JPH03108495A - 活性化因子及び活性化因子遺伝子並びに有用生理活性物質の生産方法 - Google Patents

活性化因子及び活性化因子遺伝子並びに有用生理活性物質の生産方法

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JPH03108495A
JPH03108495A JP24589489A JP24589489A JPH03108495A JP H03108495 A JPH03108495 A JP H03108495A JP 24589489 A JP24589489 A JP 24589489A JP 24589489 A JP24589489 A JP 24589489A JP H03108495 A JPH03108495 A JP H03108495A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 [産業上の利用分野] 本発明は活性化因子、活性化因子遺伝子及びその標的遺
伝子並びに有用生理活性物質の生産方法に関するもので
あり、詳しくは、好熱性細菌に由来し、特定の標的遺伝
子を活性化し、標的遺伝子の支配下にある構造遺伝子の
発現を増強せしむる性質を有する活性化因子、該活性化
因子をコードする遺伝子若しくはその発現に関与する周
辺の遺伝子、及び活性化因子の標的遺伝子並びにこれら
を用いて有用生理活性物質を製造する方法に関するもの
である。
[従来の技術] 遺伝子組換え技術を用いて有用生理活性物質(以下有用
物質と呼ぶ)を生産する際、有用物質の生産に関係のあ
る遺伝子の発現を制御する方法が重要な意味を持つ。即
ち、大量の有用物質を生産する組換え菌を充分な栄養源
を含む培地中で培養すると、有用物質の生産が組換え菌
の増殖を阻害するため、組換え菌の菌体量が低いレベル
でとどまり最終的な有用物質の生産量も低いレベルとな
る。これに対し、有用物質の生産に関係のある遺伝子の
発現を制御する方法を用いれば(具体的には、培養初期
には遺伝子の発現を抑えて組換え菌の増殖を阻害しない
状態とし、組換え菌の増殖が収まってから遺伝子を発現
させれば)最終的な有用物質の生産量を高いレベルにす
ることが可能となる。
遺伝子の発現を制御する方法としては、正の制御と負の
制御に大きく分けることがでと、前者の制御方法は、正
因子が存在すると発現が活性化され、正因子が存在しな
いと発現が活性化されないことに基づくものであり、後
者の制御方法は負因子が存在すると発現が制御され、負
因子が存在しないと発現が脱抑制されることに基づくも
のであ゛る。
現在、遺伝子組換え技術を用いた有用物質の生産は大腸
菌を宿主とする系と枯草菌を宿主とする系で広く研究が
行われており、有用物質の生産に関係のある遺伝子の発
現を制御する方法としては、lacプロモーターの制御
の利用[Gena 33゜103 (1985)] 、
 tacプロモーターの制御の利用[Proc、Nat
l、Acad、Sci、USA 80.21(1983
)] 、ラムダファージの左方プロモーターの制御の利
用[Gene、17,451(1982) ] 、 t
rpプロモーターの制御の利用[Gene 20.23
1(1982) ]などがあげられる。
[発明が解決しようとする課題] しかしながら、これらの方法はすべて負の制御の利用で
あり、正の制御を利用した方法は見当らない、さらに、
これらの方法は遺伝子の発現を脱抑制するために誘導物
質を培養液中に添加したり、培養温度を変化させる必要
があり、工業レベルで有用物質を生産する際には欠点と
なる。
[課題を解決する為の手段] 本発明の活性化因子、活性化因子遺伝子及びその標的遺
伝子は正の制御機構を形成するものであり、正の制御を
利用して有用物質の生産に関係のある遺伝子の発現を制
御する方法を提供するものである。さらに、本発明の標
的遺伝子の支配下にある構造遺伝子は培養後期に(すな
わち、組換え菌の増殖が収まってから)発現するため、
本発明の形質転換体を利用した有用物質生産方法では誘
導物質を培養液中に添加したり、培養温度を変化させる
必要がないという利点を有する。
[作用] 本発明の活性化因子遺伝子及び標的遺伝子は好熱性細菌
、詳しくはBacillus 5tearother+
++ophi−1usに由来するものであり、Baci
llus 5tearo−therIIlophi l
usのプロテアーゼ遺伝子を枯草菌、すなわちBaci
llus 5ubtillsとそのベクタープラスミド
pT853[J、Bacteriol、、146.10
