JPH02503148A - タンパク質混合物を組織化するためにトランスグルタミナーゼ遺伝子を発現する微生物の食品産業での使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 タンパク質混合物を組織化するため にトランスグルタミナーゼ遺伝子を 発現する微生物の食品産業での使用 本発明の目的は、遺伝子操作によりトランスグルタミナーゼ遺伝子を受けた微生 物が、食品又は化学産業において利用できる微生物発酵に使用され得る広範囲な 方法に関する。

トランスグルタミナーゼは、タンパク質のグルタミン残基とアミン又は塩基性ア ミノ酸、たとえばりシンのアミノ基との反応を触媒するクラスの酵素を構成する 。従って、これらンに乏しいタンパク質膜へψリシンのグラフト化、又は種々の タンパク質のそれらの間での架橋を可能にする。

これらの酵素は真核生物界に存在し、そして原核生物（細菌）には現存していな い、それらは種々の構造を有し、そして哺乳類においては、肝臓、毛包、前立腺 、子宮及び胎盤、又は血液中の血漿及び血小板中において細胞性であることがで きる。後者の場合、トランスグルタミナーゼ′（第Ｘ■因子）は、血液の凝固に 関与し、そしてこの酵素の食品使用は、ブラックプディングの製造に貢献する。

酵素調製物の形で多かれ少なかれ精製されたタンパク質に添加されるトランスグ ルタミナーゼの使用は、既知方法である。この目的に対するＧｏＭａｔｈｅｉｓ 及びＪ、Ｒ，Ｗｈｉｔａｋｅｒによる書評文献は、１９８４年以前の研究を報告 する（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＦｏｏｄＢｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１１．３ ０９〜３２７．１９８７）。これまで出版された出版物又は特許の間に、トラン スグルタミナーゼの実質的な使用に基づくいくつかの技法が記載されている。

前もってのアシル化を伴って又は伴わないでトランスグルタミナーゼの作用によ るあるタンパク質（カゼイン）の脱アミノ化は、タンパク質調製物の溶解性及び 乳化特性を高める（Ａｊ　１ｎｏａ＋ｏｔｏ■の名で出願された日本特許出願第 ５９．２１０．０９７号）。

トランスグルタミナーゼによる触媒によりグルタミンに多かれ少なかれ冨むタン パク質支持体上への種々のアミノ酸（リシン、メチオニン、システィン、トリプ トファン）のグラフト化が、２種の特許登録に存在する０両者の場合、食物タン パク質（カゼイン、大豆、グルテン、肉、漁、トウモロコシ又は米）又はそれら の分解生成物の栄養性質を高める問題が存在し、そして反応中のＣａ”イオンの 役割が強調されている（Ｓｎｏｗ　Ｂｒａｎｄ　Ｍｉｌｋ　Ｐｒｏｄｕｃｔｓの 名での日本特許出願第５８．０２８，２３４号、Ａｊ　ｉｎｏｍｏｔｏの名での 日本特許出願第６１．０６７．４９７号）。

種々のタンパク質上への酵素又は補酵素の固定化が、４種あ特許に表示される。

★トランスグルタミナーゼによる動物、植物又は細菌タンパク賃上へのＮＡＤ又 はＮＡＤＰ補酵素の固定化が、医薬的使用又は汚染を除去するために記載されて いる（Ｓｎｏｗ　Ｂｒａｎｄ　ＭｉｌｋＰｒｏｄｕｃｔｓの名での日本特許出願 第５８．０２８．２９５号）。

★いくつかの型の酵素が、トランスグルタミナーゼによりタンパク質（カゼイン 、又は他の動物又は植物タンパク質）を架橋することによって構成された膜に固 定され得る。従って、その酵素は、膜上に固定される触媒のすべての利点を有す る（Ａｊ　１ｎｏｏ＋ｏｔｏ■の名での日本特許出願第６１．２２７．７８３号 ）。

★トランスグルタミナーゼは、キャリヤータンパク質に結合されるその１つのモ ノクローナル抗体自体を介じて固定さナーゼ活性を指図することが可能である（ 　Ａｊ　１ｎｏｎ＋ｏ　ｔｏ■の名での日本特許出願第５９．１７５．８８４号 ）。

