JPH03187380A - ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを組み込んだ形質発
現ベクターで形質転換した形質転換体を用いて製造し得
るポリペプチド並びに該ポリペプチドの製造法等に間す
る。

単球走化性因子（以下、ＭＣＦと記す）は、例えばヒト
単球系細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ）と共に培
養したとき産生誘導される生理活性物質で、単球を動員
する活性や単球の有する重傷細胞増殖抑制作用を増強さ
せる活性化作用を有しており・、単球が動員され更に活
性化されることにより、ある種の細菌感染症や癌の治療
薬としての臨床応用が期待される。

本発明者のうち、松島綱治、シュスト　オッペンハイム
等はヒト単球系白血病細胞を適当な誘導剤の存在下で培
養し、その培養上清中より、いわゆる天然型ヒトＭＣＦ
を単離したやそして、その天然型ヒトＭＣＦを解析し、
その部分アミノ酸配列を解明すると共に、その分子量は
約１５ｋＤａと決定した。

本発明者等は、この天然型ヒトＭＣＦの部分アミノ酸配
列に基づいて、ヒトＭＣＦをコードするｃＤＮＡの単離
に成功し、このクローン化ｃＤＮＡの塩基配列の解析に
より、ヒトＭＣＦ　′ｖＩ駆体の全アミノ酸配列を解明
し、そのＣ末端側の７６残基のアミノ酸からなるヒトＭ
ＣＦの分子量は、約９ｋＤａと計算される低分子量のポ
リペプチドであることを明らかにした。

更に、このクローン化ＤＮＡ及びその主要部を組み込ん
だ形質発現ベクターを作製し、これを用いて形質転換し
た形質転換体を培養することにより、ヒトＭＣＦ活性を
有するポリペプチドを製造することができることが判明
し、本発明を完成した。

本発明の第１の目的は、ヒトＭＣＦ活性を有し、下記の
アミノ酸配列［Ｉ］又はその主要部の配列を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡを提供することにある。

Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａ
ｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＴｈｒＣｙｓ　Ｃｙｓ　　Ｔｙ
ｒ　　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙ
ｓ　　ｌ１ｅＳ８ｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ
　Ａｌａ　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　ＡｒｇＩＩｓ　　
Ｔｂｒ　Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌ
ｙｓ　Ｇｌｕ　ＡｌａＶａｌ　　ＩＩｓ　ＰｈｅＬｙｓ
　Ｔｈｒ　　Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ
ｌｌｅ　Ｃｙｓ　　Ｘ　　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇ
ｉｎ　Ｌｙｓ　Ｔｒｐ　ＶａｌＧｉｎ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ
　Ｍｅｔ　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　
ＧｌｎＴｈｒ　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　Ｔ
ｈｒ［Ｉ］ （但し、式［Ｉ］中Ｘは、Ａｌａ又はＴｈｒである。） 本発明の第２の目的は、上記ＤＮＡを組み込んだ形質発
現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造し得る上記
式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列又はその主要部の配列
を有し、ヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチドを提供す
ることにある。

本発明の第３の目的は、上記ポリペプチドの遺伝子工学
的手法による製造法を提供することにある。

本発明の他の目的は、以下の記載から明らかになるであ
ろう。

本発明によれば、ヒトＭＣＦ活性を有し、式〔Ｉ〕で示
されるアミノ酸配列又はその主要部の配列を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ　（以下単に本発明のＤＮ
Ａと記す）を用い、遺伝子組み換え技術を応用して、ヒ
トＭＣＦの活性を有し、式［Ｉ］で示されるアミノ酸配
列又はその主要部の配列を有するポリペプチド（以下単
に本発明のポリペプチドと記す）を製造することができ
る。

本発明のＤＮＡのうち、式［Ｉ］で示されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下ヒト
ＭＣＦをコードするＤＮＡと略記することもある〉の具
体的塩基配列としては、下記の式［Ａ］で示される塩基
配列からなるＤＮＡが挙げられる。

［Ａ］ （但し、式［Ａ］中Ｙは、Ｃ又はＴであり、Ｒは、Ｇ又
はＡである。） ヒトＭＣＦをコードするＤＮＡは、実施例１に記載の方
法又はそれに準じた方法に従って単離することが出来る
。更に、化学的に全合成することも可能である。ヒトＭ
ＣＦの主要部のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコ
ードするＤＮＡは、ヒトＭＣＦをコードするＤＮＡの余
分な領域又は欠損している領域を、例えば適当な制限酵
素による切断及び／又は化学合成オリゴデオキシリボヌ
クレオチドの結合による修復や部位特異的変異誘導法（ Ｋｕｎｋｅ　１　、　Ｔ、　Ａ、ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ
　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５４巻。

３６７頁、　１９８７年等）等の方法により製造するこ
とができる。

本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターは、遺
伝子組み換え技術及び形質発現に関する基太的理論（例
えば、Ｍａｎｉａｔｌｓ、Ｔ、ら、　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａ
ｎｕａｌ；　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏ、ｒ
　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、　１９８２年を参照〉に
則り、本発明のＤＮＡの５°末端（上流側）に翻訳開始
コドンＡＴＧを、かつ３′末端（下流側）には終止コド
ンを有するＤＮＡ断片を作製し、これを適当なプロモー
ター（例えば」１、ｌａｃ、坦ヒＳ、ＰＬ、ＳＶ４０初
期プロモーター等）及びＳＤ配列に続いて結合させ、更
にこれを宿主中で増殖可能な適当なベクター（例えばプ
ラスミドｐＢＲ３２２等）に組み込むことにより作製す
ることができる。

好ましいＳＤ配列から翻訳開始コドンまでの塩基配列と
しては、下記式［Ｂ］で示される塩基配列が挙げられる
。

５’−Ｘ’ＧＧＡＧＧＴＴＴＹ’ＡＴＴ−３°　　［Ｂ
］但し、式［Ｂ］中、Ｘｏは（Ａ）ｘを意味し、Ｘは１
〜５である。Ｙ′は　（Ａ　）　ｙ　（Ｔ　）　ｚ　を
意味し、ｙはＯ〜３を、ＺはＯ又はｌである。