91−1097(1981)]の系を利用してクローニ
ングした際に同時に得られたものである。但し、本発明
は上記取得方法に何ら限定されるものではなく、好熱性
細菌に由来し、特定の標的遺伝子を活性化し、標的遺伝
子の支配下にある構造遺伝子の発現を増強せしむる性質
を有する活性化因子をコードする遺伝子とその発現に関
与する周辺の遺伝子、及び活性化因子の標的遺伝子であ
れば、いかなる方法で所得してもかまわない。
以下、本発明を実施例により説明する。
なお以下の実施例において本発明の活性化因子をAMP
 と略称する。
[実施例] (1) AMP遺伝子及びその標的遺伝子の取得AMP
をコードする遺伝子とその発現に関与する周辺の遺伝子
及びAMPの標的遺伝子は次のようにして取得した。
(1) Bacillus stearothermo
philusの染色体[INAの分離・精製 Bacillus stearothermophil
us 置NE(FERM P−9439)をL培地(1
%バクト・トリプトン、0.5%バクト・イースト・エ
キストラクト、0.5%NaC1,NaOHでpl(7
,2に調整) 100 ml中、55℃に対数増殖期後
期まで培養し、菌体な集めた。得られた菌体を、15d
クエン酸3ナトリウムを含む0.15M NaC110
IIllに懸濁後、8.OOOrpm、  5分間、4
℃で遠心分離し集菌した。次に菌体を1mMEDTA、
20%シュークロースを含む50mMトリス−塩酸緩衝
液(pH7,6)  10mlに溶解し、looII1
g/mlのリゾチーム溶液を1ml添加し、37℃にて
10分間処理後、1%ラウロイルサルコシン酸を含む0
、IM EDTA溶液(pH9,6)を22m1添加し
た。モして13600/mlのプロナーゼを1ml添加
し、50℃にて溶液が透明になるまで処理後、粘度の比
較的低い部分を分取し、臭化エチジウム溶液(臭化エチ
ジウム100 mg、ジメチル・サルフオキシド0.5
1、脱イオン水9.5IIll)を101に対して0.
5mlml添加後、塩化セシウムを10g添加、溶解し
た。この溶解液を38,000rpa+、 40時間、
18℃で超遠心分離し、生じたDNAのバンドを集め、
n−ブタノール抽出によって臭化エチジウムを除去した
後、TEバアッフy−[0,1mM EDTA  10
mMトリス塩酸液(pH7,5)]で−晩透析する事に
よってBacillus stearothermop
hilus 置NE (FERM P−9439)の純
粋な染色体DNAを得ることができた。
(2)ベクタープラスミドpTB53の分離精製pTB
53を保持するBacillus 5ubtilis 
MT−2[J、Bacteriol、 、 154.8
31−837 (1983) ]をテトラサイタリン2
5μg/l、カナマイシン4μg/m 1を含むL培地
100nl中、37℃にて対数増殖期後期まで培養し、
菌体を集めた。得られた菌体を5011のl液[リゾチ
ーム5mg/ml 、  50mMグルコース、10m
M EDTAを含む25ff1Mトリスー塩酸液(pH
8,0) ]に懸濁し、37℃で30分間静置した。続
いて水中で5分間静置し、10m1のii液(0,2N
 Na0)I 。
1%ラウリル硫酸ナトリウム)を加え、水中で10分間
静置後、7.5mlのIII液[3M酢酸ナトリウム(
pH4,8) ]を加え、水中で15分間静置した。1
6,000rpI11.20分間、4℃で遠心抜上澄液
と12+nlイソプロピルアルコールとを混合し、室温
で15分間放置し、続いて10,000rpm、30分
間、18℃で遠心後、ベレットを70%エタノールでリ
ンスし、真空乾燥を行なった後6n+1の50mMED
T八を含む50a+M)リス−塩酸緩衝液(pH8,0
)に溶解した。この溶解液と5.9gの塩化セシウム。
0.31111の臭化エチジウム溶液とを混合し、38
,000rpm、40時間、18℃で超遠心を行い、生
じたプラスミドI)Nへのバンドを集めn−ブタノール
抽出によって臭化エチジウムを除去した後、TEバアッ
ファーで一晩透析することによって純粋なpTB53を
得ることができた。
(3)ショットガン・クローニング 上記(2)で得られたベクタープラスミドpTB531
0μgを制限酵素Baa+HI  (東洋紡製)にて完
全に分解したものと、上記(1)で得られた染色体DN
A30mgを制限酵素5au3AIにて部分的に分解し
たものとを混合し、i n+M ATPおよび5mMジ
チオスレイトールの存在下に1011の74DNAリガ
ーゼ(東洋紡製)を用いて16時間、15℃でDNA!
