JPH0269182A - ケトヘキソキナーゼの製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明はケトヘキソキナーゼ（以下、に）ＩＫと略す、
）の製造法に関するものである。

更に詳細には、本発明は、フルクトース培地で生育する
菌をフルクトース培地で培養してＫＨにを生産する方法
に関するものである。

従来、　ＫＨＫは動物起源の酵素として知られており、
微生物による生産は知られていなかった。

本発明によって、にＨＫを微生物によって生産すること
ができるようになったので、本発明は、にＨＫの大量生
産を可能とし、酵素界に大きく貢献するものである。

（従来技術及び問題点） 一般的に、Ｋ）ＩＫ（ＥＣ，２，７，１，３）は次式で
表わされる反応を行う酵素 ＫＨに フルクトース＋ＡＴＰｙ−Ｆ−１−Ｐ＋ＡＤＰとして知
られているが、にＨＫの存在は、高等動物の肝、腎、腸
粘膜、脂肪組織に知られている程度であった。

また、　ＫＨＫの一般的な製法として、ウシの肝臓をＰ
Ｈ５とし、熱処理し、硫安分別し、セファデックスＧ−
１００、ＤＥＡＥ−セルロース％ＣＭ−セルロースクロ
マトの各処理を行って精製する方法（酵素ハンドブック
３３１頁）が知られているが、その操作は煩雑であり、
また得られる酵素もきわめて少量であるに過ぎない。

（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、微生物にＫＨにの給源を求めて鋭意研究
したところ、グルコース培地では生育しにくく、フルク
トース培地でよく生育する菌がにＨＫを生産することを
知ったのである。

本発明は、フルクトース培地で生育する菌をフルクトー
ス含有培地でインキユベー　トすることを特徴とするＫ
ｌ＋にの製造法である。

本発明において、グルコース培地で生育しにくく、フル
クトース培地でよく生育する菌で、Ｋ）ＩＫを生産する
ものの１例として、Ｐｓａｕｄｏｍｏｎａｓ　ＡＭＩ　
−０ＹＡが得られ、この菌株はＦＥＲＭ　Ｐ−１０１５
２として微工研に寄託されている。

次に、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＡＭＩ　−ＯＹＡの菌
学的性質を示す。

■、　ダラム陰性菌である。

２、　０．８μ×２．０μの桿菌で、単鞭毛を有す。

３、運動性あり。

４、　フルクトース寒天培地で、ピンクで、盛り」二つ
だ生育を示し、表面は湿潤１円形で、周辺は円滑なコロ
ニーを形成する。

５、　　ｐＨ６，０〜８．５で生育し、ｐＨ７，０で最
高の生育を示し、ρ１１５．０では生育しない。

６．３０℃で良好な生育を示し、２５℃ではゆるやかな
生育となり、３７℃では生育しない。

７、炭素源の利用（コーザの培地を用い、０．１％によ
る）メタノール、メチルアミン塩酸、　Ｎａフォルメー
ト、エタノール、ラクテート、サクシネート、マレート
、フマレートでよく生育し、グルコース、フルクトース
、アスパルテート５グルタメート、グリコレート、サイ
トレートでゆるやかに生育し、オキザレート、グルタレ
ート、タートレート、アラニン、炭素源を添加しないミ
ネラル培地ではほとんど生育しない。

本発明においては、　Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＡＭＩ
　−ＯＹＡを培養し、菌体を多量取得し、この菌体をフ
ルクトース含有培地で２０〜５０℃、５〜２０時間イン
キュベートすれば、菌体内に多量のＫ）ＩＫが生成する
。

Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＡＭＩ−ＯＹＡの菌体を得る
には、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＡＭＩ　−ＯＹＡの増
殖できるいかなる培地でもよい。例えば、０．２％に、
）ＩＰＯ，、０，２％ＮａＮ０．．０．２％（ＮＨ４）
２Ｓｏい０．１％Ｋ）１２ＰＯい０．０２％ＭｇＳＯ４
・７Ｈ，０，０，０１％酵母エキス（Ｏｒｉａｎｔａｌ
酵母、Ｃｏ）と１％メタノールを含む培地で２５〜４０
℃、２０〜５０時間で連続釣上トウ培養し、大量の菌体
を生産させる。

得られた培養液は遠心処理し１分離湿菌体をフルクトー
ス含有培地に添加し、２５〜４０℃でゆっくり攪拌しつ
つ、１〜３０時間インキュベートし、菌体内にＫＨＫを
生成させる。

