JPH02504581A

JPH02504581A - ヒトマンノース結合タンパク質

Info

Publication number: JPH02504581A
Application number: JP63507701A
Authority: JP
Inventors: エゼコウィッツ、レイモンド・アラン・ブライアン
Original assignee: チルドレンズ・ホスピタル・コーポレイション
Priority date: 1987-08-20
Filing date: 1988-08-05
Publication date: 1990-12-27
Anticipated expiration: 2014-03-10
Also published as: DK43890D0; DE3856180D1; WO1989001519A1; DK43890A; EP0375736A1; FI900808A0; JP2868777B2; ATE165980T1; EP0375736B1; DE3856180T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１６．請求項１４に記載のペプチドを含む細胞。１７、細菌、真菌、または真核生物細胞である請求項１５に記載の細胞。１８、該ウィルスがワクシニアウィルスであり、該細菌が大腸菌であり、該真菌が酵母であり、該真核生物細胞が培養細胞株である請求項１６に記載の細胞。１９、請求項１４に記載のペプチドを含む治療剤。２０、細菌、真菌またはウィルスに感染した動物の治療方法であって、該歎物にマンノースに結合することのできるペプチドを投与することを特徴とする方法。２１、該ペプチドが、炭水化物に結合することのできるヒトマンノース結合タンパク質断片を含む請求項２０に記載の方法。２２、該ペプチドが、該細菌、真菌またはウィルスの増殖または感染を抑制する請求項２１に記載の方法。２３、細菌、真菌またはウィルスに感染した動物の治療方法であって、該動物に請求項１４に記載のペプチドを投与することを特徴とする方法。２４、該動物がヒトである請求項２０に記載の方法。２５、該ペプチドを、該ペプチドを含む粉末をその足に適用することにより投与する、請求項２４に記載の方法。２６、該ウィルスが）（ＩＶであり、該ペプチドが真核生物細胞の該ウィルスによる感染を度合を特徴する請求項２３に記載の方法。２７、該投与が局所投与、静脈内投与、筋肉的投与または経口投与である請求項２４に記載の方法。２８、請求項１４に記載のペプチドに結合する抗体。２９、ウィルス、細菌または真菌による感染の感受性を診断する方法であって、マンノース結合タンパク質の血清レベルを検出することを特徴とする方法。３０、該検出を、該血清との請求項１５に記載の抗体の反応を検出することにより行う請求項２９に記載の方法。３１、該検出をＥＬ　Ｉ　ＳＡ試験により行う請求項３０に記載の方法。３２、該ペプチドが、該ヒト中で１〜５００μｇ／ｚ（ｌの最終濃度で提供されるマンノース結合タンパク質である請求項２６に記載の方法。明　　　細　　　書ヒトマンノース結合タンパク質太匪旦１量この発明は、マンノースに結合することのできるタンパク質に関する。マンノース結合タンパク質（Ｍ　Ｂ　Ｐ　ｓ）は、ウサギ、ラット、およびヒト肝臓から単離されている［ティラー（Ｔａｙｌｏｒ）ら、Ｃ１ｉｎｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ　７０　：５３９．１９８６］。Ｍ　Ｂ　Ｐ　ｓはまた血清中にも見出されており、病原性生物を処理する役割を有している（同上）。記載している。これらＭ　Ｂ　Ｐ　ｓは、１つのＭＢＰの３０ｋＤａサブユニツトに対して産生された抗体を用いて検出された。この著者らは、血液循環中の有害な糖タンパク質が除去される前にＭ　Ｂ　Ｐ　ｓがこれら糖タンパク質に結合すること、および酵母および細菌にはＭＢＰＳが結合する糖タンパク質が含まれることを示唆している。Ｍ　Ｂ　Ｐ　ｓとは区別されるマンノースレセプターを記載している。これら２種のタンパク質は、一方のタンパク質に対する抗体が他方のタンパク質とも反応するので構造的に関連しているものと思われる。ワイルド（Ｗｉｌｄ）ら（Ｂ　ｉｏｅｈｅｍ、　　Ｊ　、　　２工０：１６７．１９８３）は、ヒトおよびラット肝臓からのＭＢＰの単離を記載している。ヒトＭＢＰは分子量が１００万よりも大きく、２８ｋＤａと３０．５ｋＤａのサブユニットからなっている。