この形質発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸菌にコ
ーエンらの方法（Ｃｏｈｅｎ、Ｓ、Ｎ、ら、　Ｐｒｏｃ
。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、、　ＵＳＡ、　　６９巻
、　　２１１０頁、　　１９７２年）に準じて導入する
ことにより形質転換体を得ることができる。

本発明のポリペプチドは、この形質転換体を適当な培養
条件下で培養することにより製造することができる。

この培養物を、例えばリゾチーム消化と凍結融解、超音
波破砕、フレンチプレス等により破壊したのち、遠心分
離又は枦遇することにより該ポリペプチド含有抽出液を
得ることができる。この抽出液から除核酸処理、塩析、
陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマ
トグラフィー限外濾過、ゲル濾過操作、必要に応じて透
析、電気泳動、抗体カラムを用いるアフィニティークロ
マトグラフィー等の方法を組み合せることにより本発明
のポリペプチドを精製することができる。

遺伝子組み換え技術により製造されるポリペプチドのＮ
末端には、宿主等の違いによって翻訳開始コドンに由来
するメチオニン残基が付加される場合がある。このよう
なポリペプチドも、ヒトＭＣＦ活性を有する限り、本発
明のポリペプチドに含まれる。

本発明に係わるポリペプチドとは、前記式［Ｉ］で示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのアミノ
酸配列の主要部の配列を含むポリペプチドであり、なん
らかのＭＣＦ活性、例えば単球を動員する作用或いは単
球の有する膿瘍細胞増殖抑制作用を増強させる活性化作
用を示すポリペプチドを意味する。又、ヒトＭＣＦをコ
ードするＤＮＡの対立遺伝子変異体ＤＮＡがコードする
ポリペプチド及びその主要部のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドも包含される。又、前記式［！］で示される
アミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端に他のアミ
ノ酸又はペプチド、例えばヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチ
ドの前駆部分の一部に相当するアミノ酸又はペプチドが
付加したポリペプチドも、本発明のポリペプチドに包含
される。

遺伝子組み換え技術の応用により製造した本発明のポリ
ペプチドの諸性状については、以下の方法により分析で
きる。

分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により、分子量既知蛋白標準品（ファルマシア社、スウ
ェーデン）の移動度との対比により算出する。アミノ酸
配列は、エドマン分解法により決定できる。即ち、本発
明のポリペプチドを、フルマーの方法（Ｆｕｌｌｍａｒ
、Ｃ，Ｓ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１４２巻、３３６頁、　１９８４年）に従って、尿素存
在下での２−メルカプトエタノール処理にて分子内のジ
スル′フィト結合を開裂させ、Ｃｙｓ残基を４−ビニル
ピリジン処理にて、ピリジルエチル化ポリペプチドを調
製する。更に、ピリジルエチル化ポリペプチドをメタロ
エンドペプチダーゼ（ＥＣ３，４，２４）等にて消化し
、得られたペプチド断片をシンクロパック（ＳｙｎＣｈ
ｒｏｐａｋ　）　　ＲＰ−Ｐカラム（ジンクロム社、米
国）を用い、トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃
度勾配溶出による高速液体クロマトグラフィー（）（Ｐ
ＬＣ）にて単離する。このピリジルエチル化ポリペプチ
ド及び各ペプチド断片のＮ末端部分のアミノ酸配列をプ
ロティン　シークエンサー自動分析装置（アプライドバ
イオシステム社、米国）を用いて解析する。

単球走化性活性は、ボイデン走化性活性検定槽（Ｂｏｙ
ｄｅｎ　ｃｈｅｍｏｔａｘｉｓ　ｃｈａｍｂｅｒ：ニュ
ーロ１プローブ社、米国）を用いて検定できる。即ち、
ポリカーボネートａ＜孔径８μｍ：ヌクレオボア社、米
国）で隔てた一方の室に本発明のポリペプチド液を入れ
、他室にヒト単核球を入れる。３７℃にて加温の後、膜
の検体液室側の面に移動した細胞数を、メタノール固定
及びギムザ染色の後、顕微鏡下にて計測する０本発明の
ポリペプチドの希釈及び培養用培地には、０．５％ウシ
血清アルブミン含有培養培地ＲＰ間ｌ−１６４０培地を
用いればよい。

腫瘍細胞増殖抑制活性は、次ぎの方法にて検定できる。

即ち、ヒト単球や単球／マクロファージ様細胞を９６穴
培養プレートに播き、３７℃で培養後、浮遊性細胞を除
去し、プレート粘着性細胞を準備する。この粘着性細胞
に本発明のポリペプチド液及び標的腫瘍細胞（例えば、
ヒト悪性黒色腫細胞Ａ３７５Ｍ胞ｉ　ＡＴＣＣ株番号Ｃ
ＲＬ−１６１９）を添加し、３７℃にて３日間培養する
。培養終了の６〜２４時間前に、トリチウム標識チミジ
ンを添加し、標的腫瘍細胞内への取り込み量の低下によ
り評価する０本発明のポリペプチドの希釈及び培養用培
地には、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地
を用いればよい。

本発明のポリペプチドの製剤化に際しては、賦形剤や安
定化剤を添加するのが好ましい、安定化剤としては、例
えばアルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミン、
プロタミン塩、グルコース、ガラクトース、キシロース
、マンニトール、グルクロン酸、トレハロース、デキス
トラン、ヒドロキシエチルデンプン、非イオン界面活性
剤等が挙げられる。

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を使
用する。

Ａ　　　　　　　アデニン Ｃシトシン Ｇ　　　　　　　グアニン Ｔ　　　　　　チミン ＲＮＡ　　　　　　リボ核酸 ｍＲＮＡ　　　　　伝令ＲＮＡ ＤＮＡ　　　　　　デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　　　　相補性ＤＮＡ ５ｓｃＤＮＡ　　　単鎖ｃＤＮＡ ｄｓｃＤＮＡ　　　二重鎖ｃ　ＤＮＡ アデノシン三リン酸 デオキシアデノシン三リン酸 デオキシシチジン三リン酸 デオキシグアノシン三リン酸 デオキシチミジン三リン酸 シャイン・ダルガーノ配列 キロ塩基 キロ塩基対 塩基対 リポポリサッカライド エチレンジアミン四酢酸 ジチオスレイトール キロダルトン ラウリルＩＥ＊ナトリウム ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン スルホン酸 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

