータ（平均±ＳＥ）、ＦＶａ投与エビにおける異なる文字（ｒ、ｓ、ｔ）が付されたデータ（平均±ＳＥ）、ＬＶａ投与エビにおける異なる文字（ｘ、ｙ、ｚ）が付されたデータ（平均±ＳＥ）は異なる経過時間（日数）間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。（Ａ）対照エビ（ａ）と、５日後のＨＶａ投与エビ（ｂ）及びＦＶａ投与エビ（ｃ）のＨ＆Ｅ染色造血組織（ＨＰＴ）の光学顕微鏡写真である。ＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビでより多くの有糸分裂細胞（矢印）数が認められた。（Ｂ）ＦＶａ投与エビとＨＶａ投与エビのＨＰＴにおける増殖細胞割合（％）は、対照エビのそれより有意に高かった。（Ｃ）対照エビ（ａ）、５日後のＨＶａ投与エビ（ｂ）及びＦＶａ投与エビ（ｃ）のヨウ化プロピジウム染色ＨＰＴの蛍光顕微鏡写真である。ＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビでより多くの有糸分裂細胞（矢印）数が認められた。（Ｄ）ＦＶａ投与エビのＨＰＴとＨＶａ投与エビのＨＰＴにおける分裂細胞の割合として表した分裂指数（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）は、対照エビのそれよりも有意に高かった。各棒が６つの異なる画像からの平均値と標準誤差（ＳＥ）を表す。異なる文字が付されたデータは処理間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。目盛り＝２０μｍ。生菌攻撃なしの対照エビ、及び対照エビと７日後のＨＶａ及びＦＶａ投与エビに菌数８．０×１０^６ｃｆｕエビ^−１のＬＶａで攻撃を行ったときの生残率を示すグラフである。各データポイントは３つの複製（各複製１０尾）の平均と標準誤差（ＳＥ）を表す。同じ期間で異なる文字が付されたデータは処理間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。対照エビと、ＨＶａ及びＦＶａ投与７日後のエビに菌数３．８×１０⁵ｃｆｕエビ^−１のＬＶａで攻撃を行った０日、０．５日、１日、３日、５日、７日後の無顆粒細胞（ＨＣ）（Ａ）、顆粒細胞（ＧＣ）（ｓｅｍｉ−ＧＣを含む）（Ｂ）、全血球数（ＴＨＣ）（Ｃ）を示すグラフである。統計情報は図２を参照。対照エビと、ＨＶａ及びＦＶａ投与７日後のエビに菌数３．８×１０⁵ｃｆｕエビ^−１のＬＶａで攻撃を行った０日、０．５日、１日、３日、５日、７日後のフェノール酸化酵素（ＰＯ）活性（Ａ）、呼吸バースト（ＲＢ）（Ｂ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性（Ｃ）、リゾチーム活性（Ｄ）を示すグラフである。統計情報は図２を参照。（Ａ）対照エビと、ＨＶａ及びＦＶａ投与７日後のエビにＬＶａで攻撃を行った後の相対免疫パラメータ（％）を示すグラフである。対照エビにおける異なる文字（ｘ、ｙ、ｚ）が付されたデータ（平均±ＳＥ）、ＨＶａ投与エビにおける異なる文字（ｒ、ｓ、ｔ）が付されたデータ（平均±ＳＥ）、ＦＶａ投与エビにおける異なる文字（ａ、ｂ、ｃ）が付されたデータ（平均±ＳＥ）は経過時間（日数）間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）対照エビに対するＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビの相対値を示すグラフである。ＨＶａ投与エビにおける異なる文字（ｒ、ｓ、ｔ）が付されたデータと、ＦＶａ投与エビにおける異なる文字（ａ、ｂ、ｃ）が付されたデータは経過時間（日数）間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。（Ａ）対照エビ（ａ）と、７日後のＨＶａ投与エビ（ｂ）及びＦＶａ投与エビ（ｃ）にＬＶａ攻撃を行った３日後のＨ＆Ｅ染色造血組織（ＨＰＴ）の光学顕微鏡写真である。ＦＶａ投与エビでより多くの有糸分裂細胞（矢印）数が認められた。（Ｂ）７日後のＦＶａ投与エビにＬＶａ攻撃を行った３日後のこのエビのＨＰＴにおける増殖細胞割合（％）は有意に高かった。（Ｃ）対照エビ（ａ）、７日後のＨＶａ投与エビ（ｂ）及びＦＶａ投与エビ（ｃ）にＬＶａ攻撃を行った３日後のヨウ化プロピジウム染色ＨＰＴの蛍光顕微鏡写真である。ＦＶａ投与エビでより多くの有糸分裂細胞（矢印）数が認められた。（Ｄ）７日後のＦＶａ投与エビにＬＶａ攻撃を行った３日後のＨＰＴにおける分裂細胞の割合として表した分裂指数（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）は有意に高かった。目盛り＝２０μｍ。統計情報は図５Ｂを参照。対照エビ（Ａ）と７日後のＨＶａ投与エビ（Ｂ）及びＦＶａ（Ｃ）にＬＶａ攻撃を行った後の凝集活性を示す写真である。ＦＶａ投与エビとＨＶａ投与エビはより高い凝集活性を示した。凝集された「細菌クラスタ」が無顆粒細胞（ＨＣ）（Ｄ）と小顆粒細胞（ＳＧＣ）（Ｅ）により貪食された様子が７日のＨＶａ−ＰＥエビと７日のＦＶａ−ＰＥエビの両方で観察され、ＨＣ（Ｆ）とＳＧＣ（Ｇ）の両方による貪食が１４日のＨＶａ−ＰＥエビと１４日のＦＶａ−ＰＥエビで、ＨＣ（Ｈ）とＳＧＣ（Ｉ）の両方による貪食が２１日のＨＶａ−ＰＥエビと２１日のＦＶａ−ＰＥエビで観察された。ＬＶａ（Ｊ）、ＨＶａ（Ｋ）、ＦＶａ（Ｌ）を含む異なる細菌のインタクトがＬｉｕ染色法（Ｌｉｕ’ｓｓｔａｉｎｉｎｇ）により染色された。目盛り＝５μｍ（Ａ〜Ｉ）、２μｍ（Ｊ〜Ｌ）。対照エビと、７〜３５日のＨＶａ−ＰＥエビ及び７〜３５日のＦＶａ−ＰＥエビにＬＶａ攻撃を行った後の貪食能（Ａ）、食作用係数（Ｂ）、クリアランス能力（Ｃ）を示すグラフである。対照エビと、７〜２８日のＨＶａ−ＰＥエビ及び７〜２８日のＦＶａ−ＰＥエビに生枯草菌（ＬＢｓ）攻撃を行った後の貪食能（Ｄ）、食作用係数（Ｅ）、クリアランス能力（Ｆ）を示すグラフである。異なる文字（ａ、ｂ、ｃ）が付された同じ暴露時間のデータは異なる処理間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。対照エビと、７〜４２日後の(ＨＶａ+ＦＶａ）−ＰＥエビにＬＶａ攻撃を行った後のクリアランス能力を示すグラフである。異なる文字（ａ、ｂ）が付された同じ暴露時間のデータは異なる処理間で有意な差がある（ｐ＜０．０５）。

別途定義がされない限り、ここで使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術における通常の技能で一般的に理解されているものと同じ意味を持つ。

本明細書で使用される、「ある」及び「一」（冠詞「ａ」及び「ａｎ」）は、１または２以上（即ち、少なくとも１）のその（冠詞の）文法上の目的語を指す。例えば、「ある要素」（「ａｎｅｌｅｍｅｎｔ」）とは１つの要素または２つ以上の要素を意味する。

