JPH03108495A - 活性化因子及び活性化因子遺伝子並びに有用生理活性物質の生産方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は活性化因子、活性化因子遺伝子及びその標的遺
伝子並びに有用生理活性物質の生産方法に関するもので
あり、詳しくは、好熱性細菌に由来し、特定の標的遺伝
子を活性化し、標的遺伝子の支配下にある構造遺伝子の
発現を増強せしむる性質を有する活性化因子、該活性化
因子をコードする遺伝子若しくはその発現に関与する周
辺の遺伝子、及び活性化因子の標的遺伝子並びにこれら
を用いて有用生理活性物質を製造する方法に関するもの
である。

［従来の技術］ 遺伝子組換え技術を用いて有用生理活性物質（以下有用
物質と呼ぶ）を生産する際、有用物質の生産に関係のあ
る遺伝子の発現を制御する方法が重要な意味を持つ。即
ち、大量の有用物質を生産する組換え菌を充分な栄養源
を含む培地中で培養すると、有用物質の生産が組換え菌
の増殖を阻害するため、組換え菌の菌体量が低いレベル
でとどまり最終的な有用物質の生産量も低いレベルとな
る。これに対し、有用物質の生産に関係のある遺伝子の
発現を制御する方法を用いれば（具体的には、培養初期
には遺伝子の発現を抑えて組換え菌の増殖を阻害しない
状態とし、組換え菌の増殖が収まってから遺伝子を発現
させれば）最終的な有用物質の生産量を高いレベルにす
ることが可能となる。

遺伝子の発現を制御する方法としては、正の制御と負の
制御に大きく分けることがでと、前者の制御方法は、正
因子が存在すると発現が活性化され、正因子が存在しな
いと発現が活性化されないことに基づくものであり、後
者の制御方法は負因子が存在すると発現が制御され、負
因子が存在しないと発現が脱抑制されることに基づくも
のであ゛る。

現在、遺伝子組換え技術を用いた有用物質の生産は大腸
菌を宿主とする系と枯草菌を宿主とする系で広く研究が
行われており、有用物質の生産に関係のある遺伝子の発
現を制御する方法としては、ｌａｃプロモーターの制御
の利用［Ｇｅｎａ　３３゜１０３　（１９８５）］　、
　ｔａｃプロモーターの制御の利用［Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ　８０．２１（１９８３
）］　、ラムダファージの左方プロモーターの制御の利
用［Ｇｅｎｅ、１７，４５１（１９８２）　］　、　ｔ
ｒｐプロモーターの制御の利用［Ｇｅｎｅ　２０．２３
１（１９８２）　］などがあげられる。

［発明が解決しようとする課題］ しかしながら、これらの方法はすべて負の制御の利用で
あり、正の制御を利用した方法は見当らない、さらに、
これらの方法は遺伝子の発現を脱抑制するために誘導物
質を培養液中に添加したり、培養温度を変化させる必要
があり、工業レベルで有用物質を生産する際には欠点と
なる。

［課題を解決する為の手段］ 本発明の活性化因子、活性化因子遺伝子及びその標的遺
伝子は正の制御機構を形成するものであり、正の制御を
利用して有用物質の生産に関係のある遺伝子の発現を制
御する方法を提供するものである。さらに、本発明の標
的遺伝子の支配下にある構造遺伝子は培養後期に（すな
わち、組換え菌の増殖が収まってから）発現するため、
本発明の形質転換体を利用した有用物質生産方法では誘
導物質を培養液中に添加したり、培養温度を変化させる
必要がないという利点を有する。

［作用］ 本発明の活性化因子遺伝子及び標的遺伝子は好熱性細菌
、詳しくはＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏｔｈｅｒ＋
＋＋ｏｐｈｉ−１ｕｓに由来するものであり、Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｔｅａｒｏ−ｔｈｅｒＩＩｌｏｐｈｉ　ｌ
ｕｓのプロテアーゼ遺伝子を枯草菌、すなわちＢａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｌｓとそのベクタープラスミド
ｐＴ８５３［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、、１４６．１０
９１−１０９７（１９８１）］の系を利用してクローニ
ングした際に同時に得られたものである。但し、本発明
は上記取得方法に何ら限定されるものではなく、好熱性
細菌に由来し、特定の標的遺伝子を活性化し、標的遺伝
子の支配下にある構造遺伝子の発現を増強せしむる性質
を有する活性化因子をコードする遺伝子とその発現に関
与する周辺の遺伝子、及び活性化因子の標的遺伝子であ
れば、いかなる方法で所得してもかまわない。