★２種の特許は、特定の構造体の調製のためへのトランスグルタミナーゼの使用 を記載する。液体相に分散されるタンパク質（牛乳タンパク質、コラーゲン、ゼ ラチン又は植物種子からのタンパク質）に関して、トランスグルタミナーゼは、 ひじょうに水和化された化粧用製品の獲得を可能にし、そしてその得られたタン パク質ゲルは、多（の割合の水に保持することができる（Ａｊｉｎｏａ＋ｏｔｏ ■の名での日本特許出願第６１．１７２，８０７号）、この技法の変法は、タン パク質ゲルの成形、続いて部分乾燥を付与し、これは、熱湯中で安定しており、 広範囲のｐＨにわたって不溶性であり、そしてそれから生物分解性パッケージフ ィルム又は酵素固定支持体を製造するために十分に機械的に耐性なものであるタ ンパク質膜の製造を可能にする（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ　ＫＫの名での日本特許出 願第６１．１５２．２４７号）。

★製品の製造に関する使用は、これらのトランスグルタミナーゼを含むゼリー化 された網状構造にその製品をするために、タンパク質にその酵素を添加すること によって食品又は医薬調製物中に有用な酵素を固定化することから成る。その使 用されるタンパク質は、大豆タンパク質又はゼラチンであり得る。例として言及 されるそれらの酵素は、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、グルコースオキシダ ーゼ、カタラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ及びリボヌクレアーゼＡであ る（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ　ＫＫの名での日本特許出願第５９，０６６．８８６号 ）。

★最後に、２種の特許が、食品産業に直接関係する。１つは、タンパク質、油又 は脂肪及び水を含むエマルジョンへのトランスグルタミナーゼの添加により製造 される食品調製物のためにタンパク質ゲルを得るための方法を記載する（Ａｊｉ ｎｏａ＋ｏｔｏ　ＫＫの名での日本特許出願第５９．０６６、８８６号）、もう １つは、トランスグルタミナーゼの作用下で、溶液中においてタンパク質を架橋 することによるタンパク質ゲルの調製法を記載する（Ａｊｉｎｏｍｏｔｏ　ＫＫ の名での日本特許出願第５８．１４９．６４５号）。

これらの特許の他に、いくつかの科学出版物は、トランスグルタミナーゼの使用 に基づいてＡｊｉｎｏｍｏｔｏ　）［Ｋの協力で行なわれた研究を報告する。こ れらの研究は、これまで出願され、そして言及された特許の内容を正確に確保す る。これらの文書は、本発明について報告又は触れもしていない、特に、タンパ ク質の組織化を引き起こすために、トランスグルタミナーゼをその場で生成する 微生物の使用喘報告されていない。

これまでの発見及び前記特許に比較しての、本出願の目的である本発明の独創性 は、言及されたすべての特許の目的であるトランスグルタミナーゼの酵素的調製 でなく、形質転換されるべき混合物又は生成物中において増殖しながら、遺伝子 的変性の結果として、これらの酵素を産生ずることができる微生物の導入から成 る。

この方法は、より経済的である。なぜならば、それは、酵素の使用の前、酵素の 製造及び分離のためのすべての操作を除去できるからである。

この方法はまた、ひじょうに柔軟性がある。なぜならば、それは、最適な時にそ の酵素の効果を得、そして所望する結果が得られる場合、必要とされる時にその 作用の機能としてこの酵素の産生を停止するために、遺伝子の発現を可能にする 生理化学的条件を操作することによって酵素の産生を遅（し、そして調節するこ とができるからである。従って、それは、産生される酵素の量を調節することに よって、原料、特に農業起源のものの反応における変動の補正をその結果の観点 から可能にする。これは、少なくとも酵素が反応媒体を固形化する効果を有する これまで発見された酵素添加の技法によっては不可能である。

この方法はまた、変性された菌株の賢明な選択により、いくつかの効果、たとえ ば乳酸細菌による酸性化と組織化との組合せ、又は酵母の使用により新しい酸素 供給生成物を得るための組織化とガス（ＣＯ□）の生成との組合せの同時獲得を も可能する。

