JPH03110471A

JPH03110471A - 検量線作成方法

Info

Publication number: JPH03110471A
Application number: JP24958889A
Authority: JP
Inventors: Tatsuya Kosako; 達也古佐小
Original assignee: Sysmex Corp
Current assignee: Sysmex Corp
Priority date: 1989-09-26
Filing date: 1989-09-26
Publication date: 1991-05-10
Anticipated expiration: 2013-06-11
Also published as: JP2763616B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕前とこの発明は、データ変換して抗原等の濃度を求めるため
の検量線を作成する方法に関するものでる。

〔従来の技術〕

免疫学的方法により血清中の蛋白等を測定する場合、そ
れに相対する物質を表面に感作させた担体を用いて測定
する方法がある。

例えば、血清等の検体中のある抗原の濃度を測定する際
に、その抗原と特異的に反応する抗体を感作させた不溶
性担体（例えば径がミクロン単位のラテックス粒子）と
検体とを混合することにより、抗原抗体反応を生じさせ
、担体同士を凝集させる。この凝集の程度を何らかの手
段で測定し、その凝集度を予め定められた検量線を用い
て抗原濃度に変換する。

凝集度を求めるためには、粒子計数手段により未凝集担
体数と凝集担体数とを測定し、両者の数から算出したり
、透過光や散乱光景の変化から求めたりする。

検量線は、含有されている抗原濃度の異なった複数の試
料を測定して設定される。−例として、既知の濃度ｃ、
、ｃ、、ｃ、、ｃ、、ｃ、、ｃ。

の試料を用い、凝集変人を凝集粒子数Ｐ、未凝集粒子数
Ｍにより、Ａ＝Ｐ／　ＣＭ＋Ｐ）で定義することができる。濃度Ｃへの変換は次のｎ次の
シグモイド曲線を用いて行うことができる。

１０ｇ＋ａｃ＝　　Σａ＋　　Ｃｌａｗ　−（Ｇ　　Ａ
）　／Ａ）ただし、ａ＋＋Ｇは定数である。ｎは自然数
であり、例えば３である。

これを図に示したのが第９図である。横軸に濃度（対数
表示）、縦軸に凝集度を取っている。なお、１０００　
（ｎ　ｇ／ｍｌ〕以上については、測定結果は表示しな
いようになっている。

〔発明が解決しようとする課題〕前記のように、高次のシグモイド曲線を用いれば、比較
的良好に検量線を作成することができる。

しかし、その場合第７．ａ図や第７ｂ図で示すように検
量線の両端部分に戻り現象１０，１２．１が生じること
があり、そうなると正しくデータ変換することができな
くなる。

この発明の目的は、高次のシグモイド曲線を用いながら
両端部分に戻り現象を生じることのない検量線作成方法
を提供することである。

〔課題を解決するための手段〕

この発明の検量線作成方法は、測定すべき抗原または抗
体を含有する検体と、その抗原または抗体と特異的に反
応する抗体または抗原を結合させた不溶性担体とを混合
することにより、抗原抗体反応にもとづく不溶性担体の
凝集を生成させ、その凝集度Ａを測定することにより、
検体中の抗原または抗体の濃度Ｃを求める免疫学的測定
方法における検量線の作成方法である。

この発明方法では、複数の既知濃度の試料につき各々凝
集変人を測定する。この測定により得られた各凝集度Ａ
と既知濃度Ｃとを式（ただし、ｎは自然数）に代入して同式の各定数ａ、、Ｇ、およびαを決定する
。

この際に、検量線の両端部分では前記式においてｎを１
とする。このように各定数を決定し、同式で示される検
量線を作成する。

〔作　用〕

１次のシグモイド曲線を用いると、戻り現象は発生しな
い。この発明では、検量線の両端部分、すなわち低濃度
と高濃度の領域に１次のシグモイド曲線を用いているた
め、戻り現象が発生しない。

検量線の中間部分では、高次のシグモイド曲線を用いる
ことにより、凝集度と濃度との関係を良好に近似して表
すことができる。

〔実施例〕

この発明の一実施例を第１図および第２図に基づいて説
明する。

まず、凝集度の測定方法につき説明する。

血清等の検体中の微量の蛋白を高感度に、迅速に測定す
る方法として、（、ＩＡ法（Ｃｏｕｎｔｉｎｇ　Ｉａｉ
−＠ｕｎｏａｓｓａｙ法）がある。これは、抗原抗体反
応を利用したラテックス凝集反応に伴う凝集度を、粒子
計数法により測定し、抗原の定量を行う方法である。免
疫凝集測定装置ＰＡＭＩＡ−１００（商品名、東亜医用
電子株式会社製）は、その方法を利用した装置である。