得られたインキュベート処理液は、ＫＨＫを含有する菌
体を含んでいるので、例えば、Ｏ，］８ＭＤ−フルクト
ース、１ｍＭＥＤＴＡ、１０ｄ　２−メルカプトエタノ
ール、０．５ａ＋Ｍ　ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ　５ｕ
ｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄａを含んだＰＨ６，８の５
ｍＭ−リン酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ＫＰＢ）に菌体
想濁液として４℃に冷却してＦｒｅｎｃｈｐｒｅｓｓｕ
ｒｅ　ｃｅｌｌ　ｐｒｅｓｓなどにより菌体を破砕し、
得られたホモジネート液は６０，０ＯＯＸ　ｇ以上で遠
心処理し、菌体を分離する。

得られた上清はＤＥＡＥ−セルロースカラムに吸着させ
て、溶出させ、溶出液は透析処理を行い、処理液はブル
ーデキストランセファロースカラムに吸着させ、溶出し
、これを濃縮し、更にセファデックスＧ−１００カラム
に吸着させ、溶出し、溶出液をセファデックスＧ−１０
０ゲル濾過の操作をくり返し、精製を行い、ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動において単一バンドを示すまで精
製されたＫＩＩＫを得ることができる。

本発明の実施例で得られたＫＨＫの理化学的性質は次の
通りである。

１、　次式の反応を行う。

フルクトース＋ＡＴＰｕＦ−１−Ｐ＋八〇Ｐ２、分子量
は６０　、０００で、３０　、０００の分子量をもつ２
つの同一サブユニットから構成される。

３、等電点は焦点電気泳動による測定で４．５である。

４、熱安定性は第１図に示す通りで、７０℃で３０分間
加熱してもほとんど失活はない。

精製酵素液（５＋ｍＭ　ＫＰＢ中、０．１ｍｇ／ｍ　Ｑ
　）が図示の時間で別々に７０℃、８０℃で加熱された
。その加熱された酵素は急速にアイスバスで冷却された
、残存している酵素活性は相対的な酵素活性を示してい
る。

５、ｐＨ安定性は第２図に示す通りで、ｐＨ６〜１０で
きわめて安定である。

６、　ポリアクリルアミドゲル電気泳動と等電点電気泳
動は第３図に示される。

精製酵素（５０μｇ）をポリアクリルアミドゲルに加え
、電気泳動は約２時間３ｍＡ″ｃｐｌ（８，５Ｔｒｉ　
５−ｇｌｙｃｉｎｅで行なわれた。そのゲルカラムはＣ
ｏｍｍａｓｓｉｅ　ｂｒｉｌｌｉａｎｔ　ｂｌｕｅで染
色される。

精製ＫＨＫ（１，２ｍｇ　ＫＨＫ／１０ｍ　Ｑ　）をｇ
ｌｙｃａｒｏｌ濃度勾配下でｐ＋（３，５〜１０のキャ
リヤーＡｍｐｈｏｌｉｎａから成る等電点電気泳動の中
間付近に現れる。電気泳動はＣｈｒｏｍａｔｏ　ｃｈａ
ＩＩＩｂｅｒ内（４℃）で１００時間４００ｖで行なわ
れた。その内容量は３．６−フラクションに画分され、
ｐＨとＫＨＫ活性の両方がそれぞれのフラクションで測
定された。

次に本発明の実施例を示す。

実施例 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ＡＭＩ　−ＯＹＡ、　ＦＥＲ
Ｎ　Ｐ−１０１５２の種菌培養液を、０．２％に２１（
ＰＯ，，０，２％ＮａＮＯｓ、０．２％（Ｎｌ（、）。

ｓｏ、、　ｏ、ｔ％ＫＨ，ＰＯ，，０，０２％ＭｇＳＯ
４・７１（、Ｏｌｏ、０１％酵母エキス（Ｏｒｉｅｎｔ
ａｌ酵母、Ｃｏ）と１％メタノールを含む培地５０１１
１に接種し、連続釣上トウで３０℃。

；１６時間培養した。

培養液を遠心処理し、得られた菌体（５０ｇＷｅｔ。

ｗｔ）　　を０．ＩＭ　Ｄ−フルクトース、１ｍＭ　Ｅ
ＤＴＡ、ｉｏ＋＋＋８２−メルカプトエタノール、０．
５ｍＭ　ｐｈｅｎｙｌ　ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌ
ｆｌｕｏｒｊ、ｄｅを含んだｐＨ６，８の５ｍＭ　リン
酸ナトリウムｂｕｆｆｅｒ（ＫＰＢ）に）鵠濁した。