本明細書で使用される、用語「ワクチン」または「ワクチン組成物」は、抗原性物質の免疫原性組成物（例えば、レシピエント中のその抗原性物質に特異的な免疫を引き出すために使用できる病原菌またはそのたんぱく質）を指し、変更可能である。したがって、被験者がワクチン投与された、またはワクチンで免疫を付けられた後、前記被験者は前記ワクチンの抗原を特異的に認識する免疫を形成し、病原菌にさらに暴露された場合に前記病原菌を殺すまたは不活化させる。エビにおいて、免疫付与またはワクチン投与は、注射または浸漬によって実施可能である。さらに、エビにおける免疫は、血球の細胞数などの多様なパラメータに基づいて判定することができ、例えば無顆粒細胞（ＨＣ）、小顆粒細胞（ｓｅｍｉ−ＧＣ）、顆粒細胞（ＧＣ）、フェノール酸化酵素（ＰＯ）活性、呼吸バースト（ＲＢ）、スーパーオキシドディスムターゼ（ＳＯＤ）活性、リゾチーム活性、細胞増殖、造血組織（ＨＰＴ）の分裂指数（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）、貪食能、クリアランス能力である。エビのこれらパラメータを測定する標準検査が当業者の技能範囲で既知である。

本明細書で使用される、「不活化された」または「不活化」とは、病原菌から作製されたワクチンに関するため、ワクチン中の病原菌の感染性、毒性、または病原性を例えば熱やホルマリン、紫外光照射などの方法で破壊する処理が行われることを指す。

本発明によれば、熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞の混合物は、ホルマリン不活化ビブリオ細胞単独の場合と比較して、エビにおけるビブリオ感染に対する免疫応答の強化または延長を誘導できる、ビブリオ感染に対する改良型ワクチンとして作用することが示されている。

したがって、一態様において、本発明はエビにおいてビブリオ菌により引き起こされる感染に対するワクチン組成物を提供する。前記ワクチン組成物は、前記ビブリオ菌の熱不活化細胞（熱不活化ビブリオ細胞）と、前記ビブリオ菌のホルマリン不活化細胞（ホルマリン不活化ビブリオ細胞）を含み、そのうち、前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞がエビにおいてビブリオ菌に特異的な免疫を誘導するために有効な量存在する。本発明はまた、エビに投与して前記ビブリオ菌に特異的な免疫を誘導するためのワクチン組成物の製造における前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞の混合物の使用も提供する。

一部の実施態様において、前記ビブリオ菌には、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉ、Ｖ．ｄａｍｓｅｌｌａ、Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｌｏｇｅｉ、Ｖ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｉ、Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ、Ｖ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｅｌａｇｉｃｕｓ、Ｖ．ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓが含まれるが、これらに限らない。この細菌は市販されているものを利用するか、または先行技術において報告されている標準の手順に基づいて斃死したエビから分離することができる。この細菌は培地中において約２８℃で一夜培養することができる。最近の培養に使用される培地はＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃｂｒｏｔｈ）またはＴＳＢ（トリプティックソイブロス）とすることができ、２％のＮａＣｌ、及びフェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、パラアミノ安息香酸、パラヒドロキシ安息香酸などのアミノ酸が追加される。

一部の実施態様において、前記エビには、バナメイエビ、ブラックタイガーエビ、クルマエビ、コウライエビ、インドエビ、ヨシエビ、レッドテールシュリンプ、オニテナガエビが含まれるが、これらに限らない。

熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞は、当業者の技能範囲で既知のさまざまな手順に従って作製することができる。一部の実施態様において、熱不活化ビブリオ細胞の作製は、細菌を培養し、これを採取して、海水中に再懸濁した後、細菌懸濁液を８０℃以上の温度、好ましくは９０℃以上、より好ましくは１００℃以上、皿により好ましくは１２０℃で、充分な時間、例えば５分間以上、好ましくは１０分間以上、より好ましくは１５分間以上、加熱ボックス、加熱槽、またはオートクレーブで加熱する。ある特定の実施態様において、前記細菌懸濁液は１２１℃で２０分間オートクレーブ処理される。別の実施態様において、ホルマリン不活化ビブリオ細胞の作製は、前記細菌懸濁液が充分な時間、例えば約１２〜約９６時間、好ましくは約２４〜４８時間、より好ましくは約２４時間、有効濃度のホルマリンで処理される。一部の実施例において、ホルマリンによる細菌処理の手順は約４℃〜４０℃で実施される。一部の実施例において、前記細菌試料を処理するためのホルマリンの有効濃度は、約０.１％〜約２％（ｖ／ｖ）の範囲であり、例えば０.１％（ｖ／ｖ）、０.２％（ｖ／ｖ）、０.３％（ｖ／ｖ）、０.４％（ｖ／ｖ）、０.５％（ｖ／ｖ）、０.６％（ｖ／ｖ）、０.７％（ｖ／ｖ）、０.８％（ｖ／ｖ）、０.９％（ｖ／ｖ）、１.０％（ｖ／ｖ）、または最大２.０％（ｖ／ｖ）である。ある特定の実施態様において、前記細菌懸濁液が取得され、１％ホルマリンの最終濃度までホルマリンが追加され、４℃で２４時間インキュベートされる。さらに、細菌試料がホルマリンで処理され、その後遠心分離されるか、細菌ペレットを回収するために充填され、培養液で洗浄して残留するホルムアルデヒドが除去される。

一部の実施態様において、本発明のワクチン組成物（前記熱不活化ビブリオ細胞＋前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞）中の前記ビブリオ細胞は、１０^５−１０^９ＣＦＵ／ｍｌの量で存在する。特に、本発明のワクチン組成物中の前記熱不活化ビブリオ細胞＋前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞は、ＣＦＵ比０.１：１〜１：０.１（ＨＶａ：ＦＶａ）で存在する。

一部の実施態様において、投与方法は、注射と浸漬を含むが、これらに限らない。ある実施態様において、注射投与での使用には、１尾当たり１０^４−１０^８ＣＦＵの用量で本発明のワクチン組成物がエビに注射された。別の実施態様において、浸漬による投与での使用には、本発明のワクチン組成物で浸漬を行い、エビにワクチンが投与され、例えば、１Ｌタンク内の滅菌エイジング済み汽水または海水で作製したワクチンストックを２０Ｌの水に希釈することにより１０^２−１０^５ＣＦＵ／ｍｌの濃度を達成することで実施でき、浸漬時間は約３０分間またはそれ以上、例えば、１時間、２時間、３時間、またはそれ以上とすることができる。

本発明によれば、熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞の混合物は、以下の実験によって実証されるように、熱不活化ビブリオ細胞またはホルマリン不活化ビブリオ細胞単独の場合と比較して、エビにおけるビブリオ感染に対する著しい免疫応答を誘導する改良型ワクチンとして使用することができる。特に、熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞の前記混合物に居って誘導されるクリアランス率は少なくとも４０％と高く、かつ２８日を超えて４２日まで持続する。免疫の持続性はエビ養殖において重要である。これは、エビの養殖段階が約４〜４.５ヶ月であり、免疫がより長く持続することでワクチン投与（再強化）の回数を減少でき、エビ養殖のコストを削減することができるためである。このつながりにおいて、ワクチン組成物中、熱不活化ビブリオ細胞がエビにおける免疫応答の誘導を促進するアジュバントの役割を果たすことが示唆される。

したがって、本発明はホルマリン不活化ビブリオ細胞から作製されたワクチンの免疫を向上するアジュバントとしての熱不活化ビブリオ細胞の使用も提供する。

本明細書で使用される「アジュバント」とは、ある抗原とともに投与されたときその抗原に対するレシピエントの免疫応答を強化する物質または薬剤を指す。

一実施態様において、前記熱不活化ビブリオ細胞は前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞と混合され、ホルマリン不活化ビブリオ細胞単独の場合と比較して、ビブリオ菌に対する免疫応答の増強と延長を誘導する、混合物を形成する。

