JP2763616B2 - 検量線作成方法 - Google Patents
検量線作成方法Info
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- JP2763616B2 JP2763616B2 JP24958889A JP24958889A JP2763616B2 JP 2763616 B2 JP2763616 B2 JP 2763616B2 JP 24958889 A JP24958889 A JP 24958889A JP 24958889 A JP24958889 A JP 24958889A JP 2763616 B2 JP2763616 B2 JP 2763616B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 この発明は、データ変換して抗原等の濃度を求めるた
めの検量線を作成する方法に関するものでる。
めの検量線を作成する方法に関するものでる。
免疫学的方法により血清中の蛋白等を測定する場合、
それに相対する物質を表面に感作させた担体を用いて測
定する方法がある。
それに相対する物質を表面に感作させた担体を用いて測
定する方法がある。
例えば、血清等の検体中のある抗原の濃度を測定する
際に、その抗原と特異的に反応する抗体を感作させた不
溶性担体（例えば径がミクロン単位のラテックス粒子）
と検体とを混合することにより、抗原抗体反応を生じさ
せ、この反応の程度を何らかの手段で測定し、その反応
値を予め定められた検量線を用いて抗原濃度に変換す
る。
際に、その抗原と特異的に反応する抗体を感作させた不
溶性担体（例えば径がミクロン単位のラテックス粒子）
と検体とを混合することにより、抗原抗体反応を生じさ
せ、この反応の程度を何らかの手段で測定し、その反応
値を予め定められた検量線を用いて抗原濃度に変換す
る。
検量線は、含有されている抗原濃度の異なった複数の
試料を測定して設定される。一例として、既知の濃度
C1,C2,C3,C4,C5,C6の試料を用い、濃度Ｃへの変換は次
のｎ次のシグモイド曲線を用いて行うことができる。
試料を測定して設定される。一例として、既知の濃度
C1,C2,C3,C4,C5,C6の試料を用い、濃度Ｃへの変換は次
のｎ次のシグモイド曲線を用いて行うことができる。
ただし、ai,Gは定数である。ｎは自然数であり、例え
ば３である。
ば３である。
これを図に示したのが第９図である。横軸に濃度（対
数表示）、縦軸に凝集度を取っている。なお、1000〔ng
/ml〕以上については、測定結果は表示しないようにな
っている。
数表示）、縦軸に凝集度を取っている。なお、1000〔ng
/ml〕以上については、測定結果は表示しないようにな
っている。
前記のように、高次のシグモイド曲線を用いれば、比
較的良好に検量線を作成することができる。しかし、そ
の場合第7a図や第7b図で示すように検量線の両端部分に
戻り現象10,12,14が生じることがあり、そうなると正し
くデータ変換することができなくなる。
較的良好に検量線を作成することができる。しかし、そ
の場合第7a図や第7b図で示すように検量線の両端部分に
戻り現象10,12,14が生じることがあり、そうなると正し
くデータ変換することができなくなる。
この発明の目的は、高次のシグモイド曲線を用いなが
ら両端部分に戻り現象を生じることのない検量線作成方
法を提供することである。
ら両端部分に戻り現象を生じることのない検量線作成方
法を提供することである。
この発明の検量線作成方法は、測定すべき抗原または
抗体を含有する検体と、その抗原または抗体と特異的に
反応する抗体または抗原を結合させた不溶性担体とを混
合することにより、抗原抗体反応にもとづく反応値Ａを
測定することにより、検体中の抗原または抗体の濃度Ｃ
を求める免疫学的測定方法における検量線の作成方法で
ある。
抗体を含有する検体と、その抗原または抗体と特異的に
反応する抗体または抗原を結合させた不溶性担体とを混
合することにより、抗原抗体反応にもとづく反応値Ａを
測定することにより、検体中の抗原または抗体の濃度Ｃ
を求める免疫学的測定方法における検量線の作成方法で
ある。
この発明方法では、複数の既知濃度の試料につき各々
反応値Ａを測定する。この測定により得られた各反応値
Ａと既知濃度Ｃとを式 （ただし、ｎは測定により得られた既知濃度Ｃに対する