本発明の方法の変法は、液体媒体中に微生物を予備培養し、次に限外濾過により その培養物を濃縮し、そしてその使用の前、病原性微生物の可能性ある増殖を避 けるために培養時間を制限するために、逆浸透又は凍結乾燥することから成る。

トランスグルタミナーゼと呼ばれる酵素のための遺伝子情報が微生物中に導入さ れた後、本発明は、種々のタンパク質とアミン（又はアミンを含まない）との混 合物中において、遺伝子操作により形質転換されたこれらの微生物の使用、及び 発酵の間、タンパク質の組織化のいくつかの方法を実施するために糖質を含むこ とから成る。

微生物中でクローン化された、酵素の遺伝子はいくつかの起源を有する：テンジ クネズミ又はウサギの肝臓から、胎盤から又は血小板からのトランスグルタミナ ーゼ（ＴＧａｓｅｓと呼ばれる）、このＴＧａｓｅは、１又はい（つかのサブ単 位を有する０本発明に使用され得る微生物の遺伝的形質転換は、従来の遺伝子工 学技法により、たとえば遺伝子源として動物器官から単離されたｃＤＮＡライブ ラリィ−又はｍＲＮＡを用いて、微生物（たとえば、Ｅ、コリ（Ｌｃｏｌｉ）） による遺伝子の操作及び適切なベクターを用いての標的微生物中への前記遺伝子 の導入により行なわれ得る。この研究の一部の段階は、Ｋ、ＩｋｕｒａｓＴ、Ｎ ａ５ｕ、　Ｈ，Ｙｏｋｏｔａ、　Ｒ，５ａｓａｋｉ及びＨ，Ｃｈｉｂａ（Ｃｌｏ ｎｉｎｇ　ｏｆ　ｃＤＮＡｃｏｄｉｎｇ　ｆｏｒ　Ｇｕｉｎｅａ　Ｐｉｇ　１ｉ ｖｅｒ　ｔｒａｎｓｇｌｕｔａｍｉｎａｓｅ−Ａｇｒｉｃ。

ｂｉｏｌ、ｃｈｅｍ、、　５１　（３）、　９５７〜９６１．１９８７）により 記載される。

クローン化された６０％の遺伝子が微生物に発現可能であり、そしてＴＧａｓｅ が微生物の壁の表面上に分泌又は固定され：従って、水性媒体におけるこの微生 物の細胞の懸濁液は、ＴＧａｓｅ活性及び発酵特性の両者を有するが、しかしこ の日本人の研究においては、形質転換された微生物が、食品産業で使用すること ができないＥ、コリである。

その後、他の微生物が、遺伝子工学により、第Ｘ■因子、すなわち血漿中のトラ ンスグルタミナーゼのための遺伝子を受けた（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、　Ｉ ｎｃ、の名でのヨーロッパ特許出願第０．２６８．７７２号を参照のこと）、第 ＸＩＩＩ＆因子の産生を可能にする微生物は、Ｅ、コリタイプ又は種々のバシラ ス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌及び酵母サツカロミセス　セレビシアエ（錘匹ア 出１匹腔ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）及び酵母スキゾサッカロミセス　ボンベ（匙桓 μｙ瘍山郵姐四競匹創徂）の株である。アスペルギラス（勧月田住■吐）又はネ ウロスポラ（傾肛並匹■）属の糸状菌もまた好都合である。　Ｚｙｍｏｇｅｎｅ ｔｉｃｓ　Ｉｎｃ、により構成された微生物は、寄託番号第４０２６０及び４０ ２６１号としてＡａ＋ｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔ ｉｏｎに寄託されている。従って、たとえばこれらの菌株の１つが、本発明に含 まれる技術に使用され得る。

