JPH0256633B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はその目的として人間及び動物における
或る種の生理学的または病理学的状態の診断の助
けとして血清、尿、脳脊髄液またはその類似物の
ような体液中の抗原の存在または不在を目的とし
て測定する直接粒子凝集試験に関する。 体液中の微生物抗原の検知は増加する多数伝染
病の急速な診断に役立ちうるものである。しかし
ながら主要な問題は広く利用しうる方法の感度が
充分でなく（免疫拡散、CIE）従つて感染した患
者の実際比率において抗原の存在を誤つて指示し
たり、あるいは急速な診断（RIA、ELISA）に
対し時間を多く消費しすぎることである。場合に
よつては、抗原−抗体複合体の形成が遅すぎ、か
つ（または）形成された粒子が確実性を以て観察
されるには小さすぎることがある。検知能は抗原
または抗体分子が吸着または拘束される表面上の
担体として粒子を使用する凝集試験の利用によつ
て改良されてきた。 かような凝集試験は臨床試料が特定の稀釈度に
抗体と混合され、適当な培養期間後、粒状担体に
結合された抗原複合体から成る指示システムを混
合物に添加する間接方法によつて達成できる。若
し抗原が臨床試料中に存在すれば、抗体は抗原−
担体複合体と反応するのに利用されず、凝集は起
らない。このように凝集の不在は抗原に対する陽
性試験である。これとは逆に、もし抗原が臨床試
料中に存在しなければ、抗体は抗原担体複合体と
反応し、指示試料の凝集を起すであろう。かよう
な凝集試験が作用する理論は米国特許第3171783
号；3775536号；3873683号；3879262号、4003988
号及び4045384号に例示したようにこの技術分野
ではよく知られている。 感染性疾患領域に対する唯一の真に意味深長な
診断方法は感染病毒を持つたものと組み合わされ
た抗原の初期の急速な検知であつて、かようにし
て有効な処置に対する即座の指示を与えうること
は長い間感じて来た処である。 本発明は抗原検知の直接凝集試験に関するもの
である。すなわち、本発明は臨床体液１mlにつ
き、0.2nｇ（ナノグラム）位の小さな抗原を日常
的に検知することができ、かつ均等な感度並びに
安定性が１mlにつき0.2nｇの感度を有する被覆粒
子と同様に明示されることを特徴とする高感度の
直接粒子凝集試験と、かような被覆粒子の調製方
法を提供し、これに加えて人間の血清に関する不
明確な凝集の頻度を２％またはそれ以下に減少す
る方法が記載されている。 本発明によれば、体液内で低濃度にある細菌、
原生動物類、及び菌類を含む種々の微生物のたん
白質及び多糖類の如き抗原検知のための極めて感
度の高い凝集試験が今回開発された。本発明によ
る試験は病原性細菌と関係のあるカプセル状多糖
類１mlにつき0.2nｇ位の小さなものを日常検知す
ることが記載されている。これは広く使用されて
いる向流免疫電気泳動法（CIE）より25乃至250
倍大なる感度及び放射免疫分析（RIA）に少なく
とも等しい感度を示す。これに加えて、CIEは急
速であるが、それは訓練された研究室の人員と、
かなり高価な試薬と装置を要し、かつ大抵の細菌
性多糖類に対し１ml当り10乃至50nｇの限定され
た感度を生ずる。体液中にはもつと低濃度の抗原
を生ずることが多いので、培養基で実証された細
菌性感染の患者には為陰性CIE試験が多く観察さ
れる。一方RIAはCIEより10乃至100倍も感度は
大きいが、さらに時間がかかり、かつ費用を要す
る。 本発明以前には、粒子凝集試験の広範な使用は
極めて簡単でかつ安価であつたが、かような試験
は低感度によつて小濃度の抗原及び特に血清供試
験品に関する不明確凝集（non−specific
agglutination）の発生によつて明らかになつた
明確性の不足に拘束されて来た。この後で説明す
るように、本発明の方法論を使用することにより
0.2nｇ／mlの桁の感度が達成され、人間の血清に