トリツカマー（Ｄ　ｒｉｃｋａｍｅｒ）ら（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ、　　２６１　：６　Ｂ　７Ｂ、１９８６）は、ラット肝臓からのＭ　Ｂ　Ｐ　ｓの単離、およびこれらタンパク質をコードするｃＤＮＡのクローニングを記載している。各ＭＢＰは、システィンに富んだ領域、コラーゲン様ドメインおよび炭水化物結合ドメインを有している。発明の要約一つの態様において、本発明は、ヒトマンノース結合タンパク質の少なくとも約２０個の連続アミノ酸をコードする工学的（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）核酸、またはヒトマンノース結合タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズ条件下でハイブリダイズすることのできる、少なくとも約６０または９０塩基を育する工学的核酸を特徴とする。工学的核酸とは、組換えＤＮＡ法により天然の環境から分離された核酸、または合成核酸、またはｃＤＮＡを意味する。この核酸はＤＮＡまたはＲＮＡの断片であってもよく、ベクター系の中に存在していもよく、また生物ゲノム内に存在していてもよい。他の態様においては、本発明はベクター、および発現ベクターまたはこれらベクターを含有する細胞を特徴とし、各ベクターは工学的核酸を有している。本発明はまたこれらベクターまたは細胞から発現されたペプチドを特徴とする。ペプチドとは、２個またはそれ以上のアミノ酸の鎖を意味し、タンパク質およびポリペプチドを含む。これらペプチド、およびこれらペプチドに対する抗体は治療剤または診断剤として用いることができる。好ましい態様において、本発明の核酸は、ヒトマンノース結合タンパク質の少なくとも３０アミノ酸の断片に対し７５％以上の相同性を有するペプチドをコードする。本発明の核酸は、ヒトマンノース結合タンパク質をコードするのが最も好ましい。他の好ましい態様では、本発明の核酸はｃＤＮＡであり、ハイブリダイズ条件は、５ＸＳＳＣ中で４２℃で行い洗浄を０．ｌＸ５ＳＣで６８℃で行うものであり、核酸が炭水化物結合領域をコードするものである。該領域は、第１図に示すように領域３０９〜７１４からの少なくとも約６０塩基を有する領域であるのが最も好ましい。該核酸を、毒素分子の毒性部分をコードする核酸に連結する。該毒素分子は、ＡＺＴ、リシン、またはコレラ毒素から選択するのが最も好ましい。細胞は、ウィルス、細菌、真菌、または真核生物細胞である。ウィルスはワクシニアウィルスであり、細菌は大腸菌であり、真菌は酵母であり、真核生物細胞は培養細胞株である。関連する態様において一本発明は、ＡＴＣＣに株番号６７４８３で寄託されている、ヒトマンノース結合タンパク質をコードする核酸の少なくとも約６０の連続塩基からなる核酸断片を特徴とする。別の態様において、本発明は、細菌、真菌、またはウィルスの感染した動物を処理する方法を特徴とする。該方法は、これら生物上のマンノース単位と結合することのできるペプチドを提供することを必然的に伴う。該ペプチドは、宿主防御細胞を該生物に引き付けることができる。該方法は、さらに動物に該ペプチドを投与することを必然的に伴う。好ましい態様において、該ペプチドは、炭水化物に結合することのできるヒトマンノース結合タンパク質断片である。このペプチドは、細胞、真菌、またはウィルスを不活化することができ、上記のごときペプチドである。最も好ましくは、動物はヒトである。感染の結果、菌血症または局部的細菌感染、寄生虫感染、または真菌の転移増殖となり、投与経路は、静脈内、筋肉内、経口、または局所投与であり、すなわち、粉末薬、またはローション剤の剤形で投与する。また、ウィルスはＨＩＶまたは関連ウィルスであり、該ペプチドは該ウィルスによる真核生物細胞の感染の度合を低減させる。該タンパク質またはペプチドは、ヒト血清または組織中に１〜５゜Ｏμ９／ｌ（ｌの最終濃度で提供されるマンノース結合タンパク質である。別の態様において、本発明は、ウィルス、細菌、寄生虫または真菌による感染の感受性のある患者を診断する方法を特徴とし、該方法は動物におけるマンノース結合タンパク質の血清レベルを検出することを特徴とする。その際、このレベルは感染に対する動物の感受性を反映する。該方法は、上記ペプチドに対する抗体と血清との反応を検出することを特徴とするのが好ましく、また、該検出はＥＬＩ　ＳＡ試験からなっているのが最も好ましい。本発明の他の特徴および利点は、本発明の好ましい態様についての以下の記載、お上び請求の範囲から明らかであろう。好ましい態様の記載４、