以下、本発明を実施例により説明する。

なお以下の実施例において本発明の活性化因子をＡＭＰ
　と略称する。

［実施例］ （１）　ＡＭＰ遺伝子及びその標的遺伝子の取得ＡＭＰ
をコードする遺伝子とその発現に関与する周辺の遺伝子
及びＡＭＰの標的遺伝子は次のようにして取得した。

（１）　Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏ
ｐｈｉｌｕｓの染色体［ＩＮＡの分離・精製 Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌ
ｕｓ　置ＮＥ（ＦＥＲＭ　Ｐ−９４３９）をＬ培地（１
％バクト・トリプトン、０．５％バクト・イースト・エ
キストラクト、０．５％ＮａＣ１，ＮａＯＨでｐｌ（７
，２に調整）　１００　ｍｌ中、５５℃に対数増殖期後
期まで培養し、菌体な集めた。得られた菌体を、１５ｄ
クエン酸３ナトリウムを含む０．１５Ｍ　ＮａＣ１１０
ＩＩｌｌに懸濁後、８．ＯＯＯｒｐｍ、　　５分間、４
℃で遠心分離し集菌した。次に菌体を１ｍＭＥＤＴＡ、
２０％シュークロースを含む５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（ｐＨ７，６）　　１０ｍｌに溶解し、ｌｏｏＩＩ１
ｇ／ｍｌのリゾチーム溶液を１ｍｌ添加し、３７℃にて
１０分間処理後、１％ラウロイルサルコシン酸を含む０
、ＩＭ　ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ９，６）を２２ｍ１添加し
た。モして１３６００／ｍｌのプロナーゼを１ｍｌ添加
し、５０℃にて溶液が透明になるまで処理後、粘度の比
較的低い部分を分取し、臭化エチジウム溶液（臭化エチ
ジウム１００　ｍｇ、ジメチル・サルフオキシド０．５
１、脱イオン水９．５ＩＩｌｌ）を１０１に対して０．
５ｍｌｍｌ添加後、塩化セシウムを１０ｇ添加、溶解し
た。この溶解液を３８，０００ｒｐａ＋、　４０時間、
１８℃で超遠心分離し、生じたＤＮＡのバンドを集め、
ｎ−ブタノール抽出によって臭化エチジウムを除去した
後、ＴＥバアッフｙ−［０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ　　１０
ｍＭトリス塩酸液（ｐＨ７，５）］で−晩透析する事に
よってＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐ
ｈｉｌｕｓ　置ＮＥ　（ＦＥＲＭ　Ｐ−９４３９）の純
粋な染色体ＤＮＡを得ることができた。

（２）ベクタープラスミドｐＴＢ５３の分離精製ｐＴＢ
５３を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　
ＭＴ−２［Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　、　１５４．８
３１−８３７　（１９８３）　］をテトラサイタリン２
５μｇ／ｌ、カナマイシン４μｇ／ｍ　１を含むＬ培地
１００ｎｌ中、３７℃にて対数増殖期後期まで培養し、
菌体を集めた。得られた菌体を５０１１のｌ液［リゾチ
ーム５ｍｇ／ｍｌ　、　　５０ｍＭグルコース、１０ｍ
Ｍ　ＥＤＴＡを含む２５ｆｆ１Ｍトリスー塩酸液（ｐＨ
８，０）　］に懸濁し、３７℃で３０分間静置した。続
いて水中で５分間静置し、１０ｍ１のｉｉ液（０，２Ｎ
　Ｎａ０）Ｉ　。

１％ラウリル硫酸ナトリウム）を加え、水中で１０分間
静置後、７．５ｍｌのＩＩＩ液［３Ｍ酢酸ナトリウム（
ｐＨ４，８）　］を加え、水中で１５分間静置した。１
６，０００ｒｐＩ１１．２０分間、４℃で遠心抜上澄液
と１２＋ｎｌイソプロピルアルコールとを混合し、室温
で１５分間放置し、続いて１０，０００ｒｐｍ、３０分
間、１８℃で遠心後、ベレットを７０％エタノールでリ
ンスし、真空乾燥を行なった後６ｎ＋１の５０ｍＭＥＤ
Ｔ八を含む５０ａ＋Ｍ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ８，０
）に溶解した。この溶解液と５．９ｇの塩化セシウム。