関する不明確凝集の頻度は２％またはそれ以下に
減少された。さらに明敏な選択と抗血清の調製は
均等な感度、良好な安定性及び明確性を特徴とす
る試験法に発展させた。なお、この明細書で『不
明確凝集（non−specific agglutination）』 それ故に、体液１mlにつき0.2nｇ位の低濃度の
体液内の微生物抗原を検知するための敏感な粒子
凝集試験を提供するのが本発明の目的である。 他の目的は２％またはそれ以下の人間血清との
不明確凝集の比率を特徴とする粒子凝集試験を提
供するに在る。 ポリリボホスフエート〔Polyibophosphate
（PRP）〕、ヘモフイルス インフルエンザ
（Haemophilus Inluenzae）型ｂ（略称Ｈ・I.b）
のカプセル状多糖類の急速な検知のための改良さ
れた粒子凝集が本発明の特別な目的である。 制限された感度は微生物性抗原検知の以前に記
載された方法に関する主要な問題である。その結
果、細菌性抗原は文書に示された感染性をもつす
べての患者では検知できないことになる。例え
ば、多くの試験はH.I.b脳膜炎をもつ患者の７〜
22％；H.I.b会厭（軟骨）症の患者の38％；細菌
性肺炎球菌肺炎を持つ患者の20〜39％；そして非
細菌性肺炎球菌肺炎症をもつ50〜90％の患者が、
利用可能な向流免疫電気泳動または粒子凝集分析
によつて試験された時、血清または脳脊髄液中に
検知しうる抗原を持つことに失敗していることを
明らかにした。しかしながら、0.5nｇ／mlまたは
それ以下を検知できる放射免疫分析は最初にそれ
らを医師に提出すれば実際にH.I.b.のすべての場
合脳膜炎と診断できるであろう。試験の結果はま
た患者の37％の抗原濃度が10nｇ／ml以下であ
り、それ故多くの利用しうる向流免疫電気泳動技
術の感度以下であることを示す。 本発明によれば、放射免疫分析に比較しうる感
度を有する粒子凝集分析が今回開発されたのであ
る。本発明の分析によつて達成された高感度は以
前から知られた粒子凝集分析の変形、すなわち明
確なH.I.b.抗血清の選択、抗血清のグロブリン
（水不溶たん白群）留分の使用、感知された粒子
の洗浄、及び粒子凝集分析の培養時間を通常の５
分から約45分またはそれより長くしたことに由来
する。 ａ 感度 抗血清の選択は分析の感度に著るしく影響す
る。動物の３つの種で調製した６つの抗血清は
１mlにつき0.2ナノグラム乃至1000ナノグラム
以上の範囲内のPRP感度をもつ粒子を生ずる。
明確な抗体の官能性並びにその濃度が重要であ
る。最高感度の粒子を生じる抗血清は放射抗原
結合分析により測定されるように最高濃度の抗
体を持たない。 全ヘモフイリス インフルエンザ型ｂに対す
る６つの抗血清は、ジヤーナル オブ、インミ
ユノロジイ（Journal of Inmmunology）54：
207〜211、1946年のH.E.アレキサンダーその
他により記載さされた免疫計画によれば４匹の
兎、ろば及び馬とで調製された。 本発明に関して使用した「粒子」なる用語は
不活性で他の成分に対し中性であり、かつ不可
逆的な方法で抗血清を吸着しうる粒子を意味す
る。かような粒子は平均粒子の大きさ約0.15乃
至約0.9ミクロンを有するガラス小球、ポリブ
タジエン、ポリスチレン、ポリブタジエン−ス
チレンなどがよい。蒸留水中の10％重量／容積
懸濁液として約0.81μの均一直径を有するポリ
スチレンラテツクス粒子を次のようにして前記
抗血清で増感するのが望ましい。 ろば及び兎の全抗血清は各々1/500に、そし
て馬の全抗血清は1/200に標準グリシン緩衝食
塩水（0.1Mグリシン、0.9％塩化ナトリウム、
PH8.2）中に稀釈された。抗体は１部の10％ラ
テツクス懸濁液を80部の稀釈された抗血清に添
加してラテツクス粒子上に吸着させ、室温で１
時間培養した。遊離抗血清は12000Gで10分間
遠心分離した後、傾潟した。この場合0.125％
