JPH0315147B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は抗原−抗体反応を介して感染性因子を
検出することに関する。さらに詳しくは生物検体
における連鎖球菌Ａ抗原の存在を介して連鎖球菌
Ａを検出することに関する。 連鎖球菌の数種類のうちでも、連鎖球菌Ａ群
（S.pyogenes）は、ヒトに病的症状たとえばβ型
溶血性肺炎、猩紅熱、リユーマチ熱、心疾患後発
症、糸球体腎炎、敗血性咽頭炎、産褥敗血症等を
起こさせる主な原因である。連鎖球菌の他の群は
全く無害であり、通常は咽頭に存在する。連鎖球
菌Ａによつて生ずる恐れのある感染の重大な性質
のゆえに、感染の初期段階でその存在を診断し適
当な治療手段を選択することが重要である。連鎖
球菌は通常適当な培地で培養される；しかしなが
ら連鎖球菌を種類によつて同定することは簡単な
仕事ではない。連鎖球菌Ａ−選択性培養培地はこ
れらが十分選択的であるとは言えずこの点で不完
全である。すなわち、これらは連鎖球菌Ａを生育
させている間他の種類の連鎖球菌を全て排除する
ものではない。重要なことに、連鎖球菌Ａを同定
する培養技術では、連鎖球菌Ａの存在を確定する
ために通常18時間のインキユベーシヨン時間が必
要であり、48時間程の長さが必要になることもし
ばしばである。このような長時間の試験は疾病治
療の最も良い方法に関して必要な判断を遅らせる
ことになる。連鎖球菌Ａの確実で簡単で素早い試
験が必要であることは明らかである。 生物検体たとえば咽頭からの唾液検体における
連鎖球菌の存在の試験は、本発明が提供する試験
セツトを用いると素早くそして確実である。棒体
と一端に連鎖球菌Ａ抗原を集める繊維状ふき取り
部とを備えたアプリケータを、感染部分ふき取り
に用いる。このふき取り部で検体を取つた後、こ
のふき取り部を抽出剤に浸漬してこのふき取り部
繊維から抽出剤へ抗原を放出させる。この抽出液
のアリコートを抗原と反応性を持つ抗体を含有す
る指示液へ入れる。抗原抗体反応が生ずるかどう
かにより生物検体における連鎖球菌Ａの有無が示
される。 本発明の幾つかの特徴が確実な結果をもたらす
ことが見い出された。連鎖球菌Ａ抗原を集め放出
（酵素の存在下で）するには再生セルロース繊維
（通常レーヨンとして知られている）が最も効果
的であり、これに対して天然セルロース繊維たと
えば綿は十分に働かない。棒体は孔のない
（nonporous）材料、最も好ましくは孔のない合
成材料たとえば孔のないプラスチツクで形成され
ることが天然材料たとえば木で形成されるより好
ましい。好ましい抽出剤はストレプトマイセス・
アルブス菌により産生される酵素混合物を含有す
る。好ましい指示剤は、連鎖球菌Ａ抗原と反応す
る抗体が、ラテツクス微粒子と結合して抗原抗体
反応の結果その微粒子が凝集する凝集剤である。 ここにおいて、非常に短時間ですなわち約70分
以内に行なうことができ、しかも複雑な装置を使
うことのない連鎖球菌Ａ群の診断試験が提供され
る。これにより試験を診療室内で行なうことがで
き、この試験の結果に基づいてその日のうちに治
療コースを医師が決めることができるようにな
る。この試験は、培養試験で行なわれるような連
鎖球菌Ａ微生物自体の生育よりむしろ、生物検体
たとえば咽頭からのふき取り標本における連鎖球
菌Ａ抗原の存在を検出する。それゆえ、選択的培
養試験に必要とされる長期のインキユベーシヨン
期間を実質的に省くことができる。しかしながら
本発明の有利さは、感度または精度のいずれかを
儀性にないと得られないものではなく、研究によ
り本発明試験の分析感度および精度のいずれもが
100％に達することが明らかである。 本発明によれば、試験セツトは生物標本におけ
る連鎖球菌Ａ抗原の存在を正確に検出する材料お
よび薬剤を備えたものである。標本はアプリケー
タ棒体と該棒体の一端にある繊維状ふき取り部と
を有するアプリケータにより集められる。感染部
分を繊維状ふき取り部でふき取り、これにより連