さらに別の態様において、本発明は熱不活化ビブリオ細胞をホルマリン不活化ビブリオ細胞と混合する工程を含む、エビにおけるビブリオ感染に対するワクチン組成物の作製方法を提供する。通常、本発明のワクチンの調製には海水が使用される。ワクチンの調製にはその他の賦形剤や担体も使用することができる。特に、本発明の方法は、単に熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞を混合して均質な混合物を形成することにより実施でき、さらなるアジュバント成分は必要とされない。

特定の実施態様において、本発明のエビにおけるビブリオ感染に対するワクチン組成物の作製方法は、
（a）ビブリオ菌の細胞を培養して増殖させる工程と、
（b）増殖した細胞を採取し、採取した細胞を第１部分と第２部分に分ける工程と、
（c）採取した細胞の第１部分を加熱により不活化し、熱不活化ビブリオ細胞を取得するとともに、採取した細胞の第２部分をホルマリンにより不活化し、ホルマリン不活化ビブリオ細胞を取得する工程と、
（d）熱不活化ビブリオ細胞をホルマリン不活化ビブリオ細胞と混合し、エビにおけるビブリオ菌に対するワクチン組成物を得る工程と、
を含む。

一部の実施態様において、前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞が混合され、ワクチン組成物中で１０^５−１０^９ＣＦＵ／ｍｌの量が提供される。一部の実施態様において、本発明のワクチン組成物中の前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞は、ＣＦＵ比０.１：１〜１：０.１（ＨＶａ：ＦＶａ）で存在する。

特定の一実施態様において、本発明のワクチン組成物の作製方法は、アジュバントとして追加の成分を添加する工程を含まない。

したがって、本発明の方法の利点の一つは、さらなるアジュバントの添加を行うことなく実施される、工程数の減少であり、また当業者の技能範囲で既知のアジュバントの一部（例えばアルミニウムまたはオイルベースのアジュバント）は高価な場合があり、かつそれに対する特殊な安全上の懸念や品質管理が必要とされ、さらなるコスト高につながることがある。つまり、本発明の熱不活化ビブリオ細胞とホルマリン不活化ビブリオ細胞をともに混合することによるビブリオ感染に対するワクチン組成物の作製方法は、簡単でコスト効率に優れており、大規模な製造に適用できる可能性がある。

以下の実施例により、本発明についてさらに説明する。これらの実施例は例示を目的としたものであり、本発明を限定するものではない。当業者であれば、本発明の開示に基づいて、開示された特定の実施態様に多くの変更を加え、本発明の要旨と範囲を逸脱することなく、同様または類似の結果を取得することが可能であろう。

いくつかの用語の略語を以下に示す。

本実験では各ＬＶａ、ＨＶａ、ＦＶａの投与を受けたエビの免疫パラメータを調査し、各ＨＶａとＦＶａの投与７日後にＬＶａの投与を受けたＬＶａ攻撃後のエビの生残率と免疫パラメータを調査した。対照エビ、ＨＶａ投与エビ、ＦＶａ投与エビの血球細胞増殖とＨＰＴ（造血組織）の分裂指数（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）がＬＶａ攻撃の前後で調査された。血液像、ＰＯ活性、ＲＢ、ＳＯＤ活性、リゾチーム活性が免疫パラメータのインジケータとして使用された（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚｅｔａｌ．、２０００）。ＨＶａとＦＶａの投与を受けた７〜３５日後にＬＶａ攻撃を受けたエビの食作用とクリアランスが調査された。さらに、ＨＶａとＦＶａの投与を受けた７〜２８日後に生枯草菌（ＬＢｓ）攻撃を受けたエビの食作用とクリアランスが調査された。最後に、ＨＶａとＦＶａの組み合わせ混合物の投与を受けた７〜３５日後にＬＶａ攻撃を受けたエビのクリアランスが調査された。

１. 材料及び方法

１.１.ホワイトエビバナメイエビ
ホワイトエビのバナメイエビが台湾基隆の海岸に隣接するＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｒｉｎｅＡｎｉｍａｌＣｅｎｔｅｒから実験室に提供された。エビはエアレーションした海水（塩分濃度３５％）を入れた屋内のガラス繊維サーキュレータ水槽に入れられ、実験が開始されるまで３週間順応された。順応期間中、エビは１日２回体重３％のエビ用配合飼料（ＴａｉｒｏｕＦｅｅｄＣｏｍｐａｎｙ、台湾台南市）で給餌された。

１.２. ＬＶａとＬＢｓの作製
本実験では斃死したバナメイエビから分離したＶ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓの病原菌株が使用された（Ｌｉｕｅｔａｌ．、２００４）。細菌はトリプティックソイブロス（ＴＳＢに２％のＮａＣｌを添加、Ｄｉｆｃｏ、米国メリーランド州スパークス市）で２４時間にわたり２８℃で培養された後、７１５５ｘｇで２０分間にわたり４℃で遠心分離された（Ｙｅｈｅｔａｌ．、２００９）。上清が除去され、細菌ペレットが１.９×１０^７で海水（ＭＳ）中に再懸濁され、４.０×１０^８コロニー形成単位（ｃｆｕ）ｍｌ^-１で各細菌懸濁液として免疫パラメータの調査と生菌攻撃試験用に調製された。ＢｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎａｎｄＲｅｓｏｕｒｃｅＣｅｎｔｅｒ（台湾新竹市）より取得された枯草菌（ＢＣＲＣ１０４４８）が上述同様に培養され、細菌懸濁液が４.０×１０^８ｃｆｕｍｌ^-１で生菌攻撃試験用に調製された。

１.３. ＨＶａとＦＶａの作製
前記細菌懸濁液（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）が４５００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離され、細菌ペレットがＭＳで洗浄された後再度遠心分離され、培養液が除去された。最後に、ペレットが同量のＭＳ中に再懸濁され、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理された。オートクレーブ後の細菌懸濁液が熱不活化処理に使用された。別の細菌懸濁液（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）が遠心分離され、上述同様にペレットが取得された。ＭＳ中の細菌懸濁液に最終濃度１％ホルマリンとなるようにホルマリンが添加され、４℃で２４時間インキュベートされた。前記細菌懸濁液が細菌ペレットを回収するために４５００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離され、その後ＭＳで洗浄後、再度遠心分離されて残留するホルムアルデヒドが除去された。ホルマリン処理後の細菌懸濁液がホルマリン不活化処理に使用された。

１.４. 実験計画
７つの研究が実施された。実験は特定の病原菌に対する一次暴露（ＰＥ）及び二次暴露（ＳＥ）を試験するための旧来の免疫付与に基づいて計画された（図１）。（１）対照エビ、ＭＳ−ＰＥエビ、ＬＶａ−ＰＥエビ、ＨＶａ−ＰＥエビ、ＦＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータが０〜７日間にわたり調査された。（２）５日目に対照エビ、ＨＶａ−ＰＥエビ、ＦＶａ−ＰＥエビのＨＰＴの血球細胞増殖及び分裂指数（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）が測定された。（３）対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ（ＨＶａへの一次暴露を受けて７日後のエビ）、７日ＦＶａ−ＰＥエビ（ＦＶａへの一次暴露を受けて７日後のエビ）の抵抗力がＬＶａへのＳＥ後に調査された。（４）対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータがＬＶａへのＳＥの０.５〜７日後に調査された。（５）対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビのＨＰＴの血球細胞増殖及び分裂指数（ｍｉｔｏｔｉｃｉｎｄｅｘ）がＬＶａへのＳＥの３日後に調査された。（６）ＬＶａへのＳＥを受けた７〜３５日ＨＶａ−ＰＥエビと７〜３５日ＦＶａ−ＰＥエビの凝集、食作用、クリアランスが調査された。（７）ＬＢｓ攻撃を受けた７〜２８日ＨＶａ−ＰＥエビと７〜２８日ＦＶａ−ＰＥエビの食作用及びクリアランスが調査された。エビの重量は１０.２１〜１２.６３ｇの範囲であり、平均は１１.４２±１.２１ｇ（平均±ＳＤ）であった。処理間に有意なサイズ差は見られなかった。脱皮間段階のエビのみが研究に使用された。脱皮段階は表皮の部分的収縮が識別できる尾肢を検査することで判定された（ＣｈａｎＳＭｅｔａｌ．、１９８８）。実験期間中、水温２６〜２９℃、ｐＨ７.８９〜８.２７、塩分濃度３３‰〜３５‰、溶存酸素量（ＤＯ）５.６８〜６.８４ｍｇＬ^-１の範囲であった。