本発明は、食品を産業的に製造するために、種々のトランスグルタミナーゼを生 成する微生物の使用を目的とする。従って、これらの新規微生物は、遺伝子工学 の技法による形質転換の後、次の種々の酵母株であり得るニゲルコース及び／又 はスクロースを含む溶液を発酵するために適切であるサッカロミセスセレビシア エ、ラクトース及び他の糖質を含む溶液を発酵するために適切であるクルイベロ ミセス　ラクチス（Ｋｌｕ　ｖｅｒｏｓ　ｔｅｓ　１ａｃｔｉｓ）又はタンパク 質溶液上で増殖するために適切であるヤロウイア　リポライチカ（Ｙａｒｒｏｗ ｉａ月１杜Ｊ１徂）。

形質転換された微生物はまた、食品産業において使用することができる細菌、た とえばバシラス　サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）又はすでに 使用された細菌、たとえば乳酸菌：ストレプトコーカス　ラクチス（釘旦鄭窯徨 匹姐１ａｃｔｉｓ）　、’１クトバシラス　カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕ ｓ　ｃａｓｅｉ）　、ラクトバシラス　ラクチス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ 　１ａｃｔｉｓ）及びラクトバシラス　プランタラム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌ ｕｓ且μ山ｍ已）でもあり得る。

ミルク中においてラクトースを発酵するそれらの能力を保持しているこれらの形 質転換された乳酸菌は、乳酸を生成し、そしてＴＧａｓｅ活性を発現することが できる。

本発明は、発酵可能な糖質を含むか又は含まない、そしてＣａ”イオン（ＴＧａ ｓｅ酵素を安定化する）を含むか又は含まない人工的なタンパク質溶液から成る 混合物、又は天然混合物、たとえばミルク、肉ピユーレ、穀物のペースト及びス ラリー、もしくはそれらの組合された混合物中に、これらの遺伝的に形質転換さ れた微生物の株（又はいくつかの株）を導入することから成る。

発酵は、変性された菌類のために適切である温度で行なわれ得る。一般的に、そ の温度は、適切なトランスグルタミナーゼ作用を得るためには１０℃〜４０℃で あろう。

トランスグルタミナーゼの適切な活性領域は、４〜１０のｐ。

であり、そして６〜８．３のｐＨが最適である。

溶解されたタンパク質（単独で又は混合物中で）は、微生物の添加及び発酵の開 始の前、熱処理により変性され得る。

この変性処理は、ある一定のタンパク質をＴＧａｓｅと反応せしめるために必要 である。

発酵の進行は、それぞれの場合で溶液中において活性的であるＴＧａｓｅ酵素の 濃度を決定する：この進行は、温度を調節することによって、及び微生物が酸を 生成する場合、そのｐＨを調節することによって導びかれるべきである。溶液中 の糖質の初期濃度は、ｐＨの変動及び従ってＴＧａｓｅ活性の調節手段熱処理に より停止され得る。

これらの条件下で、グルタミニル残基を含むほとんどのポリペプチド鎖は、脱ア ミノ化又は架橋、もしくは脱アミノ化及び架橋され得る。混合物が親油性アシル アミンを含む場合、タンパク質はアシル化され得、そして乳化及び／又は発泡性 質を獲得する。架橋は、親水性ゲルを導びき、これは新しい組織の基材である。

実際に、動物、植物又は微生物起源のすべての食物タンパク質は、この新規の微 生物組織化技法により転換され得る。

■ ｌ　：ひ　　　の　　告　　　： 完全な筋肉と同じように結合し、そして従って、ひき肉にされていない肉片に類 領する態様で、料理の前及び後で、スライスし、そしてその同じ方法での料理に 役立つきめを有する肉片を、ひき肉と共に得るために、トランスグルタミナーゼ を生成するように遺伝子的に変性されたラクトバシラスプランタラムを使用する 。

ａ）３°Ｃに冷却され、そして１０％の脂質を含む牛肉１００ｋｇを、３■メツ シユのグラインダーでひき肉にし；この肉を混練機に移し、そしてＩｉ　０．５ 　ｋｇ及び１０’個の微生物／Ｉｄを含む、遺伝的に変性されたラクトバシラス 　プランタラムの２４時間培養物５００ｄを添加する。十分に均質化した後、こ のペーストを測定真空プレス中に移し、そして１００ｇ部分にプラスチックバッ グにより真空パックする。その袋を真空下で密封し、次に凍結する前、２０°Ｃ で１０時間、次に１５°Ｃで１５時間インキュベートする。筋肉からのビーフス テーキカットに相当するきめのステーキを得る。

