JPH07106151B2

JPH07106151B2 - 高度形質発現組み換え体ベクタ−

Info

Publication number: JPH07106151B2
Application number: JP60019054A
Authority: JP
Inventors: 壽一福井; 純一山岸; 泰治古谷; 山田　　正明
Original assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Dainippon Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1985-02-01
Filing date: 1985-02-01
Publication date: 1995-11-15
Anticipated expiration: 2010-11-15
Also published as: JPS61177989A

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、癌壊死因子等の有用物質の生産用高度形質発
現ベクター及びその形質転換体に関する。

遺伝子組み換え技術を応用した有用物質の微生物におけ
る産生は、目的とする物質をコードするDNAからの転写
及び翻訳が正しくなされるように形質発現ベクターに組
み込み、次いで該形質発言ベクターを適当な宿主に導入
し、該宿主を培養することにより行われる。外来遺伝子
による微生物菌体中での目的とする物質を効率よく生産
するためには、外来遺伝子の形質発現ベクターの構築に
おいて、該外来遺伝子の転写効率を高めること、翻訳効
率を高めること、及び外来該遺伝子のコピー数を多くす
ることが重要な要件である。転写効率を高めるには、通
常、強いプロモーター，例えばlac,trp,tac,λP_L,recA,
phoAプロモーター等が用いられる。翻訳効率にはシャイ
ン・ダルカーノ（SD）配列及びSD配列と翻訳開始コドン
（ATG）間の塩基配列が大きな影響を与える。該領域の
最も翻訳効率の高い塩基配列の決定には、開始コドンの
下流、即ち目的物質のＮ末端部分をコードする塩基配列
を充分考慮しなければならない［European Patent No.1
11814 A2,Proc.Nat.Acad.Sci.USA.81,5403（1984）］。
即ち、産生させようとする物質に応じて、SD配列と翻訳
開始コドンATG間の塩基配列を適切に選択しなければな
らない。また、SD配列についても同様であり、翻訳効率
を高めるために必要な適切な配列は必ずしも一義的に決
まるものではない。従って、目的物質の翻訳効率を高め
るためには、それをコードする遺伝子の構造に応じて、
SD領域近辺及びSD領域から開始コドンATG間の塩基配列
を検討し、適切な塩基配列を選択しなければならない。
また、形質発現ベクターのコピー数は、より多いもの
程、目的物質を効率よく生産するために望ましい。

本発明者らは、有用物質，特に癌壊死因子の高度形質発
現ベクターの作製について上述の観点から鋭意研究を行
い、以下に示すベクターを用いることによって、その形
質換体，例えば、大腸菌中で極めて効率よく癌壊死因子
のような有用物質を産生させることを見出し、本発明を
完成した。

本発明は、更に詳しくは、癌壊死因子或いは該因子のＮ
末端部分と相同性の高いポリペプチドをコードする遺伝
子の上流に、少なくとも、発現制御配列として、他の遺
伝子のプロモーター領域と、シャイン・ダルカーノ配列
（SD配列）から翻訳開始コドン間の配列において、下記
の塩基配列［Ｉ］を有する高度形質発現組み換え体ベク
ターおよび該ベクターにより形質転換された宿主に関す
る。

５′）−AAGGAGGTT−Ｘ−ATTATG−（３′）〔Ｉ〕（式中、ＸはT,T−Ｙ又はＡ−Ｚを表わす。但し、Ｙは
A,AA,AAT、ＺはT,TCGを意味する。）本発明によれば、上記式［Ｉ］で示した塩基配列を有す
るSD配列領域から開始コドンATGまでの塩基配列を他の
遺伝子の適当なプロモーター（例えばtrp,tac,λP_Lプロ
モーターなど）領域の下流に挿入し、そして所望の遺伝
子をコードする塩基配列、更に終止ゴドンと続くDNA
を、大腸菌プラスミドのようなベクター，例えばpBR322
の適当な位置、或いはpBR322の複製開始点近傍のコピー
数制限領域を欠失させたプラスミドの適当な位置に挿入
することにより、本発明の高度形質発現ベクターを作製
することができる。そして、該形質発現ベクターを、常
法に従い、宿主に挿入して形質転換せしめ、形質転換体
を培養することにより目的物質を効率よく生産させるこ
とができる。

このような形質発現ベクターによる目的物質の生産量
は、天然の塩基配列を利用した場合に比べて、極めて高
い。

以下にヒト癌壊死因子生産用形質発現組み換え体プラス
ミド及びその形質転換体である大腸菌を例にとり具体的
に説明する。尚、発現効率に及ぼすSD配列領域及びSD配
列から開始コドンATG間の塩基配列の効果については、
得られた組み換え体プラスミドにより形質転換された大
腸菌（E.coli）を、それぞれ培養し、ヒト癌壊死因子の
発現量により評価した。

ヒト癌壊死因子をコードするDNAの５′未満を、自然界
に存在するトリプトファンオペロンのtrpプロモータ
ー，オペレーター領域に続くtrpL（リーダー）タンパク
をコードする塩基配列のうちSD配列から開始コドンATG
までの塩基配列を利用し、このATGの下流に結合させ
た。更にこれをプラスミドpBR322の制限酵素Pst I及びH
ind IIIで切断して得られる大きなDNA断片に組み込み、
組み換え体プラスミド（pHTP101）を構築した。該組み
換え体プラスミドをE.coliHB101に導入したのち、培養
し、その菌体抽出液中のヒト癌壊死因子の産生量をマウ
スＬ−Ｍ細胞（ATCC,CCL1.2）に対する細胞傷害活性
を、後記試験例に示す方法により測定した。

その結果、該形質転換体（天然の塩基配列を利用したも
の）から得られるヒト癌壊死因子は、培養液1ml当た
り、約400単位であった。

より高い発現効率を得るため、SD配列及びSD配列と開始
コドンATG間の塩基配列を化学合成したオリゴヌクレチ
オドを用いて人工的に変換し、ヒト癌壊死因子の発現量
に及ぼす効果について検討した。得られた組み換え体プ
ラスミドは、上記と同じ条件にてE.coli HB101に導入し
たのち、培養し、その菌体抽出液中のヒト癌壊死因子発
現量を測定した。

また、ベクターとして上記のプラスミドpBR322からコピ
ー数制御領域［ネイチュア;A.J.Twigg,et al.,Nature,2
83,216（1980）］を欠失させたプラスミド（pBRS6と名
づける。）を用いた場合の効果についても検討した。結
果を第１表に示す。