のラテツクス懸濁液をつくるためであるから、
ラテツクス ペレツトは少量のたん白質、すな
わち0.1％の人間血清アルブミン、または0.1％
のろば、兎または馬の血清を用いグリシン緩衝
食塩水中に懸濁し、再遠心分離を行い、グリシ
ン緩衝食塩水中に再懸濁させた。放射免疫分析
により抗−PRP抗体を持たないことが示され
た子牛胎児の血清をPRP抗原標準溶液の稀釈
剤として使用した。 凝集はセラミツクの環を備えた血清学的スラ
イド上で抗原を含む液体の0.05ml分割部分を
0.01mlの増感したラテツクス溶液に添加して行
われた。スライドを環境温度にある加湿した室
温で回転し（毎分180回）、45分後に凝集を試験
した。凝集は凝集混合物が透明でラテツクス粒
子の粗い塊が認められた時4⁺に、混合物が濁つ
ままであるが、粗い塊が認められた時3⁺に、混
合物が濁つたままであるが、粒状が容易に認め
られた時2⁺に、そして混合物が濁つたままであ
るが最小の粒子が認められた時1⁺に等級づけら
れた。2⁺またはそれより大なる凝集は陽性とし
た。比較感度を表−１に示す。

【表】 表−１は明らかにラテツクス粒子を増感する
に用いられる抗血清の品質がPRP抗原検知の
ためのラテツクス粒子凝集の感度にとつて限界
であることを例示している。表−１に説明され
た結果をみるに、感度を単に放射抗原結合分析
によつて測定したような抗血清中のPRP濃度
を基にして予言できないことは極めて明白であ
る。最上の兎抗血清と同じ位の抗体を僅か12％
含有するろばの孔血清は５倍以上の感度のラテ
ツクス粒子調製物を生じた。この感度の相違
は、兎の抗血清で被覆されたラテツクス粒子が
2.3倍以上の吸着抗体を有していたので、ろば
抗体をそれ以上有効に被覆しているラテツクス
粒子によつて説明することができなかつた。
PRPで被覆された羊の赤い血液細胞に対する
ろば及び免抗血清の凝集活性は免抗血清中の
PRP結合活性が遥かに高い濃度にも拘らず活
性は等しかつた。 結合比率は測定ろば抗体が兎抗体の結合する
よりも遥かに急速にPRP抗原と結合すること
を示している。結合半−寿命はろば抗体に対し
20分であり、兎抗体に対する60分よりも多い。
この結合比率相違の理由は明らかでない。 過剰抗体の存在下での抗原−抗体複合体の解
離比率は抗体の結合または親和力の堅さのもの
さしとなるものである。兎の抗体はろばの抗体
が解離するよりもさらにゆるやかにポリリボー
スーホスフエートから理解し、従つて抗原への
より大きな親和力を有するわけである。この結
果は、抗原と抗体との結合比率が抗原−抗体相
互作用の力よりも凝集過程においてさらに著る
しいとの仮説に支持を与えるものである。 ｂ LPを被覆するマクログロブリン留分の使用 細菌性多糖類に対する種々の動物抗血清の分
子篩クロマトグラフイーは馬のような動物（ろ
ば、馬）における抗−多糖類抗体の大多数がこ
のカラムの空虚な容積内に溶離するマクログロ
ブリン級のものに見出される。これに反して兎
抗体の大多数はもつと徐々に溶離する１ｇＧ級
の中に見出される。表−２に示されるように、
ラテツクス粒子を増感するには濃度50μｇ／ml
のろばまたは馬の抗血清マクログロブリン留分
の使用が比較的弱い馬のような抗血清の感度を
著るしく改良する。凝集反応の透明性は一般に
空虚な容積留分については良好であるが、最上
の抗血清の感度はこの変形によつてさらに改良
されてはいない。兎血清の１ｇＧ留分の使用は
凝集の感度または透明性に匹敵できる改良を生
じない。

【表】

【表】 最低濃度を示す。
ｃ 被覆LPの洗浄 ろば抗血清の感度をさらに改良する目的でグ
リシン緩衝食塩水中の種々のろば抗血清稀釈液
を被覆した抗体被覆ラテツクス粒子を、未洗浄
及び１回、２回、及び３回1/1000部の子牛胎児
の血清を含有するグリシン緩衝食塩水で洗浄し
たものと比較してその結果を表−３に示した。

【表】 表３に報告された結果から判るように、抗血
清の低濃度稀釈は感度を下げる。1/500に稀釈