１.５.ＬＶａ−ＰＥエビ、ＨＶａ−ＰＥエビ、ＦＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータ
５つの処理があり、各処理が５つの異なる時間（０、０.５、１、３、５、７日）で実施された。（１）対照エビ、（２）ＭＳ投与エビ、（３）ＬＶａ、（４）ＨＶａ、（５）ＦＶａがあった。８尾のエビが各処理に毎回使用された。各エビ頭胸部の腹部静脈洞（ｖｅｎｔｒａｌｓｉｎｕｓ）に細菌懸濁液（ＬＶａ、ＨＶａ、またはＦＶａ）２０μｌが１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１の濃度で注射され、結果３.８×１０^５ｃｆｕエビ^-１となった。処置なしのエビが背景対照とされ、ＭＳ２０μｌの投与を受けたエビが陽性対照群とされた。０.５、１、３、５、７日後に血リンパが採取された。血リンパのサンプリング及び希釈血リンパの作製は先述された手順に従って行われた（Ｙｅｈｅｔａｌ．、２００９）。簡単に説明すると、血リンパ（３００μｌ）が各エビの腹部静脈洞から個別に採取され、２７００μｌの抗凝固液で希釈された。血リンパ抗凝固液混合物（希釈血リンパ）が４つの管に入れられた。管には５００、１０００、１０００、５００μｌの希釈血リンパがそれぞれ入れられ、それぞれ（１）血球数とＲＢ、（２）ＰＯ活性、（３）ＳＯＤ活性、（４）リゾチーム活性を測定するために使用された。

１.６. ＰＥ５日後の対照エビ、ＨＶａ−ＰＥエビ、ＦＶａ−ＰＥエビにおけるＨＰＴの細胞増殖と分裂指数
３つの処理があり、各処理に５尾のエビを使用した。これらのエビは、（１）ＭＳ（対照）、（２）ＨＶａ、（３）ＦＶａの投与を受けたものである。上述と同様の方法でエビにＭＳ、ＨＶａ、またはＬＶａが注射された。５日後、エビがサンプルされ、有糸分裂を阻害するためそれぞれビンブラスチン（Ｖ１３７７、Ｓｉｇｍａ）が注射された。簡単に説明すると、エビは腹部静脈洞にビンブラスチン６０μｌ（０.５ｍｇｍｌ^-１）が注射され、通常の海水中にリリースされた（ｖａｎｄｅＢｒａａｋｅｔａｌ．、２００２）。１２時間後、エビ頭胸部の背部にＤａｖｉｄｓｏｎの固定液３ｍｌ（３０ｍｌの９５％エタノール、２０ｍｌの３７％ホルムアルデヒド、１０ｍｌの酢酸、３０ｍｌの蒸留水）が注射された。ＨＰＴのサンプリング、固定、包埋、永久スライドの作製及びＨＰＴの観察は先述された方法にしたがって行われた（ｖａｎｄｅＢｒａａｋｅｔａｌ．、２００２；Ｓｉｒｉｒｕｓｔａｎａｕｍｅｔａｌ．、２０１１；Ｂｅｌｌｅｔａｌ．、１９９３）。

ＨＰＴ含有スライドのその他セットはキシレン中で脱パラフィンされ、何段階かのエタノール溶液と水道水で再水和された。ＲＮＡ消化のためＲＮａｓｅＡ溶液（１ｍｇＬ^-１）一滴がスライド上に滴下され、続いてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）液（０.２ｍｇｍｌ^-１）で１０分間染色した後、スライドが流水で約４５分間洗浄された。永久スライドの作製、観察、ＨＰＴの分裂指数の判定は先述された方法にしたがって行われた（Ｚｈａｎｇｅｔａｌ．、２００６；Ｓｉｒｉｒｕｓｔａｎａｕｍｅｔａｌ．、２０１１；Ｈｕｍａｓｏｎｅｔａｌ．、１９７９）。

１.７. ＬＶａへのＳＥ後の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビの抵抗力
１つの生菌攻撃なしの処理と、３つの生菌攻撃処理の計４つの処理が行われた。ＰＥの（１）ＭＳ投与、（２）ＨＶａ投与７日後、（３）ＦＶａ投与７日後のエビにＳＥとしてＬＶａの投与が行われ、これらが生菌攻撃ありの群とされた。各エビ頭胸部の腹部静脈洞に２０μｌのＨＶａ（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）またはＦＶａ（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）細菌懸濁液が注射され、結果３.８×１０^５ｃｆｕエビ^-１とされた。生菌攻撃ありの対照群として、エビに同量の滅菌ＭＳが注射された。７日後、各エビ頭胸部の腹部静脈洞に個別に２０μｌのＬＶａが４.０×１０^８ｃｆｕｍｌ^-１で注射され、結果８.０×１０^６ｃｆｕエビ^-１とされた。生菌攻撃なしの対照エビにはＰＥとして同量のＭＳが、ＳＥとして同量のＭＳが注射された。各群には３０尾のエビが含まれた。実験エビと対照エビ（１０尾水槽^-１）は海水２０Ｌ（３５‰）を含む４０Ｌの水槽に保持され、３つ複製された。したがって、１２０尾［(３×３×１０）＋（１×３×１０）］がこの研究に使用された。１日目は１２時間ごとに、それ以降は７日目の実験終了まで１日１回エビの生残が調査された。

１.８. ＬＶａへのＳＥ後の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータ
（１）ＭＳが投与されたエビ（対照エビ）、（２）７日後のＨＶａ投与エビ（７日ＨＶａ−ＰＥエビ）、（３）７日後のＦＶａ投与エビ（７日ＦＶａ−ＰＥエビ）の３つの処理が行われ、それぞれの処理が５つの異なる期間（０.５、１、３、５、７日）で調査された。８尾のエビが各処理と期間に使用された。さらに、背景値を得るために処理なしの８尾のエビが使用された。実験エビには２０μｌのＨＶａまたはＦＶａ（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）が個別に注射され、結果３.８×１０^５ｃｆｕエビ^-１が通常の海水にリリースされた。対照エビには２０μｌのＭＳが注射された。７日後、エビに個別に２０μｌのＬＶａが１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１で注射され、結果３.８×１０^５ｃｆｕエビ^-１とされた。ＬＶａ攻撃の０.５、１、３、５、７日後に血リンパが個別に採取された。血リンパのサンプリングと希釈された血リンパの作製は上述と同様に行われた。

１.９. 免疫パラメータの測定
第１の管から希釈血リンパ一滴が血球計に置かれ、位相差倒立顕微鏡（ＬｅｉｃａＤＭＩＬ、ＬｅｉｃａＭｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ、ドイツヴェッツラー）を使用してＨＣ、ＧＣ（ｓｅｍｉ−ＧＣを含む）及び全血球数（ＴＨＣ）が測定された。残りの希釈血リンパ混合物は後の試験に使用された。

