JPS6049478B2 - グリセロキナ−ゼ酵素及び該酵素の製法 - Google Patents
グリセロキナ−ゼ酵素及び該酵素の製法Info
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- JPS6049478B2 JPS6049478B2 JP52101022A JP10102277A JPS6049478B2 JP S6049478 B2 JPS6049478 B2 JP S6049478B2 JP 52101022 A JP52101022 A JP 52101022A JP 10102277 A JP10102277 A JP 10102277A JP S6049478 B2 JPS6049478 B2 JP S6049478B2
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、新規な又は変性グリセロキナーゼ酵素及び当
該酵素の製法に係る。
該酵素の製法に係る。
グリセロキナーゼはグリセロール誘導体とりわ−け組織
及ひ血清中の脂質の検出及び定量に広く利用されている
。
及ひ血清中の脂質の検出及び定量に広く利用されている
。
しかし乍ら、現在利用されているグリセロキナーゼは、
室温に於いてさえも熱的に不安定であり、冷蔵庫中ての
貯蔵を必要とされる。グリセロールの存在下で生長する
或る微生物が耐熱性あるグリセロキナーゼ酵素を生産し
得ることが判明した。
室温に於いてさえも熱的に不安定であり、冷蔵庫中ての
貯蔵を必要とされる。グリセロールの存在下で生長する
或る微生物が耐熱性あるグリセロキナーゼ酵素を生産し
得ることが判明した。
本明細書に於いて“耐熱性゛とは、いかなる基質の非存
在下、ＰＨ７．５±０．５．タンパク質濃度２ｍ９／Ｍ
ｔ以下及ひ温度５５゜Ｃで１時間以ｊ上の半減期を有す
る酵素のことをいう。又更に、或る微生物の菌株が、グ
リセロールの非存在下に於いてさえも耐熱性グリセロキ
ナーゼを生産し得ることが判明した。
在下、ＰＨ７．５±０．５．タンパク質濃度２ｍ９／Ｍ
ｔ以下及ひ温度５５゜Ｃで１時間以ｊ上の半減期を有す
る酵素のことをいう。又更に、或る微生物の菌株が、グ
リセロールの非存在下に於いてさえも耐熱性グリセロキ
ナーゼを生産し得ることが判明した。
それ故、本発明の一観点に依れば、耐熱性（上４記で定
義した）のグリセロキナーゼが提供される。
義した）のグリセロキナーゼが提供される。
本発明の耐熱性グリセロキナーゼは以下の理化学的性質
を有する。
を有する。
（ａ）少なくとも０．１重量％のグリセロールの存在下
で培養されたバチルス属の耐熱性微生物から生産される
。
で培養されたバチルス属の耐熱性微生物から生産される
。
（ｂ）それぞれの分子量が５００００〜６００００の４
つの等しいか又は同じようなサブユニットから成る構造
を有する。
つの等しいか又は同じようなサブユニットから成る構造
を有する。
（Ｃ）安定ＰＨ範囲が３．２〜９．７である。
（ｄ）至適ＰＨ範囲が７．５±０．５である。（ｅ）作
用適温が６５±５℃である。ノ（ｆ）基質の非存在下、
ＰＨ７．５±０．５、タンパク質濃度２ｍｇ／ｍｌ以下
及び温度５５℃に於いて１時間以上の半減期を有する。
用適温が６５±５℃である。ノ（ｆ）基質の非存在下、
ＰＨ７．５±０．５、タンパク質濃度２ｍｇ／ｍｌ以下
及び温度５５℃に於いて１時間以上の半減期を有する。
（ｇ）陰イオン交換樹脂に結合する。
（ｈ）３０℃よりも６０℃でより高い速度定数（Ｖｍａ
ｘ）を有する。
ｘ）を有する。
本発明の別の観点に依れば、耐熱性グリセロキナーゼの
製造方法は、好熱性の微生物が耐熱性グリセロキナーゼ
を生産し得る培地で少なくとも１つの前記微生物を培養
し、当該微生物の細胞を破壊レζ前記酵素を放出せしめ
、当該酵素と前記細胞破片とを分離することから成る。
製造方法は、好熱性の微生物が耐熱性グリセロキナーゼ
を生産し得る培地で少なくとも１つの前記微生物を培養
し、当該微生物の細胞を破壊レζ前記酵素を放出せしめ
、当該酵素と前記細胞破片とを分離することから成る。
（本明細書に於いて゜“好熱性゛とは少なくとも５０゜
Ｃの温度に於いても生長し得る微生物のことてある。）
好ましくは前記好熱性微生物はバチルス属であり、例え
ばＢ●コアギユランス（Ｂ●ＣＯａｇｕｌａｒｌｓ），
Ｂ●カルドドテナクス（Ｂ●ＣａｌｄＯｔｅＴｌａｘ）
，Ｂ●カルドリテイクス（Ｂ◆ＣａｌｄＯｌｙｔｉｃｕ
ｓ），Ｂ●カルドヴエロクス（Ｂ●ＣａｌｄＯｖｅｌＯ
ｘ），Ｂ●サブチリス（Ｂ●Ｓｕｂｔｊｌｌｓ）Ｂ●リ
チノホルミス（Ｂ●１１ｃｈｅｎ０ｆ０ｒｍｉｓ）の菌
株又はそれらの変異株である。特に好適な微生物は、バ