すると、より大きな最大の感度はラテツクス粒
子を洗浄した場合に達成される。未洗浄ラテツ
クス粒子は狭い範囲の稀釈についてのみ最高の
感度に到達した。２回の洗浄は最高感度を生じ
たが、これに反し３回洗浄は感度を減少させる
結果となつた。 洗浄実験からの増感されたラテツクス粒子は
40℃に貯蔵され、12ケ月及び24ケ月後に再試験
した。ろば抗血清を1/500及び1/1000に稀釈し
て増感し、２回洗浄したラテツクス粒子はそれ
らの元の感度を保持したが、これに反し未洗浄
ラテツクス粒子は24ケ月後に1/2乃至1/4に感度
を減少した。 ｄ 培養期間の持続 添付図面の第１図は培養期間と分析感度の関
係を示す。高濃度の抗原はラテツクス粒子を５
分以内に凝集させた。感度は最初の45分乃至60
分の間に急速に増加し、その後最高0.05nｇ／
mlに達するが最高感度の見本は10時間で得られ
る。本発明の馬のような血清はすべての培養期
間において兎の血清よりも敏感であつた。この
後に記載するように、試料溶液50ミクロリツト
ルと、被覆ラテツクス粒子10ミクロリツトルと
の比較研究を実施するに当つて、血清学のスラ
イド上で混合し、毎分180回転で室温において
回転した。このスライドを掩い、熱水で飽和し
たスポンジを以て湿度を保持した。スライドは
示された時間に検査した。 培養時間を５分から45分またはそれ以上に長
くすることは感度を10〜20倍に増加させた。実
際的な臨床目的には、馬のような抗血清で被覆
したラテツクス粒子を用いる時には普通５〜15
分間隔で読みとる45分の培養時間が選ばれる。
かようなラテツクス粒子は液１mlにつき0.2nｇ
の抗原感度を有していた。 粒子凝集分析の感度を増加することは不明確
な凝集の影響をも増すことが予期され、実際に
血清見本の場合に入院加療させた子供達からの
血清の69％はこれらラテツクス粒子を凝集し
た。この主要な欠点は前もつてこの分析法の広
範な使用を制限した。ガンマ グロブリンで被
覆されたラテツクス粒子の凝集に含まれる因子
は熱に不安定な血清成分（多分補充物）と、熱
に安定な抗−グロブリンと、特に慢性の炎症性
疾患を持つ患者からの人間の血清内に通常見出
される低基準のものとである。 不明確な凝集は全非免疫動物血清で増感され
た対照ラテツクス粒子の凝集によつて確認され
た。マクログロブリンで被覆されたラテツクス
粒子を使用する時、対照ラテツクス粒子は非免
疫血清のマクログロブリン留分で被覆される。 本発明によれば、人間血清との不明確な凝集の
頻度は次の(i)、(ii)及び(iii)により２％またはそれ以
下に減少された。 (i) 非免疫動物血清の増感されたラテツクス粒子
への添加 (i) ポリアニオンおよび（または）還元剤を含有
する血清緩衝液を直接培養混合物に添加するこ
とにより、および（または） (iii) 血清の熱不活性化。 不明確な凝集の影響は病院加療を要する小児科
及び大人の患者でH.I.b.疾患を持たないものから
集められた血清を用いて測定された。すべての血
清はろばの抗血清（抗−PRP LP）で増感された
ラテツクス粒子及び非免疫ろば血清（対照LP）
で増感されたラテツクス粒子を用いて試験され
た。 予備実験において、熱に安定な凝集剤を含む血
清は培養の開始時に培養混合物に添加された１，
４−ジチオスレイトール（DTT）または２−メ
ルカポエタノール（ME）のような還元剤10ミク
ロリツトルの添加によつて試験された。最適濃度
はDTTに対し0.018M、そしてMEに対し0.35M
であつた。（培養混合物中の最終濃度はDTTに対
して0.0026M、そしてMEに対しては0.05Mであ
つた） 次に表−４は試験前４℃において少なくとも24
時間貯蔵された104の小児科血清で得た結果を総
括したものである。

【表】 血清の69％が抗−PRPとの不明確な凝集を生
じ、４％を除くすべてが対照LPによつて確認さ
れた。 熱不活性化（60℃15分間）が不明確凝集をほん