反応値Ａから得た曲線に近似するように決定される自然
数） に代入して同式の各定数ai,G,およびαを決定する。
反応値Ａを測定する。この測定により得られた各反応値
Ａと既知濃度Ｃとを式 （ただし、ｎは測定により得られた既知濃度Ｃに対する
反応値Ａから得た曲線に近似するように決定される自然
数） に代入して同式の各定数ai,G,およびαを決定する。
この際に、検量線の両端部分では前記式においてｎを
１とする。このように各定数を決定し、同式で示される
検量線を作成する。
１とする。このように各定数を決定し、同式で示される
検量線を作成する。
１次のシグモイド曲線を用いると、戻り現象は発生し
ない。この発明では、検量線の両端部分、すなわち低濃
度と高濃度の領域に１次のシグモイド曲線を用いている
ため、戻り現象が発生しない。検量線の中間部分では、
高次のシグモイド曲線を用いることにより、反応値と濃
度との関係を良好に近似して表すことができる。
ない。この発明では、検量線の両端部分、すなわち低濃
度と高濃度の領域に１次のシグモイド曲線を用いている
ため、戻り現象が発生しない。検量線の中間部分では、
高次のシグモイド曲線を用いることにより、反応値と濃
度との関係を良好に近似して表すことができる。
この発明の一実施例を第１図および第２図に基づいて
説明する。
説明する。
まず、反応値として凝集度の測定方法につき説明す
る。
る。
血清等の検体中の微量の蛋白を高感度に、迅速に測定
する方法として、CIA法（Counting Immunoassay法）が
ある。これは、抗原抗体反応を利用したラテックス凝集
反応に伴う凝集度を、粒子計数法により測定し、抗原の
定量を行う方法である。免疫凝集測定装置PAMIA−100
（商品名、東亜医用電子株式会社製）は、その方法を利
用した装置である。
する方法として、CIA法（Counting Immunoassay法）が
ある。これは、抗原抗体反応を利用したラテックス凝集
反応に伴う凝集度を、粒子計数法により測定し、抗原の
定量を行う方法である。免疫凝集測定装置PAMIA−100
（商品名、東亜医用電子株式会社製）は、その方法を利
用した装置である。
この実施例では、例えば上記の免疫凝集測定装置を使
用する。この装置では、検体（測定すべき抗原が含まれ
ている）と試薬（検体中の測定すべき抗原と特異的に反
応する抗体が結合されたラテックス粒子が含まれてい
る）とを混合させることにより、抗原抗体反応が生じ、
ラテックス粒子が検体中の抗原を媒介として相互に凝集
し始め、次第に凝集塊が形成される。所定時間後、検体
と試薬の混合液がフローセルに導入される。フローセル
ではシースフローが形成され、粒子はフローセル中央部
分を整列して流れる。粒子の細流部分にレーザ光が照射
され、個々の粒子から発せられる散乱光を計測し、弁別
することにより、未凝集ラテックス粒子の数Ｍと凝集ラ
テックス粒子の数Ｐが求められ、両粒子数M,Pから凝集
度が算出される。例えば、Ａ＝P/（Ｍ＋Ｐ）とすること
ができる。算出された凝集度は、検量線により抗原濃度
に換算される。なお、凝集度の算出については、他にも
色々と定義して用いることができる。例えば、特開昭60
−111963号公報や、特開昭60−24356号公報等にも算出
方法が詳しく示されている。
用する。この装置では、検体（測定すべき抗原が含まれ
ている）と試薬（検体中の測定すべき抗原と特異的に反
応する抗体が結合されたラテックス粒子が含まれてい
る）とを混合させることにより、抗原抗体反応が生じ、
ラテックス粒子が検体中の抗原を媒介として相互に凝集
し始め、次第に凝集塊が形成される。所定時間後、検体
と試薬の混合液がフローセルに導入される。フローセル
ではシースフローが形成され、粒子はフローセル中央部
分を整列して流れる。粒子の細流部分にレーザ光が照射
され、個々の粒子から発せられる散乱光を計測し、弁別
することにより、未凝集ラテックス粒子の数Ｍと凝集ラ
テックス粒子の数Ｐが求められ、両粒子数M,Pから凝集
度が算出される。例えば、Ａ＝P/（Ｍ＋Ｐ）とすること
ができる。算出された凝集度は、検量線により抗原濃度
に換算される。なお、凝集度の算出については、他にも
色々と定義して用いることができる。例えば、特開昭60
−111963号公報や、特開昭60−24356号公報等にも算出
方法が詳しく示されている。
つぎに、検量線の作成方法を説明する。検量線を作成
するためには、予め濃度のわかっている試料を実際に測