チルス、ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｔｅａｒＯｔｈｅｒｍＯｐｈｉｌｕｓ）種の微生物であ
り、例えば予めナショナル カナーズ アソシエイシヨ
ン（ＮａｔｉＯｒｌａｌＣａｎｎｅｒｓＡｓｓＯｃｌａ
ｔｊＯｎ）に寄託番号ＮＣＡｌ５Ｏ３（ＡＴＣＣ７９５
４及びＮＣＩＢ８９２４として同じく寄託されている）
として寄託されている微生物てある。本発明は、更に、
グリセロール又はグリセロール類の非存在下で培養され
た場合、グリセロキナーゼを生産するバチルス属の変異
株をも提供する。
Ｃの温度に於いても生長し得る微生物のことてある。）
好ましくは前記好熱性微生物はバチルス属であり、例え
ばＢ●コアギユランス（Ｂ●ＣＯａｇｕｌａｒｌｓ），
Ｂ●カルドドテナクス（Ｂ●ＣａｌｄＯｔｅＴｌａｘ）
，Ｂ●カルドリテイクス（Ｂ◆ＣａｌｄＯｌｙｔｉｃｕ
ｓ），Ｂ●カルドヴエロクス（Ｂ●ＣａｌｄＯｖｅｌＯ
ｘ），Ｂ●サブチリス（Ｂ●Ｓｕｂｔｊｌｌｓ）Ｂ●リ
チノホルミス（Ｂ●１１ｃｈｅｎ０ｆ０ｒｍｉｓ）の菌
株又はそれらの変異株である。特に好適な微生物は、バ
チルス、ステアロサーモフイラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓ
ｔｅａｒＯｔｈｅｒｍＯｐｈｉｌｕｓ）種の微生物であ
り、例えば予めナショナル カナーズ アソシエイシヨ
ン（ＮａｔｉＯｒｌａｌＣａｎｎｅｒｓＡｓｓＯｃｌａ
ｔｊＯｎ）に寄託番号ＮＣＡｌ５Ｏ３（ＡＴＣＣ７９５
４及びＮＣＩＢ８９２４として同じく寄託されている）
として寄託されている微生物てある。本発明は、更に、
グリセロール又はグリセロール類の非存在下で培養され
た場合、グリセロキナーゼを生産するバチルス属の変異
株をも提供する。
従つて、これらの菌株を使用すれば、グリセロール又は
グリセロール類似物を欠く培地中で当該微生物を培養す
ることによつて耐熱性グリセロキナーゼを生産し得る。
しかし乍ら、グリセロール又はグリセロール類似物の非
存在下でグリセロキナーゼを生産する微生物及び生産し
ない微生物の両場合に於いて、培地は通常少なくとも０
．１重量％及び好ましくは４Ｊ重量％以下のグリセロー
ル又はグリセロール類似物を含有する。最も好ましくは
前記培地は０．２〜１．睡量％のグリセロール又はグリ
セロール類似物を含有する。本明細書に於けるグリセロ
ール類似物とは、多一官能Ｃ３アルコール、特に２つの
水酸基を含有する前記アルコール、例えばグリセリン酸
、Ｌ一又はＤ−グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセ
トン、又は３ーメルカプトープロパンー１，３−ジオー
ルである。前記いずれの場合に於いても、培地は、天然
物から得られた栄養源例えばペプトン、酵母水解物等を
含有する複合培地か、又は無機及び簡単な有機の栄養源
を含有する一定の塩培地てよい。
グリセロール類似物を欠く培地中で当該微生物を培養す
ることによつて耐熱性グリセロキナーゼを生産し得る。
しかし乍ら、グリセロール又はグリセロール類似物の非
存在下でグリセロキナーゼを生産する微生物及び生産し
ない微生物の両場合に於いて、培地は通常少なくとも０
．１重量％及び好ましくは４Ｊ重量％以下のグリセロー
ル又はグリセロール類似物を含有する。最も好ましくは
前記培地は０．２〜１．睡量％のグリセロール又はグリ
セロール類似物を含有する。本明細書に於けるグリセロ
ール類似物とは、多一官能Ｃ３アルコール、特に２つの
水酸基を含有する前記アルコール、例えばグリセリン酸
、Ｌ一又はＤ−グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセ
トン、又は３ーメルカプトープロパンー１，３−ジオー
ルである。前記いずれの場合に於いても、培地は、天然
物から得られた栄養源例えばペプトン、酵母水解物等を
含有する複合培地か、又は無機及び簡単な有機の栄養源
を含有する一定の塩培地てよい。
前記培地は、好ましくは温度３０〜７０゜Ｃ特に５０〜
６５゜Ｃ（微生物の温度耐性によつて決める）及びＰＨ
５〜８に調整される。又、前記培地は好気性下又は嫌気
性下に調整されてもよいが、しかし乍ら前者が好ましい
。細胞破壊は、通常の技術例えばソニフイケーシヨン、
ホモゲナイゼイシヨン又は酵素処理等により行い得る。
６５゜Ｃ（微生物の温度耐性によつて決める）及びＰＨ
５〜８に調整される。又、前記培地は好気性下又は嫌気
性下に調整されてもよいが、しかし乍ら前者が好ましい
。細胞破壊は、通常の技術例えばソニフイケーシヨン、
ホモゲナイゼイシヨン又は酵素処理等により行い得る。