ｂ）上記の変法：牛肉１００ｋｇ、　Ｉｉｏ、　５　ｋｇ及び培養物５００ｄを カッターで混練し、そして均質化し、そして８０ＩＩＩＩ１１の直径の円柱状の ローフ１ｋｇに圧縮し：それらを同じインキュベーションにかけ、そして再び凍 結する。同等のきめ及びスライスされるべき同等の能力を有する１ｋｇのビーフ ローストの同等物を得る。

２：　ｌ　　で・　　れたロースト： 牛肉１００ｋｇを３肺の大きさのひき肉にし、８０°Ｃで２分間、電子レンジで 料理し、そして次に、水切りをし、Ｉｉｏ、４ｋｇ及び上記ラクトバシラス　プ ランクラム培養物５００ｄを添加し、そしてその混合物をプラスチック袋につめ 、そして前記例におけるようにしてインキュベートする―この工程は、遺伝子的 に変性されたラクトバシラス　プランタラムにより引き起こされる酸性化に耐性 のある可能性ある病原性微生物の排除を可能にする。

■１± 上記と同じ方法を行なう。但し、ラクトバシラス　プランタラム培養物５００Ｉ ｎ１が、遠心分離により１００倍に予備濃縮された同じ微生物の培養物５０−に より交換され、そしてインキュベーションが２０°Ｃで１０時間に減じられた。

■土工 透析によりラクトースを除去された、５倍に濃縮されたｐＨ６，４の残留物（軟 質残留物）１００ｋｇを得、そしてそれに、水１００１　、遺伝的に変性された サツカロミセス　セレビシアエノ１０５ｇ／ｌｌ１１ノ濃縮物１２、ｌ１２０ｋ ｇ及び必要な味覚を得るためのイチゴフレーバー（Ｆｉｒｍｅｎｉｃｈ）を添加 し；これらを注意して混合し、そして４０ｇを１００ａｌｌの長方形のプラスチ ックカップに注ぎ、そして２０°Ｃで１５時間インキュベートし、上部をベニノ キ（染料）により着色し、その混合物を７５°Ｃに１分間加熱し、そしてそのカ ップをヒートシールする。ローフに僚ていて、スライスでき、そしてタンパク質 にひじように冨む生成物を得る。

ＪＬＬ上 大豆タンパク質１００ｇ、高粘度のカゼイネート１００　ｇ、水１０００　ｇ、 塩２０ｇ、必要な味覚を付与するためのスパイス、コチニルレッド、１８１０ｇ 、クリーム１００ｇ及び遺伝子的に変性されたクルイベロミセス　ラクチスの１ ％培養物を混合する。

真空下で激しく撹拌し、１ｋｇのローフにし、３５℃に２４時間保持し、次にダ ンプオーブン中において９０℃で１時間半、料理し、その後、真空下でプラスチ ックでバックする。１ｇ似肉のローフを得る。

１± 例５におけるのと同じ方法を行なう、但し、大豆タンパク質かりシンが添加され ているグルテン粉末により交換され、これはタンパク質を組織化するのと同時に そのタンパク質の再平衡化を可能にする。グルテン２００ｇ、リシンＬｏｇ、水 １０００　ｇ　、塩２０ｇ、ペラパー２ｇ、ガーリック５ｇ、ナツメグ０．２ｇ 、コチニルレッド溶液０．１　＃Ｉｌ！、１８１０ｇ、ラード１００ｇ及び遺伝 子的に変性されたクルイベロミセス　ラクチスの培養物１００ｇを十分に混合し 、８０ｍｍの直径のプラスチック袋に１ｇづつのかたまりを注ぎ、３５°Ｃに２ ４時間保持し、次にウェットオーブン中において８５℃で１．５時間料理する。