０．３１１１１の臭化エチジウム溶液とを混合し、３８
，０００ｒｐｍ、４０時間、１８℃で超遠心を行い、生
じたプラスミドＩ）Ｎへのバンドを集めｎ−ブタノール
抽出によって臭化エチジウムを除去した後、ＴＥバアッ
ファーで一晩透析することによって純粋なｐＴＢ５３を
得ることができた。

（３）ショットガン・クローニング 上記（２）で得られたベクタープラスミドｐＴＢ５３１
０μｇを制限酵素Ｂａａ＋ＨＩ　　（東洋紡製）にて完
全に分解したものと、上記（１）で得られた染色体ＤＮ
Ａ３０ｍｇを制限酵素５ａｕ３ＡＩにて部分的に分解し
たものとを混合し、ｉ　ｎ＋Ｍ　ＡＴＰおよび５ｍＭジ
チオスレイトールの存在下に１０１１の７４ＤＮＡリガ
ーゼ（東洋紡製）を用いて１６時間、１５℃でＤＮＡ！
ｌの連結反応を行った。

次に、上記反応液を用いて、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂ
ａｃ−ｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　８１．４１〜４６（１９６
１）に示されたコンピテント・セル法にてＢａｃｉｌｌ
ｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２を形質転換し、カゼ
イン１％、テトラサイクリン２５μｇ／ｌ、カナマイシ
ン４μｇｅＩｌｌ及び寒天１．５％を含むし培地上に広
げた。３０℃、１日間でコロニーを形成させ、プロテア
ーゼの分泌によりコロニーの周囲に形成されるハローに
よってプロテアーゼ遺伝子ＤＮＡを含む形質転換体を選
択した。

こうして得たプロテアーゼ遺伝子ＤＮＡを含む組換え体
プラスミドｐＳＰ５３にはｐＴＢ５３のＢａｍＨＩサイ
トに約１８ｋｂｐのＤＮＡが挿入されていた。

（４）へＭＰ遺伝子及びその標的遺伝子の同定（３）で
得られたｐｓＰ５３を各種制限酵素による分解反応及び
Ｔ４ＤＮ＾リガーゼによる連結反応を利用して、或はＥ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｔのベクタープラスミド
ｐＨｃ１９　（東洋紡製）を利用することによって、第
１図に示される様々なサイズのプラスミドを作成した。

そして、これらのプラスミドを保持するＢａｃｉｌｌｕ
ｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２を２５＋ｎｌのＬ培地
にて１２時間、３７℃で培養し、上澄液のプロテアーゼ
活性を測定したところ、第１表に示される結果となった
。

プラスミドｐｓＰ１３５を保持するＢａｃｉｌｌｕｓｓ
ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２及びプラスミドｐｓｐ　１６
４を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｌｌｉｓ　Ｍ
Ｔ−２は、プラスミドｐｓＰ５３を保持するＢａｃｌｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２と同等の活性を示
し、プラスミドｐｓＰ１６を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｌｓ　ＭＴ−２の約５倍の活性値であった
。従ってｐｓＰ　５３．　ｐｓＰ１３５．　ｐｓＰ１６
４内に共通に存在し、ｐｓｐＨｉ内には存在しない様な
、制限酵素ＥｃｏＴ２２Ｉのフラグメント（約２．０ｋ
ｂｐ）に活性を増強する因子、すなわち活性化因子がコ
ードされている可能性があると考えられた。またｐｓＰ
１６４のＥｃｏＴ２２１フラグメントを逆向きにつなぎ
変えたｐｓＰ１４６．同じ（ＥｃｏＴ２２１　フラグメ
ントをプラスミド上の別の位置につなぎ変えたｐＳＰＴ
２　、　ｐｓＰＴｌｌ　（両者はＥｃｏＴ２２１フラグ
メントの向きが逆である）をそれぞれ保持するＢａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２の活性もｐｓＰ
１６を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　
ＭＴ−２の活性の約５倍であったこと、及びＥｃｏＴ２
２ＩフラグメントのみがベクタープラスミドｐＴＢ５３
につながれたｐＥＴＢ５３を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ
　５ｕｂｔｌｌｌｓ　ＭＴ−２は活性を示さなかったこ
とより、ＥｃｏＴ２２１　フラグメントにはプロテアー
ゼ活性を有する酵素の遺伝子が存在するのではなく、ト
ランスに働き、プロテアーゼ活性を増強する因子、すな
わち活性化因子の遺伝子が存在することが明らかとなっ
た。