【図面の簡単な説明】

区里第１図は、ｐＭＢＰ中に挿入したヒトＭＢＰｃＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ地図である。特表千２−５０４５８１（４）第２図は、該ｃＤＮＡ配列およびヒトＭＢＰの対応アミノ酸配列である。第３図は、ゲノムＤＮＡ、および３つのすべての解読わくで示した対応アミノ酸配列である。第４図は、ＭＢＰの提唱モデルの図解である。第５図は、ヒトＭＢＰのアミノ酸配列を他のレクチンと比較して示すものである。不変領域は再上段に、ガラクトース特異的領域およびマンノース特異的領域は下段に示しである。ヒトマンノース結合タンパク　（ヒトＭＢＰヒトＭＢＰは可溶性のレクチン様分子であり、肝細胞で合成され、血流中に放出される。一般に、ヒトＭＢＰは、その炭水化物結合ドメインにおいてマンノースのような炭水化物と結合することができる。ヒトＭＢＰは、一般に、たとえばマンノース−セファロースカラムを通過させることにより、上記ワイルドおよびトリツカマーにより記載されたようにして単離することができる。ヒトＭＢＰの一般構造を第４図に示しである。アミノ末端ＩＯはシスティンに富んでおり、鎖間ジスルフィド橋による多量体生成と一致している。これに続く部分は、非筋原繊維コラーゲン遺伝子のものと同様な、Ｇ　ｌｙ　−Ｘ　−Ｙ　（Ｇ　ｌｙはグリシンを表す。ＸおよびＹは他のアミノ酸である）の繰り返しパターンを有するコラーゲン様部分１２である。最後に、カルボキシ末端の炭水化物認識ドメイン１４が存在する。マンノース結合ドメインはこの領域内にある。ヒトＭＢＰをコードする核酸、たとえばＤＮＡは、標準的な方法により単離することができる。たとえば、トリツカマーら（上掲）により記載されたようにして、該核酸に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを構築し、ゲノムライブラリーかまたはｃＤＮＡライブラリーをプローブするのに用いることができる。別法として、関連遺伝子からの遺伝子断片をプローブとして用いることができる。該プローブは、ヒトＭＢＰの炭水化物結合ドメインの領域と相同であるのが好ましい。この方法によって単離したクローンには工学的核酸が含まれる。いったん単離したら、ヒトＭＢＰをコードする遺伝子は、組換えヒトＭＢＰタンパク質、またはそのペプチド断片を製造するのに有用である。加えて、修飾ペプチドを発現させるために該核酸を標準的な方法によって修飾することができる。つぎに、ヒトＭＢＰをコードする核酸のクローニングを記載する。これら実施例は本発明を限定するものではなく、同様の結果を得るために多くの等価な手段が存在することは当業者により認識される肝臓ｃＤＮＡライブラリーをｐＫＴ２１８中で構築した。このライブラリーを、トリツカマーら（上掲）により記載されたようにして止ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したゲル精製放射性標識ラットＭＢＰ−ＣｃＤＮＡ配列を用いてプローブした。このプローブを、潜在的に有用なりローンを同定するために厳重でない（ｎｏｎ　−ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下で用いた。フィルターを、０．７５Ｍ　ＮａＣ１，５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、５ｘデハルツ（Ｄ　ｅｈａｒｄｔｓ）溶液およＵ　０　、１　％　Ｓ　Ｄ　Ｓ　（５Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ）中、４２℃にて１時間プＬ／ハイブリダイズし、ついで４２℃で一夜ハイブリダイズした。このフィルターを４５℃にて２ｘＳＳＣ中で３０分間、ついで１ｘＳＳＣ中で３０分間洗浄した。さらに、キアッコウスキー（Ｋ　ｗｉａｔｋｏｖｓｋｉ）ら（３２３Ｎａｔｕｒｅ　４５５，１９８６）により記載されたようにして、大腸菌Ｃ６００中にプレートしたλＨＥＰＧ２　ｇｔｌ　ＯｃＤＮＡライブラリーをスクリーンした。