この実施例では、例えば上記の免疫凝集測定装置を使用
する。この装置では、検体（測定すべき抗原が含まれて
いる）と試薬（検体中の測定すべき抗原と特異的に反応
する抗体が結合されたラテックス粒子が含まれている）
とを混合させることにより、抗原抗体反応が生じ、ラテ
ックス粒子が検体中の抗原を媒介として相互に凝集し始
め、次第に凝集塊が形成される。所定時間後、検体と試
薬の混合液がフローセルに導入される。フローセルでは
シースフローが形成され、粒子はフローセル中央部分を
整列して流れる。粒子の細流部分にレーザ光が照射され
、個々の粒子から発せられる散乱光を計測し、弁別する
ことにより、未凝集ラテックス粒子の数Ｍと凝集ラテッ
クス粒子の数Ｐが求められ、両粒子数Ｍ、Ｐから凝集度
が算出される。例えば、Ａ＝Ｐ／　（Ｍ＋Ｐ）とするこ
とができる。算出された凝集度は、検量線により抗原濃
度に換算される。なお、凝集度の算出については、他に
も色々と定義して用いることができる。

例えば、特開昭６０−１１１９６３号公報や、特開昭６
０−２４３５６号公報等にも算出方法が詳しく示されて
いる。

つぎに、検量線の作成方法を説明する。検量線を作成す
るためには、予め濃度のわかっている試料を実際に測定
し、得られた凝集度と濃度とから変換式を決定する。

ここでは、α−フェトプロティン（ＡＦＰ）の場合を例
にとり、検量線作成方法の一例を説明する。

第１図はこの実施例の方法によって作成した検量線図で
ある。まず、既知濃度Ｃｏ　、Ｃ＋　、Ｃｘ　。

ｃ、、ｃ、、ｃ、、ｃ、の試料の凝集度を測定する。具
体的にはＣ０〜Ｃ１は、それぞれ０，２．８．３２．１
２８．５１２．２０４８　［ｎｇ／ｍｌ〕である。

この実施例では濃度Ｏの試料（これは例えば検体希釈液
）を検量線作成時に用いるが、このことにより、試薬中
のラテックス粒子の自然凝集の影響を除外した変換式を
作成することができる。凝集度Ａと濃度Ｃとの関係は、
次式で示されるｎ次のシグモイド曲線を用いる。これに
より良好に近似することができた。

Ａ　−α Ａ　−α ただし、αは濃度ＣＯ（すなわち濃度Ｏ）の試料の凝集
度であり、これが自然凝集分である。ａＯ＋ａｌ＋　　
ａｔ、ａｘｅ”’は定数である。ＧはｌＪＳ度人−αが
漸近する値であり、定数である。

このシグモイド曲線を用いて次のように検量線を決定す
る。

ｉ）濃度Ｃ＝、ＣＭ、ＣＩによるデータを用いて、濃度
Ｃ１以上の領域における関係式を決定する。ただし、こ
れには１次のシグモイド曲線を用いる（上式において、
ｎ＝１）。

ｉｉ）＆１度Ｃ＋　〜Ｃｍ　（’）データを用イテ濃度
Ｃ１〜Ｃ５の領域における関係式を決定する。ただし、
これには３次のシグモイド曲線を用いる（上式において
ｎ＝３）。

ｌｉ）濃度０１〜Ｃ４のデータを用いて濃度００〜ＣＩ
の領域における関係式を決定する。ただし、これには１
次のシグモイド曲線を用いる。

このように、この実施例においては、濃度Ｃ３以下と０
６以上の両端の領域では１次のシグモイド曲線を用い、
濃度Ｃ１〜Ｃ６の間の領域では３次のシグモイド曲線を
用いて、濃度Ｃ，，Ｃ，の箇所でそれぞれ曲線を接合し
ている。

濃度０１〜Ｃ１の領域では３次のシグモイド曲線を用い
ると、凝集度と濃度との関係を良好に近似して表すこと
ができた。

次に、全領域に３次のシグモイド曲線を用いず、両端の
領域に１次のシグモイド曲線を採用した理由を説明する
。簡単のため、従来の検量線を例に取り説明する。

検量線の較正のため、試料を測定したところ、第３図あ
るいは第４図に示すようにデータが並んだとする。ただ
し、縦軸、横軸はそれぞれ濃度Ｃと（Ｇ−Ａ）／Ａの対
数である。このように、場合によって第３図あるいは第
４図のようになるのは、測定条件や試薬の特性に由来す
るものであろうと思われる。さて、次にプロットされた
点を元に、これらを曲線で結び近似させる。３次式で近
似させると、第３図は第５ａ図あるいは第５ｂ図のよう
に近似でき、第４図は第６図のように近似できる。第５
ａ図、第５ｂ図に示す近似曲線には橋があり、第６図に
示す近似曲線には極がない。