次に、活性化因子の標的を固定することを試みた。まず
、ｐｓＰ１６内に存在するプロテアーゼ遺伝子及びその
発現に関与する上流域の遺伝子の塩基配列をＭ１３シー
ケンシングキット（東洋紡製）及び［α−”Ｐ］ｄＣＴ
Ｐ（アマ−ジャム社製）を用いて、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、＾ｃａｄ、ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．５４８３　（１９
７７年）記載のサンガーらのダイデオキシチエインター
ミネーション法により決定した。そして塩基配列より求
まる制限酵素部位を利用して第１図に示される様にｐＵ
Ｐ７８よりｐＵＰＤ２５を作成し、さらにｐＵＰＤ２５
とｐｓＰ１２５よりｐｓＰＦｌｏを作成した。

前記第１表に同時に示した様に、ｐｓＰＦｌｏを保持す
るＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２は活
性を有しないことから、ｐｓＰ１６内に存在し且つｐｓ
ＰＦｌｏ内には存在しない様な、プロテアーゼ遺伝子上
流域のＳｓｐＩ−ＥｃｏＴ　２２Ｉフラグメント（約０
．１ｋｂｐ）にプロテアーゼ遺伝子の発現に関与する遺
伝子（即ちプロテアーゼ遺伝子のプロモーター）が存在
することが明らかとなった。また、ｐｓＰＦｌｏにＥｃ
ｏＴ２２１フラグメントをつないだプラスミドｐｓＰＦ
ｌＯ−Ｅｌ　、ｐｓＰＦｌｏ−Ｅ２（両者はＥｃｏＴ２
２Ｉフラグメントの向きが逆である）を保持するＢａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２も活性を示さ
なかったことより、ＥｃｏＴ２２１フラグメントにコー
ドされている活性化因子の標的も５ｓｐｌ−ＥｃｏＴ２
２ｒフラグメントに存在している可能性があると考えら
れた。

そこで、ｐＳＰＦｌｏ及びｐＳＰ１６のプロテアーゼ遺
伝子の上流に他のプロモーターを含むフラグメントをつ
なぐことにより、様々なプラスミドを作成し、さらにこ
れらのプラスミドにＥｃｏＴ２２１フラグメントをつな
いだプラスミドも作成し、それぞれのプラスミドを保持
するＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２の
プロテアーゼ活性を第１表と同様の方法で測定したとこ
ろ、第２表に示される結果となった。

ｐｓＰＦｌｏ−Ｒ３４（ＭＴ−２の染色体ＤＮＡ由来の
プロモーターを含むフラグメントを有する）　、ｐＳＰ
Ｆｌｏ−αｌ［ベクタープラスミドｐｌ（Ｙ３００ＰＬ
Ｋ　（東洋紡製）にコードされている複製蛋白質Ｒｅｐ
−α１のプロモーターを含むフラグメントを有する］を
それぞれ保持するＭＴ−２はｐＳＰＦｌｏ−Ｒ３４ＥＴ
（ｐｓＰＦｌｏ−Ｒ３４にＥｃｏＴ２２１フラグメント
をつないだプラスミド）、ｐｓＰＦｌＯ−αＩ　ＥＴ（
１）ＳＰＦＩＯ−αｌにＥｃｏＴ２２１　フラグメント
をつないだプラスミド）をそれぞれ保持するＢａｃｉｌ
ｌｕｓ　５ｕｂｔＮｉｓ　ＭＴ−２と同等の活性を示し
、活性の増強は見られなかったことより、活性化因子（
ＡＭＰ）の標的は５ｓｐｌ−ＥｃｏＴ２２１フラグメン
トにあることが明らかとなった。またｐｓＰ１６−α１
は、Ｒｅｐ−α１のプロモーターを含むフラグメントを
ｐＳＰ１６の５ｓｐｌ−ＥｃｏＴ２２１フラグメントの
上流につないだプラスミドであるが、これを保持するＢ
ａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２の活性に対
し、ｐｓＰ１６−ａ　ＩＥＴ（ｐｓＰ１６−α１にＥｃ
ｏＴ２２Ｉフラグメントをつないだプラスミド）を保持
するＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２の
活性は、約２．２倍と増加の割合が低かった。これはＡ
ＭＰが５ｓｐＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉフラグメントの標的遺
伝子に作用し、同フラグメントに存在するプロモーター
のみを選択的に活性化するためであると考えられた。