ピンク色のローフを得る。

■１工　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　・、連続的 なすすぎによりラクトースを０．５％に減じられた、３倍に：ａ縮されたＰＨ６ ，４の軟質残留物６０ｇを得、それに、４０％の脂肪を含む甘いクリーム４０ｋ ｇを添加し、乳酸ナトリウム１ｋｇ及び塩１．５ｋｇを添加し、遺伝子的に変性 されたクルイベロミセス　ラクチスの培養物１ｋｇを添加し、ミルクから得られ 、そして逆浸透により５倍に濃縮された、プレビバクテリアム　リネンス（Ｂｒ ｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕａ　１ｉｎｅｎｓ）の培養物１ｋｇを添加し；十分に混 合し、Ｐｏｎｔ　１°Ｅｖｆｑｕｅ型に注ぎ、３５℃で１０時間インキュベート し、電子レンジ中において７５℃に２時間保持し、冷却し、ベニノキの溶液によ りその表面を着色し、Ｂ、リネンスにより接種し、そして通常のチーズ製造作業 条件に続いて、チーズ熟成室に８日間静置し、バックし、そして通常のＦｏｎｔ 　ｌ’Ｅｖｆｑｕｅとして得る。通常の収量の２倍の収量でチーズが得られる。

これらの例は本発明を制限するものではない。それらは、本発明の重要性及びそ の最終使用の前、酵素の生成及び分離を伴わない相当の前進性を示すものである 。同時に、それらは発酵の重要性を示す。

国ｆＩＡ調査報告

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. １．微生物発酵の方法であって、機能的なトランスグルタミナーゼのその場での 産生効果を有する、遺伝子操作により形質転換された微生物を用いての、食品又 は化学産業に有用な発酵方法。
2. ２．トランスグルタミナーゼ酵素のための遺伝子の遺伝子操作及びクローニング により形質転換された微生物の少なくとも１つの株が、同化できる糖質の存在下 でタンパク質に導入される請求の範囲第１項記載の方法。
3. ３．前記微生物を、５℃〜５０℃の温度で、４〜１０（１０を含む）のｐＨ値で 及び培地中の糖質の濃度の調節下で増殖せしめる請求の範囲第１又は第２項のい づれか１項記載の方法。
4. ４．前記微生物を６５℃以上（６５℃を含む）の温度で熱処理し、トランスグル タミナーゼ活性を停止する請求の範囲第１〜３項のいづれか１項記載の方法。
5. ５．トランスグルタミナーゼ酵素が培養培地中に微生物により産生された後、で きるだけ早く、その酵素を安定化し、そして活性化するために、カルシウム塩を その発酵溶液に添加する請求の範囲第１〜４項のいづれか１項記載の方法。
6. ６．微生物株が、特に限外濾過、逆浸透又は凍結乾燥により濃縮された濃縮形で 導入される請求の範囲第１〜４項のいづれか１項記載の方法。
7. ７．その場で産生されるトランスグルタミナーゼの機能が、タンパク質のみ又は 他の食物成分に関連するタンパク質の組織の変性にある請求の範囲第１〜６項の いづれか１項記載の方法。
8. ８．その場で産生されるトランスグルタミナーゼの機能が、種々のタンパク質の 溶液又は懸濁液の組織化にある請求の範囲第１〜６項のいづれか１項記載の方法 。
9. ９．その場で産生されるトランスグルタミナーゼの機能が、タンパク質の栄養価 の変性にある請求の範囲第１〜６項のいづれか１項記載の方法。
10. １０．その場で産生されるトランスグルタミナーゼの機能が、形質転換された微 生物を用いての微生物発酵によりタンパク質上に酵素又は補酵素をグラフトする ことにある請求の範囲第１〜６項のいづれか１項記載の方法。
11. １１．請求の範囲第１〜１０項のいづれか１項記載の方法により得られる生成物 。
12. １２．屠殺製品の製造のために請求の範囲第１１項記載の生成物の使用。
13. １３．チーズ製品の製造のために請求の範囲第１１項記載の生成物の使用。
14. １４．デリカテッセン食品の製造のために請求の範囲第１１項記載の生成物の使 用。