lの連結反応を行った。
次に、上記反応液を用いて、Journal of B
ac−teriology 81.41〜46(196
1)に示されたコンピテント・セル法にてBacill
us 5ubtilis MT−2を形質転換し、カゼ
イン1%、テトラサイクリン25μg/l、カナマイシ
ン4μgeIll及び寒天1.5%を含むし培地上に広
げた。30℃、1日間でコロニーを形成させ、プロテア
ーゼの分泌によりコロニーの周囲に形成されるハローに
よってプロテアーゼ遺伝子DNAを含む形質転換体を選
択した。
こうして得たプロテアーゼ遺伝子DNAを含む組換え体
プラスミドpSP53にはpTB53のBamHIサイ
トに約18kbpのDNAが挿入されていた。
(4)へMP遺伝子及びその標的遺伝子の同定(3)で
得られたpsP53を各種制限酵素による分解反応及び
T4DN^リガーゼによる連結反応を利用して、或はE
scherichia coltのベクタープラスミド
pHc19 (東洋紡製)を利用することによって、第
1図に示される様々なサイズのプラスミドを作成した。
そして、これらのプラスミドを保持するBacillu
s 5ubtilis MT−2を25+nlのL培地
にて12時間、37℃で培養し、上澄液のプロテアーゼ
活性を測定したところ、第1表に示される結果となった
プラスミドpsP135を保持するBacilluss
ubtilis MT−2及びプラスミドpsp 16
4を保持するBacillus 5ubtllis M
T−2は、プラスミドpsP53を保持するBacll
lus 5ubtilis MT−2と同等の活性を示
し、プラスミドpsP16を保持するBacillus
subtills MT−2の約5倍の活性値であった
。従ってpsP 53. psP135. psP16
4内に共通に存在し、pspHi内には存在しない様な
、制限酵素EcoT22Iのフラグメント(約2.0k
bp)に活性を増強する因子、すなわち活性化因子がコ
ードされている可能性があると考えられた。またpsP
164のEcoT221フラグメントを逆向きにつなぎ
変えたpsP146.同じ(EcoT221 フラグメ
ントをプラスミド上の別の位置につなぎ変えたpSPT
2 、 psPTll (両者はEcoT221フラグ
メントの向きが逆である)をそれぞれ保持するBaci
llus 5ubtilis MT−2の活性もpsP
16を保持するBacillus 5ubtilis 
MT−2の活性の約5倍であったこと、及びEcoT2
2IフラグメントのみがベクタープラスミドpTB53
につながれたpETB53を保持するBacillus
 5ubtllls MT−2は活性を示さなかったこ
とより、EcoT221 フラグメントにはプロテアー
ゼ活性を有する酵素の遺伝子が存在するのではなく、ト
ランスに働き、プロテアーゼ活性を増強する因子、すな
わち活性化因子の遺伝子が存在することが明らかとなっ
た。
次に、活性化因子の標的を固定することを試みた。まず
、psP16内に存在するプロテアーゼ遺伝子及びその
発現に関与する上流域の遺伝子の塩基配列をM13シー
ケンシングキット(東洋紡製)及び[α−”P]dCT
P(アマ−ジャム社製)を用いて、Proc、Natl
、^cad、sci、USA 74.5483 (19
77年)記載のサンガーらのダイデオキシチエインター
ミネーション法により決定した。そして塩基配列より求
まる制限酵素部位を利用して第1図に示される様にpU
P78よりpUPD25を作成し、さらにpUPD25
とpsP125よりpsPFloを作成した。
前記第1表に同時に示した様に、psPFloを保持す
るBacillus 5ubtilis MT−2は活
性を有しないことから、psP16内に存在し且つps
PFlo内には存在しない様な、プロテアーゼ遺伝子上
流域のSspI−EcoT 22Iフラグメント(約0
.1kbp)にプロテアーゼ遺伝子の発現に関与する遺
伝子(即ちプロテアーゼ遺伝子のプロモーター)が存在
することが明らかとなった。また、psPFloにEc
oT221フラグメントをつないだプラスミドpsPF
lO−El 、psPFlo−E2(両者はEcoT2
2Iフラグメントの向きが逆である)を保持するBac
illus 5ubtilis MT−2も活性を示さ
なかったことより、EcoT221フラグメントにコー
ドされている活性化因子の標的も5spl−EcoT2
2rフラグメントに存在している可能性があると考えら
れた。
そこで、pSPFlo及びpSP16のプロテアーゼ遺
伝子の上流に他のプロモーターを含むフラグメントをつ
なぐことにより、様々なプラスミドを作成し、さらにこ
れらのプラスミドにEcoT221フラグメントをつな
いだプラスミドも作成し、それぞれのプラスミドを保持
するBacillus 5ubtilis MT−2の
プロテアーゼ活性を第1表と同様の方法で測定したとこ
ろ、第2表に示される結果となった。
psPFlo−R34(MT−2の染色体DNA由来の
プロモーターを含むフラグメントを有する) 、pSP