鎖球菌Ａ抗原を繊維により集める。続いて、スト
レプトマイセス・アルブス菌により産生されかつ
前記ふき取り部から連鎖球菌Ａ抗原の放出に効果
を有する酵素の混合物を含有する水性抽出剤に前
記ふき取り部を浸漬する。指示例は連鎖球菌Ａ抗
原と特異的に反応する抗体を含有するよう準備さ
れる。連鎖球菌Ａ抗原含有（連鎖球菌Ａ抗原が生
物検体に存在している場合）抽出剤を指示例へ加
えると、検出可能な抗原抗体反応が生じる。 本発明の重要な特徴は、ふき取り部から連鎖球
菌Ａ抗原の放出に効果のある酵素を含有する抽出
剤を用いることである。単にふき取り部で感染部
分をふき取りこのふき取り部を酵素不含有溶液に
入れただけでは信頼性の高い結果をもたらさない
ことがわかつた。連鎖球菌Ａ抗原は、酵素を含有
しない水性媒体へ自由に溶解するよりむしろふき
取り部の繊維に付着しやすいと思われる。しかし
ながらストレプトマイセス・アルブスから得られ
る酵素混合物が存在すると、連鎖球菌Ａ抗原は水
性媒体へ遊離することが見い出された。抗原遊離
のメカニズムは知られていない。しかしながら、
酵素が、ふき取り部繊維に固着しやすい連鎖球菌
Ａ抗原子分子の部分から抗体反応性決定因子を含
有するこの分子の部分を遊離させると考えられ
る。 ストレプトマイセス・アルブス酵素を含有する
抽出剤は次のようにして調製される： マイコフイル（Mycophil） 寒天（メリーラ
ンド、コツキースヴイレ、ベクトン、デイツキン
ソンアワドコンパニー、BBLマイクロバイオロ
ジー部門製）で、ストレプトマイセス・アルブス
（NCTC＃7807）を25℃にて５日間生長させる。
次いでこの微生物を液体培地40mlへ移し、振とう
しながら25℃で５日間生長させる。液体培地は、
イーストエキス、ポリペプトン、デキストロー
ス、ポリソルベート80（ツイーン）と一塩基性リ
ン酸カリウムとからなる。 ５日後、液体培地40mlを同じ培地400mlへ移し、
振とうしながら25℃で培養する。５日から14日の
間、培養培地のアリコートをとり、ストレプトコ
ツカス・ピオゲネス（ATCC＃8135）細胞を溶解
する活性を測定する。 10000〜13000×ｇで30分間遠心分離して培養液
を集める。次いで上澄液をチーズクロスで過
し、0.05MトリスPH8.0に対して透析する。次い
でアリコートを凍結乾燥して４℃に保つ。 さらに、アプリケータを正しく選択することが
試験の信頼性に影響する重大な因子であることも
見い出された。標本を集めるために用いられるア
プリケータの多くの一般的型は本発明の試験にお
いては十分に効果的ではない。特に、天然のセル
ロース材料で作られたふき取り部は非常に劣る働
らきしかしないことがわかつた。本発明の重要な
見地によれば、培養ふき取り部は再生セルロース
（レーヨン）繊維で形成されるのが非常に好まし
いことがわかつた。レーヨンは綿に比して好まし
いだけでなく、ほかの点では培養ふき取り部を形
成するのに適する他の合成繊維に比べても好まし
い。 本発明は関する他の重要な発見は、たとえば木
のような天然材質で作られたアプリケータの棒体
は良い結果を得るのに適さないということであ
る。本発明の別の重要な見地によれば、アプリケ
ータ棒体は合成材料、特にたとえばポリスチレ
ン、ポリカーボネート、ポリプロピレン、ポリエ
チレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリアミ
ドおよびポリアクリル酸類のような非多孔性プラ
スチツクを含む非多孔性材料が好ましい。 連鎖球菌Ａ抗原を集めるのに天然セルロース材
料たとえば綿や木が不適当で、再生セルロース繊
維が最も好ましいということは驚くべきことであ
る。この発見は、本発明のシステムが天然材料の
セルロースと一緒に存在する物質の存在に非常に
感受性が高いということを示唆するものである。
この感受性を引き起こすメカニズム（１種または
複数の）はいまだ解明されていない；しかしなが
ら、幾つかの要因が含まれるであろう。繊維から