以上の結果に示すごとく、SD配列及び／又はSD配列から
開始コドンATG間の塩基配列を第１表に示したごとく人
工的に変換することにより、ヒト癌壊死因子の発現量が
増大する。特にSD配列から開始コドンATG間の塩基配列
を前記式［Ｉ］においてＸがT,TA,TAA,TAATのごとき塩
基配列で構成させ、かつベクターとしてpBR322のコピー
数制御領域を欠失させたプラスミドpBRS6を用いること
により、ヒト癌壊死因子の発現量は飛躍的に増大する。

このような発現効率の上昇は、SD配列をコンセンサス配
列に置換したこと及びベクターとしてプラスミドのコピ
ー数を多くしたことのみならず、特にSD配列から開始コ
ドンATG間の塩基配列の上記第１表に示したような特定
の塩基配列に置換したことにより、ヒト癌壊死因子のＮ
末端領域部分をコードする遺伝子部分に対応するmRNA部
分とSD配列から開始コドンATG間の塩基配列に対応するm
RNA部分との間で翻訳効率を低下させるような二次構造
又は立体構造が形成しにくくなったことによるものと考
えられる。

以上のことから、発現効率を左右する種々の要因のう
ち、特にSD配列から開始コドンATG間の塩基配列と開始
コドンに続く構造遺伝子の塩基配列との相関関係が非常
に大きな要因であることが判る。言い換えれぼ、本発明
の高度形質発現ベクターの構造はヒト癌壊死因子のみな
らず、該因子のＮ末端部分と相同性の高いポリペプチド
をコードしている遺伝子についても利用できる。また、
該高度形質発現ベクターのヒト癌壊死因子のＮ末端部分
をコードする塩基配列の下流に他の有用物質の構造遺伝
子を連結することにより、ヒト癌壊死因子以外の有用物
質を効率よく生産するためにその利用が可能となる。

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を使
用する。

ＡアデニンＣシトシンＧグアニンＴチミン DNA デオキシリボ核酸 cDNA 相補DNA RNA リボ核酸 mRNA 伝令RNA dATP デオキシアデノシン三リン酸 dCTP デオキシシチジン三リン酸 dGTP デオキシグアノシン三リン酸 dTTP デオキシチミジン三リン酸オリゴ（dC）オリゴデオキシシチジル酸オリゴ（dG）オリゴデオキシグアニル酸オリゴ（dT）オリゴデオキシチミジル酸 poly（Ａ）ポリアデニル酸 bP 塩基対 kbP キロ塩基対以下に実施例，試験例，参考例を挙げて本発明を更に具
体的に説明する。

参考例１天然の塩基配列を利用したヒト癌壊死因子の形質発現プ
ラスミドの作製参考例２で得た組み換え体プラスミドpHTNF13 DNA 5μ
ｇを50mM NaCl,6mM MgCl₂及び6mM 2−メルカプトエタノ
ールを含む10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）45μｌに溶
かし、Ava I及びHind III制限酵素を各々15単位加え、3
7℃で60分間消化した。得られたDNA断片を５％ポリアク
リルアミドゲル電気泳動により分離し、そのゲルより約
600塩基対のDNA断片を電気泳動法により抽出し、抽出液
に終濃度0.3M NaCl及び2.5倍量の冷エタノールを加え、
そのDNA断片を沈殿物として0.4μｇ得た。

Cla I及びAva I制限酵素の粘着末端を両端に有する開始
コドンATGを含む化学合成リンカー（第１図の合成DNA断
片）をBiosearch社製の核酸合成機を用い、リン酸トリ
エステル法により合成した。この合成リンカーと先に得
たDNA断片を結合反応溶液（5mM MgCl₂,5mM ジチオスレ
イトール及び1mM ATPを含む66mM Tris−HCl緩衝液（pH
7.5）40μｌに溶解し、T₄DNAリガーゼ10単位を用い16℃
で16時間反応を行った。反応液を60℃,15分間加熱した
のち、NaCl濃度を50mMに合わせ、Hind III制限酵素水解
を行った。得られたDNA断片を５％ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動により分離し、そのゲルより約600塩基
対のDNA断片を電気泳動法により抽出した。抽出液に終
濃度0.3M NaCl及び2.5倍量の冷エタノールを加え、そ
のDNA断片を沈殿物として得た。このDNA断片をDNA断片
Ｉとする。

トリプトファンオペレーター，プロモーター領域及び
リーダーペプチドをコードする領域を有するプラスミド
pTrpLC−１（第１図参照．尚、このプラスミドはプロシ
ーディングスオブザナショナルアカデミーオ
ブサイエシーズオブザユナイテッドステイツ
オブアメリカ;Proc.Nat.Acad.Sci.,USA,81,5956（1
984）にpCT−１として記載されているプラスミドのアテ
ニュエイター（attenuator）を含むTaq IからCla I領域
を欠失させたものと同一である。）DNA5μｇを100mM Na
Cl,6mM MgCl₂及び6mM2−メルカプトエタノールを含む10
mM Tris−HCL緩衝（pH7.5）50μｌに溶かし、Cla I及び
Pst I制限酵素を各々15単位加え、37℃,60分間消化し
た。得られたDNA断片を５％ポリアクリルアミドゲル
電気泳動により分離し、そのアクリルアミドゲルより
約1.1kbpのDNA断片を電気泳動法により抽出し、抽出液
に終濃度0.3M NaCl及び2.5倍量の冷エタノールを加え、
そのDNA断片を沈殿物として１μｇ得た。

このDNA断片と先のDNA断片Ｉを結合反応溶液に溶かし、
T₄DNAリガーゼ10単位を用い、16℃,16時間反応を行っ
た。反応液を60℃,15分間加熱し、最終50mM NaCl濃度に
なるように緩衝液を加え、Hind III及びPst I制限酵素
水解を行った。得られたDNA断片を５％ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により分離し、そのポリアクリルア
ミドゲルより1.7kbpのDNA断片を電気泳動法により抽
出した。抽出液に終濃度0.3M NaCl及び2.5倍量の冷エタ
ノールを加え、そのDNA断片を沈殿物として得た。このD
NA断片をDNA断片IIとする。

pBR322 DNA4.8μｇを50mM NaCl及び6mM MgCl₂を含む10m
M Tris−HCl緩衝液（pH7.5）45μｌに溶解し、pst I及
びHind III制限酵素を各々15単位加え、37℃,60分間消
化した。得られたDNA断片を0.7％アガロースゲル電気
泳動により分離し、そのアガロースゲルより3.6kbpの
DNA断片を電気泳動法により抽出した。抽出液に終濃度
0.3M NaCl及び2.6倍量の冷エタノールを加え、その断片
を沈殿物として2.5μｇ得た。