定し、得られた凝集度と濃度とから変換式を決定する。
するためには、予め濃度のわかっている試料を実際に測
定し、得られた凝集度と濃度とから変換式を決定する。
ここでは、α−フェトプロテイン（AFP）の場合を例
にとり、検量線作成方法の一例を説明する。
にとり、検量線作成方法の一例を説明する。
第１図はこの実施例の方法によって作成した検量線図
である。まず、既知濃度C0,C1,C2,C3,C4,C5,C6の試料の
凝集度を測定する。具体的にはC0〜C6は、それぞれ０、
２、８、32、128、512、2048〔ng/ml〕である。
である。まず、既知濃度C0,C1,C2,C3,C4,C5,C6の試料の
凝集度を測定する。具体的にはC0〜C6は、それぞれ０、
２、８、32、128、512、2048〔ng/ml〕である。
この実施例では濃度０の試料（これは例えば検体希釈
液）を検量線作成時に用いるが、このことにより、試薬
中のラテックス粒子の自然凝集の影響を除外した変換式
を作成することができる。凝集度Ａと濃度Ｃとの関係
は、次式で示されるｎ次のシグモイド曲線を用いる。こ
れにより良好に近似することができた。
液）を検量線作成時に用いるが、このことにより、試薬
中のラテックス粒子の自然凝集の影響を除外した変換式
を作成することができる。凝集度Ａと濃度Ｃとの関係
は、次式で示されるｎ次のシグモイド曲線を用いる。こ
れにより良好に近似することができた。
ただし、αは濃度C0（すなわち濃度０）の試料の凝集
度であり、この自然凝集分である。a0,a1,a2,a3,…は定
数である。Ｇは凝集度Ａ−αが漸近する値であり、定数
である。
度であり、この自然凝集分である。a0,a1,a2,a3,…は定
数である。Ｇは凝集度Ａ−αが漸近する値であり、定数
である。
このシグモイド曲線を用いて次のように検量線を決定
する。
する。
ｉ）濃度C4,C5,C6によるデータを用いて、濃度C6以上の
領域における関係式を決定する。ただし、これには１次
のシグモイド曲線を用いる（上式において、ｎ＝１）。
領域における関係式を決定する。ただし、これには１次
のシグモイド曲線を用いる（上式において、ｎ＝１）。
ii）濃度C1〜C6のデータを用いて濃度C1〜C6の領域にお
ける関係式を決定する。ただし、これには３次のシグモ
イド曲線を用いる（上式においてｎ＝３）。
ける関係式を決定する。ただし、これには３次のシグモ
イド曲線を用いる（上式においてｎ＝３）。
iii）濃度C1〜C4のデータを用いて濃度C0〜C1の領域に
おける関係式を決定する。ただし、これには１次のシグ
モイド曲線を用いる。
おける関係式を決定する。ただし、これには１次のシグ
モイド曲線を用いる。
このように、この実施例においては、濃度C1以下とC6
以上の両端の領域では１次のシグモイド曲線を用い、濃
度C1〜C6の間の領域では３次のシグモイド曲線を用い
て、濃度C1,C6の箇所でそれぞれ曲線を接合している。
以上の両端の領域では１次のシグモイド曲線を用い、濃
度C1〜C6の間の領域では３次のシグモイド曲線を用い
て、濃度C1,C6の箇所でそれぞれ曲線を接合している。
濃度C1〜C6の領域では３次のシグモイド曲線を用いる
と、凝集度と濃度との関係を良好に近似して表すことが
できた。これは言い換えれば、ｎが測定により得られた
既知濃度Ｃに対する凝集度Ａから得た曲線に近似するよ
うに決定されるものであることを意味する。
と、凝集度と濃度との関係を良好に近似して表すことが
できた。これは言い換えれば、ｎが測定により得られた
既知濃度Ｃに対する凝集度Ａから得た曲線に近似するよ
うに決定されるものであることを意味する。
次に、全領域に３次のシグモイド曲線を用いず、両端
の領域に１次のシグモイド曲線を採用した理由を説明す
る。簡単のため、従来の検量線を例に取り説明する。
の領域に１次のシグモイド曲線を採用した理由を説明す
る。簡単のため、従来の検量線を例に取り説明する。
検量線の較正のため、試料を測定したところ、第３図
あるいは第４図に示すようにデータが並んだとする。た
だし、縦軸，横軸はそれぞれ濃度Ｃと（Ｇ−Ａ）/Aの対
数である。このように、場合によって第３図あるいは第
４図のようになるのは、測定条件や試薬の特性に由来す
るものであろうと思われる。さて、次にプロットされた
点を元に、これらを曲線で結び近似させる。３次式で近
似させると、第３図は第5a図あるいは第5b図のように近