実施例１ ＴＰ ｄＡＴＰ ｄＣＴＰ ｄＣＴＰ ｄＴＴＰ ＳＤ配列 ｂ ｂｐ ｐ ＬＰＳ ＥＤＴＡ ＴＴ Ｄａ ＤＳ ＯＰＳ ヒトＭＣＦをコード　るＤＮＡの ヒト前骨髄性白血病細胞株）（Ｌ−６０細胞（ＡＴＣＣ
株番号ＣＣＬ−２４０）を組織培養用シャーレ（９０ｘ
１６ｍｍ）に、培養液１ｍｌあたり約百万個の細胞密度
で播いた。培養液には、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地を用い、ホルボール−１２−ミリステ
ート−１３−アセテート（ＰＭＡ）及びビタミンＡ酸を
、それぞれ最終濃度として５００ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ
／ｍｌになるように添加した。この培養液中で、３７℃
、５％炭酸ガス含有空気中、湿度９０〜１００Ｘにて、
２日間培養した。

培養終了後、培養液及び非付着性細胞を吸引除去した。

シャーレに付着した分化細胞を、ＬＰＳ及びシクロヘキ
シミドを、それぞれ最終濃度として１０μｇ／ｍｌ及び
１μｇ／ｍｌになるように添加した１０％ウシ胎児血清
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、上記と同条件下で、
更に６時間培養した。培養終了後、培養液を吸引除去し
、シャーレ上に残った細胞を、０．５％ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム、５ｍＭクエン敢ナトナトリウム０
．１Ｍ２−メルカプトエタノールを含む６Ｍグアニジル
チオシアネート液にて溶解し、均質化した。この液を０
．１ＭＥＤＴＡを含む５．７Ｍ塩化セシウム水溶液上に
重層し、超遠心分離機（日立工機、ＲＰ２７−２　ｏ−
ター）にて２６．５００ｒｐｍｒ２０時間遠心分離する
ことにより、全ＲＮＡをペレットとして得た。この全Ｒ
ＮＡベレットを、０．３５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ
）リス及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量
に溶解し、エタノールを添加し沈澱として回収した。

この全ＲＮＡを、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ）リ
ス塩酸ＭＷｔ液（ｐＨ７，４）に溶解し、６５℃で５分
間加熱した。これに塩化ナトリウムを最終濃度として０
．５Ｍになるように添加したのち、予め１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ）リス塩
酸Ｍｔｌｔ液（ｐＨ７，４）にて平衡化したオリゴ（ｄ
Ｔ）セルロースカラムに負荷し、同カラムに吸着したｍ
ＲＮＡを、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍ間トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ７，４）にて溶出することにより単離した
。

上記で得られたｍＲＮＡを鋳型として、グブラーとホフ
マンの方法（Ｇｅｎｅ、　２５巻、２６３頁、　　１９
８３年〉に準じてｃＤＮＡを合成した。即ち、ｍＲＮＡ
の約６μｇを蒸留水に溶解（６μｇ／６μｍ）シ、これ
に０．６μｍの１００ｍＭ水酸化メチル水銀水溶液を添
加し、室温で１０分間放置した０次いで、約２０単位の
ＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｌｎ、プロメガバイオ
チク社、米国）を含む０．５Ｍ２−メルカプトエタノー
ル液の１．８μｍを添加した。室温で５分間放置の後、
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．２５ｍＭ　ｄＧＴＰ、
１．２５ｍＭ　ｄＡＴＰ、１．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ、０
．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、　０．１７μＭ　ａ　−３２Ｐ−
ｄＣＴＰ（放射比活性６，０ＯＯＣ１／ｍｍｏｌｅ）　
、　４μｇのオリゴ（ｄＴ）１２〜１８，１２０単位の
トリ骨髄性白血病ウィルス由来逆転写酵素（バイオ・ラ
ッド社、米国〉を含む３２μｌの５０ｍＭ　トリス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，３）を添加し、４２℃で６０分間反応
させた後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ液の２μｌを添加して反
応を停止させた。この反応液に、フェノール／クロロホ
ルム混液（１：１）を添加し、反応生成物（ｓｓｃＤＮ
ＡとｍＲＮＡの複合体）を、水層に抽出した。その水層
に酢酸アンモニウムを最終濃度として２．５Ｍになるよ
うに添加し、更にエタノールを加えることにより、上記
複合体を沈澱として回収した。

この反応生成物（ｓｓｃＤＮＡとｍＲＮＡの複合体）を
、二次合戒綬衝液［組成：　５ｍＭ塩化マグネシウム、
１０ｎｎＭ　［酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウ
ム、０．１５ｍＭβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド　、　４０ｐＭ　　ｄＣＴＰ１４０ｐＭ　　ｄＡ
ＴＰ、　　　４０ｐＭ　　ｄＴＴＰ、　　　４０ｐＭ　
ｄＣＴＰ、５μｇのウシ血清アルブミン、１．２５単位
の大腸菌リボヌクレアーゼＨ１２４単位の大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩを含む２０ｍＭ　トリス塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５）　］のＺｏｏμｍに溶解した。これを１２℃
で６０分間反応させた後、２．５単位の大腸菌ＤＮＡリ
ガーゼを添加し、更に２２℃で６０分間反応させた。Ｅ
ＤＴＡを添加することにより、反応を停止させた６反応
生成物（ｄｓｃＤＮＡ　）は、フェノール／クロロホル
ム混液（に１　）による抽出及びエタノール処理により
、沈澱として回収した。