ｐＭＢＰを含む５つのクローンを単離し、それらの配列をＭ１３、Ｍｐ１８クローニングベクター（メッシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）ら、Ｌ匹ムＮａｔ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　７土：３６４２．１９７７）を用いサンガー（Ｓ　ａｎｇｅｒ）らの方法（７４Ｐｒｏｅ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ５４６３．１９７７）により決定した。この配列は、第２図に示しである。ｐＭＢＰの制限地図は第１図に示してあり、上記λｇｔｌＯライブラリーから単離した３　、　６　ｋｂの旦ｃｏＲＩ挿入部を有している。施例２ニゲツムクローン断片（第１図）をヒトゲノムライブラリーのためのプローブとして用いた。このライブラリーは、ＥＭＢＬ　　３ＡのＢａ＋ａＨ１部位にＭｂ。ｌ消化ゲノムＤＮＡを挿入することにより標準的な方法でＥＭＢＬｓＡ中に構築した。厳重な（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ）条件下でハイブリダイズしたクローンを単離した。とりわけ、洗浄条件が０．１　ｘＳＳｃ中、６８℃で行うものであった他は上記のようにしてハイブリダイゼーションを行った。陽性と同定されたクローンをプラーク精製し、それらの核酸配列を上記のようにして決定した。この配列を第３図に示す。他の関連する遺伝子をもこの方法により単離することができる。たとえば、マクロファージの膜レセプタータンパク質は、より厳重・でない条件下（３７℃にて上記ハイブリダイゼーション緩衝液を使用）ではそのＤＮＡがヒトＭＢＰプローブとハイブリダイズすること、およびヒトＭＢＰと同様のサイズを有するペプチドはヒトＭＢＰに対する抗血清で免疫沈降する点でヒトＭＢＰと類似している。ヒトＭＢＰペプチド断片の発現は、標準的な方法を用いて行なゎれる。たとえば、ヒトＭＢＰをコードするＤＮＡ、好ましくはｃＤＮＡの所望の領域を上記クローンのうＳｏｌつから単離し、幾つかの標準発現ベクターのうちのいず八に挿入することもできる。発現のための好ましい領域は、二本化物結合ドメイン、最も好ましくはマンノース結合ドメインをコードする領域である。この領域は、第１図においてヌクレオチド塩基３５９〜８０７の間にあり、３５０ｂｐのＰｓｔｌ −Ｘｂａｌ断片を含んでいる。所望の領域を一層明確に同定するため、該配列をヒトマンノースレセプターのような関連タンパク質中の配列と比較する。ラットＡおよびＣＭＢＰｓとの比較により、コラーゲン領域と同等な領域、ヌクレオチド塩基２８７〜３５９において他のマンノース結合タンパク質の間で最大の相同性が認められる（第１図）、この領域はマンノース結合に関与していないので、本発明には有用ではない。むしろ、第１図において３５９〜８０７の領域が非常に有用である。ヒトＭＢＰの特定の領域がマンノースに結合するかどうかを示すために、ヒトＭＢＰをコードするｃＤＮＡを標準的な方法で製造し、ちょうどこの領域を含有するクローンを生成させることができる。ついで、得られたクローン化ＤＮＡを発現ベクター中に挿入する。ついで、そのようなベクターにより生成したペプチドをマンノース−セファロースカラムに通し、マンノースに結合するかどうかを調べる。別法として、ラジオイムノアッセイを行い、放射性標識マンノースが発現ペプチドと反応するかどうかを調べることができる。マンノースに結合するこれらペプチドは、この発明に有用である。ヒトＭＢＰペプチドのアミノ酸の単一の短い直線状領域がマンノースとの結合に関与していることはありそうもなく、むしろ、おそらくそのような領域の２個またはそれ以上が協同し合って、マンノースと反応し結合することのできる３次元ペプチド構造を形成するのであろう。そのような領域は、上記のように他のマンノース結合タンパク質との比較により同定することができ、すべてのそのような領域をコードするＤ　Ｎ　Ａ断片をクローニングし発現することができる。そのようなりＮＡ断片は、長さが少なくとも６０〜９ｏ塩基対であり、少なくとも約２０〜３０アミノ酸をコードしているらし第５図を参照すると、マンノースもしくは他の糖結合特異性を有する他のレクチンをヒトＭＢＰと比較することにより、そのような比較を行った。第５図において下方の列はマンノース結合タンパク質との一致を示しており、この列および上方の列（不変アミノ酸を示す）のアミノ酸がマンノースへの結合にとって最も重要である。