このDNA断片とDNA断片IIを結合反応溶液40μｌに溶解
し、T₄DNAリガーゼ10単位を用いて結合させ、ヒト癌壊
死因子形質発現プラスミド（pHTP101）を構築した（第
１図参照）。

この形質発現プラスミドをコーエン（Cohen）らの方法
（プロシーディングスオブザナショナルアカデ
ミーオブサイエンシーズオブザユナイテッド
ステイツオブアメリカ;proc.Nat.Acad.Sci.,USA,
69,2110（1972））によりE.coli HB101に導入し、形質
転換体を得た。形質転換株の選択は、アンピシリン25μ
g/mlを含むLB寒天培地（組成：精製水１中、バクトト
リプトン10g,バクトイーストエキストラクト5g,食塩10
g,agar15g）で行い、アンピシリン耐性の形質転換株を
分利し、試験例に記した方法により培養し、次いで細胞
傷害活性の測定を行い、ヒト癌壊死因子を生産する形質
転換株を選択した。このような形質転換株の一つより目
的とする組み換え体プラスミドpHTP101をウイルキィー
（Wilkie）らの方法（ニュクレイックアシッドリサ
ーチ;Nucleic Acid Res.,７,859（1979））により抽出
した。

ジデオキシ法（サンガー（Sauger）らの方法（サイエン
ス;Science,219,1205（1981），メッシング（Messing）
の方法（メソッドインエンチモロジー;Methods in
Enzymology,101,20（1983））による塩基配列の決定に
よりこのプラスミドは、トリプトファンリーダーペプチ
ドのプロモーター,SD領域の下流に…ATCGATTを介し、開
始コドンATGに直接ヒト癌壊死因子構造遺伝子を連結し
たものであることが確認された。

実施例１ SD領域と開始コドンATG間の塩基配列の変換によるヒト
癌壊死因子形質発現プラスミドの改良参考例１で得たプラスミドpHTP101 DNA4μｇを80mM NaC
l,6mM MgCl₂及び6mM2−メルカプチトエタノールを含む1
0mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）40μｌに溶かし、15単位
のCla I及び1.5単位のAva I制限酵素を加え、37℃,60分
間消化し、0.7％アガロースゲル電気泳動により分離
し、そのゲルより電気泳動法により目的とするDNA断片
を抽出し、終濃度0.3M NaClとし、2.5倍量の冷エタノ
ールを加え、沈殿物として得た。

このDNA断片とリン酸トリエステル法により化学合成し
た開始コドンATGを含み、かつその下流からヒト癌壊死
因子構造遺伝子のAva I制限酵素切断認識部位までに相
当する23塩基対のDNA断片（第２図の合成DNA断片）を含
む結合反応溶液に溶かし、T₄DNAリガーゼ10単位を用
い、16℃,16時間反応を行った（第２図参照）。この反
応液をE.coli HB101に導入し、形質転換体を得た。形質
転換株の選択はアンピシリン25μg/mlを含むLB寒天培地
で行い、アンピシリン耐性の形質転換株を分離した。参
考例１で記載した方法により、ヒト癌壊死因子を生産す
る形質転換株を選択した。目的とする組み換え体プラス
ミドpHTP102を抽出し、ジデオキシ法による塩基配列の
決定により、このプラスミドpHTP102は、ヒト癌壊死因
子構造遺伝子の開始コドンATGの上流が５′…ATCGTCC−
３′の塩基配列になっているものであり、先のプラスミ
ドpHTP101と開始コドンATGの上流３塩基対のみが異なる
ものであることを確認した。

実施例２（１）高コピー数変異体プラスミドベクターの作製pBR3
22 DNA2.3μｇを50mM NaCl,6mM MgCl₂及び6mM2−メルカ
プトエタノールを含む10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）3
0μｌに溶かし、Ava I及びPvu II制限酵素10単位を加
え、37℃,60分間消化した。得られたDNA断片を0.7％ア
ガロースゲル電気泳動により分離した。そのゲルによ
り約3.7kbpのDNA断片を電気泳動法により抽出し、抽出
液に終濃度を0.3M NaCl及び2.5倍量の冷エタノールを加
え、そのDNA断片を沈殿物として1.2μｇを得た。

この沈殿物をT₄ DNAポリメラーゼ反応緩衝液（50mM Thi
s−HCl緩衝液（pH7.5）,10mM MgSO₄,0.1mM ジチオスレ
イトール,50μg/ml bovine serum albumin）30μｍに溶
かし、dATP,dGTP,dTTP,dCTP各々2nmole及び１単位のDNA
ポリメラーゼI Klenowフラグメントと混合し、22℃,30
分間インキュベートし、DNA断片の両末端を平滑末端と
した。次いで冷エタノールを加えて、目的とするDNA断
片を沈殿物として得た。この沈殿物を結合反応溶液に溶
解し、T₄DNAリガーゼを用い、16℃,16時間反応を行っ
た。反応液に2.5倍量の冷エタノールを加え、DNAを沈殿
として得た。このプラスミドベクターをpBRS6と呼ぶ
（第３図）。

pBRS6はpBR322に比し、細胞当たりのコピー数は２〜５
倍である。

（２）高コピー数を有するヒト癌壊死因子形質発現プラ
スミドの作製実施例１で得たプラスミドpHTP102 DNA2.5μｇを100mM
NaCl,6mM MgCl₂及び6mM2−メルカプチトエタノールを含
む10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）30μｌに溶かし、Sca
I及びHind III制限酵素を各々10単位加え、37℃60分間
消化した。水飽和フェノール30μｌを加え、除タンパク
を行ったのち、終濃度0.3M NaCl及び２倍量の冷エタノ
ールを加え、DNAを沈殿させた。この沈殿物をT₄DNAポリ
メラーゼ反応緩衝液30μｌに溶かし、dATP,dGTP,dTTP,d
CTP各々2nmole及びDNAポリメラーゼＩ Klenowフラグメ
ント１単位を加え、22℃,30分間インキュベートするこ
とにより、Hind III切断部位を充填し、両末端を平衡末
端とした。このDNA断片を５％ポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動により分離し、約1.7kbpのDNA断片をゲルか
ら溶出させ、これを冷エタノールで沈殿し、回収した。

他方、（１）項で作製したプラスミドベクターpBRS6を1
00mM NaCl,6mM MgCl₂及び6mM2−メリカプトエタノール
を含む10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）に溶解し、Sca I
及びEcoR I制限酵素により消化し、DNAポリメラーゼＩ
Klenowフラグメントを用いてEcoR I切断部位を充填し
た。このDNA断片を５％ポリアクリルアミドゲル電気泳
動により分離し、約3.8kbpのDNA断片をゲルから電気泳
動法により溶出させ、冷エタノール加え沈殿物として得
た。