この反応生成物（ｄｓｃＤＮＡ）を、オリゴ（ｄＣ）鎖
付加１１衝液［組成：　２ｍＭ塩化コバルト、０．２ｍ
Ｍ　ＤＴＴ。

０、１ｍＭ　ｄＣＴＰ及び工Ｏ単位のターミナルデオキ
シヌクレオチジル　トランスフェラーゼを含有する１０
０ｍＭカコジル酸ナトリウム（ｐＨ７，２）　］の１０
０μｍに溶解し、３７℃で３０分間反応させることによ
り、ｄｓｃＤＮＡの３′末端にオリゴ（ｄＣ）＃［を付
加させた０反応生成物［オリゴ（ｄＣ）鎖付加ｄｓｃＤ
ＮＡ］は、フェノール／クロロホルム混液（１：１）に
よる抽出及びエタノール処理により、沈澱として回収し
た。

上記のオリゴ（ｄＣ）　ｇ付加ｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡを、
オリゴ（ｄＧ）鎖付加ｐＢＲ３２２，Ｐｓｔｒ−ｃｕｔ
　（ベセスダリサーチラボラトリーズ、米国〉とともに
、アニーリング緩衝液［組成：　１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び
１００ｍＭ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ）リス塩酸緩
衝液（ｐＨ７，４）　］中に溶解混合し、６５℃で１０
分間、５７℃で２時間、更に４５℃で２時間反応させる
ことにより、オリゴ（ｄＣ）　［とオリゴ（ｄＧ）Ｍを
結合させ、環状二重鎖の組み換えプラスミドを調製した
。

上記の組み換えプラスミドを、次の方法に従って大腸菌
８８１０１株に導入しヒトｃＤＮＡライブラリーを作製
した。即ち、大腸菌８８１０１株をＬ培地［組成：１％
トリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナトリ
ウム、０．１％ブドウ糖（ｐＨ７，２）　］に接種し、
濁度（波長６００ｎｍの吸光度）が約０．５に達するま
で、３０℃で培養した。この培養画体液を氷水中で３０
分間ｎｒＩｔシたのち、遠心分離にて菌体を採取した。

この菌体を５０ｍＭ塩化カルシウム液中に再懸濁させ、
氷水中で６０分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採
取し、これを２０％グリセリンを含む５０ｍＭ塩化カル
シウム液中に懸濁させた。この菌体液に上記の組み換え
プラスミド溶液を添加混合し、氷水中で２０分間、室温
で１０分間反応させたのち、Ｌ培地を添加して３７℃で
６０分間振盪培養した。その菌体液の一定量を、６．２
５ｐｇ／ｍｌ濃度のテトラサイクリンを含むＬ培地寒天
平板（寒天濃度１．５％〉に播き、３７℃で一夜培養し
、テトラサイクリン耐性クローンを選択して、ヒトｃＤ
ＮＡライブラリーとした。

このヒトｃＤＮＡライブラリーから、ヒトＭＣＦをコー
ドするｃＤＮＡを、下記の化学合成オリゴデオキシリボ
ヌクレオチドをプローブとして用い、ハナハンとメセル
ソンの方法（ＧＩ！ｎｅ、　１０巻、６３頁、　１９８
０年）に準じたコロニー・ハイブリダイゼーション法に
より選択した。

即ち、ヒト培養細胞株ＴＨＰ−１細胞から単離された、
いわゆる天然型ヒトＭＣＦの部分アミノ酸配列、Ｍｅ　
ｔ−Ａｓｐ−Ｈｌ　５−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　−Ｌｙ　ｓ−
Ｇ　１　ｎ−Ｔｈ　ｒ−Ｇｌｎ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ　−
Ｌｙｓ−Ｔｈｒ、に基づいて下記式［Ｉ］〜［４］で示
される４種類のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学
合成し、プローブとして用いた。

５’　−ＡＴＧＧＡＹＣＡＹＴ丁ＲＧＡ−３’　　　　
　　［Ｉコ５’　−ＡＴＧＧＡＹＣＡＹＣＴＮＧＡ−３
°　　［２］５°−ＧＡＹＡＡＲＣＡＲＡＣＹＣＡ−３
’　　　　　［３コ５’　−ＧＡＹＡＡＲＣＡＲＡＣＲ
ＣＡ−３°　　［４］但し、上記式中、ＹはＴ及びＣを
意味し、ＲはＡ及びＧを意味し、ＮはＴ、　Ｃ，Ａ及び
Ｇを意味する。従って、式［Ｉ］で示されるプローブは
、８種類のＤＮＡ（１４−ｍａｒ）の混合物であり、式
［２コ〜［４］で示されるプローブは、いずれも１６種
類のＤＮＡ　（１４−ｍａｒ　）の混合物である。

上記式［Ｉ〕〜［４］のそれぞれの合成プローブ（ｌＱ
Ｑｐｍｏｌｅ　）について、γ−３２ｐ−ＡＴＰ　（５
０９ｍｏｌｅ相当量：比活性５．０ＯＯＣ１／ｍｍｏｌ
ｅ　）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位）
を用いる基本反応条件下で・３２ｐにて末端標識をした
。

ヒトｃ　ＤＮＡライブラリーの中から、式［Ｉ］と［２
］のプローブを混ぜたもの又は、式［３］と［４］のプ
ローブを混ぜたものの２種類の混合プローブのいずれの
プローブとも結合する塩基配列を含むクローンを検索し
た。コロニー・ハイブリダイゼーションの条件は、３６
℃で４０時間とした。その結果、約３，６万クローンの
中から、３５クローンが選択された。これら−次選択さ
れたクローンから単離したｃＤＮＡについて、各種制限
酵素を用いた制限酵素地図解析を行い、いずれも共通の
塩基配列を含むものであることを確認した。

最終的に選択した３種類の組み換えプラスミド（プラス
ミド番号：　ＰＨＭＣＦ７、ｐＨＭＣＦ２５及びｐＨＭ
ｃＦ２９　）について、その塩基配列をジデオキシ法に
て決定した。　ＰｔＪｃｌＢ及びＰＴＪＣ１９をクロー
ニングベクターとし、ＴａＫａＲａ　７−ＤＥＡＺＡシ
ークエンスキット（宝酒造）を用い、操作手順書く宝酒
造編）に従って実施した。