似でき、第４図は第６図のように近似できる。第5a図、
第5b図に示す近似曲線には極があり、第６図に示す近似
曲線には極がない。第5a図、第5b図、第６図の座標の取
り方を変えると、それぞれ第7a図、第7b図、第８図のよ
うになる。ここで注目すべきことは、第7a図、第7b図に
おいて、検量線の端部に戻り現象10,12,14が生じている
ことである。第８図には、その戻り現象は生じていな
い。戻り現象とは、検量線の端部、すなわち低濃度領
域、高濃度領域の両方において、あるいはそのいずれか
一方において、凝集度Ａの増加に伴って濃度Ｃが逆に減
少したり、凝集度Ａの減少に伴って濃度Ｃが逆に増加し
たりする現象である。この戻り現象が発生するのは、第
5a図、第5b図で示すように極を有する３次式で近似した
からである。また、３次式にかかわらず、極大点または
極少点を持てば、検量線には前述した戻り現象が発生す
る。極大点や極小点を持つ可能性があるのは二次式以上
である。一次式であれば極は発生し得ない。
あるいは第４図に示すようにデータが並んだとする。た
だし、縦軸，横軸はそれぞれ濃度Ｃと（Ｇ−Ａ）/Aの対
数である。このように、場合によって第３図あるいは第
４図のようになるのは、測定条件や試薬の特性に由来す
るものであろうと思われる。さて、次にプロットされた
点を元に、これらを曲線で結び近似させる。３次式で近
似させると、第３図は第5a図あるいは第5b図のように近
似でき、第４図は第６図のように近似できる。第5a図、
第5b図に示す近似曲線には極があり、第６図に示す近似
曲線には極がない。第5a図、第5b図、第６図の座標の取
り方を変えると、それぞれ第7a図、第7b図、第８図のよ
うになる。ここで注目すべきことは、第7a図、第7b図に
おいて、検量線の端部に戻り現象10,12,14が生じている
ことである。第８図には、その戻り現象は生じていな
い。戻り現象とは、検量線の端部、すなわち低濃度領
域、高濃度領域の両方において、あるいはそのいずれか
一方において、凝集度Ａの増加に伴って濃度Ｃが逆に減
少したり、凝集度Ａの減少に伴って濃度Ｃが逆に増加し
たりする現象である。この戻り現象が発生するのは、第
5a図、第5b図で示すように極を有する３次式で近似した
からである。また、３次式にかかわらず、極大点または
極少点を持てば、検量線には前述した戻り現象が発生す
る。極大点や極小点を持つ可能性があるのは二次式以上
である。一次式であれば極は発生し得ない。
この実施例では、これよりわかるように、検量線の両
端部分の領域に関して、１次のシグモイド曲線を採用し
たので、戻り現象を回避できる。
端部分の領域に関して、１次のシグモイド曲線を採用し
たので、戻り現象を回避できる。
さて、従来の検量線とこの実施例の検量線の違いにつ
き、10〔ng/ml〕以下の低濃度試料を測定し、その正確
度で評価した結果を第２図、第10図に示す。
き、10〔ng/ml〕以下の低濃度試料を測定し、その正確
度で評価した結果を第２図、第10図に示す。
横軸は試料の既知濃度であり、縦軸はその試料を測定
して得られた凝集度Ａから検量線を用いて濃度換算した
値である。直線は45度線である。第２図はこの実施例に
よる検量線を用いた場合であり、第10図は従来の検量線
を用いた場合である。第２図の方がプロットした各点が
45度の直線に近く、明らかにこの実施例による検量線を
用いた方が正確度が高いことがわかる。
して得られた凝集度Ａから検量線を用いて濃度換算した
値である。直線は45度線である。第２図はこの実施例に
よる検量線を用いた場合であり、第10図は従来の検量線
を用いた場合である。第２図の方がプロットした各点が
45度の直線に近く、明らかにこの実施例による検量線を
用いた方が正確度が高いことがわかる。
なお、前記実施例では既知濃度の試料のうちに濃度が
０の試料を含めたが、不溶性担体の自然凝集分を考慮す
る必要がない場合は、必ずしも濃度が０の試料を含ませ
る必要はない。また検量線の両端を使用しない部分は、
前記のα−フェトプロテインの例ではｎ＝３を選択して
いるが、測定結果によっては、ｎは他の数たとえば4,5
など高次のものとしてもよく、前記式によるシグモイド
曲線に近似するようにｎを決定する。
０の試料を含めたが、不溶性担体の自然凝集分を考慮す
る必要がない場合は、必ずしも濃度が０の試料を含ませ
る必要はない。また検量線の両端を使用しない部分は、