先述されているように（Ｓｏｄｅｒｈａｌｌｅｔａｌ．、１９７９）、一部変更を加えて、Ｌ−ジヒドロキシフェニルアラニン（Ｌ−ＤＯＰＡ）から産生されるドーパクロムの形成を記録することにより、全ＰＯ活性が分光測定で測定された。簡単に説明すると、第２の管から希釈血リンパ１０００μｌが８００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離された。測定の詳細は先述されている（Ｙｅｈｅｔａｌ．、２００９）。

血球のＲＢは、先述されているように（Ｂｅｌｌｅｔａｌ．、１９９３）、スーパオキシドアニオンの測定として、ホルマザンに対するニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）の減少を使用して数値化された。簡単に説明すると、第１の管からの希釈血リンパ１００μｌが、細胞の付着性を高めるために前もって１００μｌのポリＬリシン溶液（０.２％）でコーティングされた９６ウェルマイクロプレートにトリプリケートで分注された。測定の詳細は先述されている（Ｙｅｈｅｔａｌ．、２００９）。

ＳＯＤ活性は、Ｒａｎｓｏｄキット（Ｒａｎｄｏｘ、英国クラムリン）を使用して、スーパーオキシドラジカル依存性反応を阻害する能力により測定された。簡単に説明すると、第３の管からの希釈血リンパ１０００μｌが８００ｘｇ、４℃で２０分間遠心分離された。測定の詳細は先述されている（Ｙｅｈｅｔａｌ．、２００９；Ｂｉａｇｉｎｉｅｔａｌ．、１９９５）。

リゾチーム活性が先述されたとおりの方法（Ｅｌｌｉｓｅｔａｌ．、１９９０）に従って判定された。簡単に説明すると、第４の管からの希釈血リンパ５００μｌが遠心分離され、沈殿物が１ｍｌ（０.０２％）のＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｙｓｏｄｅｉｋｔｉｃｕｓ（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）と混合された。測定の詳細は先述されている（Ｅｌｌｉｓｅｔａｌ．、１９９０；Ｔａｙａｇｅｔａｌ．、２０１０）。

１.１０. ＬＶａへのＳＥ３日後の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビのＨＰＴの細胞増殖と分裂指数
３つの処理が各処理５尾のエビで実施された。エビはＰＥとして（１）ＭＳ、（２）ＨＶａ、（３）ＦＶａの投与を７日間受けた。８尾のエビが各処理と時間に使用された。エビに２０μｌのＨＶａまたはＦＶａ（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）が個別に注射され、結果３.８×１０^５ｃｆｕエビ^-１が通常の海水（３５％塩分濃度）に７日間リリースされた。エビはＳＥとしてＬＶａが投与され、３日後エビがサンプリングされ、有糸分裂を阻害するために個別にビンブラスチン（Ｖ１３７７、Ｓｉｇｍａ）が注射された。後続のビンブラスチン注射、ＨＰＴ固定、スライド染色、永久スライドの作製、細胞増殖と分裂指数の観察に係る手順は２.６節の説明と同様に実施された。

１.１１. ＬＶａへのＳＥを受けたＨＶａ−ＰＥエビとＦＶａ−ＰＥエビにおける食作用とクリアランス能力、及びＬＢｓ攻撃を受けたＨＶａ−ＰＥエビとＦＶａ−ＰＥエビにおける食作用とクリアランス
ＬＶａへのＳＥのため、３つの処理があり、７、１４、２１、２８、３５日間ＰＥとして（１）ＭＳ、（２）ＨＶａ、（３）ＦＶａの投与を受けた後、ＳＥとしてＬＶａ（３.８×１０^５ｃｆｕエビ^-１）の投与を３時間受けたエビが、凝集された「細菌クラスタ」、食作用及びクリアランス観察のための実験に使用された。５０μｌの血リンパがサンプリングされ、５０μｌの抗凝固液とそっと混合された後、１００μｌの固定液（１％パラホルムアルデヒド）が添加され、３０分間インキュベートされた。固定血球がサイトスピン（Ｔｈｅｒｍｏ、英国シャンドン）を１０００ｒｐｍで１０分間使用してスライドガラス上で拡散された。スライドガラスがＬｉｕ氏Ａ溶液で３０秒間、Ｌｉｕ氏Ｂ溶液で６０秒間染色された後、流水で３０秒間洗浄された。異なる処理のＶ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓの細胞が上述と同様に染色された。貪食能とクリアランス能力の実験が先述された方法（ＴａｙａｇＣＭｅｔａｌ．、２０１０）に従って実施された。貪食能は貧食率（ＰＲ）として定義され、ＰＲ（％）＝［(貪食性血球）／(合計血球）］×１００で表された。食作用係数（ＰＩ）は、ＰＩ＝［(貪食性血球によって貪食される細菌）／(貪食性血球）］で表された。対照エビ（ＭＳ）における細菌コロニー数が対照群として表され、ＨＶａ投与エビ及びＦＶａ投与エビのコロニーがテスト群とされた。クリアランス能力は「１００−［(テスト群のｃｆｕ）／(対照群のｃｆｕ）］×１００」で表された。ＬＢｓの比較のために、３つの処理が行われた。エビに（１）ＭＳ、（２）ＨＶａ、（３）ＦＶａを投与した７、１４、２１、２８日後に、ＬＢｓ攻撃（３.８×１０^５ｃｆｕエビ^-１）を３時間受けたエビが食作用とクリアランス観察の実験に使用された。貪食能、食作用係数、クリアランス能力は先述されたものと同様に実施された。

１.１２. ＨＶａとＦＶａの混合物の作製
細菌懸濁液（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）が４５００ｘｇ、４℃で１０分間遠心分離され、細菌ペレットがＭＳで洗浄され、再度遠心分離されて培養液が除去された。最後に、ペレットが同量のＭＳで再懸濁され、１２１℃で２０分間オートクレーブ処理された。オートクレーブ後の細菌懸濁液が熱不活化処理に使用された。別の細菌懸濁液（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）が遠心分離され、上述と同様にペレットが取得された。ＭＳ中の細菌懸濁液に最終濃度１％ホルマリンまでホルマリンが添加され、４℃で２４時間インキュベートされた。前記細菌懸濁液が細菌ペレットを回収するために４５００ｘｇで１０分間、４℃で遠心分離され、その後ＭＳで洗浄後、再度遠心分離されて残留するホルムアルデヒドが除去された。ホルマリン処理済みの細菌懸濁液がホルマリン不活化処理に使用された。ＦＶａとＨＶａの混合物がＦＶａ（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）１分量にＨＶａ（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）１分量を追加して２分量のＦＶａ+ＨＶａ混合物（１.９×１０^７ｃｆｕｍｌ^-１）を取得することで作製された。

１.１３. 統計分析
すべてのデータに一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）が行われた。有意な差が０.０５レベルで示された場合、多重比較（テューキー）検定を使用してＳＡＳコンピュータソフトウェア（ＳＡＳＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、米国ノースカロライナ州ケーリー）で処理間の有意差が調査された。比率データ（抵抗試験）は分析の前に逆正弦変換を使用して正規化（ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ）された。統計的有意差はｐが＜０.０５であることが要求された。

２. 結果

２.１. ＬＶａ−ＰＥエビ、ＨＶａ−ＰＥエビ、ＦＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータ
異なる期間の対照エビとＭＳ投与エビにおいてＨＣ、ＧＣ、ＴＨＣ、ＰＯ活性、ＲＢ、ＳＯＤ活性、リゾチーム活性に有意な差は見られなかった。ＬＶａ投与エビのＨＣ、ＧＣ、ＴＨＣは０.５日後に減少し、１日後に最低レベルに達した後、０.５〜７日間にわたり背景値より低いままであった。ＨＶａ投与エビのＨＣ、ＧＣ、ＴＨＣは１〜５日間増加した後、７日後に背景値に戻った。ＦＶａ投与エビのＨＣ、ＧＣ、ＴＨＣは０.５日後に減少したが、その後増加し、５日目に最高レベルまで増加した（図２）。