このDNA断片先に得た1.7kbpのDNA断片を結合反応溶液40
μｌに溶解し、T₄DNAリガーゼ10単位を用い、16℃で16
時間反応を行った。この反応液を用いてE.coli HB101を
形質転換した。参考例１に記した方法によりアンピシリ
ン25μg/mlを含むLB寒天培地で培養し、アンピシリン耐
性形質転換株を選択分離し、ヒト癌壊死因子を生産する
形質転換株を選択した。このような形質転換株の一つよ
り目的とするプラスミドpHTP302を抽出した（第３
図）。

ジデオキシ法による塩基配列の決定により、このプラス
ミドは、トリプトファンプロモーター,SD領域の下流に
直接ヒト癌壊死因子の構造遺伝子を連結した高コピー数
変異体であることが確認された。

実施例３ SD領域及びSD領域と開始コドンATG間の塩基配列の同時
変換によるヒト癌壊死因子形質発現プラスミドの改良トリプトファンプロモーター，オペレーター領域にあ
るHpa I制限酵素確認部位から下流のSD領域及びヒト癌
壊死因子の構造遺伝子の開始コドンAGTを含み、かつ構
造遺伝子のAva I制限酵素認識部位までの領域に相当す
る55塩基対の部分を種々変換したDNA断片をリン酸トリ
エステル法により化学合成した。これらのDNA断片の塩
基配列は、第４図に示した通りである。これらの合成DN
A断片は、トリプトファンオペロンのリーダーペプチド
のプロモーター，オペレーターのSD領域をコンセンサス
塩基配列に変換したものであり、かつSD領域と開始コド
ンATG間の距離及びその塩基配列を形質発現効率を高め
るべく種々変換したものである。

実施例２で得たプラスミドpHTP302を100mM NaCl,6mM Mg
Cl₂,及び２−メルカプトエタノールを含む10mM Tris−H
Cl緩衝液（pH7.5）に溶かし、Ava I及びHpa I制限酵素
で消化し、0.7％アガロースゲル電気泳動により分離
し、そのゲルより電気泳動法により目的とするDNA断片
を抽出し、2.5倍量の冷エタノールを加え、沈殿物とし
て得た。

このDNA断片と第４図に示した化学合成DNA断片の各々と
結合反応溶液に溶かし、T₄DNAリガーゼ10単位を用い、1
6℃、16時間反応を行った。各々の反応液を用いて、そ
れぞれE.coli HB101を形質転換した。形質転換株の選択
は、参考例１に記した方法により、アンピシリン25μg/
mlを含むLB寒天培地で培養し、アンピシリン耐性の形質
転換株を分離した。ヒト癌壊死因子を生産する形質転換
株を選択した。各々、形質転換株の一つより目的とする
組み換え体プラスミドDNAを抽出した。

即ち、DNA断片01を挿入したプラスミドpHTP301,DNA断片
10を挿入したプラスミドpHTP310,DNA断片12を挿入した
プラスミドpHTP312,DNA断片14を挿入したプラスミドpHT
P314,DNA断片16を挿入したプラスミドpHTP316,DNA断片1
7を挿入したプラスミドpHTP317およびDNA断片18を挿入
したプラスミドpHTP318を各々得た（第５図参照）。こ
れらの挿入したDNA及び近傍の塩基配列は、ジデオキシ
法によりその構造確認を行った。

試験例細胞損害活性測定によるヒト癌壊死因子の定量マウスＬ−Ｍ細胞を用いる細胞損害活性の測定法は、次
の通りである。

検体を培地で連続的に２倍希釈した検液0.1mlとＬ−Ｍ
細胞（ATCC,CCL1.2）の懸濁液（１×10⁵個/ml）0.1mlを
96穴の組織培養用マイクロプレート（Flow Labs.）に加
える。培地には１％のウシ胎児血清を含むイーグルのME
N培地を用いる。マイクロプレートを５％の炭酸ガスを
含む空気中、37℃で48時間培養する。培養終了後、グル
タルアルデヒド20μｌを加え、生き残った細胞を固定す
る。固定後、マイクロプレートを洗浄，乾燥して、0.05
％メチレンブルー溶液を0.1ml加え、固定された細胞を
染色する。余分なメチレンブルーを洗い流し、乾燥した
後、固定された細胞に付着したメチレンブルーを0.36N
塩酸で抽出し、その665nmにおける吸光度をタイターテ
ック・マルチスキャン（Flow Lads.）で測定する。この
吸光度を生き残った細胞数に比例する。Ｌ−Ｍ細胞の50
％を殺すために必要な活性濃度を１単位/mlと定義し
た。

ヒト癌壊死因子をコードする形質発現プラスミドにより
形質転換したE.coli HB101をアンピシリン25μg/mlを含
むLBブロース（１中の組成：バクトトリプトン10g,バ
クトイーストエキストラクト5g,食塩10g）5mlに接種
し、37℃で一晩培養後、各々培養液0.1mlを、それぞれ2
5μg/mlのアンピシリン,20μg/mlのインドリルアクリル
酸及び１μg/mlのビタミンB₁を含む改良Ｍ−９培地（１
中の組成:Na₂HPO₄ 6g,KH₂PO₄ 3g,NaCl 0.5g,NH₄Cl 1
g,1M MgSO₄ 2ml,20％グリコース10ml,1M CaCl₂ 0.1ml,
カザミノ酸5g）10mlに加え、37℃で更に24時間培養を継
続したのち、遠心分離により菌体を集めた。菌体を1ml
の0.1％リゾチーム及び30mM NaClを含む50mM Tris−HCl
（pH8.0）緩衝液に再懸濁し、０℃で30分間静置したの
ち、ドライアイス／エタノール浴での凍結と37℃での融
解を６回繰り返した。次いで、遠心分離により菌体残渣
を除き、清澄な上清液を得た。その上清画分を細胞障害
活性の測定検体とした。

参考例２（１）ヒト癌壊死因子をコードするクローン化DNAを検
出するためのプローブの調製参考例３で得たウサギ癌壊死因子をコードするクローン
化DNAを制限酵素Hae II及びAva Iを用いて切り出し、そ
れぞれ第33〜120番の88bpから成るDNA断片と第285〜585
番の299bpから成るDNA断片を得た。制限酵素Ava Iで切
り出した299bpのDNA断片はウサギ癌壊死因子をコードす
る領域であり、Hae IIで切り出した88bpのDNA断片はウ
サギ癌壊死因子前駆体をコードする領域に相当する部分
である。