その後、通常の酵素単離及ひ精製技術が行なわれ、例え
ばイオンー交換クロマトグラフィー、リン酸カルシウム
での分別、硫酸アンモニウム又は有機溶媒（例えは１０
〜２０Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール等）を使用する沈澱、
デキストラン、アガロース又はアガロースポリアクリル
アミド上でのゲル沖過、及び／又はヌクレオチド誘導細
胞間質又はスルホゾ酸置換モノクロロトリアゾニル（゜
“プロシオゾ゛）染料での親和クロマトグラフィー（Ａ
ｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒＯｍａｔＯｇｒａｐｈｙ）等で行
なわれる。バチルス属の好熱性微生物から生産された耐
熱性グリセロキナーゼは、それぞれの分子量が５０００
０〜６００００の４つの等しい又は同じようなサブ−ユ
ニットから成る構造を有する。
ばイオンー交換クロマトグラフィー、リン酸カルシウム
での分別、硫酸アンモニウム又は有機溶媒（例えは１０
〜２０Ｖ／Ｖ％濃度のエタノール等）を使用する沈澱、
デキストラン、アガロース又はアガロースポリアクリル
アミド上でのゲル沖過、及び／又はヌクレオチド誘導細
胞間質又はスルホゾ酸置換モノクロロトリアゾニル（゜
“プロシオゾ゛）染料での親和クロマトグラフィー（Ａ
ｆｆｉｎｉｔｙｃｈｒＯｍａｔＯｇｒａｐｈｙ）等で行
なわれる。バチルス属の好熱性微生物から生産された耐
熱性グリセロキナーゼは、それぞれの分子量が５０００
０〜６００００の４つの等しい又は同じようなサブ−ユ
ニットから成る構造を有する。
前記グリセロキナーゼは陰イオン交換樹脂に結合し、グ
リセロールの存在下でＰＨ５．Ｏに於いて安定である。
前記グリセロキナーゼは、３０℃の場合よりも６０℃に
於ける場合、より高速度定数（Ｖｍａｘ）を有する。グ
リセロールの非存在下で培養された場合グリセロキナー
ゼを生産するバチルスステアロサーモフイラスの変異株
、即ち構成変異株（ＣＯｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｍｕｔａ
ｎｔ）は環境及び加圧淘汰法（ＥｎｖｉｒＯｍｅｎｔａ
ＩａｎｄｓｅｌｅｃｔｉＯｎｐｒｅｓｓｌｌｒｅｔｅｃ
ｈｎｉｑＬ］ＥＳ）又はＷ照射等によつて得られること
ができる。
リセロールの存在下でＰＨ５．Ｏに於いて安定である。
前記グリセロキナーゼは、３０℃の場合よりも６０℃に
於ける場合、より高速度定数（Ｖｍａｘ）を有する。グ
リセロールの非存在下で培養された場合グリセロキナー
ゼを生産するバチルスステアロサーモフイラスの変異株
、即ち構成変異株（ＣＯｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｍｕｔａ
ｎｔ）は環境及び加圧淘汰法（ＥｎｖｉｒＯｍｅｎｔａ
ＩａｎｄｓｅｌｅｃｔｉＯｎｐｒｅｓｓｌｌｒｅｔｅｃ
ｈｎｉｑＬ］ＥＳ）又はＷ照射等によつて得られること
ができる。
前記変異株は、工業技術院微生物工業技術研究所（以下
微工研と言う）に微工研菌寄第４１７５及び４１７６号
として寄託した。前記微工研菌寄第４１７５及び４１７
６号の菌株は、ナショナル コレクション インダスト
リアル バクテリア（ＮａｔｉＯｒｌａＩＣＯＩＩｅｃ
ｔｉＯｎＯｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ）
に寄託番号ＮＣＩＢｌｌ２７Ｏ及びＮＣＩＢｌｌ２７ｌ
としてそれぞれ寄託されているものである。
微工研と言う）に微工研菌寄第４１７５及び４１７６号
として寄託した。前記微工研菌寄第４１７５及び４１７
６号の菌株は、ナショナル コレクション インダスト
リアル バクテリア（ＮａｔｉＯｒｌａＩＣＯＩＩｅｃ
ｔｉＯｎＯｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌＢａｃｔｅｒｉａ）
に寄託番号ＮＣＩＢｌｌ２７Ｏ及びＮＣＩＢｌｌ２７ｌ
としてそれぞれ寄託されているものである。
これらの菌株は、例えばコードン、ハイネス及びハング
（Ｇｃ）ＤＯｎ，ＨａｙｎｅｓａｎｄＰａｎｇ）による
米国農務省のアグリカルチユラル ハンドブック（Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＨａｎｄｂＯＯｋ）、（１９７３
年）、５９ページに記載されている標準試験によつて、
Ｂ．ステアロサーモフイラスであることが確認され得る
。又これらの菌株は、下記のようなルー及びリン（Ｒｕ
ｃｈａｎｄＬｉｎ）のテスト（Ｊ．ＢａｃｔｅｒｉＯｌ
ＯｇｙＶＯＩｌ２４，ｌ９７５，ＮＯ．ｌ頁３４８）か