菌体懸濁液を１，０００ｋｇ／ｃＪでＦｒｅｎｃｈ　ｐ
ｒｅｓｓｕｒｅｃｅｌｌ　ｐｒｅｓｓに通して細胞を破
砕する。なお、以下に述べるすべての操作も特に記さな
いかぎり、４℃で行なった。

得られたホモジネートを６０分間６８，０ＯＯＸ　ｇで
遠沈する。上述した同じ成分を含む５ｍＭ　ＫＰＢで平
衡化させたＤＥＡＥ−セルロースカラム（２、５ｘ　３
０ｃｍ）にその上澄を吸着させる。そのカラムを、同じ
ｂｕｆｆｅｒで完全に洗った後、ＫＨＫは０．３ＭＫＣ
ｌを含んだｂｕｆｆｅｒで溶出される。酵素活性はＲａ
ｕｓｈｓｌとＣ１ｅｌａｎｄによって提唱された方法に
よって測定さ１％ れた。タンパク含量はＥ２８□値を１５．０として決定
された。ＫＨＫ画分は透析チューブの中に注ぎ込み、ｐ
ｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ　６，０００中に
入れる。濃縮された透析チューブはＳｍＭＫＰＢ中で一
晩、透析される。

不溶性の物質が６０分間の６８，０００ｘ　ｇの遠心分
離で除去される。透明なローズレッドの上澄は５ｍＭに
ＰＢで平衡化されたブルーデキストランセファロースカ
ラム（’ｌ　Ｘ　２０ｃｍ）にチャージする。カラムに
同様のｂｕｆｆｅｒを流した後、　Ｋｌ（Ｋは１．Ｍ　
ＫＣＩを含む５！ＬＭＫＰＢで溶出される。溶出曲線は
第４図に示される。

ＫＨＫ活性を含む両分はｐｏｌ、ｙｅｔｈｙｌｅｗｇｌ
ｙｃｏｌ　６，０００で濃縮され、同様のｂｕｆｆｅｒ
で平衡化させた５ａｐｈａｄａｘ　Ｇ−１００カラム（
１、３Ｘ　２００ｃｍ）にかけられる。主な不純物がｖ
ｏｉｄ　ｖｏｌｕ肩ａあたりに溶出された後にＫＨＫは
すぐにカラムから溶出される。　５ｅｐｈａｄａｘ　Ｇ
−１００ゲル濾過の操作がくり返される。２回目のゲル
濾過の溶出パターンはＫＨＫの活性を伴うタンパク質の
ほぼ均整のとれたパターンである（第５図）。

この段階における酵素標品はポリアクリルアミドゲル電
気泳動において５０μｇのタンパク質が加えられた場合
でも単一のタンパク質のバンドを示す。

ＫＨＫは４０％の精製収率をもって約１０００倍精製さ
れた。Ｄ−ｆｒｕｃｔｏｓｅ−１−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ
からＤ−ｆｒｕｃｔｏｓｅを生成する後方への反応に対
するＤ−ｆｒｕｃｔｏｓｅを生成する前方向への反応の
酵素活性の速度が酵素の精製の全過程を通してほとんど
一定して２．６であった。これはその２つの酵素反応が
１つの酵素タンパク質によって触媒作用を受けていると
いうことを示唆している。その前方向への反応において
は精製ＫＨＫの比活性は１７８ｕｎｉｔｓ／ｍｇ　ｐｒ
ｏｔｅｉｎと決定された。　ＫＨＫの分子量は６０　、
０００と評価され、ＫＨＫは３０゜０００の分子量をも
つ２つの同一サブユニットから構成されている。ＫＨＫ
の等電点は焦点電気泳動によって４．５であると分かっ
た。微生物のＫＨＫはその熱安定性によって特徴づけら
れる（第１図）。

μｇ　Ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＱのレベルのような希釈酵素
液で実験した時でさえ７０℃で３０分間酵素液を加熱し
た後でＫＨＫの失活はほとんど見られなかった。８０℃
においては少なくとも１５分間は安定であった。

【図面の簡単な説明】

第１図はＮＨＫの熱安定性を示す図で、第２図はＫＨに
のｐＨ安定性を示す図で、第３図は精製したにＩＩＫの
ポリアクリルアミドゲル電気泳動と等電点電気泳動の結
果を示す図で、第４図はＫ）ＩＫのプルーデキストラン
セファロースカラムの溶出曲線を示す図で。 第５図はＫＨＫのセファデックスＧ−１００ゲル濾過の
結果を示す図である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. （１）フルクトース培地で生育する菌をフルクトース含
   有培地でインキュベートすることを特徴とするケトヘキ
   ソキナーゼの製造法。