この２種のDNA断片を³²Pで標識して、ヒト癌壊死因子cD
NAをクローニングのためのプローブとし、（８）項で使
用した。

（２）ヒト肺胞マクロファージからのmRNA画分の単離ヒト肺からリン酸緩衝化生理食塩液を用いて肺胞マクロ
ファージを6.3×10⁷個採取した。この肺胞マクロファー
ジを10％牛胎児血清含有のRPMI−1640培地に懸濁させて
ペトリディッシュ（直径8cm）に１枚当たり９×10⁶個と
なるように播き、37℃で５％炭酸ガス含有空気中、湿度
90〜100％で前培養した。１時間の前培養の後、エンド
トキシン（大腸菌由来のリポポリサッカライド）,TPA
（ホルボール−12−ミリステート−13−アセテート）及
びシクロヘキシミドをそれぞれ最終濃度が10μg/ml,10n
g/ml及び１μg/mlとなるように添加混和し、更に培養を
継続した。４〜4.5時間後（通算５〜5.5時間）に培養液
を吸引除去し、ディッシュ上に残ったマクロファージを
0.6％ラウロルサルコシン酸ナトリウムと6mMクエン酸ナ
トリウムを含む5Mグアニジルチオシアネート液で溶解
し、ホモジナイズした。このホモジネートを0.1M EDTA
含有5.7M塩化セシウム水溶液上に重層し、超遠心分離機
（RPS27−２ロータ−，日立製作所）を用い26,500rpmで
20時間遠心し、全RNA画分をペレットとして得た。これ
を0.35M NaCl,20mM Tris及び20mM EDTAを含む7M尿素液
の少量に溶解し、エタノール沈殿として回収した。全RN
Aとして159μｇが得られた。

この全RNA画分を1mM EDTAを含む10mM Tris−HCl緩衝液
（pH7.4）（以下TE液という）1mlに溶解し、65℃で５分
間加熱した。これにNaCl溶解を0.5Mとなるように加えた
後、あらかじめ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに付し、吸着したpoly（Ａ）
mRNAをTE液で溶出することにより、８μｇのpoly（Ａ）
mRNAを得た。このpoly（Ａ）mRNAを1.9ng/nlの濃度で蒸
留水を溶解し、これをアフリカツメガエルの卵母細胞１
個当たり50nlずつ注入し、前述の方法に従って、卵母細
胞中で翻訳された蛋白質のＬ−929細胞障害活性を測定
した。その結果、10個の卵母細胞のホモジネート0.1ml
中に6.6単位/mlの活性を認め、このpoly（Ａ）mRNA調製
品中にヒト癌壊死因子のmRNAが含まれていることを確認
した。

（３）cDNAの合成（２）項で得られたpoly（Ａ）mRNAを鋳型としてGubler
らの方法［Gene,25,263（1983）］に従ってcDNAを合成
した。

反応液量;40μｌ 50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.3）;10mM MgCl₂;10mMジチ
オスレイトール;4mMピロホスフェートナトリウム;1.2
5mM dGTP,dATP,dTTP;0.5mM dCTP;0.167μM α−³²P−dC
TP（比活性3000Ci/mmole）;4μｇオリゴ（dT）_12〜18;6
μg poly（Ａ）mRNA;120単位トリ骨髄性白血病ウイルス
由来逆転写酵素。

43℃で30分間反応させた後、EDTAを加えて反応を停止さ
せ、フェノール−クロロホルム混液（1:1）で抽出し、
その水層に酢酸アンモニウムを最終濃度2.5Mになるよう
に加え、エタノールにより反応生成物（単鎖cDNA−RNA
複合体）を沈殿させた。この単鎖cDNA−RNA複合体を下
記組成の反応緩衝液100μｌに溶解した。

反応緩衝液組成： 20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.5）;5mM MgCl₂;10mM（N
H₄）₂SO₄;100mM KCl;0.15mM β−ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド;50μg/mlウシ血清アルブミン;40
μM dGTP,dATP,dTTP,dCTP;0.9単位大腸菌リボヌクレア
ーゼH;23単位大腸菌DNAポリメラーゼＩ。

12℃で60分間、続いて22℃で60分間反応させた後、EDTA
を加えて反応を停止させ、上記と同様にフェノール−ク
ロロホリム混液で抽出し、エタノールにより沈殿させて
二重鎖cDNAを得た。

（４）オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製（３）項で得られた二重鎖cDNAに次の組成の反応緩衝液
100μｌを加え、37℃で30分間反応させ、二重鎖cDNAに
オリゴ（dC）テールを付加させた。

反応緩衝液； 2mM CoCl₂,0.2mMジチオシレイトール,0.1mM α−³²P−d
CTP（比活性3Ci/mmole）及び10単位ターミナルデオキシ
ヌクレオチジルトランスフェラーゼを含有する100mMカ
コジル酸ナトリウム（pH7.2）。

反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−ク
ロロホルム混液で抽出し、オリゴ（dC）テール付加cDNA
をエタノールにより沈殿させ回収した。これを10mM Tri
s−HCl緩衝液（pH7.4）,1mM EDTA及び100mM NaClを含む
水溶液に1ml当たり２μｇのオリゴ（dC）テール付加cDN
Aを含むように溶解した。

（５）オリゴ（dG）テール付加プラスミドpDR322 DNAの
調製 20mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）,10mM MgCl₂,50mM （NH
₄）₂SO₄及び1ml当たり0.1mgのウシ血清アルブミンを含
む水溶液100μｌにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素pst
Iエンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１時間反応
させた。反応終了後、反応液をフェノール−クロロホル
ム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によってDNA
を回収した。得られたDNAを前述のオリゴ（dC）テール
付加に用いた水溶液（但し³²P−dCTPの代わりに³H−dGT
Pを含む）200μｌに溶解し、ターミナルデオキシヌクレ
オチジルトランスフェラーゼ80単位を用いて37℃で20分
間反応させ、約10〜15個のdG残基を取り込ませた。反応
液をフェノール−クロロホルム混液で抽出し、水層から
エタノール沈殿によってオリゴ（dG）テール付加プラス
ミドpBR322DNAを回収した。これをオリゴ（dC）テール
付加cDNAの場合と同様の緩衝液に1ml当たり20μｇのオ
リゴ（dC）テール付加プラスミドpBR322DNAを含むよう
に溶解した。

（６）組み換え体プラスミドの作製（４）項で得られたオリゴ（dC）テール付加cDNA溶液12
0μｌを、（５）項で得られたオリゴ（dC）テール付加p
BR322 DNA溶液120μｌと混合し、65℃で５分間、57℃で
120分間インキュベートしてアニーリングを行い、組み
換え体プラスミド溶液を調製した。