ＬＶａ投与エビのＰＯ活性、ＲＢ、ＳＯＤ活性、リゾチーム活性は減少し、０.５〜７日目は背景値より低かった。ＨＶａ投与エビのＰＯ活性、ＲＢ、ＳＯＤ活性、リゾチーム活性は１日後に有意に増加し、その後やや減少して、７日後は背景値と同様になった。ＦＶａ投与エビのＰＯ活性、ＲＢ、ＳＯＤ活性は０.５日目に減少し、その後増加して５日目に最高レベルに達したが、７日目までに背景値まで戻った。ＦＶａ投与エビのリゾチーム活性は０.５〜７日目で変化しないままであった（図３）。

ＰＥとしてＨＶａ、ＦＶａ、ＬＶａの投与を受けたエビの先天免疫応答パターンを明らかにするため、免疫パラメータが背景値に正規化され、相対比率値として表示される（図４）。ＬＶａ投与エビの免疫パラメータパターンは０.５〜７日間減少した。ＨＶａ投与エビの免疫パラメータパターンは１日目により早く増加した後、徐々に減少し、７日目までに背景値に戻った。ＦＶａ投与エビの免疫パラメータパターンは０.５日に減少し、その後増加して５日目に最高値に達した。ＨＶａ、ＦＶａ、ＬＶａの投与を受けたエビは異なる先天免疫応答パターンを示した。

２.２. ＰＥ後５日目のＨＶａ−ＰＥエビとＦＶａ−ＰＥエビにおけるＨＰＴの細胞増殖と分裂指数
５日目の対照エビ、ＨＶａ投与エビ、ＦＶａ投与エビのＨ＆Ｅ染色ＨＰＴ光学写真が取得された（データ未表示）。ＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビの増殖細胞割合が有意に増加した（図５Ａ）。５日目の対照エビ、ＨＶａ投与エビ、ＦＶａ投与エビのＰＩ染色ＨＰＴの蛍光写真が取得され、ＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビで有糸分裂細胞の数が多いことが観察された（データ未表示）。ＨＰＴにおける分裂細胞比率で表される分裂指数は、対照エビのそれよりＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビで有意に高かった（図５Ｂ）。

２.３. ＳＥとしてのＬＶａ後の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビの抵抗力
生菌攻撃なしの対照エビすべてが生残した。対照的に、生菌攻撃群では０.５日後に斃死の発生が開始した。３〜７日目でＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビ間に生残率に有意な差は見られなかった。しかし、５〜７日目でＦＶａ投与エビのほうが（８３.３％）ＨＶａ投与エビ（７０％）より生残率が高かった。対照エビの生残率は生菌攻撃後４〜７日目で４０％とずっと低かった（図６）。

２.４. ＳＥとしてのＬＶａ後の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータ
ＳＥとしてのＬＶａ後０.５〜７日目に対照エビの免疫パラメータが減少した。７日ＨＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータはＳＥとしてのＬＶａ後の３〜７日目に徐々に増加したが、背景値よりも低い値のままであった。７日ＦＶａ−ＰＥエビのＨＣ、ＧＣ、ＴＨＣはＳＥとしてのＬＶａ後０.５〜１日目より低かったが、その後増加し、ＳＥとしてのＬＶａ後３〜７日目に背景値と同様になった。７日ＦＶａ−ＰＥエビのＰＯ、ＲＢ、ＳＯＤ、リゾチーム活性はＳＥとしてのＬＶａ後１日目に増加し、ＳＥとしてのＬＶａ後０.５〜７日目に値は背景値と同様になった（図７、図８）。

ＰＥとしてのＭＳ、ＨＶａ、ＦＶａ投与に続いてＳＥとしてのＬＶａ投与を受けたエビの二次免疫応答パターンを明らかにするため、免疫パラメータが背景値に正規化され、相対比率値として表示される（図９Ａ）。対照エビと７日ＨＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータパターンはＳＥとしてのＬＶａ後１日目に最低まで減少した後、徐々に増加したが、値はＳＥとしてのＬＶａ後１〜７日目に背景値よりずっと低いままであった。しかし、７日ＦＶａ−ＰＥエビの免疫パラメータパターンは０.５日目に減少したが、１日目に徐々に増加し、値はＳＥとしてのＬＶａ後３〜７日目に背景値と同様になった。対照エビに対する７日ＦＶａ−ＰＥエビと７日ＨＶａ−ＰＥエビの相対値を正規化する（ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）ためにさらに計算が行われた（図９Ｂ）。ＳＥとしてのＬＶａに直面したとき７日ＨＶａエビと７日ＦＶａエビ両方の免疫が誘発されたが、７日ＦＶａエビは７日ＨＶａエビよりも効率的な免疫応答を示した。

２.５. ＳＥとしてのＬＶａ後、ＳＥ後３日目の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビにおけるＨＰＴの細胞増殖と分裂指数
ＳＥとしてのＬＶａ後、ＳＥ後３日目の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビのＨ＆Ｅ染色ＨＰＴの光学写真を図１０Ａに示す。ＳＥとしてのＬＶａ後、７日ＦＶａ−ＰＥエビの増殖細胞割合は７日ＨＶａ−ＰＥエビと対照エビのそれより有意に高かった（図１０Ｂ）。ＳＥとしてのＬＶ後の対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビのＰＩ染色ＨＰＴの蛍光写真を図１０Ｃに示す。ＦＶａ投与エビにおいて有糸分裂細胞（矢印）の数が多いことが観察された。ＳＥの３日後７日ＦＶａ−ＰＥエビの分裂指数は対照エビと７日ＨＶａ−ＰＥエビよりも有意に高かった（図１０Ｄ）。

２.６. ＳＥとしてのＬＶａ投与を受けたＨＶａ−ＰＥエビとＦＶａ−ＰＥエビにおける食作用とクリアランス能力、及びＬＢｓ攻撃を受けたＨＶａ−ＰＥエビとＦＶａ−ＰＥエビにおける食作用とクリアランス
対照エビ、７日ＨＶａ−ＰＥエビ、７日ＦＶａ−ＰＥエビの血球染色の後、３時間後のＬＶａ投与を図１１Ａから図１１Ｃに示す。ＨＶａ及びＦＶａ処理において、細菌が凝集して細菌クラスタを形成した後、血球に付着した。両方の処理において、ＨＣとＳＧＣによる細菌クラスタの貪食が観察された（図１１Ｄ、図１１Ｅ）。同様の細菌凝集と貪食性ＨＣ及びＳＧＣの現象が１４日ＨＶａ−ＰＥエビと１４日ＦＶａ−ＰＥエビの両方（図１１Ｆ、図１１Ｇ）、及び２１日ＨＶａ−ＰＥエビと２１日ＦＶａ−ＰＥエビの両方（図１１Ｈ、１１Ｉ）で観察された。ＬＶａ、ＨＶａ、ＦＶａのインタクトがＬｉｕ染色法（Ｌｉｕ’ｓｓｔａｉｎｉｎｇ）により確認された。