連鎖球菌Ａ抗原を放出するのに用いられる酵素を
阻害する物質が天然セルロース材料に含まれてい
るのかもしれない。または、天然セルロース繊維
が連鎖球菌Ａ抗原の抗原活性部位と反応して抗体
による抗原の識別をできなくする物質を含む可能
もある。多孔性材料たとえば木は、抗原、酵素ま
たは他の薬剤を吸着することにより明確な結果を
妨害するのかもしれない。天然繊維材料が連鎖球
菌Ａ抗原の検出を妨げる際の考えられるメカニズ
ムは、合成材料を用いて得られる驚くべき優れた
結果に対する考えられうる解釈として説明され
る。しかしながら、この考えられうる解釈は厳密
に試験されてはいないので、出願人は結果に対す
るこのような解釈について拘束されるものではな
い。 本発明の好ましい実施態様によれば、抽出剤中
の連鎖球菌Ａ抗原の存在は、抗原と反応性を持つ
抗体が結合したラテツクス粒子懸濁液を含む凝集
指示剤により検出される。異なつたラテツクス粒
子に結合した抗体に対して抗原分子が結合すると
ラテツクス粒子が架橋する結果となり、これらが
凝集し懸濁液から析出するようになる。凝集は肉
眼でも認めることができるが顕微鏡で検査するこ
とにより観察するのが好ましい。 適当なラテツクス粒子は、カルボキシル化され
た形で、ペンシルバニア、ウオーリントン、ポリ
サイエンシーズ社から購入できる。粒子は粒径約
0.2〜約1.0ミクロンの範囲であり、一般には粒子
表面積１cm²につき約１×10¹⁰〜約１×10¹²の抗体
分子を有する。指示剤は１mlにつき約１×10^-3〜
約10×10^-3gmの抗体結合ラテツクス粒子を有す
る。粒子を調製するための抗体は、ストレイン
（strain）Ｔ−23のＡ群β−溶血性連鎖球菌でウ
サギに免疫することにより得るのが好ましい。活
性抗体はこれらのウサギの血清から、50％飽和
（NH₄）₂SO₄液の存在下による析出と、トリス緩
衝液0.01MPH8.0で平衝化したDEAE−セルロース
（DE−52、ワツトマン）を用いたイオン交換クロ
マトグラフイとを組合わせることにより得られ
る。活性抗体フラクシヨンはNaC1勾配を用いて
DEAEセルロースカラムから溶出される。活性抗
体フラクシヨンはNaC1勾配を用いてDEAEセル
ロースカラムから溶出される。活性抗体フラクシ
ヨンは0.04〜0.09MNaC1でカラムから溶出する。 ラテツクス抗体試薬は、ウサギの抗−連鎖球菌
Ａ群抗体を、結合剤として１−エチル−３−（３
−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド
（EDC）を用いたカルボキシル化ラテツクスに結
合させることにより調製される。 本発明は抗体結合ラテツクス粒子の凝集を介し
た連鎖球菌Ａの検出に限定されるものではなく、
他の多数の適当な抗原−抗体反応検出方法で置き
換えることもでき、放射免疫アツセイや免疫螢光
法をも含む。勿論これに限定されるものではな
い。免疫凝集法の有利な点は実施が簡単で１分以
内に結果がわかりそして明瞭に判読できることで
ある。 本発明による試験セツトは、プラスチツク棒体
とレーヨンふき取り部を有する適当なアプリケー
タを備える。酵素含有抽出剤は、使用の場でもと
の状態に戻すために凍結乾燥した形で提供される
のが一般的である。もとの状態にした後、抽出剤
は冷蔵状態（約２℃〜約８℃）で約10日間貯蔵で
きる。指示薬は安定な懸濁液として提供され、冷
蔵状態で約12ケ月間保存される。懸濁液は使用前
に振とうする。試験セツトは試験を行なうための
付加的器具を有してよく、これにより最適な器具
が使用できることを確実にし試験を妨害するかも
しれない材料の使用を防止するのが好ましい。こ
のような器具としては、抗原をふき取り部から抽
出するのに適当な径の試験管、凝集反応を行なう
ための複数の凹部を有する試験プレート、手動撹
拌棒、移動用ピペツトチツプ等である。試験セツ
トはまた陽性（連鎖球菌Ａ抗原含有）および陰性
の対照サンプルを有しているとよい。また、別の