ヒトＭＣＦ前駆体をコードする塩基配列及び塩基配列か
ら演鐸されるアミノ酸配列を、第１表にまとめて示す、
　ＰＨＭＣＦ７及びｐＨＭｃＦ２９に組み込まれたヒト
ＭＣＦ前駆体をコードする塩基配列は、第１表に示した
配列中、塩基番号１０５及び２２６番目の塩基が、それ
ぞれＴ及びＧであった。一方、ｐＨＭＣＦ２５に組み込
まれたヒトＭＣＦ前駆体をコードする塩基配列中、塩基
番号１０５及び２２６番目の塩基は、それぞれＣ及びＡ
であった。

第１表 ＬｅｕＬｅｕｌｌｅＡｌａＡｌａＴｈｒＰｈａｒｌｅＰ
ｒｏＧｌｎ　　（２０）ＡｒｇＬｙｓＩｌｓＳｅｒＶａ
ｌＧｌｎＡｒｇＬｅｕＡｌａＳａｒ（５０） ＬｙｓＧｌｕＡｌａＶａｌＩｌｅＰｈｅＬｙｓＴｈｒｌ
ｌｅＶａｌ（７０） ＧＣＣＡＡＧＧＡＧＡＴＣＴＧＴＲＣＴＧＡＣＣＣＣＡ
ＡＧＣＡＧ　２４０ＡｌａＬｙｓＧ１ｕＩｌｅＣｙｓ　
Ｘ　ＡｓｐＰｒｏＬｙｓＧｌｎ　　（８０）第１表中、
数字は塩基番号を示す、括弧内の数字はアミノ酸番号を
示す、＊＊＊は、翻訳終止コドンを意味する。塩基番号
１〜２９７番目迄の塩基配列は、ヒトＭＣＦ前駆体をコ
ードする塩基配列、塩基番号７０〜２９７番目道の塩基
配列（式［Ａ］で示される塩基配列に相当）は、ヒトＭ
ＣＦをコードする塩基配列である。塩基番号１０５番目
のＹは、Ｃ又はＴである。塩基番号２２６番目のＲは、
Ｇ又はＡである。

アミノ酸番号１〜９９番目迄のアミノ酸配列は、ヒ）　
ＭＣＦ前駆体のアミノ酸配列（式［ＩＩ］で示されるア
ミノ酸配列に相当〉、アミノ酸番号２４〜９９番目迄の
アミノ酸配列（式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列に相当
〉は、ヒトＭＣＦのアミノ酸配列である。アミノ酸番号
７６番目のアミノ酸（Ｘ）は、Ａｌａ又はＴｈｒである
。

実施例２ ヒトＭＣＦポリペプチドの　造 （１〉形質発現プラスミドｐＨＭｃ０７６の構築第１表
に示すヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの第２４〜９９番
目のアミノ酸配列、即ち式［Ｉ１で示されるアミノ酸配
列（但し、式［Ｉ］中、ＸはＡｌａである）を有するポ
リペプチドを生産するための形質発現プラスミドを、以
下の方法で構築した。即ち、実施例１に記載のヒトＭＣ
ＦをコードするｃＤＮＡが組み込まれたプラスミドｐＨ
ＭＣＦ７から制限酵素ＰｓｔＩによる消化にて、第１表
に示すヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの全領域をコード
する塩基配列を含む大きなりＮＡ断片を単離した。この
ＤＮＡ断片をＭ　１３ｍｐ　１Ｂフアージベクター（宝
酒造）のポリリンカー領域にある制限酵素ＰｓｔＩの切
断部位の領域に挿入した。

この組み換えファージＤＮＡを用い、クンケルらの方法
（Ｋｕｎｋｅ　１　、　Ｔ、　Ａ、ら、　Ｍｅｔｈｏｄ
ｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、。

１５４巻、３６７頁、　１９８７年〉に準じた部位特異
的変異誘導法により、ヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの
Ｎ末端から第２３番目のＡｌａと第２４番目のＧｉｎを
コードするコドンの間に ５’　−ＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧ−３”の塩基配列を、
更に該前駆体ポリペプチドのＣ末端アミノ酸であるＴｈ
ｒに続く翻訳終止コドン（ＴＧＡ）と３′非翻訳領域の
塩基配列との間に ５’−ＴＧＡＣＴＣＧＡＧ−３’ の塩基配列を挿入した０部位特異的変異誘導には、ＭＵ
ＴＡ−ＧＥＮＥインビトロムタジェネシス　キット（バ
イオ・ラット社）を用い、操作手順書くバイオ・ラッド
社編〉に従って行った。即ち、上記の組み換えファージ
ＤＮＡを大腸菌ＪＭ１０５株に感染させ、これを培養し
てファージを採取した０次いで、このファージを大腸菌
ＣＪ２３６株に感染させるとともに、ウリジン（１μｇ
／ｍｌ　）及びクロラムフェニコール（２０ｕ　ｇ／ｍ
ｌ　）を含有する２ｘＴＹ培地［組成：１．６％トリプ
トン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム］中、
３７℃で５時間培養し、その培養上清からウラシルが導
入された単鎖ファージＤＮＡを単離した。

別途、下記式［５］及び［６コで示される塩基配列を有
する２種類の変異誘導プライマーを常法に従って化学合
成した。

５　’　−ＣＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴ
ＡＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣ−３’［５コ ５’　−ＣＣＧＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＡＧ
ＡＣＡＣＴＣＡＣＴＣＣＡＣ−３’［６］ この変異誘導プライマーの５′末端にリン酸基を付加し
、このリン酸化プライマーを先に調製したウラシルが導
入された単鎖ファージＤＮＡとアニールｗ１衝液［組成
：　２ｍＭ塩化マグネシウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウ
ムを含む２０ｍＭ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）］
中、７０℃で１０分間反応させのち、１分間に１℃の割
合で３０’Ｃまで徐々に冷却することにより、変異誘導
プライマーをファージＤＮＡに結合させた。