ら構成変異株として確認され得る。前記菌株を力ティン
のトリプテイツクハイドロリゼート及び大豆粗粉の酵素
消化液（０ｘＩｄＬｔｄ社のトリプトンソーヤプロスア
ガー）の混合物を含有するかんてんプレート上に載置す
る。
（Ｇｃ）ＤＯｎ，ＨａｙｎｅｓａｎｄＰａｎｇ）による
米国農務省のアグリカルチユラル ハンドブック（Ａｇ
ｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＨａｎｄｂＯＯｋ）、（１９７３
年）、５９ページに記載されている標準試験によつて、
Ｂ．ステアロサーモフイラスであることが確認され得る
。又これらの菌株は、下記のようなルー及びリン（Ｒｕ
ｃｈａｎｄＬｉｎ）のテスト（Ｊ．ＢａｃｔｅｒｉＯｌ
ＯｇｙＶＯＩｌ２４，ｌ９７５，ＮＯ．ｌ頁３４８）か
ら構成変異株として確認され得る。前記菌株を力ティン
のトリプテイツクハイドロリゼート及び大豆粗粉の酵素
消化液（０ｘＩｄＬｔｄ社のトリプトンソーヤプロスア
ガー）の混合物を含有するかんてんプレート上に載置す
る。
そして２碕間６０℃で生長させる。次いで、前記プレー
トに１０ｇ／ｌのグリセロールと１５０ｐｇ／ｍｌのク
ロノラムフエニコールとの溶液を噴霧する。前記プレー
トを更に６０℃て１時間培養し、その後１モルのリン酸
カリウム中１０ｇ／′のトリフェニルテトラゾリウムク
ロライド、ＰＨ７．５を噴霧する。潜在的な独特のコロ
ニーがピングからレッドに７変色した。本発明の種々の
観点の具体例を実施例にて説明する。
トに１０ｇ／ｌのグリセロールと１５０ｐｇ／ｍｌのク
ロノラムフエニコールとの溶液を噴霧する。前記プレー
トを更に６０℃て１時間培養し、その後１モルのリン酸
カリウム中１０ｇ／′のトリフェニルテトラゾリウムク
ロライド、ＰＨ７．５を噴霧する。潜在的な独特のコロ
ニーがピングからレッドに７変色した。本発明の種々の
観点の具体例を実施例にて説明する。
この実施例に於いて使用した培地は次のようである：複
今培地 ｘ／てトリプテイツ
クミートダイジエスト ２０（バクトトリプトン）
酵素工キズ １０ＦｅＣｆ
３・６Ｈ２００．０１４Ｍｎｃｅ２・４Ｈ２００．０３
０Ｋ，ＳＯ４２．６Ｍ ｇＳＯｅ７Ｈ，ＯＯ．５４Ｃｉｔ ｒｉｃＡｃｉｄＯ．６４Ｎａ２ＨＩ ）０４４Ｉ２Ｈ，０６．４４４ ＣＮ９培地 メチオニン、バリン及びイソ−ロイシン以外の全てのア
ミノ酸を除去し且つ塩化アンモニウム濃度を１０ｇ／ｌ
から３０ｇ／ｌに増加することを除いては、ＲＯＷｅ，
Ｇ（１）１ｄ跪Ｒｇ及び石ｅｌ即ＸｅｎによるＪＢａｃ
ｔｅｒｌＯｌＯｇｙ，ＶＯｌｌ２４（１９７５）ＮＯ．
ｌ頁２７９に記載のとおりの培地である。
今培地 ｘ／てトリプテイツ
クミートダイジエスト ２０（バクトトリプトン）
酵素工キズ １０ＦｅＣｆ
３・６Ｈ２００．０１４Ｍｎｃｅ２・４Ｈ２００．０３
０Ｋ，ＳＯ４２．６Ｍ ｇＳＯｅ７Ｈ，ＯＯ．５４Ｃｉｔ ｒｉｃＡｃｉｄＯ．６４Ｎａ２ＨＩ ）０４４Ｉ２Ｈ，０６．４４４ ＣＮ９培地 メチオニン、バリン及びイソ−ロイシン以外の全てのア
ミノ酸を除去し且つ塩化アンモニウム濃度を１０ｇ／ｌ
から３０ｇ／ｌに増加することを除いては、ＲＯＷｅ，
Ｇ（１）１ｄ跪Ｒｇ及び石ｅｌ即ＸｅｎによるＪＢａｃ
ｔｅｒｌＯｌＯｇｙ，ＶＯｌｌ２４（１９７５）ＮＯ．
ｌ頁２７９に記載のとおりの培地である。
使用される微生物は、全て、バチルス属のも０であり、
特にコードン等の前記刊行物頁２１２（表２１）及ひ２
１４（表２２）から同定されるバチルスステアロサーモ
フイラス種である。
特にコードン等の前記刊行物頁２１２（表２１）及ひ２
１４（表２２）から同定されるバチルスステアロサーモ
フイラス種である。
ＮＣＡｌ５Ｏ３菌株は、ＡＴＣＣ７９５４として寄託さ
れており、第３者に入手可能である。前記変異株は表１
の如くパブリツクカルチヤーコレクシヨン（Ｐｕｂｌｉ
ｃｃｕｌｔｕｒｅｃＯｌｌｅｃｔｉＯｎ）に寄託されて
いる。前記変異株は、ルー及びリンの刊行物（前出）に
記載されている構成変異株テストによつてＮＣＡｌ５Ｏ
３と区別される（この場合両方とも深紅色を示す）。
れており、第３者に入手可能である。前記変異株は表１
の如くパブリツクカルチヤーコレクシヨン（Ｐｕｂｌｉ
ｃｃｕｌｔｕｒｅｃＯｌｌｅｃｔｉＯｎ）に寄託されて
いる。前記変異株は、ルー及びリンの刊行物（前出）に
記載されている構成変異株テストによつてＮＣＡｌ５Ｏ
３と区別される（この場合両方とも深紅色を示す）。
又、多数の生化学的性質によつても両者は区別される。
下記表２〜６にこれらの諸性質を列挙する。前記変異株
の単離は後述する。以下の実施例に於いて、酵素活性は
、３０℃で１分間リン酸化された基質（グリセロール又