これらの結果は、ヒトＭＢＰをヒトおよびラット肝アシアロ糖タンパク質レセプター［トリツカマー、１９８７、ストラフチャー・アンド・バイオシンセシス・オブ・メンプラン・レセプターズ・ツイツチ・ミーディエイト・エンドサイト− シス・オブ・グリコプロテインズ（Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｍｅｍｂｒａｎｅ　ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ　ｗｈｉｃｈｍｅｄｉａｔｅ　ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ　ｏｒ　ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ）、キドニー争インターナショナル（Ｋ　１ｄｎｅｙ　Ｉ　ｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、印刷中コ、トリ肝レセプター［トリツカマー、１９８７、上掲書コ、イヌのアポタンパク質［ベンメン（Ｂ　ｅｎｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳ　Ａ　　８２　：６３７９．１１７：３６１，１９８５］を含むレクチンタンパク質：ニス・ベリギ五７（Ｓ　、　ｐｅｒｉｇｉｎｉａ）の血リンパから単離したガラクトース特異的レクチンのＮＨ，部分［タカハシ（Ｔ　ａｋａｈａｓｈｉ）ら、Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ。２６０：１２２２８．１９８５］：ウニのニー・クラシスビナ（Ａ、ｃｒａｓｓ　１ｓｐｉｎａ）の体腔液から単離したレクチン［ギガ（Ｇ　ｉｇａ）ら、Ｊ、Ｂ匪Ｃｈｅｗ、　　１３　：６１９７．１９８７］；ニワトリ軟骨コアプロテオグリカンタンパク質［シガク（Ｓ　ｈｉｇａｋｕ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。Ｓｃｉ、ＵＳＡ　　８３：５０８１，１９８６コおよびＩｇＥＦｃレセプター［イクタ（Ｉ　ｋｕｔａ）ら、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　　８４：８１９、＋９８７３と比較することによって得た。上記マンノース結合ペプチド、または全組換えタンパク質は、表面上でマンノースを発現する細胞、たとえば細菌、真菌およびウィルスなどを特に標的とするのに有用である。それゆえ、このペプチドをそのような細胞を殺したり増殖を抑制したりすることのできる分子と結合することにより、優れた治療学的用途を何するハイブリッドペプチドを構築することができる。たとえば、リシンおよびコレラ毒素の毒性部分、またはＡＺＴなどの化学物質をこのペプチドと結合することができる。このことを行うために、たとえば、マーフィー　（Ｍ　ｕｒｐｈｙ）の米国特許第４，６７５，３８２号明細書に記載されているように、そのような毒素をコードする核酸をマンノース結合ペプチドをコードする核酸に連結させ、単一物として発現させてハイブリッドペプチドを生成させることができる。別のやり方として、たとえば、ロス（Ｒｏｓｓ）の米国特許第４，２７５，０００号明細書に記載されているように、これら２つのペプチドを別々に合成し、化学的に連結することができる。ペプチド発現に適した発現ベクターとしては、すべての一般的な細菌ベクター（たとえばｐＫＫ２３３−２、アマン（Ａ＋ｎａｎｎ）ら、Ｇ　ｅｎｅ印刷中、ファルマシア、８００　センテニアル・アブ二二一、ピスカタウエー、ＮＪＯ８８５４より発売）、酵母発現ベクター、ウィルス発現ベクターおよび真核生物ベクターが挙げられる。当業者には、そのようなベクターが一般にそのようなタンパク質を発現するのに適していること、および下記に挙げる実施例は本発明を限定するものでないことがわかるであろう。毒素ペプチドをコードする核酸を有するかまたは有しない完全長または部分ｃＤＮＡＭＢＰクローンは、ベクターｐＳ　Ｖ　２　ｎｅｏ（サザーンら、Ｊ、Ｍ蛙、狐、広肌畦、１：３２７（１９８２）およびクローニング・ベクター°ズ（Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｅｃｔｏｒｓ）、ア・ラボラトリーズ・マニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　Ｍａｎｕａｌ）、パウェルズ（Ｐ　ｏｕｖｅｌｓ）ら編、エルセビエ・サイエンス（Ｅ　１ｓｅｖｉｅｒ　Ｓ　ｃｉｅｎｃｅ）発行、ＮＹ、５２バンダービ）Ｌ、　）　−７ブニユー、ＮＹ、ＮＹ　　１００１７．