次いで、合成緩衝液［組成：各０．４ｍＭのデオキシヌ
クレオシド三リン酸（ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＡＴ
Ｐ、　ｄＴＴＰ）、０、７５　　ｍＭ　ＡＴＰ、３．７
５ｍＭ塩化マグネシウム及び１、５ｍＭ　ＤＴＴを含む
１０ｍＭ）リス塩ｗｉ緩衝液（ｐＨ７，４）］中、水中
に５分間、２５℃で５分間及び３７℃で９０分間の反応
条件下で、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを作用させ鋳型の
ファージＤＮＡに対して相補的なりＮＡを合成し、その
末端をＴ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させ、反応を一２
０℃での凍結にて停止させることにより、環状二重鎖Ｄ
ＮＡを作製した。これを大腸菌ＪＭ１０５株に感染させ
、その各クローンについてそれぞれ培養し、培養菌体か
ら変異型複製型二重鎖ＤＮＡを単離した。単離した変異
型複製型二重鎖ＤＮＡの塩基配列が意図した塩基配列に
変換されていることを、上記の培養上清から単離した単
鎖ＤＮＡを用いた塩基配列の解析（ジデオキシ法）によ
り確認した。

次いで、変異型複製型二重鎖ＤＮＡから制限酵素Ｄｒａ
　ＩとＸｈｏＩによる消化にて、ヒトＭＣＦポリペプチ
ドをコードする領域を含むＤＮＡ断片を切り出した。

このＤＮＡ断片を、ＭＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片
という。

別途、参考例１に記載の形質発現ベクターｐＥＰ２０５
から制限酵素ＤｒａＩとＸｈｏＩを用いて、アンピシリ
ン耐性遺伝子及び複製開始点を含む大きなりＮＡ断片（
この断片を、ＥＰ２０５　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片と
いう〉を切り出し１９．これを上記のＭＣＦ　（Ｄｒａ
Ｉ−Ｘｈｏ　Ｉ）断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
結合させることにより、ヒトＭＣＦ生産用形質発現プラ
スミドｐＨＭｃｃ＋７６をｔｆ４ｗ！＆シた。

形質発現プラスミドｐＨＭｃＯ７６を、実施例１に記載
の方法に準じて、大腸菌ＨＢ　１０１株に導入した。

該プラスミドが導入された形質転換体を、２５μｇ／ｍ
１濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地寒天平板（寒天濃
度１．５％〉で、３７℃にて一夜培養し、アンピシリン
耐性クローンを選択することにより得た。

このアンピシリン耐性クローン、即ち形質転換体を大腸
菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨＭｃＯ７６と名付け、式［Ｉコで示
されるアミノ酸配列（但し、式［Ｉ］中、Ｘは、Ａｌａ
である）を有するヒトＭＣＦポリペプチドの生産菌とし
た。

（２）ヒトＭＣＦポリペプチドの製造 上記で得たヒトＭＣＦポリペプチドの生産菌、大腸菌Ｈ
Ｂ１０１／ｐＨＭｃＯ７６をＬＢ培地にて３７℃で一夜
培養したのち、その菌体液を約１００倍量の栄養培地［
組成：１．５％リン酸二ナトリウム・１２水塩、０．３
％リン酸−カリウム、０．１％塩化アンモニウム、２ｍ
ｇ／ｌ　ビタミンＢｌ、０．５％カザミノ酸、２ｍＭ　
Ｍ酸マグネシウム、０．１＋ｎＭ塩化カルシウム、１％
トリプトン、０，５％酵母エキス、１％塩化ナトリウム
、０．４％グリセリン］に接種し、更にインドール−３
−アクリル酸を最終濃度２０μｇ／ｍ　１になるように
添加したのち、３５〜３７℃で２０〜３０時間培養する
。菌体を遠心分離により採取し、０．１％リゾチーム及
び３０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭ　）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，０）に懸濁させる。氷水中で３０分間
静置したのちドライアイス／エタノール浴での凍結と３
７℃での融解を繰り返して菌体を破壊し、これに１７５
０容■の１０％ポリエチレンイミンを加えて静置ののち
遠心分離にて菌体残査等を除いた抽出液を得る。この抽
出液に硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように添加
し、静置ののち遠心分離により沈澱を採取する。この沈
澱を蒸留水に溶解させ、５ｍＭリン酸塩緩衝化生理食塩
液（ＰＨ６，５）に対して透析したのちセファクリルＳ
−２００カラム（ファルマシア社）を用いるゲルｖ通に
付し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析に
て、ヒトＭＣＦポリペプチドを含む画分を集める。これ
を、　２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ６，５）に対して
透析し、同緩衝液にて平衡化したＣＭ−セファロース（
ファルマシア社）に負荷し、同カラムに吸着したヒトＭ
ＣＦポリペプチドを、塩化ナトリウムの濃度勾配（０〜
０．５Ｍ　）にて溶出する。ヒトＭＣＦポリペプチドの
溶出画分を集め限外が過にて濃縮したのち、トヨパール
ＭＷ−５５（東ソー）を用いるゲル濾過により精製する
ことにより、ヒトＭＣＦポリペプチドの精製品を得るこ
とができる。

実施例３ ヒトＭＣＦ　　性を有　るボリベプ　ドの（１〉形質発
現プラスミドの構築 第１表に示すヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドのアミノ酸
配列（但し、第１表中のＸはＡｌａである）のＮ末端か
ら第２７又は３０番目のアミノ酸をＮ末端とするヒトＭ
ＣＦ活性を有するポリペプチド、即ち実施例２に記載の
ヒトＭＣＦポリペプチドのＮ末端部分が欠失した種々の
ポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを構築した。

即ち、実施例２に記載の形質発現プラスミドＰＨＭＣＯ
７６から制限酵素力ヱＩと５ａｌＩにより、実施例２に
記載のＭＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片を含む大きな
りＮＡ断片を単離し、これをＭ１３ｍｐ１９ファージベ
クター（宝酒造）のポリリンカー領域にある制限酵素５
ａｌＩとＸｂａＩの切断部位の領域に挿入して組み換え
ファージＤＮＡを作製した。この組み換えファージＤＮ
Ａを鋳型とし、下記の種々の化学合成変異誘導ブライマ
ーを用い、実施例２に記載の部位特異的変異誘導法に従
って、ＭＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片の塩基配列中
、ヒトＭＣＦポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸をコ
ードする塩基配列を部分的に欠失させ、。