対照用として試験セツトには、直接比較のために
抗体を含まないラテツクス懸濁液を有するのが好
ましい（非凝集懸濁液でもいくらか濁ることがあ
ることを記憶すべきである）。 もとの状態にした抽出剤をピペツトできれいな
試験管へ入れる（一般には試験管１本につき約
0.5ml）。アプリケータを用いて感染部位たとえば
咽喉を拭ぐい、次いで各棒体のふき取り端部を試
験管の１つへ入れる。試験管を少なくとも30分好
ましくは１時間約体温（37℃）でインキユベート
し、酵素により繊維から連鎖球菌Ａを遊離させ
る。インキユベートの間、試験管の上部を適当な
手段で被覆して蒸発を防ぐ。インキユベート期間
後、アプリケータのふき取り部を試験管室壁に押
しつけて液体を放出させながらアプリケータを引
き上げる。次いでアプリケータを廃棄する。各サ
ンプルのアリコートたとえば50μlをサンプルプレ
ートの２つの凹部（ウエル）の各々へ入れ、これ
と同時に陽性および陰性対照物のアリコートも入
れ、１対の凹部３組を準備する。対になつた凹部
の１方へ抗体含有ラテツクス懸濁液を加え、他方
へ抗体を含有しないラテツクス懸濁液を加える。
個々にプラスチツク撹拌棒を使つて、各凹部の反
応物を混合する。サンプルプレートにふたをかぶ
せ、約４分間機械式回転器上へ置く。結果は直ち
に判読される。強い凝集反応は肉眼でも見える
が、凹部にある混合物を顕微鏡下で観察するのが
好ましい。抗体含有ラテツクス懸濁液の凹部にお
いて見られる抗体を含まない懸濁液の凹部との差
異は、ふき取り部位に連鎖球菌Ａが存在していた
ことを示す。２つの凹部に何ら相違ない場合には
連鎖球菌Ａが存在しないと結論することができ
る。 実施例 １ 固形分2.5重量％含有カルボキシル化ラテツク
ス（ペンシルバニア、ウオーリントン、ポリサイ
エンシーズ社より入手）4.0mlを蒸留水で３回洗
う。最後の洗浄後、粒子を蒸留水4.0mlで再懸濁
させる。0.05MKH₂PO₄（PH4.5）を１ml加える。
ラテツクス懸濁液を電磁撹拌機へ入れ、22℃に保
つ。EDC2重量％溶液（ミズリー、セントルイ
ス、シグマケミカルカンパニーから入手）5.0ml
を加え、3.5時間反応させる。カルボジイシドラ
テツクスを食塩水（0.9％NaC1）で一回洗い、食
塩水（0.9％NaC1）5.0mlに再懸濁させる。 ウサギの抗体1.2mgを0.2M硼酸塩（PH8.5）5.0
mlに溶解し、食塩水中の活性化ラテツクス懸濁液
5.0mlを加える。ラテツクスとウサギの抗体を22
℃にて20時間反応させる。抗体と結合していない
表面カルボキシル基を中和するために、5mMエ
タノールアミン溶液を加え、続いて２重量％濃度
のウシ血清アルブミン溶液を加える。抗体−ラテ
ツクスを洗い、0.9％NaC1、0.2％NaN₃、0.2％
BSA、0.05％ツイーン−20を含む0.1Mグリシン
（PH8.2）に懸濁させ、４℃で貯蔵する。 実施例 ２ 上述した連鎖球菌Ａ群ラテツクス凝集試験セツ
トの効果は多数の施設における臨床評価により決
定される。ラテツクス凝集試験の結果は培養結果
と比較される。 咽頭炎の症状を示す成人および子供1440人から
咽頭ふき取り物を集める。標本をレーヨン製ふき
取り部上に集め、修正スチユアート（Stuarts）
培地〔マリオンカルチユレツト（Marion
Culturette）」中に入れて実験室に移す。本発明
の分析を行なう前に、培養のために各ふき取り部
をヒツジ血液寒天平板に接種するために用いる。
培養18〜24時間後、β溶血性集落を毛細管沈降試
験によりグループ別けする。本発明のラテツクス
凝集試験方法は、ふき取り標本95％（1366／
1440）の範囲で培養結果と一致した。結果を第１
表に示す。

【表】 実施例 ３ 連鎖球菌Ａ群ラテツクス凝集試験の感受性を咽
頭ふき取り標本309から測定する。これらの標本
はβ−溶血性連鎖球菌を培養することにより陽性
と決定され、毛細管沈降試験によりＡ群と確認さ
れたものである。これらの標本の281（91％）が本