１９８５）中に連結することができ、該ベクターはＰＢＲ３２２からの複製開始点およびアンピシリン耐性遺伝子を含んでいる。それはまた、転写プロモーターを提供するＳＶ４０配列およびポリアデニル配列をも含んでいる。このＤＮＡを、これら２つの配列の間に挿入する。連結後、この組換えベクターを大腸菌中で増殖させ、ついで、標準的なリン酸カルシウムトランスフェクションプロトコールを用いてチャイニーズハムスター卵巣細胞中に導入する。このベクター上のｎｅｏ遺伝子は６４１８に対する耐性を提供し、これを用いて形質転換細胞を選択することができる。ついで、セファロース−マンノースカラムを用い、これらベクターおよび生物によるマンノース結合ペプチドの発現を行うことができる。発現した物質はカラムに結合し、これを５０＋Ｍ）リス／ｌＯｍＭＥＤＴＡで溶出し、８％ポリアクリルアミドゲル（ラムリ（Ｌａｅ＋＋＋＠ｌｉ）バッファーを使用、Ｎａｔｕｒｅ　２２７　：６００．１９７０）中で電気泳動を行ってペプチドの存在を観察する。マンノース結合ペプチド、すなわち、その上うなカラムに結合するペプチドを産生ずるクローンはこの発明に適している。そのような発現ペプチドまたはヒトＭＢＰ自身に対する抗体は、標準的な方法によって製造することができる。この抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体のいずれでもよく、動物血清中のペプチドを同定したり臨床診断試験に有用である。用途マンノースが表面にさらされていることは多くの病原体の細胞壁の特徴であり、これに対し、ヒトおよび動物を含む高等生物では膜糖タンパク質が加工されて複合糖を有し、これが内部のマンノース残基をマスクしている傾向がある。これら内部のマンノース残基はＭＢＰｓによって認識されない。組換えマンノース結合タンパク質、またはマンノース結合ドメインを含むキメラペプチドは治療剤として有用である。これらタンパク質またはペプチドは、マンノースに富んだ病原体（細菌、真菌、酵母、寄生体を含む）、またはある種のウィルスのエンベロープ糖タンパク質に特異的に結合し、それゆえ、そのような病原体を動物から直接除去することができる。非ウィルス性の病原体に関しては、宿主の防御機構による除去の効率は、マンノース結合タンパク質複合体を食細胞表面に付着させ、そうすることによって該病原体の循環系からのクリアランスを高め、該食細胞にこれら病原体を認識させることによって増大させることができる。マンノースに富んだ糖タンパク質を発現するウィルスに関しては、該ウィルスおよびウィルス感染細胞の直接不活化は、リシン、コレラ毒素、またはジフテリア毒素などの毒素、またはＡＺＴなどの代謝拮抗薬を該マンノース結合タンパク質のマンノース結合ドメインに結合させることによって高められる。たとえば、第１図に示したヒトＭＢＰのカルボキシ末端マンノース結合ドメインを含む３５０ｂｐのＰｓｔｌ−Ｘｂａｌ断片を発現ベクター中で発現させ、生成したペプチドをジデオキシシトシンまたはＡＺＴなどのヌクレオチド類似体に化学的に結合させることができる。下記に示すように、蛍光的に標識したそのようなペプチドは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）を引き起こすウィルスであると考えられているＨＩＶに感染していない細胞には結合しないが、感染細胞には結合する。得られた生成物は、薬物様分子をＨＩＶまたはＨＩＶ感染細胞に対し特異的に標的としてねらうのに特に有効でなければならない。実施例３　：ＨＩ　Ｖ標的ヒトＭＢＰは、Ｈ９ＣＤ４＋細胞がＨＩＶに感染するのを防ぐのにインビボで有効であることが示された。精製ＨＩＶを、高度にｉｏｐ、Δｃｔａ８８３：１９７．１９８６．ワイルドら、Ｂｉｏｃｈｅｔ　Ｊ　。２１０：１６７．１９８３．タウンゼント（Ｔ　ｏｗｎｓｅｎｄ）ら、Ｂ　ｉｏｃｈｅｍ。Ｊ、１９４：２０９．１９８１．およびカワサキら、Ｊ　、　Ｂｉｏｃｈｅｇｅ。９４：９３７．１９８３に記載の方法により調製〕の存在下または不在下でインキユベートした。