はグリセライド）の１μモルとして１単位を定義する単
位で与えられる。５非一構成バチルス微生物からグリセ
ロキナーゼの生産実施例１４００ｍ１のフラスコ中で４
ｇ／ｆのグリセロールを含有する複合培地（上記で定義
した）１００ｍＬ中θで、Ｂ．ステアロサーモフイラス
ＮＣＡｌ５Ｏ３を６０′Ｃで１２〜１６時間２００ｒ′
Ｐｍで振とうしながら生成させた。
下記表２〜６にこれらの諸性質を列挙する。前記変異株
の単離は後述する。以下の実施例に於いて、酵素活性は
、３０℃で１分間リン酸化された基質（グリセロール又
はグリセライド）の１μモルとして１単位を定義する単
位で与えられる。５非一構成バチルス微生物からグリセ
ロキナーゼの生産実施例１４００ｍ１のフラスコ中で４
ｇ／ｆのグリセロールを含有する複合培地（上記で定義
した）１００ｍＬ中θで、Ｂ．ステアロサーモフイラス
ＮＣＡｌ５Ｏ３を６０′Ｃで１２〜１６時間２００ｒ′
Ｐｍで振とうしながら生成させた。
得られた細胞物質を集積し、グリセロキナーゼ活性の分
析を行つた。酵素の収率は２０弾位／ｇ乾燥細胞であつ
た。前記培地のグリセロールを除いて、同様に行うと、
酵素の収率は１弾位／ｇ乾燥細胞以下であつた。実施例
２ バチルスの種々の菌株を用いて実施例１を繰り返した。
析を行つた。酵素の収率は２０弾位／ｇ乾燥細胞であつ
た。前記培地のグリセロールを除いて、同様に行うと、
酵素の収率は１弾位／ｇ乾燥細胞以下であつた。実施例
２ バチルスの種々の菌株を用いて実施例１を繰り返した。
グリセロキナーゼの収率を表７に示す。使用した菌株は
、Ｕ．Ｊ．Ｈｅｊｎｅｎ＆Ｗ．Ｈｅｉｎｅｎ，Ａｒ′Ｃ
ｈ．ＭｌｃｒＯｂｌＯｌ．ｖＯｌ８２，（１９７２），
頁１〜２３によつて単離され同定されたものである。構
成変異株の単離 Ｂ．ステアロサーモフイラスＮＣＡｌ５Ｏ３の乾燥凍結
サンプルを復元し、振とうフラスコ中グリセロールを含
有しない複合培地中て６０℃の温度て生長させた。
、Ｕ．Ｊ．Ｈｅｊｎｅｎ＆Ｗ．Ｈｅｉｎｅｎ，Ａｒ′Ｃ
ｈ．ＭｌｃｒＯｂｌＯｌ．ｖＯｌ８２，（１９７２），
頁１〜２３によつて単離され同定されたものである。構
成変異株の単離 Ｂ．ステアロサーモフイラスＮＣＡｌ５Ｏ３の乾燥凍結
サンプルを復元し、振とうフラスコ中グリセロールを含
有しない複合培地中て６０℃の温度て生長させた。
１Ｗｆ間後、サンプルを４ｇ／ｅのグリセロールを含有
する同様の培地に移した。
する同様の培地に移した。
更にｌ叫間後、ミニマル培地と２０ｇ／′のグリセロー
ルを含有する複合培地とて斜行的に分割されたかんてん
プレートにサンプルを移した。前記プレートの左側（塩
培地）から塗抹コロニーを取り除き、生理食塩水中に懸
濁させる。この培地を、４ｇ／′のグリセロールを含有
するミニマル培地ど旬／ｅのグリセロールを含有する複
合培地とで斜行的に分割された第２のプレートに移した
。
ルを含有する複合培地とて斜行的に分割されたかんてん
プレートにサンプルを移した。前記プレートの左側（塩
培地）から塗抹コロニーを取り除き、生理食塩水中に懸
濁させる。この培地を、４ｇ／′のグリセロールを含有
するミニマル培地ど旬／ｅのグリセロールを含有する複
合培地とで斜行的に分割された第２のプレートに移した
。
上記のように培養後、ミニマル培地領域から１つのコロ
ニーを取り除き、グリセロールを含有しない複合培地で
３サイクル培養し、続いて４ｇ／′のグリセロールを含
有するミニマル培地て培養した。得られた培地を、構成
変異株に対するルー及びリン（前出）のテストのために
、トリプトンソーヤプロスアガー上に載置した。
ニーを取り除き、グリセロールを含有しない複合培地で
３サイクル培養し、続いて４ｇ／′のグリセロールを含
有するミニマル培地て培養した。得られた培地を、構成
変異株に対するルー及びリン（前出）のテストのために
、トリプトンソーヤプロスアガー上に載置した。
最深紅コロニーを・選択し、これを微工研菌寄第４１７
５号（ＮＣＡｌ５Ｏ３／３Ｇ又はＮＣＩＢｌｌ２７Ｏ）
とした。
５号（ＮＣＡｌ５Ｏ３／３Ｇ又はＮＣＩＢｌｌ２７Ｏ）
とした。
グリセロールを含有しない複合培地で３回培養した後、
培地をトリプトンソーヤプロスアガー上に載置し、噴霧
を行つた。第２の変異株を上記のように選択し、これを
微工研菌寄第４１７６号（ＮＣＡｌ５Ｏ３／４７Ｃ又は
ＮＣＩＢｌｌ２７ｌ）とした。
培地をトリプトンソーヤプロスアガー上に載置し、噴霧
を行つた。第２の変異株を上記のように選択し、これを
微工研菌寄第４１７６号（ＮＣＡｌ５Ｏ３／４７Ｃ又は
ＮＣＩＢｌｌ２７ｌ）とした。
構成変異株からグリセロキナーゼの生産実施例３〜６
上記の如く単離した変異株微工研寄託受理番号４１７５