（７）形質転換体の選択（６）項で得られた組み換え体プラスミド溶液を用いE.
colix 1776株を形質転換させた。即ち、E.colix 1776株
を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミジン40μg/m
lを補ったＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度（600nm）が
0.5となるまで培養し、菌体を４℃で遠心して集め、50m
M CaCl₂含有10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.3）10mlに分散
し、４℃で再度遠心して沈殿させた。集めた菌体を同じ
緩衝2mlに分散し、０℃で５分間静置した。この分散液
0.2mlに（６）項で得られた組み換え体プラスミド溶液
0.1mlを添加混合し、０℃で15分間静置し、更に42℃で
２分間保持した後、前の培養で用いたのと同一組成のＬ
−ブロス0.5mlを加えて１時間振盪培養を行った。この
培養液の一部を取り、前述の成分の他にテトラサイクリ
ン15μg/mlを含むＬ−ブロス寒天平板に広げ、37℃で約
12時間培養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してcDNA
ライブラリーを作製した。

（８）クローニング（７）項で得られたcDNAライブラリーについて、ヒト癌
壊死因子をコードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質
転換体をスクリーニングするため、（１）項で得られた
ウサギ癌壊死因子をコードするDNAの制限酵素Ava Iで切
り出した断片（299bp）の³²P標識物をプローブとし、コ
ロニー・ハイブリダイゼーション試験をハナハン（Hana
han）らの方法［ジーン;Gene,10,63（1980）］に従って
行った。約２万個のコロニーから、この標識プローブと
強く結合する塩基配列を含む組換え体プラスミドを持つ
形質転換体43個を選び出した。

更に、この43個のコロニーについて、制限酵素Hae IIで
切り出したウサギ癌壊死因子コード領域の上流に相当す
るDNA断片（88bp）の³²P標識物をプローブとし、二次ス
クリーニングを行い、このプローブと強くハイブリダイ
ズする６個のコロニーを選び出した。この２回のスクリ
ーニングにより、ウサギ癌壊死因子をコードするDNA塩
基配列及びその上流部分と相同性の高い塩基配列を含む
DNAを得た。

（９）クローン化DNAの塩基配列の決定ここで選ばれた６個のクローン（プラスミド番号pHTNF
−1,−4,−5,−13,−22,−26）のうちから、プラスミド
pHTNF−13による形質転換体をLBブロスで培養して菌体
を得た。この菌体をWilkieらの方法［Nucleic Acids Re
s.,７,859（1979）］に従って処理し、プラスミドDNAを
得た。このプラスミドDNAを制限酵素pst Iで分解し、分
離精製してクローン化DNAを得た。このクローン化DNA断
片を種々の制限酵素で分離し、16種の制限酵素断片につ
いて、それぞれの塩基配列をMaxam−Gilbert法により脱
リン酸化,³²Pによる末端標識，塩基特異的化学分解反
応，ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーを行い決
定した。ヒト癌壊死因子前駆体をコードする塩基配列を
第２表に示した。

〔〕で囲んだ部分はヒト癌壊死因子をコードする領域
である。〔特願昭59−43617（特開昭60−185799）参
照〕参考例３（１）ウサギ肺胞マクロファージからのmRNA分画の単離
精製ウサギ（体重約2.5kg）にPropionibacteriumacnes死菌
体を１羽当り100mgの投与量で静脈内に注入し、８日後
に屑殺した。直ちに開胸気管切開し、気管内に注入した
チューブを介してリン酸緩衝化生理食塩液を用い肺洗浄
を繰返し、肺胞マクロファージを採取した。12羽のウサ
ギより約３×10⁹個の肺胞マクロファージが得られた。
この肺胞マクロファージを10％牛胎児血清含有のRPMI−
1640培地に懸濁させてペトリディッシュ（直径8cm）に
１枚当り２×10⁷個となるように播き、37℃で５％炭酸
ガス含有空気中、湿度90〜100％で前培養した。１時間
の前培養の後、エンドトキシン（大腸菌由来のリポポリ
サッカライド）,TPA（ホルボール−12−ミリステート−
13−アセテート）及びシンクロヘキシミドをそれぞれ最
終濃度が10μg/ml,10ng/ml及び１μg/mlとなるように添
加混和し、更に培養を継続した。４〜4.5時間後（通算
５〜5.5時間）に培養液を吸引除去し、ディッシュ上に
残ったマクロファージを0.6％ラウロイルサルコシン酸
ナトリウムと6mMクエン酸ナトリウムを含有する5Mグア
ニジルチオシアネート液で溶解しホモジナイズした。こ
のホモジネートを0.1M EDAT含有5.7M塩化セシウム水溶
液上に重層し、超遠心分離機（RPS27−２ローター，日
立製作所）を用い26,550rpmで20時間遠心し全RNA画分を
ペレットとして得た。これを0.35M NaCl,20mM Tris及び
20mM EDTAを含む7M尿素液の少量に溶解し、エタノール
沈殿として回収した。12羽のウサギより全RNAとして5.2
mgが得られた。

この全RNA画分を1mM EDNAを含む10mM Tris−HCl緩衝液
（pH7.4）（以下TE液という）2mlに溶解し、65℃で５分
間加熱した。これにNaCl溶液を0.5Mとなるように加えた
後、あらかじむ0.5M NaClを含むTE液で平衡化したオリ
ゴ（dT）セルロースカラムに付し、吸着したpoly（Ａ）
mRNAをTE液で溶出することにより、314μｇのpoly
（Ａ）mRNAを得た。ここで得たpoly（Ａ）mRNAの200μ
ｇをアガロースゲル電気泳動（ゲル濃度１％,6M尿素存
在下,pH4）に付し、その分子サイズに従って７つの画分
に分け、ゲルを溶解（70℃,10分間）させた後、水飽和
フェノールによる抽出とクロロホルムによる抽出のの
ち、エタノールにより沈殿させて各画分よりpoly（Ａ）
mRNAを回収した。各画分のpoly（Ａ）mRNAについてアフ
リカツメガエルの卵母細胞を用いる方法でウサギ癌壊死
因子mRNA量を測定し、分子サイズとして1.6〜2.7kbに相
当する画分にウサギ癌壊死因子mRNAを高濃度に回収し
た。