ついで、この処理ウィルスをＨ９ＣＤ４＋リンパ球（ＨＩ　Ｖ感染の主要な標的である）とともにインキユベートし、７日後にウィルス感染性を、ａ）ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質の出現（特定の抗エンベロープ糖タンパク質抗血清を用いた免疫蛍光法により細胞表面上でアッセイを行った）およびｂ）逆転写酵素活性の存在（該細胞がＨＩＶに感染したときにのみ存在する）により測定した。ヒトＭＢＰは、ウィルスの細胞内への侵入を完全に抑制した。このことは、細胞表面上にＨＩＶエンベロープ糖タンパク質が存在しないこと、および逆転写酵素活性が検出されないことにより示された。コントロール実験により、ヒトＭＢＰによる抑制は特異的であることが示された。これらの実験には、マンノースに富む酵母マンナン、およびネオ糖タンパク質マンノース−ＢＳＡでヒトλＩＢＦを捕捉した。感染細胞または非感染細胞への結合を観察する１；めの蛍光標識ヒトＭＢＰを用いた実験において、マンナンおよびマンノース−ＢＳＡがヒトＭＢＰのウィルス感染細胞への結合を抑制すること、およびヒトＭＢＰは非感染Ｈ９細胞には結合しないことを示すために蛍光標識ヒトＭＢＰを用いに０それゆえ、ヒトＭＢＰは、これら細胞の表面上にさらされたマンノースを認識する。それゆえ、ヒトＭＢＰまたはそのマンノース結合ドメインは、ＨＩＶ、まｆニ：埜細胞表面にマンノースに富んだエンベロープ糖タンパク質を発現する関連ウィルスに感染した細胞を同定するのに適している。ヒトＭＢＰ、そのマンノース結合ドメインまたはそのキメラ分子は、感染細胞を直接かつ特異的に殺すために細胞毒性剤を標的するのに用いることができる。さらに、これら分子は、ウィルス感染のまん延を防ぎ、さらにその初期感染をさえも防ぐために用いることができる。ヒトＭＢＰおよび上記関連ペプチドは、通常の方法により投与することかできる。１ことえば、ヒトＭＢＰおよび関連ペプチドは、１〜５００μ９７峠血清レベル、最も好ましくは１５０μ９／ｚ（ｌの最終濃度で、動物とりわけヒトの血流中に直接注射することができ、このレベルを維持するためにこの投与量を繰り返すことができる。ヒトＭＢＰおよび関連ペプチドは、予防的に、または感染後に投与することができる。同様に、これら分子は、経口投与、皮下注射することができるし、さらに、たとえば細菌感染またはトリコフィトン・ルブルム（Ｔ　ｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ…ヒ叩）（水虫を引き起こす）の感染などの局所感染を治療する１こめに粉末剤やローション剤の形態で適用することさえできる。これらペプチドの他の用途は、ＨＩＶなどの病因による感染に対する動物の感受性を決定することにある。この場合、動物のＭＢＰＳの血清レベルは、たとえばＥＬ　Ｉ　ＳＡプロトコールで得られたヒトＭＢＰまたはその関連ペプチドに対する抗体を用いて測定する。ついで、血清中のＭ　Ｂ　Ｐ　ｓレベルを、ある病因に対するこの動物の感染の感受性と関連付け、また他の動物の感受性を評価するためにこの関連性を用いることができる。それゆえ、たとえば、もし高レベルのヒトＭＢＰがＨＩＶによる感染の感受性の低さと関連付けられるならば、低レベルのヒトＭＢＰを有するヒトは１（ＩＶ感染に対して感受性がある可能性が高いことになる。さらに、ゲノムのレベルでは、そのような感受性は核酸の欠失と関係がある。その上うな欠失は、クローニングしたヒトＭＢＰ遺伝子、またはその断片をプローブとして用いることにより発見することができる。ＨＩＶ感受性と関連する多形性を検出することができ、感染に対する他のヒトの感受性を予測するために用いることができる。！■ １９８７年８月４日に下記寄託をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）に行い、該寄託に対して受託番号Ｎ二〇Ｃ６７４１３３が与えられた。出願人の譲り受は人、チルドレンズ・メディカル・センター・コーポレーシジン（Ｃｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）は、ＡＴＣＣが該寄託の・永続性、ならびに特許が付与されたときに該寄託を公衆に容易に入手させる寄託機関であることを表明する。かくして寄託された材料の公衆への入手のあらゆる制限は、特許が付与されるたとき除かれるであろう。この材料は、特許出願の継続期間中、３７ＣＦＲ１，１４および３５ｔＪＳＣ１２２の下、長官により権利を付与すると決定された者に入手可能となるであろう。