及び４１７６を、実施例１のように、グリセロールを含
有する振とうフラスコ及びグリセロールを含有しない振
とうフラスコ中でそれぞれ生長させ）た。
及び４１７６を、実施例１のように、グリセロールを含
有する振とうフラスコ及びグリセロールを含有しない振
とうフラスコ中でそれぞれ生長させ）た。
酵素収率を単位／ｇ乾燥細胞で表８に示す。実施例７Ｂ
．ステアロサーモフイラス微工研菌寄第４１７５号の１
ｅ種培地を、．４ｇ／′のグリセロールを含有する攪拌
複合培地中で６０℃で調整した。
．ステアロサーモフイラス微工研菌寄第４１７５号の１
ｅ種培地を、．４ｇ／′のグリセロールを含有する攪拌
複合培地中で６０℃で調整した。
これを同様の２０′種培地の種づけのために使用した。
グリセロールを含有しない４００ｅの複合培地が６０℃
で入つている４００ｆ培地容器を、前記２０ｅ種培地で
種づけした。培地が光学密度０．８を有するまで、６０
℃，７．２±０．２の調整ＰＨ，ｌ分に３００ｅの空気
の通気、及ひ２５０ｒｐｍ（７）攪拌下で微生物の生長
を続けた。続いて、生長条件を変えないで１時間に亘り
、５００ｇ／ｅのグリセロール１０ｆを加えた。
グリセロールを含有しない４００ｅの複合培地が６０℃
で入つている４００ｆ培地容器を、前記２０ｅ種培地で
種づけした。培地が光学密度０．８を有するまで、６０
℃，７．２±０．２の調整ＰＨ，ｌ分に３００ｅの空気
の通気、及ひ２５０ｒｐｍ（７）攪拌下で微生物の生長
を続けた。続いて、生長条件を変えないで１時間に亘り
、５００ｇ／ｅのグリセロール１０ｆを加えた。
培地を、その後、二酸化炭素の発生が止み始めるまで、
同一条件下に培養し続けた。次いで、培地を室温に冷却
し、細胞をデ・ラバル遠心分離機（ＤｅＬｉｖａｌｃｅ
ｎｔｒｉｆｕｇｅ）に集めた。１．１百万単位のグリセ
ロキナーゼを含有する４．９ｋ９の湿潤細胞ペーストが
得られた。
同一条件下に培養し続けた。次いで、培地を室温に冷却
し、細胞をデ・ラバル遠心分離機（ＤｅＬｉｖａｌｃｅ
ｎｔｒｉｆｕｇｅ）に集めた。１．１百万単位のグリセ
ロキナーゼを含有する４．９ｋ９の湿潤細胞ペーストが
得られた。
実施例８
５００ｇ／ｅのグリセロール１０ｅの代わりに、同じグ
リセロール２０ｅを１時間１ｅの割合て培地に加えるこ
とを除いては、実施例７と同様に行なつた。
リセロール２０ｅを１時間１ｅの割合て培地に加えるこ
とを除いては、実施例７と同様に行なつた。
２．０±０．５百万単位のグリセロキナーゼを含有する
９．０ｋｇの湿潤細胞ペーストが得られた。
９．０ｋｇの湿潤細胞ペーストが得られた。
細胞をホモゲナイゼイシヨンで破壊し、細胞破片を遠心
分離機で除去すると、タンパク質１ｍｇ当り１．０禅位
のグリセロキナーゼを含有する細胞抽出物が得られた。
次いて、前記細胞抽出物を、ＰＨ５でのＲＨ沈澱、ジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルローズのクロマトグ
ラフィ、硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ交叉結合デキ
ストラン（ＤＥＡＥ′“セフアデツクズ）のクロマトグ
ラフィ、及び交叉結合デキストランＣ′セフアデツクズ
Ｇ２ＯＯ）でのゲルｐ過により、連続的に精製した。
分離機で除去すると、タンパク質１ｍｇ当り１．０禅位
のグリセロキナーゼを含有する細胞抽出物が得られた。
次いて、前記細胞抽出物を、ＰＨ５でのＲＨ沈澱、ジエ
チルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セルローズのクロマトグ
ラフィ、硫酸アンモニウム沈澱、ＤＥＡＥ交叉結合デキ
ストラン（ＤＥＡＥ′“セフアデツクズ）のクロマトグ
ラフィ、及び交叉結合デキストランＣ′セフアデツクズ
Ｇ２ＯＯ）でのゲルｐ過により、連続的に精製した。
最終収率（細胞抽出物に対する）及ひ比活性を表９に示
す。
す。
精製された酵素は、それぞれ分子量５００００〜６００
００の４つの同一の又は類似のサブ−ニットから成るテ
トラマーであつた。
００の４つの同一の又は類似のサブ−ニットから成るテ
トラマーであつた。
前記精製酵素は、基質の存在下ＰＨ７．５及び温度６０
゜Ｃで３時間以上の半減期を有し、６５゜Ｃで約３５分
間、７０′Ｃで約１８分間、及び８０℃で約３分間の半
減期を有していた。又、前記精製酵素は、グリセロール
の存在下ＰＨ３．５及び温度＋４゜Ｃで２４１１ｆ１間
以上の半減期を有し、ＰＨ４．９で４時間、及びＰＨ６
．Ｏ又は７．５で２ケ月の半減期を有していた。３０℃
に於ける速度定数に対し、種々の温度に於ける速度定数
（■Ｍａｘ）を表１０に示す。