ＳＥとしてのＬＶａ投与を受けた７〜３５日ＦＶａ−ＰＥエビと７〜２１日ＨＶａエビの食作用活性はＬＶａの投与を受けた対照エビのそれより有意に高く（図１２Ａ）、ＳＥとしてのＬＶａ投与を受けた７〜３５日ＦＶａ−ＰＥエビと７〜３５日ＨＶａ−ＰＥエビの食作用係数はＬＶａの投与を受けた対照エビのそれよりやや高かった（図１２Ｂ）。両処理のクリアランス能力は最長２８日までパフォーマンスがより高いままであった（図１２Ｃ）。ＬＢｓの投与を受けた７〜２８日ＨＶａエビ、７〜２８日ＦＶａエビ、対照エビの間で貪食能における有意な差は観察されなかったが（図１２Ｄ）、ＬＢｓの投与を受けた７〜２８日ＦＶａ−ＰＥエビと７〜２８日ＨＶａ−ＰＥエビの食作用係数はＬＢｓの投与を受けた対照エビのそれよりやや高かった（図１２Ｅ）。ＬＢｓの投与を受けた７日ＨＶａ−ＰＥエビと７日ＦＶａ−ＰＥエビのクリアランス能力はＬＢｓの投与を受けた対照エビのそれより有意に高かった。しかし、クリアランス能力の傾向は１４日後低下した（図１１Ｆ）。

２.７. ＨＶａ＋ＦＶａ−ＰＥエビにおけるクリアランス能力
ＨＶａとＦＶａ（ＣＦＵ比１：１）の組み合わせ混合物の投与を受けたエビの血リンパにおけるクリアランス能力を図１３に示す。エビは７つの群に振り分けられ、ＨＶａとＦＶａ（ＣＦＵ比１：１）の組み合わせ混合物が注射された。その後各群が組み合わせ混合物（ＨＶａ＋ＦＶａ）の投与を受けてからそれぞれ７、１４、２１、２８、３５、４２日後にＬＶａに暴露された。ＬＶａへの暴露の３時間後にクリアランス能力の分析用にエビから血リンパが採取された。血リンパ中のＬＶａ残留量が少ないということは、クリアランス能力の高さを示唆している。図１３に示すように、ＨＶａとＦＶａの組み合わせ混合物は処理から４２日目まで４０％のクリアランス能力を示した。図１２Ｃに示すようにＨＶａ投与エビとＦＶａ投与エビの結果が２８日より後より高い能力を維持していないことと比較して、ＨＶａとＦＶａの組み合わせ混合物により誘導されたエビの免疫は向上され、延長されている（保護期間が２８日間に対して４２日間と１.５倍より長くなっている）。

３. 結論及び討論
現在の研究結果から、ＨＶａとＦＶａの両方がＶ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓへのＳＥからエビを保護するワクチンとして使用できる。一次免疫パターン、二次免疫パターン、高められた食作用、免疫誘発の強さに基づきＦＶａはよりよい候補であり、一方ＨＶａは一次免疫における早期の増加、二次免疫パターンにおける若干の向上、高められた食作用、免疫誘発の若干の強さに基づき、免疫刺激剤とワクチンの両方としての二面性を示した。したがって、ＨＶａは特異的認識および記憶の誘導を促進する「免疫活性化物質」または「アジュバント」として使用することができる。ＦＶａとＨＶａの組み合わせ混合物は免疫応答を調節し、エビ養殖産業においてビブリオ病に対する免疫力を高めるための「ワクチン成分」として有効に作用する。

まとめると、ＨＶａ投与エビの免疫パラメータは１日後の早期に増加し、一方ＦＶａ投与エビの免疫パラメータは５日後に増加して、両方の処理ともにより高いＨＰＴ増殖を示した。ＦＶａ投与エビはＬＶａに対するより高い抵抗力を示し、また免疫パラメータのより早い回復、及び攻撃後３日でより高いＨＰＴの増殖と分裂指数を示した。さらに、ＨＶａとＦＶａの組み合わせ混合物の投与を受けたエビはＨＶａまたはＦＶａを単独で投与されたエビよりもより向上かつ延長された免疫を示した。そのようなＨＶａとＦＶａの組み合わせ混合物はエビ養殖産業においてビブリオ感染に対する改良型ワクチンの開発に役立つ。