の僅か53％に減少した。そして非免疫ろば血清の
抗−PRP及び対照LP両者への添加が不明確凝集
を31％に減少した。そして10ミクロリツトルの還
元剤；すなわちジチオスレイトールの添加が不明
確反応の影響を２％に下げた。52の貯蔵した大人
の血清について得た結果も同様であつた。2.5の
通常のろば血清をラテツクス粒子に添加し、
DTTを培養混合物に添加した時に、僅か１つの
血清が不明確凝集（抗−PRP LP及び対照LPに
は陽性）を生じた。 新鮮な血清がより高い比率の不明確凝集を生ず
るか否かを測定するために、大人からの100血清
を集め、直ちに氷上に置いて同日に分析した。各
血清は還元剤（ME）を用いた場合及び用いない
場合、そして熱不活性化（60℃５分間）を用いた
場合及び用いない場合について試験した。凝集は
抗−PRP LP及び対照LPが各々2.5％の通常ろば
血清を含む場合について試験し、すべての場合に
対応させた。凝集見本は次の表−５に総括して示
した。

【表】 未処理血清（熱活性化なし、還元剤なし）の42
％は不明確凝集を生じた。還元剤（ME）を添加
する場合血清の28は陰性（供試試料２）となり抗
グロブリンの存在を示した。初め陰性であつた14
血清は陽性（供試試料４）となり、熱不安定凝集
がメルカプトエタノールにより再活性化されたこ
とを示す。ME単独の正味の効果は不明確凝集を
38％に減少することであつた。同様な不明確凝集
の比率は熱不活性化のみで達成される。しかしな
がら、血清の熱不活性化及び還元剤の培養混合物
への添加の組合せは不明確凝集の影響を２％また
はそれ以下の桁に減少した。 熱不活性化が時間を浪費するため、熱に不安定
な血清因子による不明確凝集を除去する別の方法
が開発された。ナトリウムポリアンエトート ス
ルホネート（SPS）、デキストラン サルフエー
ト、キヤラゲニン及びヘパリンを含む多数のポリ
アニオンは熱不安定な血清因子によりグロブリン
で被覆されたラテツクス粒子の不明確凝集を防止
する。 大人からの100の新鮮な血清は濃度0.05％にお
けるME（上記のような）と、SPSの両者を含む
血清緩衝剤を用い試験した。100の血清の僅か１
つが抗−PRP及び対照LPによる不明確凝集を生
じた。この血清を用いた不明確凝集は加熱により
除去された。 還元剤及びポリアニオンの両者を含む血清緩衝
液を安定化増感ラテツクス粒子及び血清供試試料
の培養混合物に添加することが望ましい。 かような血清緩衝液は次のようにして調製す
る。 14モルの２−メルカプトエタノール（標準の濃
厚溶液）をグリシンの緩衝食塩水（GBS）（0.1M
グリシン、0.9％塩化ナトリウム、PH8.2）中で1/
４０に稀釈した。ポリアンエトール、スルホネート
５％水溶液を同じGBS中で1/100に稀釈した。 血清緩衝液は２−メルカプトエタノールの代り
にジチオスレイトール、グルタチオン、システイ
ン及びその類似物の如き他の還元剤を含んでもよ
い。これに加えて、デキストラン サルフエー
ト、ヘパリン及びキヤラゲニン及びその類似物の
ような他のポリアニオンも、それらが抗原−抗体
反応を妨害しない限り使用してもよい。 次の表−６は血清緩衝液中の試薬の最適濃度を
示す。還元剤またはポリアニオンの濃度を高くす
ると分析感度を減少させ、これより低い濃度はす
べての血清において不明確凝集を除去するのに失
敗した。

【表】 上に記載した血清緩衝液を使用する試験システ
ムにおいて、ラテツクス懸濁液中の非免疫動物血
清の有効濃度を再試験してみた。 粒子懸濁液中0.25％以下の非−免疫動物血清濃
度（最終分析混合物中0.035％以下）は血清緩衝
液を使用したにも拘らず時々不明確凝集を生じ
た。 ラテツクス懸濁液中約25％までの非免疫動物血
清濃度（最終分析混合物中3.5％）は不明確凝集
の影響を減少するのに有効であるが、最高濃度す
なわち25％はポリリボホスフエートに対する分析
の感度を1/2に減少した。 他の体液における不明確凝集 多くの尿供試試料は抗−PRP及び対照LPに関