（５）　ＡＭＰ遺伝子及びその標的遺伝子の塩基配列上
記（４）で同定されたＡＭＰ遺伝子を含むＥｃｏＴ２２
Ｉフラグメントの塩基配列を、＾ＰＰＬＩＥＤ　ＢＩＯ
−５ＹＳＴＥＭＳ、ＩＮＣ，の蛍光ブライマー及びＤＮ
Ａシーケンサ−３７０八を用いて、ダイブオシチエイン
ターミネーション法により決定した。その結果ＡＭＰ遺
伝子を含むＥｃｏＴ２２Ｉフラグメントの塩基配列は第
２図に示されるものであった。またＡＭＰの標的遺伝子
を含む５ｓｐＩ−ＥｃｏＴ２２１フラグメントの塩基配
列は、上記（４）でプロテアーゼ遺伝子の発現に関与す
る上流域の遺伝子の中に含まれており、図３に示される
ものであった。尚第２．３図中Ａはアデニン、Ｔはチミ
ン、Ｇはグアニン、Ｃはシトシンを夫々示す。

（６）　ＡＭＰのアミノ酸配列 上記（５）で決定された塩基配列からＥｃｏＴ２２Ｉフ
ラグメントに存在するオーブンリーディングフレームを
検索したところ、１００アミノ酸残基以上の蛋白質をコ
ードするオーブンリーディングフレームが唯ひとつ存在
することが判明した。このオーブンリーディングフレー
ムが八ＭＰのものであるかどうかを以下の方法で調べた
。

まずこのオーブンリーディングフレームが実際にＢａｃ
ｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ内で転写、′翻訳されて
いるかどうかを見るため、β−ガラクトシダーゼ遺伝子
との融合遺伝子の作成を試みた。ベクタープラスミドｐ
ＨＹ３００ＰＬに（東洋紡製）の５ｆｆｌａｌ−Ｅｃｏ
Ｒ１間にＥｃｏＴ２２１フラグメントをサブクローニン
グしたプラスミド９１１ＹＥＴ３を作成し、これをオー
プンリーディングフレーム内にその切断部位が存在する
制限酵素Ｃｆｒ１０１　（東洋紡製）で分解し、Ｋｌｅ
ｎｏｗＦｒａｇｍｅｎｔ（東洋紡製）で末端を平滑化後
ざらにＰｓｔｌで分解した。これとβ−ガラクトシダー
ゼ遺伝転子合ベクターｐＭＣ１８７１（ファルマシア社
製）を５ｅａｌ及びＰｓｔｌで分解したものとを混合、
リガーゼ反応を行い、反応液でＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕ
ｂｔｌｌｉｓ　ＭＴ−２をコンピテントセル法にて形質
転換し、得られた形質転換体が保持するプラスミドを調
べたことにより、オーブンリーディングフレームとβ−
ガラクトシダーゼの融合遺伝子を持つプラスミドｐＥＴ
ＬＡＣ２を作成することができた（第４図参照）。

ｐＥＴＬＡＣ２の融合遺伝子は融合蛋白質をコードして
おり、アミノ末端側の１７８アミノ酸残基がオーブンリ
ーディングフレームのアミノ末端側に由来し、カルボキ
シル末端側の１０１６アミノ酸残基がβ−ガラクトシダ
ーゼのカルボキシル末端側に由来しているため、オーブ
ンリーディングフレームがＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔ
ｉｌｉｓ内で転写、翻訳されるのであれば、ｐＥＴＬＡ
Ｃ２を保持するＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓは
β−ガラクトシダーゼ活性を有することになる。

本発明者らの実験によると、ｐＥＴＬＡＣ２を保持する
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｌｌｉｓ　ＭＴ−２はベク
タープラスミドｐＨＹ３００ＰＬにを保持するＢａｃｉ
ｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ　ＭＴ−２と異なり、４０
μｌの２％５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−
β−Ｄ−ガラクトシド溶液（溶媒はジメチルフォルムア
ミド）を含んだし寒天培地上で青色コロニーを形成し、
明らかにβ−ガラクトシダーゼ活性を有しているため、
オーブンリーディングフレームがＢａｃｉｌｌｕｓ　５
ｕｂ−ｔｉｌｉｓ内で転写、翻訳されていることが確認
された。