なし

参考文献

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４６．ＢｉａｇｉｎｉＧ、ＳａｌａＤ、ＺｉｎｉＩ．Ｄｉｅｔｈｙｌｄｉｔｈｉｏｃａｒｂａｍａｔｅ、ａｓｕｐｅｒｏｘｉｄｅｄｉｓｍｕｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓｔｈｅｍａｔｕｒａｔｉｏｎｏｆｉｓｃｈｅｍｉｃ−ｌｉｋｅｌｅｓｉｏｎｓｃａｕｓｅｄｂｙｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−１ｉｎｔｒａｓｔｒｉａｔａｌｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ＮｅｕｒｏｓｃｉＬｅｔｔ１９９５；９０、２１２〜２１６．
４７．ＥｌｌｉｓＡＥ．Ｌｙｓｏｚｙｍｅａｓｓａｙ．Ｉｎ：ＳｔｏｌｅｎＪＳ、ＦｌｅｔｃｈｅｒＴＣ、ＡｎｄｅｒｓｏｎＤＰ、ＲｏｂｅｒｓｏｎＢＳ、ｖａｎＭｕｉｓｗｉｎｋｅｌＷＢ、ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｆｉｓｈｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−１．ＦａｉｒＨａｖｅｎ、ＮＪ：ＳＯＳｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；１９９０．ｐ．１０１〜１０３
４８．ＴａｙａｇＣＭ、ＬｉｎＹＣ、ＬｉＣＣ、ＬｉｏｕＣＨ、ＣｈｅｎＪＣ．Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｈｏｔ−ｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｏｆＳｐｉｒｕｌｉｎａｐｌａｔｅｎｓｉｓｅｎｈａｎｃｅｄｔｈｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉａｎｄｉｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ．ＦｉｓｈＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌ２０１０；２８、７６４〜７７３．
４９．ＬｉＣＣ、ＹｅｈＳＴ、ＣｈｅｎＪＣ．ｔｈｅｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｏｆｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｆｏｌｌｏｗｉｎｇＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．ＦｉｓｈＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌ２００８；２５、８５３〜８６０．
５０．ＬｉＣＣ、ＹｅｈＳＴ、ＣｈｅｎＪＣ．ＩｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｉｔｙｏｆｔｈｅｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉｗｅａｋｅｎｅｄｂｙｔｈｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｏｆａＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓｉｎｊｅｃｔｉｏｎａｎｄｌｏｗ−ｓａｌｉｎｉｔｙｓｔｒｅｓｓ．ＦｉｓｈＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌ２０１０；２８、１２１〜１２７．
５１．ＣｈｅｎｇＷ、ＬｉｕＣＨ、ＫｕｏＣＭ、ＣｈｅｎＪＣ．ＤｉｅｔａｒｙａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｏｆｓｏｄｉｕｍａｌｇｉｎａｔｅｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｉｍｍｕｎｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉａｎｄｉｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ．ＦｉｓｈＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌ２００５；１８、１〜１２．
５２．ＣｈａｎｇＣＣ、ＹｅｈＭＳ、ＬｉｎＨＫ、ＣｈｅｎｇＷ．ｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｎｃａｐａｓｅ−３ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄａｃｔｉｖｉｔｙｉｎｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ．ＦｉｓｈＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌ２００８；２５、６７２〜６７８．
５３．ＳｍｉｔｈＶＪ、ＳｏｅｄｅｒｈａｅｌｌＫ．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｄｅｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎａｎｄｌｙｓｉｓｏｆｈａｅｍｏｃｙｔｅｓｉｎｔｈｅｆｒｅｓｈｗａｔｅｒｃｒａｙｆｉｓｈ，Ａｓｔａｃｕｓａｓｔａｃｕｓ，ｂｙｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓｏｆｐｒｏｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅａｃｔｉｖａｔｉｎｇｓｙｓｔｅｍｉｎｖｉｔｒｏ．ＣｅｌｌＴｉｓｓｕｅＲｅｓ１９８３；２３３、２９５〜３０３．
５４．ＬｏｒｅｎｚｏｎＳ、ＤｅＧｕａｎｎｉｎｉＳ、ＳｍｉｔｈＶＪ、ＦｅｒｒｅｒｏＥＡ．ＥｆｆｅｃｔｓｏｆＬＰＳｉｎｊｅｃｔｉｏｎｏｎｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｈａｅｍｏｃｙｔｅｓｉｎｃｒｕｓｔａｃｅａｎｓｉｎｖｉｖｏ．ＦｉｓｈＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌ１９９９；９、３１〜５０．
５５．ＨｏｕＷＹ、ＣｈｅｎＪＣ．ｔｈｅｉｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙｅｆｆｅｃｔｏｆｈｏｔ−ｗａｔｅｒｅｘｔｒａｃｔｏｆＧｒａｃｉｌａｒｉａｔｅｎｕｉｓｔｉｐｔａｔａｏｎｔｈｅｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉａｎｄｉｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ．ＦｉｓｈＳｈｅｌｌｆｉｓｈＩｍｍｕｎｏｌ２００５；１９、１２７〜１３８．
５６．ＹｅｈＳＴ、ＣｈｅｎＪＣ．ＩｍｍｕｎｏｎｏｄｕｌａｔｉｏｎｂｙｃａｒｒａｇｅｅｎａｎｉｎｔｈｅｗｈｉｔｅｓｈｒｉｍｐＬｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉａｎｄｉｔｓｒｅｓｉｓｔａｎｃｅａｇａｉｎｓｔＶｉｂｒｉｏａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ．Ａｑｕａｃｕｌｔｕｒｅ２００８；２７６、２２〜２６．
５７．ＷａｔｓｏｎＦＬ、Ｐｕｔｔｍａｎｎ〜ＨｏｌｇａｄｏＲ、ＴｈｏｍａｓＦ、ＬａｍａｒＤＬ．ＨｕｇｈｅｓＭ．ｅｔａｌ．ＥｘｔｅｎｓｉｖｅｄｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＩｇ−ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍｏｆｉｎｓｅｃｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ２００５；３０９、１８７４〜１８７８．
５８．ＰｈａｍＬＮ、ＤｉｏｎｎｅＭＳ、Ｓｈｉｒａｓｕ−ＨｉｚａＭ、ＳｃｈｎｅｉｄｅｒＤＳ、ＡｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｄｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｉｎＤｒｏｓｏｐｈｉｌａｉｓＤｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎＰｈａｇｏｃｙｔｅｓ．ＰＬｏＳＰａｔｈｏｇ２００７；３:e２６．ｄｏｉ:１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｐａｔ．００３００２６．
５９．ＤｏｎｇＹ、ＴａｙｌｏｒＨＥ、ＤｉｍｏｐｏｕｌｏｓＧ、ＡｇＤｓｃａｎ、ａｈｙｐｅｒｖａｒｉｂｌｅｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｒｅｃｅｐｔｏｒｏｆｒｅｃｅｐｔｏｒｔｈｅＡｎｏｐｈｅｌｅｓｇａｍｂｉａｅｉｎｎａｔｅｉｍｍｕｎｅｓｙｓｔｅｍ．ＰＬｏＳＢｉｏｌ、２００６；４、１１３７〜１１４５．
６０．ＷｏｊｔｏｗｉｃｚＷＭ、ＦｌａｎａｇａｎＪＪ、ＭｉｌｌａｒｄＳＳ、ＺｉｐｕｒｓｋｙＳＬ、ＣｌｅｍｅｎｓＪＣ、ＡｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓｐｌｉｃｉｎｇｏｆＤｒｏｓｏｐｈｉｌａＤｓｃａｍｇｅｎｅｒａｔｅｓａｘｏｎｇｕｉｄａｎｃｅｒｅｃｅｐｔｏｒｓｔｈａｔｅｘｈｉｂｉｔｉｓｏｆｏｒｍ−ｓｐｅｃｉｆｉｃｈｏｍｏｐｈｉｌｉｃｂｉｎｄｉｎｇ．Ｃｅｌｌ、２００４；１１８、６１９〜６３３．

Claims

エビにおいてビブリオ菌により引き起こされる感染に対するワクチン組成物であって、前記ビブリオ菌の熱不活化細胞（熱不活化ビブリオ細胞）と前記ビブリオ菌のホルマリン不活化細胞（ホルマリン不活化ビブリオ細胞）を含み、そのうち、前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞が、エビにおいてビブリオ菌に対し特異的な免疫を誘導するために有効な量で存在することを特徴とする、ワクチン組成物。
前記ビブリオ菌が、Ｖ．ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ａｎｇｕｉｌｌａｒｕｍ、Ｖ．ｃａｍｐｂｅｌｌｉ、Ｖ．ｄａｍｓｅｌｌａ、Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉ、Ｖ．ｈａｒｖｅｙｉ、Ｖ．ｌｏｇｅｉ、Ｖ．ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｉ、Ｖ．ｏｒｄａｌｉｉ、Ｖ．ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ、Ｖ．ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｖ．ｐｅｌａｇｉｃｕｓ、Ｖ．ｓｐｌｅｎｄｉｄｕｓ、Ｖ．ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓを含む群より選択されたことを特徴とする、請求項１に記載のワクチン組成物。
前記ワクチン組成物が、注射または浸漬での投与用であることを特徴とする、請求項１または２に記載のワクチン組成物。
前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞がワクチン組成物中に合計で１０^５−１０^９ＣＦＵ／ｍｌの量で存在することを特徴とする、請求項１乃至３のいずれかに記載のワクチン組成物。
前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞が、前記ワクチン組成物中にＣＦＵ比０.１：１〜１：０.１で存在することを特徴とする、請求項１乃至４のいずれかに記載のワクチン組成物。
前記エビが、バナメイエビ（Ｌｉｔｏｐｅｎａｅｕｓｖａｎｎａｍｅｉ）、ブラックタイガーエビ（Ｐｅｎａｅｕｓｍｏｎｏｄｏｎ）、クルマエビ（Ｍａｒｓｕｐｅｎａｅｕｓｊａｐｏｎｉｃａｓ）、コウライエビ（Ｆｅｎｎｅｒｏｐｅｎａｅｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）、インドエビ（Ｆ．ｉｎｄｉｃｕｓ）、ヨシエビ（Ｍｅｔａｐｅｎａｅｕｓｅｎｓｉｓ）、レッドテールシュリンプ（Ｆ．ｐｅｎｉｃｉｌｌａｔｕｓ）、オニテナガエビ（Ｍａｃｒｏｂｒａｃｈｉｕｍｒｏｓｅｎｂｅｒｇｉｉ）を含む群より選択されたことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれかに記載のワクチン組成物。
ビブリオ菌のホルマリン不活化細胞（ホルマリン不活化ビブリオ細胞）から作製されたワクチンの免疫を向上するためのアジュバンドとしての前記ビブリオ菌の熱不活化細胞（熱不活化ビブリオ細胞）の使用。
前記熱不活化ビブリオ細胞が前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞と混合され、前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞単独と比較して、前記ビブリオ菌に対してより強化かつ延長された免疫応答を誘導できる混合物を形成することを特徴とする、請求項７に記載の使用。
前記熱不活化ビブリオ細胞と前記ホルマリン不活化ビブリオ細胞を混合して混合物を形成する工程を含むことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれかにおいて定義されるワクチン組成物の作製方法。
前記混合物にアジュバントとしての追加成分を追加する工程を含まないことを特徴とする、請求項９に記載の方法。