し不明確凝集を生ずる。これは尿を加熱（100℃
５分間）するか、または過することによつて除
去することができる。好ましい態様では0.45ミク
ロンのフイルターが使用される。 脳脊髄液供試試料は極めて稀れに不明確凝集を
生ずるが、これは加熱（100℃５分間）により除
去される。PRP抗原は上の加熱及び過操作に
安定である。 次の特別な例は本発明の好ましい態様を例示し
たものである。 ａ ラテツクス粒子の被覆 抗−PRPラテツクス粒子を調製するため
Ｈ・インフルエンザ型ｂの全ろば抗血清をグリ
シン緩衝食塩水（GBS）中で1/500に稀釈し、
56℃で30分間加熱した。１部のラテツクス懸濁
液（蒸留水中の直径0.81μ粒子の10％懸濁液）
を80部の稀釈した抗血清に添加し、最終ラテツ
クス粒子濃度を0.125％とした。混合物を室温
で１時間培養し、12000Gで10分間遠心分離し、
上澄液を棄てた。ペレツトを0.1％の非−免疫
ろば血清を含有する等容量のGBS中に再懸濁
し、上のように再遠心分離した後、2.5％非免
疫ろば血清を含む等容量のGBS中に再懸濁し
た。GBS中で1/500に稀釈した非免疫ろば血清
を初めにラテツクス粒子の被覆に使用した以外
は上記と同じように対照ラテツクス粒子を調製
した。全体を通じ使用した非免疫ろば血清は免
疫された同一動物から免疫する以前に血清を採
取すべきである。 マクログロブリン留分を使用する場合には、
予め免疫したもの及び免疫ろば血清の全部をセ
フアクリルＧ−200ゲル過コラム上のクロマ
トグラフイーにかけ、コラムの空虚な容量に溶
離する留分を貯蔵する。この貯蔵した空虚な容
量留分GBS中１ミリリツトルにつき50μｇのた
ん白のたん白濃度に稀釈し、次に前に述べた方
法中の稀釈全血清と代替した。 ｂ 血清緩衝液の調製 14モルの２−メルカプトエタノール（標準濃
厚溶液）をGBS中で1/40に稀釈した。ナトリ
ウムポリアンエトール サルホネートを最終濃
度0.05％になるように添加した。 ｃ 分析操作 分析操作は本発明に従い次のように実施し
た。 次の図式につき清浄な乾燥した血清学のスラ
イドの２つの溜めの各々に陽性対照血清、陰性
対照血清及び試験さるべ脳脊髄液及び尿供試試
料50ミクロリツトルを添加する。陽性対照血清
は2nｇPRP抗原／mlを含有する。陰性対照血
清はもしSBが添加されなければ、抗−PRP
LP及び対照LPの両方を凝集する抗−グロブリ
ンを含有し、かくしてSBの活性の検査を与え
る。尿の供試試料は0.45ミクロンフイルターに
より予め過される。

【表】 緩衝液を加える。 陽性対照血清、陰性対照血清または血清供試
料を含有する各溜めに血清緩衝液10ミクロリツ
トルを加える。 ラテツクス懸濁液を泡立たないように静かに
撹拌し、抗−PRPラテツクス粒子10ミクロリ
ツトルを各対（列Ａ）の１つの溜めに加えて試
剤を十分に撹拌した。 対照ラテツクス粒子の10ミクロリツトルを各
対の第２の溜めに添加し、試剤を十分に混合し
た。 スライドを血清振盪機上に置き、約45分間回
転した。凝縮が工程を通じて見られるよう室を
熱水に浸漬したスポンジにより加湿すべきであ
る。スライドを室から取り出し、凝縮物を拭い
とり、凝集を次のようにして黒色の背景上で斜
めの光線中で前後に傾斜させながら読みを取
る。 ４＋ 大きな塊−透明な背景 ３＋ 大きな塊−乳白色の背景 ２＋ 小さな塊 １＋ 微細な粒 ０ 乳白状 ３＋及び４＋の反応はスライドを腕の長さで
見る時、容易に対照と識別されるべきである。
２＋の反応はより精密な検査を要する。 結果の判断 ヘモフイルスLP 対照LP 判 断 （＋） （−） Ｈインフルエンザ
型ｂ抗原に対し陽
性 （−） （−） H.インフルエン
ザ型ｂ抗原に対し
陰性 （＋） （＋） 不明確な凝集 Ｈ−インフルエ
ンザ型ｂ抗原は存
在するかも知れず
存在しないかも知
れない ２＋陽性凝集は「弱い陽性」として報告される