Flo−αl[ベクタープラスミドpl(Y300PL
K (東洋紡製)にコードされている複製蛋白質Rep
−α1のプロモーターを含むフラグメントを有する]を
それぞれ保持するMT−2はpSPFlo−R34ET
(psPFlo−R34にEcoT221フラグメント
をつないだプラスミド)、psPFlO−αI ET(
1)SPFIO−αlにEcoT221 フラグメント
をつないだプラスミド)をそれぞれ保持するBacil
lus 5ubtNis MT−2と同等の活性を示し
、活性の増強は見られなかったことより、活性化因子(
AMP)の標的は5spl−EcoT221フラグメン
トにあることが明らかとなった。またpsP16−α1
は、Rep−α1のプロモーターを含むフラグメントを
pSP16の5spl−EcoT221フラグメントの
上流につないだプラスミドであるが、これを保持するB
acillussubtilis MT−2の活性に対
し、psP16−a IET(psP16−α1にEc
oT22Iフラグメントをつないだプラスミド)を保持
するBacillus 5ubtilis MT−2の
活性は、約2.2倍と増加の割合が低かった。これはA
MPが5spI−EcoT22Iフラグメントの標的遺
伝子に作用し、同フラグメントに存在するプロモーター
のみを選択的に活性化するためであると考えられた。
(5) AMP遺伝子及びその標的遺伝子の塩基配列上
記(4)で同定されたAMP遺伝子を含むEcoT22
Iフラグメントの塩基配列を、^PPLIED BIO
−5YSTEMS、INC,の蛍光ブライマー及びDN
Aシーケンサ−370八を用いて、ダイブオシチエイン
ターミネーション法により決定した。その結果AMP遺
伝子を含むEcoT22Iフラグメントの塩基配列は第
2図に示されるものであった。またAMPの標的遺伝子
を含む5spI−EcoT221フラグメントの塩基配
列は、上記(4)でプロテアーゼ遺伝子の発現に関与す
る上流域の遺伝子の中に含まれており、図3に示される
ものであった。尚第2.3図中Aはアデニン、Tはチミ
ン、Gはグアニン、Cはシトシンを夫々示す。
(6) AMPのアミノ酸配列 上記(5)で決定された塩基配列からEcoT22Iフ
ラグメントに存在するオーブンリーディングフレームを
検索したところ、100アミノ酸残基以上の蛋白質をコ
ードするオーブンリーディングフレームが唯ひとつ存在
することが判明した。このオーブンリーディングフレー
ムが八MPのものであるかどうかを以下の方法で調べた
まずこのオーブンリーディングフレームが実際にBac
illus 5ubtilis内で転写、′翻訳されて
いるかどうかを見るため、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
との融合遺伝子の作成を試みた。ベクタープラスミドp
HY300PLに(東洋紡製)の5fflal−Eco
R1間にEcoT221フラグメントをサブクローニン
グしたプラスミド911YET3を作成し、これをオー
プンリーディングフレーム内にその切断部位が存在する
制限酵素Cfr101 (東洋紡製)で分解し、Kle
nowFragment(東洋紡製)で末端を平滑化後
ざらにPstlで分解した。これとβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝転子合ベクターpMC1871(ファルマシア社
製)を5eal及びPstlで分解したものとを混合、
リガーゼ反応を行い、反応液でBacillus 5u
btllis MT−2をコンピテントセル法にて形質
転換し、得られた形質転換体が保持するプラスミドを調
べたことにより、オーブンリーディングフレームとβ−
ガラクトシダーゼの融合遺伝子を持つプラスミドpET
LAC2を作成することができた(第4図参照)。
pETLAC2の融合遺伝子は融合蛋白質をコードして
おり、アミノ末端側の178アミノ酸残基がオーブンリ
ーディングフレームのアミノ末端側に由来し、カルボキ
シル末端側の1016アミノ酸残基がβ−ガラクトシダ
ーゼのカルボキシル末端側に由来しているため、オーブ
ンリーディングフレームがBacillus 5ubt
ilis内で転写、翻訳されるのであれば、pETLA
C2を保持するBacillus 5ubtilisは
β−ガラクトシダーゼ活性を有することになる。
本発明者らの実験によると、pETLAC2を保持する
Bacillus 5ubtllis MT−2はベク
タープラスミドpHY300PLにを保持するBaci
llus 5ubtilis MT−2と異なり、40
μlの2%5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリル−
β−D−ガラクトシド溶液(溶媒はジメチルフォルムア
ミド)を含んだし寒天培地上で青色コロニーを形成し、
明らかにβ−ガラクトシダーゼ活性を有しているため、
オーブンリーディングフレームがBacillus 5
ub−tilis内で転写、翻訳されていることが確認
された。