次に、このオーブンリーディングフレームにコードされ
た蛋白質がＡＭＰであるかどうかを見るため、ＥｃｏＴ
２２Ｉフラグメントをその内部に存在する制限酵素部位
を利用して小型化、或は塩基の欠失を作ることにより種
々のフラグメントを作成し、これらのフラグメントがＡ
ＭＰ遺伝子を含んでいるかどうかをプロテアーゼ活性の
測定により調べた。

その結果は第５図に示す通りでオーブンリーディングフ
レーム及びその発現に関与する上流の遺伝子を完全に含
むＲａｎ　ＩＩＩ−ＥｃｏＴ２２Ｉフラグメントのみが
プロテアーゼ活性を増強し、オーブンリーディングフレ
ーム及びその発現に関与する上流の遺伝子を完全に含ま
ない他のどのフラグメントもプロテアーゼ活性を増強し
ないことが分かった。

また、ＥｃｏＴ２２Ｉフラグメントをオーブンリーディ
ングフレーム内のＰｖｕ１部位で分解し、Ｍｕｎｇ　　
ＢｅａｎＮｕｃｌｅａｓｅ　（東洋紡製）で処理するこ
とにより、２塩基の欠失を生じさせたフラグメント（欠
失によってオーブンリーディングフレームはフレームシ
フトを起こしている）もプロテアーゼ活性を増強しなか
った。これらのことからオーブンリーディングフレーム
にコードされた蛋白質がＡＭＰであることが明らかとな
った。

塩基配列より推定されるＡＭＰのアミノ酸配列は第６図
に示されるものであった。

尚図中Ａはアラニン、Ｃはシスティン、Ｄはアスパラギ
ン酸％Ｅはグルタミン酸、Ｆはフェニルアラニン、Ｇは
グリシン、Ｈはヒスチジン、■はイソロイシン、Ｋはリ
ジン、Ｌはロイシン、Ｍはメチオニン、Ｎはアスパラギ
ン、Ｑはグルタミン、Ｒはアルギニン、Ｓはセリン、Ｔ
はトレオニン、■はバリン、Ｙはチロシンを夫々示す。

［発明の効果］ 本発明を用いて有用物質の生産に関与する遺伝子の発現
を制御すれば、有用物質を効率よく製造することが可能
となる。

【図面の簡単な説明】

第１図はｐｓＰ５３由来の派生プラスミドの構築手順を
示すフローチャート、第２図は活性化因子遺伝子を含む
ＥｃｏＴ２２１フラグメントの塩基配列を示す図、第３
図は活性化因子の標的遺伝子を含む５ｓｐＩ−ＥｃｏＴ
２２１フラグメントの塩基配列を示す図、第４図はｐＥ
ＴＬＡＣ２の制限部位・機能地図を示す図、第５図は活
性因子遺伝子を含むＥｃｏＴ２２Ｉフラグメントの小型
化、欠失による活性化因子の限定結果を示す図、第６図
は活性化因子のアミノ酸配列を示す図である。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
   活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
   造遺伝子の転写を増強させる性質を有する活性化因子。
2. （２）好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
   活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
   造遺伝子の転写を増強させる性質を有する活性化因子を
   コードする遺伝子。
3. （３）好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
   活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
   造遺伝子の転写を増強させる性質を有する転写活性化因
   子をコードする遺伝子及び標的遺伝子を含む遺伝子並び
   に構造遺伝子を含む組換えプラスミド。
4. （４）好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
   活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
   造遺伝子の転写を増強させる性質を有する転写活性化因
   子をコードする遺伝子、及び標的遺伝子を含む遺伝子並
   びに構造遺伝子を含む組換えプラスミドにて細菌宿主を
   形質転換した形質転換体。
5. （５）好熱性細菌に由来し、標的遺伝子を含む遺伝子を
   活性化し、該標的遺伝子を含む遺伝子の支配下にある構
   造遺伝子の転写を増強させる性質を有する転写活性化因
   子をコードする遺伝子、及び標的遺伝子を含む遺伝子並
   びに構造遺伝子を含む組換えプラスミドにて細菌宿主を
   形質転換した形質転換体を栄養培地にて培養し、該培養
   物から有用生理活性物質を生産することを特徴とする有
   用生理活性物質の生産方法。
6. （６）好熱性細菌に由来する標的遺伝子を含む遺伝子。