べきである。 この明細書を通じ使用されたように熱処理及び
培養の間使用された持続時間と温度とは最適であ
る。より短い時間間隔に対しより高温または逆に
より長い時間間隔に対しより低温で同一結果の得
られうることが理解される。さらに前記の明細者
は本発明の作業能力を確保するため使用された試
薬、媒体及び技術を明示している。しかしなが
ら、技術、時間、容量及び材料、媒体及び装置の
型における変化は本発明の範囲から離れることな
く使用しうることはこの技術の熟達者には極めて
明らかであり、本発明の範囲は付属の請求の範囲
によつてのみ限定されるものである。

【図面の簡単な説明】

ここに添附の第１図は、種々の培養期間後
LPAによつて検知された最少濃度のPRP−５に
関するグラフであり、2⁺またはそれより大なる凝
集は陽性の結果と考えられる。△−△LPは兎
＃144の抗血清で被覆〇−〇LPはロバ＃132抗血
清で被覆したものを示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 化学的及び生物学的に安定なシステムを形成
   し得る生理学的緩衝システム内に懸濁された抗原
   に対し作用する動物抗血清又はその免疫グロブリ
   ン留分にて被覆された担体粒子を含有する液状試
   薬と体液の試験血清とを結合させることより成
   り、抗原を含有する疑いのある体液内の抗原を検
   知する直接凝集方法において、試験血清内での熱
   不安定凝集素の影響を最小にできるポリアニオン
   と試験血清内での熱安定凝集素の影響を最小にで
   きる還元剤を含む血清緩衝システムを反応混合物
   に付加することによつて不明確凝集の影響を実質
   的に除去したことを特徴とする直接凝集方法。 ２ 前記ポリアニオンがナトリウムポリアンエト
   ール、デキストランサルフエート、カラゲニン及
   びヘパリンより成る群から選ばれる特許請求の範
   囲第１項に記載の直接凝集方法。 ３ 前記還元剤が２−メルカプトエタノール、ジ
   チオスレイトール、グルタチオン及びシステイン
   より成る群から選ばれる特許請求の範囲第１項に
   記載の直接凝集方法。 ４ 試験血清と液状試薬の結合前に試験血清に前
   記血清緩衝システムを付加する特許請求の範囲第
   １項に記載の直接凝集方法。 ５ 試験血清と液状試薬の結合前に液状試薬に前
   記血清緩衝システムを結合する特許請求の範囲第
   １項に記載の直接凝集方法。 ６ 前記血清緩衝システムが、前記試験血清と前
   記液状試薬より成る反応混合物に付加される特許
   請求の範囲第１項に記載の直接凝集方法。 ７ 試験血清、血清緩衝システム及び液状試薬の
   結合前に、通常の動物血清又はその免疫グレブリ
   ン留分が試験血清に付加される特許請求の範囲第
   １項に記載の直接凝集方法。 ８ 液状試薬、血清緩衝システム及び試験血清の
   結合前に通常の動物血清を液状試薬に付加する特
   許請求の範囲第１項に記載の直接凝集方法。 ９ 液状試薬と試験血清の付加の前に通常の動物
   の血清又はその免疫グロブリン留分を血清緩衝シ
   ステムに結合する特許請求の範囲第１項に記載の
   直接凝集方法。 １０ 通常の動物の血清又はその免疫グロブリン
   留分を、液状試薬、血清緩衝システム及び試験血
   清より成る反応混合体に付加する特許請求の範囲
   第１項に記載の直接凝集方法。 １１ 前記試薬は、前記抗原に対する抗体を含有
   しない通常の動物の血清を含む特許請求の範囲第
   １項に記載の直接凝集方法。 １２ 抗原に対する抗体を吸着して有する微細粒
   子と血清緩衝システムの懸濁より成り、該血清緩
   衝システムは、血清供試品中の熱不安定凝集素の
   影響を最小にできるポリアニオンと血清供試品中
   の熱安定凝集素の影響を最小にできる還元剤の混
   合物を含むことより成る、抗原を含有する凝いの
   ある体液内の抗原を検知する試薬。