第５ａ図、第５ｂ図、第６図の座標の取り方を変えると
、それぞれ第７ａ図、第７ｂ図、第８図のようになる。

ここで注目すべきことは、第７ａ図、第７ｂ図において
、検量線の端部に戻り現象１０゜１２．１４が生じてい
ることである。第８図にはその戻り現象は生じていない
。戻り現象とは、検量線の端部、すなわち低濃度領域、
高濃度領域の両方において、あるいはそのいずれか一方
において、凝集度への増加に伴って濃度Ｃが逆に減少し
たり、凝集度への減少に伴って濃度Ｃが逆に増加したり
する現象である。この戻り現象が発生するのは、第５ａ
図、第５ｂ図で示すように極を有する３次式で近似した
からである。また、３次式にかかわらず、極大点または
極少点を持てば、検量線には前述した戻り現象が発生す
る。極大点や極小点を持つ可能性があるのは二次式以上
である。

−次式であれば極は発生し得ない。

この実施例では、これよりわかるように、検量線の両端
部分の領域に関して、１次のシグモイド曲線を採用した
ので、戻り現象を回避できる。

さて、従来の検量線とこの実施例の検量線の違いにつき
、１０　Ｃｎｇ／ｍｌ）以下の低濃度試料を測定し、そ
の正確度で評価した結果を第２図、第１０図に示す。

横軸は試料の既知濃度であり、縦軸はその試料を測定し
て得られた凝集度Ａから検量線を用いて濃度換算した値
である。直線は４５度線である。

第２図はこの実施例による検量線を用いた場合であり、
第１０図は従来の検量線を用いた場合である。第２図の
方がプロットした各点が４５度の直線に近く、明らかに
この実施例による検量線を用いた方が正確度が高いこと
がわかる。

なお、前記実施例では既知濃度の試料のうちに濃度が０
の試料を含めたが、不溶性担体の自然凝集分を考慮する
必要がない場合は、必ずしも濃度がＯの試料を含ませる
必要はない。

〔発明の効果〕

この発明の検量線作成方法は、検量線の両端部分では１
次のシグモイド曲線を用いているため、戻り現象のない
検量線を作成することができる。

そのため、低濃度領域および高濃度領域においても、正
しい測定結果を得ることができる。また、検量線の中間
部分では、シグモイド曲線を任意の寓次のものとするこ
とにより、凝集度と濃度との関係を精密に近似して表す
ことができる。

【図面の簡単な説明】

第１図はこの発明の一実施例により作成した検量線のグ
ラフ、第２図は同検量線を用いた濃度換算値と既知濃度
との比較図、第３図ないし第８図は各々従来の検量線の
端部における戻り現象の説明図、第９図は従来方法によ
り作成した検量線のグラフ、第１Ｏ図はその検量線を用
いた濃度換算値と既知濃度との比較図である。箒図り図抗原１膚Ｃ［ｎｇ／ｍｌｌを炉運膚［ｎｇ／ｍｌ］七ＶＡフ図第図第５ａ図第５ｂ図第図第７ａ　　図第ｂ図第図１円１０Ｃｏｇ１０Ｃ１内〆第図ｔ７７、　！Ｉ？、渫贋［ｎｇ／ｍｌ］口０図￥ｆ、知燻虜［ｎｇ／ｍｌ］

Claims

【特許請求の範囲】試料に含有する所定の抗原または抗体と特異的に反応す
る抗体または抗原を結合させた不溶性担体と前記試料と
を混合することにより、抗原抗体反応に基づく不溶性担
体の凝集を生成させ、抗原または抗体の濃度が異なる複
数の既知濃度の試料につき各々凝集度Ａを測定する過程
と、測定により得られた各凝集度Ａと既知濃度Ｃとから
式ｌｏｇ＿１＿０Ｃ＝Σ＾ｎ＿ｉ＿＝＿９ａ＿１〔ｌｏ
ｇ・｛Ｇ−（Ａ−α）｝／Ａ−α｝〕＾１（ただし、ｎ
は自然数）における各定数ａ＿１、Ｇ、およびαを決定し、同式で
示される検量線を作成する過程とを含み、前記検量線の
両端部分では前記式においてｎを１とすることを特徴と
する検量線作成方法。