これを実施例２に記載のＥＰ２０５　ｖｅｃｔｏｒ−Ｄ
ＮＡ断片と結合させることにより、構築した。

この部位特異的変異誘導に用いる変異誘導プライマーの
塩基配列は、下記の通りである。

第１表に示したヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの第２７
〜９９番目のアミノ酸配列（但し、第１表中のＸはＡｌ
ａである）を有するポリペプチド生産用形質発現プラス
ミド構築の場合、 ５’　−ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡＡＴＣＡＡ
ＴＧＣＣＣ−３’ヒヒトＣＦ前駆体ポリペプチドの第３
０〜９９番目のアミノ酸配列（但し、第１表中のＸはＡ
ｌｍである）を有するポリペプチド生産用形質発現プラ
スミド構築の場合、 ５’　−ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＧＴ
ＣＡＣＣＴＧＣ−３’である。

実施例２に記載の方法に従って、それぞれの変異型複製
型二重鎖ＤＮＡを作製°し単離した０次いで、それぞれ
の変異型複製型二重鎖ＤＮＡから制限酵素ＤｒａＩとＸ
ｈｏＩによる消化にて、該ポリペプチドをコードする塩
基配列を含むＤＮＡ断片を単離した。これらの各ＤＮＡ
断片を、形質発現ベクターｐＥＰ２０５由来のＥＰ２０
５　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片と結合させることにより
、それぞれのポリペプチド生産用の形質発現プラスミド
を構築した。

（２〉ヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチドの製造前項
で作製した形質発現プラスミドを用い、実施例２に記載
の方法に従って、大腸菌Ｈ８１０１株に導入し形質転換
体を作製する６次いで、これらの形質転換体を用い、実
施例２に記載の方法に従うて、ヒトＭＣＦ活性を有する
ポリペプチドを製造することができる。

上記の形質発現プラスミドＤＮＡを用い、原核細胞由来
ＤＮＡ翻訳キット（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｌｃ　ＤＮＡ−
Ｄ１ｒｅｃｔｅｄ丁ｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、ア
マジャム社）にて、試験管内でポリペプチドを合成する
ことができる。

形質発現プラスミドＤＮＡは、常法に従って抽出し、塩
化セシウム・エチジウムプロミド超遠心分離法にて精製
した（Ｍａｎｉａｔｌｓ、Ｔ、ら、　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｉｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａ
ｎｕａｌＢ　７５〜９６頁、　ＣｏｌｄＳｐｒｌｎｇ　
Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、　１９８２
年）、形質発現プラスミド及び上記の翻訳キットを用い
たポリペプチドの生産は、該キットに添付の操作手順書
に従い、トリチウム標識ロイシンを用いる系を採用し、
かつ転写・翻訳反応系に、リボヌクレアーゼ阻害剤（ヒ
ト胎盤由来：アマジャム社）を添加する。生産産物は、
　５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ、’Ｕ、に、、　Ｎａｔｕｒｅ、　２２７巻、６
８０頁、　１９７０年）ののちオートラジオグラフィー
解析、生物活性により同定する。

参考例１ ベクターＥＰ２０５の プラスミドｐＢＲ３２２を、制限酵素公！工とＰｖｕ　
Ｉ　Ｉにて消化し、得られた大きな断片（約３．７ｋｂ
ｐ　）を単離した。このＤＮＡ断片の両端を、ＤＮＡポ
リメラーゼ■（クレノー　フラグメント）及びｄＧＴＰ
、　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを用いて平滑末端
としたのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて結合させることに
より、プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点近傍のコピ
ー数制御領域を欠失させたプラスミドベクター（ｐＢＲ
３６という）を作製した。

このベクターＰＢＲ３６を、制限酵素ＰｓｔＩとＥｃｏ
ＲＩにて消化し、アンピシリン耐性遺伝子の上流領域を
含む小さなりＮＡ断片（約０．７５ｋｂｐ　）を単離し
た。このＤＮＡ断片をＡｍｐ　（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ
）断片という。

このＡｍｐ　（Ｐｓ　ｔ　Ｉ−ＥｃｏＲＩ）断片を、実
施例２に記載した方法に従ってＭ１３ｍｐ１Ｂファージ
ベクター（宝酒造）に挿入した。この組み換えファージ
ＤＮＡを用い、実施例２に記載の方法による部位特異的
変異誘導法により、　Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ）
断片中の一塩基（Ａ）を他の塩基ＣＧ）に変換すること
により、制限酵素ＤｒａＩの切断認識配列（ＴＴＴＡＡ
Ａ）を消去した。

即ち、ウラシルが導入された単鎖ファージＤＮＡを、上
記の組み換えファージＤＮＡを感染させた大腸菌ＣＪ２
３６株の培養上清から単離した。

別途、下記式［７］で示される塩基配列を有する変異誘
導プライマーを常法に従って化学合成した。

５′−ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣ−３’
　　　　　　　［７コこの変異誘導プライマーの５°末
端にリン酸基を付加し、このリン酸化変異誘導プライマ
ーを、上記のウラシルが導入された単鎖ファージＤＮＡ
と結合させ、実施例２に記載の方法に従って、目的とす
る変異型複製型二重鎖ＤＮＡを単離した。

この変異型複製型二重１１ＤＮＡから制限酵素Ｐｓｔ　
ＩとＥｃｏＲｒによる消化にて、Ａｍｐ（Ｐｓｔｌ−Ｅ
ｃｏＲＩ）断片に対応し制限酵素ＤｒａＩの切断認識配
列が消去されたＤＮＡ断片（変異Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ）断片という）を単離した。この変異Ａｍｐ　
（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ）断片を、前記のベクターｐＢ
ＲＳ６から制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔｌにて切り出さ
れる大きなりＮＡ断片にＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて
結合させることにより、プラスミドベクターｐＢＲ３６
の塩基配列中、アンピシリン耐性遺伝子領域に存在する
制限酵素ＤｒａＩの切断認識配列が消去されたプラスミ
ドを作製し、これをｐＢＲ３６０１と名付けた。