゜Ｃで３時間以上の半減期を有し、６５゜Ｃで約３５分
間、７０′Ｃで約１８分間、及び８０℃で約３分間の半
減期を有していた。又、前記精製酵素は、グリセロール
の存在下ＰＨ３．５及び温度＋４゜Ｃで２４１１ｆ１間
以上の半減期を有し、ＰＨ４．９で４時間、及びＰＨ６
．Ｏ又は７．５で２ケ月の半減期を有していた。３０℃
に於ける速度定数に対し、種々の温度に於ける速度定数
（■Ｍａｘ）を表１０に示す。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １ 次の性質を有する （ａ）少なくとも０．１重量％のグリセロールの存在下
で培養されたバチルス属の耐熱性微生物から生産される
、（ｂ）それぞれの分子量が５００００〜６００００の
４つの等しいか又は同じようなサブユニットから成る構
造を有する、（ｃ）安定ｐＨ範囲が３．２〜９．７であ
る、（ｄ）至適ｐＨ範囲が７．５±０．５である、（ｅ
）作用適温が６５±５℃である、（ｆ）基質の非存在下
、ｐＨ７．５±０．５、タンパク質濃度２ｍｇ／ｍｌ以
下及び温度５５℃に於いて１時間以上の半減期を有する
、（ｇ）陰イオン交換樹脂に結合する、 （ｈ）３０℃よりも６０℃でより高い速度定数（Ｖ＿ｍ
＿ａ＿ｘ）を有する、グリセロキナーゼ酵素。 ２ 微生物がグリセロキナーゼ酵素を生産し得るような
培地で前記微生物を培養し、微生物の細胞を破壊して前
記酵素を放出せしめ、前記酵素と細胞破片とを分離する
グリセロキナーゼ酵素を生産する方法に於いて、前記微
生物が少なくとも５０℃の温度で生長し得且つ次の性質
を有する（ａ）少なくとも０．１重量％のグリセロール
の存在下で培養されたバチルス属の耐熱性微生物から生
産される、（ｂ）それぞれの分子量が５００００〜６０
０００の４つの等しいか又は同じようなサブユニットか
ら成る構造を有する、（ｃ）安定ｐＨ範囲が３．２〜９
．７である、（ｄ）至適ｐＨ範囲が７．５±０．５であ
る、（ｅ）作用適温が６５±５℃である、 （ｆ）基質の非存在下、ｐＨ７．５±０．５、タンパク
質濃度２ｍｇ／ｍｌ以下及び温度５５℃に於いて１時間
以上の半減期を有する、（ｇ）陰イオン交換樹脂に結合
する、 （ｈ）３０℃よりも６０℃でより高い速度定数（Ｖ＿ｍ
＿ａ＿ｘ）を有する、耐熱性グリセロキナーゼを生産す
ることを特徴とする前記方法。 ３ 前記培地が少なくとも０．１重量％好ましくは４．
０重量％以下のグリセロール又はグリセロール類似物を
含有していることを特徴とする特許請求の範囲第２項に
記載の方法。 ４ 前記培地が０．２〜１．０重量％のグリセロール又
はグリセロール類似物を含有していることを特徴とする
特許請求の範囲第３項に記載の方法。 ５ 前記微生物がバチルス属であることを特徴とする特
許請求の範囲第２項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６ 前記微生物がバチルス・ステアロサーモフイラス種
であることを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載の
方法。７ 前記微生物の菌株が、工業技術院微生物工業
技術研究所の微工研菌寄第４１７５号として寄託された
ものであるか、又は該研究所の微工研菌寄第４１７６号
として寄託されたものかのいずれかであることを特徴と
する特許請求の範囲第６項に記載の方法。 ８ 前記培地が、ｐＨ５〜８及び温度３０〜７０℃好ま
しくは５０〜６５℃に調整されていることを特徴とする
特許請求の範囲第２項〜第７項のいずれかに記載の方法
。 ９ 前記培地が好気性条件下にあることを特徴とする特
許請求の範囲第２項〜第８項のいずれかに記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB35258/76A GB1567606A (en) | 1976-08-24 | 1976-08-24 | Glycerokinases |
| GB35258/76 | 1976-08-24 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5326389A JPS5326389A (en) | 1978-03-11 |
| JPS6049478B2 true JPS6049478B2 (ja) | 1985-11-01 |
Family
ID=10375696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52101022A Expired JPS6049478B2 (ja) | 1976-08-24 | 1977-08-22 | グリセロキナ−ゼ酵素及び該酵素の製法 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4385120A (ja) |