ここで得られ精製poly（Ａ）mRNAを以下の実験に用い
た。

（２）cDNAの合成精製poly（Ａ）mRNA 4μｇを用い以下に示す条件でcDNA
を合成した。

反応液量;100μｌ 50mM Tris−HCl緩衝液（pH8.3）;10mM MgCl₂;70mM KCl;
1mMジチオスレイトール;0.5mM dTTP,dCTP,dAT,dGTP（但
しdCTPは³²Pで標識，比活性4.4×10cpm/nmole）;3μｇ
オリゴ（dT）_12〜18,80単位トリ骨髄性白血病ウイルス
由来逆転写酵素。

43℃で90分間反応させた後、EDTA水溶液で反応を停止さ
せた。フェノール−クロロホルム混液（1:1）によりcDN
A−mRNA複合体を抽出し、エタノールにより沈殿させ回
収した。更に、アルカリ加温処理することによりmRNAを
分解除去した後、合成された単鎖cDNAをエタノールによ
り沈殿させ回収した。

この単鎖cDNAの沈殿を下記組成の反応緩衝液40μｌに溶
解した。

反応緩衝液； 0.5mM dATP,dTTP,dGTP,dCTP;5mM MgCl₂;70mM KCl;1.5mM
β−メルカプトエタノール;8単位大腸菌DNAポリメラー
ゼＩ（ラージフラグメント）を含有する0.1M Hepes緩衝
液（pH6.9）。

15℃で20時間反応させ二重鎖cDNAを合成した。反応液に
ドデシル硫酸ナトリウム水溶液を加えて反応を停止さ
せ、二重鎖cDNAをフェノール−クロロホルム混液で抽出
し、エタノールにより沈殿させ回収した。

得られた二重鎖cDNAの沈殿を、50mM酢酸ナトリウム（pH
4.5）,1mM ZnSO₄,200mM NaCl,0.5％グリセロース及びS1
ヌクレアーゼ0.5単位を含有する水溶液100μｌに溶解
し、37℃で20分間反応させてヘアピン構造を開裂させ
た。反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール
−クロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出し
た後、エタノールにより沈殿させcDNAを回収した。

（３）オリゴ（dC）テール付加cDNAの調製上記により得られた二重鎖cDNAに次の組成の反応緩衝液
100μｌを加え37℃で20分間反応させ、二重鎖cDNAオリ
ゴ（dC）テールを付加させた。

反応緩衝液； 1mM CoCl₂,0.1mMジチオスレイトール,0.2μｇポリ
（Ａ）,0.1mM ³H−dCTP（比活性5400cpm/pmol）及び10
単位ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラー
ゼを含有する130mMカコジル酸ナトリウム−30mM Tris−
HCl緩衝液（pH6.8）。

反応はEDTA水溶液を添加して停止させ、フェノール−ク
ロロホルム混液で抽出し、更にエーテルで再抽出した
後、オリゴ（dC）テール付加cDNAをエタノールにより沈
殿させ回収した。これを10mM Trisb−HCl緩衝液（pH7.
4）,1mM EDTA及び100mM NaClを含む水溶液に1ml当り0.2
μｇのオリゴ（dC）テール付加cDNAを含むように溶解し
た。

（４）オリゴ（dC）テール付加プラスミドpBR322 DNAの調製 200mM Tris−HCl緩衝液（pH7.4）,10mM MgCl₂,50mM（NH
₄）₂SO₄及び1ml当り0.1mgのウシ血清アルブミンを含む
水溶液100μｌにpBR322を10μｇ溶解し、制限酵素pst I
エンドヌクレアーゼ15単位を加え、37℃で１時間反応さ
せた。反応終了後、反応液をフェノール抽出し、水層か
らエタノール沈殿によってDNAを回収した。得られたDNA
を前述のオリゴ（dC）テール付加に用いた水溶液（但し
³H−dCTPの代りに³H−dGTPを含む）200μｌに溶解し、
ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ
80単位を用いて37℃で20分間反応させ、約10〜15個のdG
残基を取り込ませた。反応液を水飽和フェノール−クロ
ロホルム混液で抽出し、水層からエタノール沈殿によっ
てオリゴ（dG）テール付加プラスミドpBR322DNAを回収
した。これをオリゴ（dG）テール付加cDNAの場合と同様
の緩衝液に1ml当り２μｇのオリゴ（dG）テール付加プ
ラスミドpBR322DNAを含むように溶解した。

（５）組み換え体プラスミドの作製オリゴ（dG）テール付加cDNA溶液50μｌをオリゴ（dG）
テール付加pBR322DNA溶液50μｌと混和し、65℃で10分
間、57℃で120分間、45℃で60分間、35℃で60分間及び
室温で60分間インキュベートしてアニーリングを行い、
組み換え体プラスミド溶液を調製した。

（６）形質転換体の選択上記で得られた組み換え体プラスミド溶液を用い、E.co
lix 1776株を形質転換させた。即ち、E.colix 1776株
を、ジアミノピメリン酸100μg/ml及びチミジン40μg/m
lを補ったＬ−ブロス20ml中、37℃で吸光度（600nm）が
0.5となるまで培養し、菌体を冷却器付遠心分離機で集
め、50mM CaCl₂含有10mM Tris−HCl緩衝液（pH7.3）10m
lに分散し、０℃で再度遠心して沈殿させた。集めた菌
体を同じ緩衝液2mlに分散し、０℃で５分間静置した。
この分散液0.2mlに上記組み換え体プラスミド溶液0.1ml
を添加混合し、０℃で15分間静置し、更に42℃で２分間
保持した後、前の培養で用いたのと同一組成のＬ−ブロ
ス0.5mlを加えて１時間振盪培養を行った。この培養液
の一部を取り、前述の成分の他にテトラサイクリン15μ
g/mlを含むＬ−ブロス寒天平板に広げ37℃で約12時間培
養し、テトラサイクリン耐性菌を選択してcDNAライブラ
リーを作製した。

（７）ハイブリダイゼージョン試験前記のcDNAライブラリーについて、ウサギ癌壊死因子を
コードするcDNAを含むプラスミドを持つ形質転換体をス
クリーニングするため³²P標識cDNAプローブを用いるコ
ロニー・ハイブリダイゼーション試験をHanahanらの方
法［Gene,10,63（1980）］に従って行った。³²P標識cDN
Aプローブは、誘導プラスミド及びマイナス肺胞マクロ
ファージより上記（１）項の方法で得たmRNAを鋳型とし
て、（２）項の方法で合成した。但し、³²P−dCTPは高
放射能比活性のものを用い、高濃度に標識した。この試
験により誘導プラスのプローブ強く結合し、誘導マイナ
スのプローブとはハイブリダイズしない塩基配列を含む
組み換え体プラスミドを有する形質転換体を選別した。
約２万個のコロニーから50個のコロニーが選び出され
た。