更に、このプラスミドベクターｐＢＲ３６０１を、制限
酵素ＤｒａＩによる消化にて得られた大きなりＮＡ断片
に、ＳｍａＩリンカ−（宝酒造）をＴ４　ＤＮＡリガー
ゼにて結合させることにより、新規プラスミド　ベクタ
ーを作製した。この新規プラスミドベクターは、プラス
ミドｐＢＲ３２２の変異誘導体であり、その塩基配列中
、制限酵素ＤｒａＩの切断認識塩基配列が完全に消去さ
れたものであり、ｐＢＲ３６０２と名付けた。尚、Ｓｍ
ａ　Ｉリンカ−の塩基配列は下記のとおりである。

５’　−ＣＣＣＧＧＧ−３’ 更に、この新規ベクターｐＢＲ３６０２より、制限酵素
〜＋ｔＩＩと５ａｌＩにて消化して得られる大きなりＮ
Ａ断片を単離した［この断片を、　ｐＢＲ３６０２（Ａ
ａｔＩＩ−５ａｌＩ）断片という］。

別途に参考例２に記載したヒト　インターロイキン１α
生産用形質発現プラスミドＰＨＩＰＨ３８３ａがら制限
酵素ＡａｔＩＩと５ａｉｌによる消化にて単離したＤＮ
Ａ断片、即ちトリプトファンプロモーター領域及びヒト
　インターロイキン１αをコードする領域を含むＤＮＡ
断片（ｔｒｐ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＩＬ１α−ＤＮＡ断
片という）を単離した。このｔｒｐ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ
／ＩＬＩ　ａ　−ＤＮＡ断片を、ｐＢＲ３６０２（Ａａ
ｔＩＩ−３ａｌＩ）断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用い
て結合させることにより、新規の発現プラスミドを構築
した。この発現プラスミドをｐＥＰ２０５と名付けた。

参考例２ 形質発現ベクターｐＨｌＰＨ３８３ａの構築ヒト　イン
ターロイキン１α前駆体ポリペプチドをコードするクロ
ーン化ｃ　ＤＮＡは、ヨーロッパ公開特許第０１８８９
２０号に記載の方法に従って単離した。

このヒト　インターロイキン１αｃ　ＤＮＡが組み込ま
れた組み換えプラスミドｐＨＬ４　（Ｆｕｒｕｔａｎｉ
、Ｙ、ら。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、　１３巻、　
５Ｅ１６９頁、　１９８５年）から、制限酵素ＰｓｔＩ
による消化にて、ｃＤＮＡ領域を切り出し、更に制限酵
素ＥｃｏＲＩとＢｓｔＮＩにて消化し、ｅ、熱望ヒト　
インターロイキン１αをコードする領域の中央部に相当
する約４１１ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ
断片は、ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号の第５
表記載の塩基番号第３９８〜８０８番目の塩基配列に相
当する。

このＤＮＡ断片に、下記の式［８］及び［９コで示され
る２種類の化学合成オリゴデオキシリボヌクレオチド　
アダプターをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた
。ここで得られたＤＮＡ断片を、５Ｄ−ＩＬＩ断片とい
う。

式［８］の化学合成オリゴデオキシリボヌクレオチドア
ダプターとは、下記式［ａｌ〜［ｅ］で示される５種類
のＤＮＡ断片を、順次結合させて作製したＤＮＡアダプ
ターである。

３’−ＴＴＣＣＴＣＣＡＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣ５’−Ｔ
ＴＡＴＧＴＣＡＴＣＡＣＣＴＴＴＴＡＧ　　　　　　　
　　　　　　［ｃ１３’　−ＡＧＴＡＧＴＧＧＡＡＡＡ
ＴＣＧＡＡＧＧ３’−ＣＴＡＧＴＡＧＴＴＴＡＴＧＣＴ
ＴＡＡ式［９］の化学合成オリゴヌクレオチドアダプタ
ーの塩基配列は、次の通りである。

別途に、形質発現ベクターｐＥＰ３０２　（Ｆｕｒｕｔ
ａｎｉ、Ｙ、ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、　　１３巻。

５８６９頁、　　１９８５年）を、制限酵素虫υ工とシ
ルＨＩにて消化し、大腸菌トリプトファンプロモーター
領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大きなりＮ
Ａ断片（以下、ＥＰ３０２　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片
という〉を単離した。

このＥＰ３０２　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片を、上記の
５Ｄ−ＩＬＩ断片と、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結
合させることにより、成熟型ヒトインターロイキン１α
ポリペプチド生産用の形質発現プラスミドｐＨｌＰＨ３
８３ａを構築した。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト単球走化性因子活性を有し、下記のアミノ酸
   配列［ I ］又はその主要部を有するポリペプチドをコ
   ードするＤＮＡ。 【遺伝子配列があります。】 ［ I ］ （但し、式［ I ］中Ｘは、Ａｌａ又はＴｈｒである。
   ）
2. （２）下記のアミノ酸配列［II］を有するヒト単球走化
   性因子前駆体ポリペプチドをコードするＤＮＡ又はその
   対立遺伝子変異体ＤＮＡにおいて、その５’末端側の２
   ４〜２９個のコドンが欠失した塩基配列を有するＤＮＡ
   。 【遺伝子配列があります。】 ［II］ （但し、式［II］中Ｘは、Ａｌａ又はＴｈｒである。）
3. （３）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡを組み込んだ
   形質発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造する
   ことを特徴とするヒト単球走化性因子活性を有するポリ
   ペプチドの製造法。
4. （４）特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡを組み込んだ
   形質発現ベクターで形質転換した宿主を用いて製造する
   ことを特徴とするヒト単球走化性因子活性を有するポリ
   ペプチドの製造法。
5. （５）ヒト単球走化性因子活性を有し、特許請求の範囲
   第１項の式［ I ］で示されるアミノ酸配列又はその主
   要部の配列を有するポリペプチド。
6. （６）特許請求の範囲第１項の式［ I ］で示されるア
   ミノ酸配列において、そのＮ末端側の１〜６個のアミノ
   酸が欠失したアミノ酸配列を有し、ヒト単球走化性因子
   活性を有するポリペプチド。