次に、このオーブンリーディングフレームにコードされ
た蛋白質がAMPであるかどうかを見るため、EcoT
22Iフラグメントをその内部に存在する制限酵素部位
を利用して小型化、或は塩基の欠失を作ることにより種
々のフラグメントを作成し、これらのフラグメントがA
MP遺伝子を含んでいるかどうかをプロテアーゼ活性の
測定により調べた。
その結果は第5図に示す通りでオーブンリーディングフ
レーム及びその発現に関与する上流の遺伝子を完全に含
むRan III−EcoT22Iフラグメントのみが
プロテアーゼ活性を増強し、オーブンリーディングフレ
ーム及びその発現に関与する上流の遺伝子を完全に含ま
ない他のどのフラグメントもプロテアーゼ活性を増強し
ないことが分かった。
また、EcoT22Iフラグメントをオーブンリーディ
ングフレーム内のPvu1部位で分解し、Mung  
BeanNuclease (東洋紡製)で処理するこ
とにより、2塩基の欠失を生じさせたフラグメント(欠
失によってオーブンリーディングフレームはフレームシ
フトを起こしている)もプロテアーゼ活性を増強しなか
った。これらのことからオーブンリーディングフレーム
にコードされた蛋白質がAMPであることが明らかとな
った。
塩基配列より推定されるAMPのアミノ酸配列は第6図
に示されるものであった。
尚図中Aはアラニン、Cはシスティン、Dはアスパラギ
ン酸%Eはグルタミン酸、Fはフェニルアラニン、Gは
グリシン、Hはヒスチジン、■はイソロイシン、Kはリ
ジン、Lはロイシン、Mはメチオニン、Nはアスパラギ
ン、Qはグルタミン、Rはアルギニン、Sはセリン、T
はトレオニン、■はバリン、Yはチロシンを夫々示す。
[発明の効果] 本発明を用いて有用物質の生産に関与する遺伝子の発現
を制御すれば、有用物質を効率よく製造することが可能
となる。
【図面の簡単な説明】
第1図はpsP53由来の派生プラスミドの構築手順を
示すフローチャート、第2図は活性化因子遺伝子を含む
EcoT221フラグメントの塩基配列を示す図、第3
図は活性化因子の標的遺伝子を含む5spI−EcoT
221フラグメントの塩基配列を示す図、第4図はpE
TLAC2の制限部位・機能地図を示す図、第5図は活
性因子遺伝子を含むEcoT22Iフラグメントの小型
化、欠失による活性化因子の限定結果を示す図、第6図
は活性化因子のアミノ酸配列を示す図である。

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. (1)好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
    活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
    造遺伝子の転写を増強させる性質を有する活性化因子。
  2. (2)好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
    活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
    造遺伝子の転写を増強させる性質を有する活性化因子を
    コードする遺伝子。
  3. (3)好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
    活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
    造遺伝子の転写を増強させる性質を有する転写活性化因
    子をコードする遺伝子及び標的遺伝子を含む遺伝子並び
    に構造遺伝子を含む組換えプラスミド。
  4. (4)好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
    活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
    造遺伝子の転写を増強させる性質を有する転写活性化因
    子をコードする遺伝子、及び標的遺伝子を含む遺伝子並
    びに構造遺伝子を含む組換えプラスミドにて細菌宿主を
    形質転換した形質転換体。
  5. (5)好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
    活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
    造遺伝子の転写を増強させる性質を有する転写活性化因
    子をコードする遺伝子、及び標的遺伝子を含む遺伝子並
    びに構造遺伝子を含む組換えプラスミドにて細菌宿主を
    形質転換した形質転換体を栄養培地にて培養し、該培養
    物から有用生理活性物質を生産することを特徴とする有
    用生理活性物質の生産方法。
  6. (6)好熱性細菌に由来する標的遺伝子を含む遺伝子。
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