次いで、これらの選択された菌株についてハイブリダイ
ゼーション・トランスレーション試験をマニアティスら
編モルキュラークローニング;Maniatis,T.,et al.,
（ed）“Molecular Cloning",329（1980）,Cold Spring
Harbor Lab.,に記載の方法に従って行った。それぞれ
の形質転換体よりプラスミドDNAを抽出し、ニトロセル
ロースフィルター上に加熱変性させたのち固定し、これ
に上記（１）項で得たウサギ癌壊死因子mRNAを含むpoly
（Ａ）mRNA画分を加え、50℃で３時間反応させ、ハイブ
リダイゼーションを行った。結合したmRNAを溶出回収し
た後アフリカツメガエルの卵母細胞に注入し、回収され
たmRNAがウサギ癌壊死因子mRNAであるか否かを検定し
た。この試験により、上記で選択された20個の形質転換
体よりウサギ癌壊死因子mRNAと強くハイブリダイズする
cDNAを含むプラスミドを持つ菌株３個を見いだした。そ
のうち最も長いcDNA（約750bp）を有するプラスミドよ
り、制限酵素Dde IでDNA断片を切り出し、二次スクリー
ニング用のプローブとした。このDNA断片を³²Pで標識
し、上記（６）項で得たcDNAライブラリーについて再度
コロニー・ハイブリダイゼーション試験を行い、標識プ
ローブを強く結合するcDNAを含むプラスミドを持つ形質
転換体を選んだ。cDNAライブラリーを約６万個のコロニ
ーのうち98個が陽性コロニーであった。これらからcDNA
を制限酵素pst Iで切り出し、そのサイズをポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動で調べ、1kbp以上のサイズを有す
る17個のクローンを選び出した。これらのうち最も大き
なcDNAを含む形質転換体（菌体番号:RTNF802,クローン
化DNA番号:pRTNF802）について、クローン化DNAを単離
し、塩基配列を決定した。

（８）クローン化DNAの塩基配列の決定（７）項で選択された菌株（RTNF802）をジアミノピメ
リン酸及びチミジンを添加したＬ−ブロスで培養して菌
体を得た。この菌体をWilkieらの方法［Nucleic Acids
Res.,７,859（1979）］に従って処理し、プラスミドDNA
を得た。このプラスミドDNAを制限酵素pst Iで分解し、
精製分離してクローン化DNAを得た。このクローン化DNA
断片を種々の制限酵素で分離し、適当な制限酵素断片に
ついてそれぞれの塩基配列をMaxam−Gilbert法により脱
リン酸化,³²Pによる末端標識，塩基特異的化学分解反
応，ゲル電気泳動及びオートラジオグラフィーから決定
した。

その塩基配列を第３表に示した。第１〜15番はcDNAをベ
クターに組み込むために付加したＧ連鎖テールである。
第16〜276番はウサギ癌壊死因子を前駆体を構成するに
必要なポリペプチドをコードすると推定される塩基配列
である。第277〜291番の塩基はウサギ癌壊死因子のＮ末
端に相当するアミノ酸配列をコードし、第715〜738番目
の塩基はＣ末端部分のアミノ酸配列をコードしている。
〔特願昭58−228790（特開昭60−120990）参照〕

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト癌壊死因子をコードする遺伝子のアミノ末
端部をトリプトファンプロモーターに開始コドンATGを
介して連結した形質発現プラスミドの製造方法の１例を
示す説明図である。第２図は、トリプトファンプロモーターを用いSD領域と
開始コドンATGの連結領域にあるCla I制限酵素切断部位
を利用して、その連結領域を変換する方法の１例を示す
説明図である。第３図は、pBR322由来の高コピー数を有するプラスミド
ベクターの製造方法の１例及びヒト癌壊死因子をコー
ドする遺伝子を高コピー数を有するプラスミドベクタ
ーに組み込む方法の１例を示す説明図である。第４図は、本発明のヒト癌壊死因子の高レベルの発現を
可能にする新規なSD領域及びそのSD領域と開始コドンAT
G間の連結領域の塩基配列を含むHpa I制限酵素部位から
Ava I制限酵素部位までの化学合成DNA断片の塩基配列を
示す説明図である。第５図は、第４図に示した化学合成DNA断片を置換した
ヒト癌壊死因子の高レベル形質発現プラスミドの製造方
法の例を示す説明図である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】癌壊死因子或いは該因子のＮ末端部分と相
同性の高いポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、
少なくとも、発現制御配列として、他の遺伝子のプロモ
ーター領域と、シャイン・ダルカーノ配列から翻訳開始
コドン間の配列において、下記の塩基配列を有する高度
形質発現組み換え体ベクター。（５′）−AAGGAGGTT−Ｘ−ATTATG−（３′）〔Ｉ〕（式中、ＸはT,T−Ｙ又はＡ−Ｚを表わす。但し、Ｙは
A,AA,AAT、ＺはT,TCGを意味する。）
【請求項２】他の遺伝子のプロモーター領域がトリプト
ファンのプロモーター領域である特許請求の範囲第１項
の組み換え体ベクター。
【請求項３】コードする遺伝子がヒト癌壊死因子の遺伝
子である特許請求の範囲第１項又は第２項の組み換え体
ベクター。
【請求項４】挿入されるベクターが大腸菌中で増殖しう
るプラスミドである特許請求の範囲第１〜３項のいずれ
かの組み換え体ベクター。
【請求項５】プラスミドがpBR322である特許請求の範囲
第４項の組み換え体ベクター。
【請求項６】プラスミドがpBR322から制限酵素Ava I及
びPvu IIの切断認識部位間の短鎖のDNA領域を欠失させ
たpBR322変異体である特許請求の範囲第４項の組み換え
体ベクター。
【請求項７】pHTP310,pHTP312,pHTP314,pHTP316,pHTP31
7又はpHTP318である特許請求の範囲第１項の組み換え体
ベクター。
【請求項８】癌壊死因子或いは該因子のＮ末端部分と相
同性の高いポリペプチドをコードする遺伝子の上流に、
少なくとも、発現制御配列として、他の遺伝子のプロモ
ーター領域と、シャイン・ダルカーノ配列から翻訳開始
コドン間の配列において、下記の塩基配列を有する高度
形質発現組み換え体ベクターにより形質転換された細菌
宿主。（５′）−AAGGAGGTT−Ｘ−ATTATG−（３′）〔Ｉ〕（式中、ＸはT,T−Ｙ又はＡ−Ｚを表わす。但し、Ｙは
A,AA,AAT、ＺはT,TCGを意味する。）
【請求項９】形質転換された宿主が大腸菌である特許請
求の範囲第８項の宿主。