| JP (1) | JPS6049478B2 (ja) |
| DE (1) | DE2738184C2 (ja) |
| GB (1) | GB1567606A (ja) |
| IL (1) | IL52710A (ja) |
| ZA (1) | ZA774778B (ja) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS5852632B2 (ja) * | 1979-06-06 | 1983-11-24 | 東洋醸造株式会社 | 新規なグリセロ−ルキナ−ゼおよびその製造法 |
| JPS5668391A (en) * | 1979-11-07 | 1981-06-09 | Unitika Ltd | Glucose-6-phosphate dehydrogenase and its preparation |
| DE2950381A1 (de) * | 1979-12-14 | 1981-06-19 | Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim | Verfahren und reagens zur bestimmulng von triglyceriden |
| GB8811365D0 (en) * | 1988-05-13 | 1988-06-15 | Shell Int Research | Process for preparing heteropolysaccharide & microorganisms for use in such process |
| US5772996A (en) * | 1990-08-03 | 1998-06-30 | Public Health Laboratory Service Board | Pharmaceutical compositions containing superoxide dismutase from Bacillus Stearothermophilus and Bacillus Caldotenax |
| JP2754975B2 (ja) * | 1991-10-01 | 1998-05-20 | トヨタ自動車株式会社 | ファルネシル二リン酸合成酵素およびそれをコードするｄｎａ配列 |
| JPH07749U (ja) * | 1993-06-02 | 1995-01-06 | 義也 田中 | 拡大レンズ付きブックカバ−とブック |
| GB9902659D0 (en) * | 1999-02-05 | 1999-03-31 | Microbiological Res Authority | Assay with reduced background |
-
1976
- 1976-08-24 GB GB35258/76A patent/GB1567606A/en not_active Expired
-
1977
- 1977-08-08 ZA ZA00774778A patent/ZA774778B/xx unknown
- 1977-08-12 IL IL52710A patent/IL52710A/xx unknown
- 1977-08-22 JP JP52101022A patent/JPS6049478B2/ja not_active Expired
- 1977-08-24 DE DE2738184A patent/DE2738184C2/de not_active Expired
-
1981
- 1981-07-16 US US06/284,115 patent/US4385120A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| IL52710A (en) | 1980-10-26 |
| ZA774778B (en) | 1979-03-28 |
| JPS5326389A (en) | 1978-03-11 |
| GB1567606A (en) | 1980-05-21 |
| DE2738184A1 (de) | 1978-03-02 |
| IL52710A0 (en) | 1977-10-31 |
| US4385120A (en) | 1983-05-24 |
| DE2738184C2 (de) | 1986-08-21 |
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