前記のα−フェトプロテインの例ではｎ＝３を選択して
いるが、測定結果によっては、ｎは他の数たとえば4,5
など高次のものとしてもよく、前記式によるシグモイド
曲線に近似するようにｎを決定する。
この発明の検量線作成方法は、検量線の両端部分では
１次シグモイド曲線を用いているため、戻り現象のない
検量線を作成することができる。そのため、低濃度領域
および高濃度領域においても、正しい測定結果を得るこ
とができる。また、検量線の中間部分では、シグモイド
曲線を任意の高次のものとすることにより、反応値と濃
度との関係を精密に近似して表すことができる。
１次シグモイド曲線を用いているため、戻り現象のない
検量線を作成することができる。そのため、低濃度領域
および高濃度領域においても、正しい測定結果を得るこ
とができる。また、検量線の中間部分では、シグモイド
曲線を任意の高次のものとすることにより、反応値と濃
度との関係を精密に近似して表すことができる。
第１図はこの発明の一実施例により作成した検量線のグ
ラフ、第２図は同検量線を用いた濃度換算値と既知濃度
との比較図、第３図ないし第８図は各々従来の検量線の
端部における戻り現象の説明図、第９図は従来方法によ
り作成した検量線のグラフ、第10図はその検量線を用い
た濃度換算値と既知濃度との比較図である。
ラフ、第２図は同検量線を用いた濃度換算値と既知濃度
との比較図、第３図ないし第８図は各々従来の検量線の
端部における戻り現象の説明図、第９図は従来方法によ
り作成した検量線のグラフ、第10図はその検量線を用い
た濃度換算値と既知濃度との比較図である。
Claims (1)
- 【請求項１】試料に含有する所定の抗原または抗体と特
異的に反応する抗体または抗原を結合させた不溶性担体
と前記試料とを混合することによる抗原抗体反応に基づ
く免疫学的測定方法において、抗原または抗体の濃度が
異なる複数の既知濃度の試料につき各々反応値Ａを測定
する過程と、測定により得られた各反応値Ａと既知濃度
Ｃとから式 （ただし、ｎは測定により得られた既知濃度Ｃに対する
反応値Ａから得た曲線に近似するように決定される自然
数） における各定数ai,G,およびA0を決定し，同式で示され
る検量線を作成する過程とを含み、前記検量線の両端部
分では前記式においてｎを１とすることを特徴とする検
量線作成方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24958889A JP2763616B2 (ja) | 1989-09-26 | 1989-09-26 | 検量線作成方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP24958889A JP2763616B2 (ja) | 1989-09-26 | 1989-09-26 | 検量線作成方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03110471A JPH03110471A (ja) | 1991-05-10 |
| JP2763616B2 true JP2763616B2 (ja) | 1998-06-11 |
Family
ID=17195250
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP24958889A Expired - Lifetime JP2763616B2 (ja) | 1989-09-26 | 1989-09-26 | 検量線作成方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2763616B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP3645023B2 (ja) * | 1996-01-09 | 2005-05-11 | 富士写真フイルム株式会社 | 試料分析方法、検量線の作成方法及びそれを用いる分析装置 |
-
1989
- 1989-09-26 JP JP24958889A patent/JP2763616B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03110471A (ja) | 1991-05-10 |
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