該寄託材料は、該寄託微生物試料の提供の最新の要求から少なくとも５年間、および、いかなる場合においても、寄託日から少な（とも３０年間または特許の荷動期間のいずれか長い期間、生存させ汚染されないように保持するために必要なあらゆる配慮をもって維持されるであろう。出願人の譲り受は人は、寄託の条件により該寄託機関が要求された試料の提供を行えなくなった場合は、該寄託を取り替える義務を有することを知っている。他の態様は下記請求の範囲内に開示されている。ＦＩＧ、　２ＦＩＧ、　３ＦＩＧ、　３　Ｃｏｎｔ＋ｊＦＩＧ、　３　ＣｏｎｔｄＦＩＧ、　　３　Ｃｏｎｔｄ国際調査報告 ”　　　　−’　　　　ＰＣＴ／ｌ’ｓ　ｄ５１１０２５９１一、−１ａ−−鰭一−１ＰＣＴ／ＵＳ　ａｌ１１０２５９１

Claims

【特許請求の範囲】

１．ヒトマンノース結合タンパク質の少なくとも約２０個の連続アミノ酸をコードする工学的核酸。
２．ヒトマンノース結合タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズ条件下でハイブリダイズすることのできる、少なくとも約６０塩基を有する工学的核酸。
３．該ヒトマンノース結合タンパク質の少なくとも３０アミノ酸の断片に対し７５％以上の相同性を有するペプチドをコードする請求項１または２に記載の１核酸。
４．該ヒトマンノース結合タンパク質をコードする請求項２に記載の核酸。
５．ｃＤＮＡである請求項４に記載の核酸。
６．ヒトマンノース結合タンパク質をコードする核酸にハイブリダイズ条件下でハイブリダイズすることのできる、少なくとも約９０塩基を有する請求項２に記載の核酸。
７．該ハイブリダイズ条件が、５×ＳＳＣ中で４２℃で行い、洗浄を０．１×ＳＳＣで６８℃で行うものである請求項２に記載の核酸。
８．ＡＴＣＣに株番号６７４８３で寄託されている、ヒトマンノース結合タンパク質をコードする核酸の少なくとも約６０の連続塩基からなる核酸断片。
９．炭水化物結合領域をコードする請求項６に記載の核酸。
１０．該領域が、第１図に示した領域３５９−８０７からの少なくとも約６０塩基からなる請求項９に記載の核酸。
１１．毒素分子の毒性部分をコードする核酸に連結される請求項１０に記載の核酸。
１２．該毒素分子が、ＡＺＴ、リシン、またはコレラ毒素から選ばれる請求項１１に記載の核酸。
１３．請求項１、２、８、９、１０、１１または１２に記載の核酸を含むベクターまたは発現ベクター。
１４．請求項１、２、８、９、１０、１１または１２に記載の核酸によりコードされるペプチド。
１５．請求項１、２、８、９、１０、１１または１２に記載の核酸を含む細胞。
１６．請求項１４に記載のペプチドを含む細胞。
１７．細菌、真菌、または真核生物細胞である請求項１５に記載の細胞。
１８．該ウイルスがワクシニアウイルスであり、該細菌が大腸菌であり、該真菌が酵母であり、該真核生物細胞が培養細胞株である請求項１６に記載の細胞。
１９．請求項１４に記載のペプチドを含む治療剤。
２０．細菌、真菌またはウイルスに感染した動物の治療方法であって、該動物にマンノースに結合することのできるペプチドを投与することを特徴とする方法。
２１．該ペプチドが、炭水化物に結合することのできるヒトマンノース結合タンパク質断片を含む請求項２０に記載の方法。
２２．該ペプチドが、該細菌、真菌またはウイルスの増殖または感染を抑制する請求項２１に記載の方法。
２３．細菌、真菌またはウイルスに感染した動物の治療方法であって、該動物に請求項１４に記載のペプチドを投与することを特徴とする方法。
２４．該動物がヒトである請求項２０に記載の方法。
２５．該ペプチドを、該ペプチドを含む粉末をその足に適用することにより投与する、請求項２４に記載の方法。
２６．該ウイルスがＨＩＶであり、該ペプチドが真核生物細胞の該ウイルスによる感染を度合を低液する、請求項２３に記載の方法。
２７．該投与が局所投与、静脈内投与、筋肉内投与または経口投与である請求項２４に記載の方法。
２８．請求項１４に記載のペプチドに結合する抗体。
２９．ウイルス、細菌または真菌による感染の感受性を診断する方法であって、マンノース結合タンパク質の血清レベルを検出することを特徴とする方法。
３０．該検出を、該血清との請求項１５に記載の抗体の反応を検出することにより行う請求項２９に記載の方法。
３１．該検出をＥＬＩＳＡ試験により行う請求項３０に記載の方法。
３２．該ペプチドが、該ヒト中で１〜５００μｇ／ｍｌの最終濃度で提供されるマンノース結合タンパク質である請求項２６に記載の方法。