発明のラテツクス凝集試験で陽性であつた。培養
において連鎖球菌Ａ群のコロニーが10個より少な
く生じたふき取り標本を除外するならば試験の感
受性は95％であつた。 実施例 ４ 連鎖球菌Ａ群ラテツクス凝集試験の特異性を、
β−溶血性連鎖球菌に対し陰性な培養物を生じる
咽頭ふき取り標本1067と、毛細管沈降試験により
Ａ群以外であると確認されたβ−溶血性連鎖球菌
を生長させる培養物を産出する咽頭ふき取り標本
64とから測定する。それらのうち、1085の標本が
凝集陰性であり、特異性96％であつた。 本発明は特定の好ましくは実施例に関して記載
したが、当業者にとつて明らかな変法は本発明の
範囲から逸脱するものではない。 様々な特徴は本明細書の特許請求の範囲に記載
されている。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 連鎖球菌Ａを含有する可能性のある生物検体
   を集めるものであつて、アプリケータ棒体と一端
   が連鎖球菌Ａ抗原を集める繊維で形成されたふき
   取り部とを備えたアプリケータ手段と、 前記ふき取り部から連鎖球菌Ａ抗原を放出す
   る、ストレプトマイセス・アルブス菌によつて産
   生される酵素を含有する抽出剤を含む容器と、 連鎖球菌Ａ抗原と反応する抗体含有指示剤を含
   む容器とを含み、 前記アプリケータ手段の前記繊維ふき取り部で
   生物検体を集め、該ふき取り部を連鎖球菌Ａ抗原
   を放出するのに十分な時間前記抽出剤中に置き、
   しかる後該抽出剤のアリコートを前記指示剤と混
   合したときに、前記生物検体における連鎖球菌Ａ
   の存在が抗原抗体反応の発現または非発現により
   示されることを特徴とする連鎖球菌Ａ検出用試験
   セツト。 ２ ふき取り部が再生セルロース繊維からなる特
   許請求の範囲第１項記載の試験セツト。 ３ 棒体が合成物質材料からなる特許請求の範囲
   第１項記載の試験セツト。 ４ 棒体が非多孔性材料からなる特許請求の範囲
   第１項記載の試験セツト。 ５ ふき取り部が再生セルロース繊維からなり、
   棒体がプラスチツクからなる特許請求の範囲第１
   項記載の試験セツト。 ６ 指示剤が、抗体が抗原と結合すると凝集する
   懸濁ラテツクス粒子に結合した抗体を含有し、抗
   原抗体反応の発現または非発現が前記懸濁粒子の
   凝集または非凝集により観察される特許請求の範
   囲第１項記載の試験セツト。 ７ アプリケータ棒体と繊維状ふき取り部とを有
   するアプリケータを準備し、前記ふき取り部で生
   物検体をふき取り、 前記ふき取り部から、連鎖球菌Ａ抗原の放出を
   行う、ストレプトマイセス・アルブス菌によつて
   産生される酵素を含有する抽出剤を準備し、前記
   ふき取り部を前記抽出剤に浸漬し、前記ふき取り
   部を前記抽出剤中で前記繊維状ふき取り部から抗
   原を放出するのに十分な時間インキユベートし、 前記抗原と反応する抗体を含む指示剤を準備
   し、前記抽出剤のアリコートを該指示剤へ加え、 前記生物検体における連鎖球菌Ａの存在または
   不存在を示す抗原抗体反応の発現または非発現を
   調べる、 ことを含む連鎖球菌Ａの検出方法。 ８ ふき取り部が再生セルロース繊維からなる特
   許請求の範囲第７項記載の方法。 ９ 棒体が合成物質材料からなる特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 １０ 棒体が非多孔性材料からなる特許請求の範
   囲第７項記載の方法。 １１ ふき取り部が再生セルロース繊維からな
   り、棒体がプラスチツクからなる特許請求の範囲
   第７項記載の方法。 １２ 指示剤が、抗体が抗原と結合したとき凝集
   する懸濁したラテツクス粒子と結合した抗体を含
   有し、抗原抗体反応の発現または非発現が前記懸
   濁粒子の凝集または非凝集により観察される特許
   請求の範囲第７項記載の方法。