JPH02500804A - 望ましくない交差反応を排除するためにオリゴヌクレオチドを使用するポリヌクレオチドの検定法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 望ましくない交差反応を排除するためにオリゴヌクレオチドを使用するポリヌク レオチドの検定法 発明の背景 本発明は、所望のヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド配列）の検定法であって 、該配列が、この配列の検定を妨害して偽の定性または定量結果を導き得るその 他のヌクレオチド配列（非−標的ヌクレオチド配列）と共に存在している可能性 のあるものである該所望のヌクレオチド配列の検定法に関するものである。

関連技術 ポリヌクレオチド中の独特な、または偽発現されるヌクレオチド配列は、ヌクレ オチド重合体プローブとハイブリダイゼーシヨンさせることによって検出するこ とができると長らく考えられてきた。

球貧血などの遺伝子疾患、各種の癌の早期検出が可能になった。検出したいと望 むヌクレオチド配列（標的ヌクレオチド配列）と相補（通常は正確に相補）する ヌクレオチド配列を有するプローブ（「標的プローブ」と称する）を選択する。

標的ポリヌクレオチドとプローブとのハイブリダイゼーシヨンを行った後、通常 、形成された標的プローブ／ポリヌクレオチドハイブリッドを、ハイブリダイズ していないプローブから分離する。次いで、２つの分離した媒質のいずれかのプ ローブ量を試験し、初めに存在した標的量の定性または定量測定値を得る。

しかしながら、多数の検定には、標的配列のヌクレオチド配列に非常に類似して いるヌクレオチド配列（例えば１〜５個のヌクレオチドのみが異なる）を有する １またはそれ以上の非標的ポリヌクレオチドが存在し得る。この様な場合、非標 的ヌクレオチドは、少なくとも幾つかの標的プローブとハイブリクイズし、誤っ た定性または定量結果を生じることによって検定を妨害し得る。この問題は、プ ローブ配列が、各々の種が標的ヌクレオチド配列またはそれに非常に類似してい る（例えば１ヌクレオチドのみが異なっている）ヌクレオチド配列を含有してい る特定の属内の種々の微生物種を検定し得るように選択される場合、特に問題と なる。

上記のタイプの妨害に対する解決策は、例えばワレース等（Ｗａｌｌａｃｅ　ｅ ｔ　ａｌ、）、Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　’Ｓｃｉ、　ＵＳＡ、８ ０．　２７８−２８２（１９８３）によって提案され、その提案の中ではストリ ンジエンシーを正確にコントロールすることによって１個のヌクレオチドの相違 を検出する。ワレース等は、わずか１９ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプ ローブおよび正確にフントロールしているストリンジエンシーを使用し、１点の 突然変異だけが異なっている、ニトロセルロースに結合している鐘状赤血球貧血 に関連するヘモグロビンＤＮＡと正常なり　Ｎ　Ａを区別することができた。こ の方法は、存在し得る非標的ポリヌクレオチドの類似ヌクレオチド配列より標的 ヌクレオチド配列のヌクレオチド配列により相補的なヌクレオチド配列を有する 標的プローブが意図的に選択されるので、標的プローブ／標的ポリヌクレオチド ハイブリッドは標的プローブ／非標的ポリヌクレオチドハイブリッドより高い融 解温度を有するという事実を利用している。これらのタイプの検定では、ニトロ セルロースに結合しているポリヌクレオチドとポリヌクレオチドプローブを、理 想的にはプローブ／標的ポリヌクレオチドハイブリッドとプローブ／非標的ポリ ヌクレオチドのそれぞれの融解温度の間にある制御された温度でハイブリダイズ させる。しがしながら、上の融解温度は約２−３℃異なるだけかもしれない。

従って、上の方法についての大きな問題は、この方法には温度のストリンジェン トなコントロールが必要であり、更に通常、非標的ポリヌクレオチドからの多量 の妨害物が混入される（即ち、比較的大量のプローブが非標的ポリヌクレオチド とハイブリダイズされる）か゛、または標的プローブと標的ポリヌクレオチドの ハイブリダイゼーシヨンの程度が低くなり、その結果、誤った定性結果を導き得 るということである。更に、よい定量結果を得るためには、標準曲線を確立する ための検定および未知試料の検定の両者におけるハイブリダイゼーシヨンの間、 はぼ同一の温度が維持されなければならないので、更に高度な温度制御が必要で ある。

定義 本発明の開示および特許請求の範囲で使用される時、以下の用語は次の様に定義 される： ヌクレオチド：　リン酸基、５炭糖および窒素含有塩基からなる核酸のサブユニ ット。ＲＮＡでは５炭糖はリボースである。Ｄ　Ｎ　Ａでは２デオキシリボース である。

ヌクレオチド重合体：ホスホジエステル結合で結合しているヌクレオチド鎖また はその類似体。

オリゴヌクレオチド：通常約１０〜約１００ヌクレオチドであるが、２００また はそれ以上のヌクレオチド長さであることもあるヌクレオチド重合体。これらは 通常、ヌクレオチドモノマーから合成されるかまたは酵素的手段によって得られ る。

ポリヌクレオチド：通常約１００ヌクレオチド長さ以上のヌクレオチド重合体。

れは、非常に類似したヌクレオチド配列群（例えば１つの属内の種々の微生物の 様に１ヌクレオチドだけが異なっている）を包含し得る。

非標的ヌクレオチド配列：標的ヌクレオチド配列と高度にホモロジーな配列なの で、選択されたプローブを使用する標的ヌクレオチド配列の検定を妨害し得る１ またはそれ以上のヌクレオチド配列。

通常、しかしながら必然的ではないが、標的および非標的ヌクレオチド配列は別 個のヌクレオチド重合体である。非標的プローブは、非標的配列の１部分のみに 相補的であり、非標的配列および隣接するヌクレオチドの両者の部分とオーバー ラツプし得る。非標的プローブの必要なことは、標的プローブとの交差反応を防 ぐに十分なだけ非標的配列とハイブリダイズすることである。

ヌクレオチド重合体プローブ：標的または非標的ヌクレオチド重合体と優先的に ハイブリダイズするように選択された、それ自身ヌクレオチド重合体であるプロ ーブ（通常オリゴヌクレオチドであるが、必然的ではない）。

融解温度：ヌクレオチド重合体ハイブリッドについて、そのハイブリッドの１／ ２が変性する温度。

＾肌９１虜 本発明は、１またはそれ以上の非標的ヌクレオチド配列からの妨害を低減し得る ように選択されたプローブ（“標的プローブ）を使用する、標的ヌクレオチド配 列の検定方法を提供するものである。この方法は、標的プローブとハイブリダイ ズし得る非標的配列の量を低減するために、存在し得る非標的配列の少なくとも １部分とハイブリダイズし得る１またはそれ以上のその他のプローブ（“非標的 プローブ）を与えることによって行なわれる。

好ましくは、本発明は、非標的ポリヌクレオチド配列をも含有していることがあ る標的ポリヌクレオチド配列を検出するための検定方法、およびこの様な検定を 行なうのに有用なキットを提供するものである。ハイブリダイズ条件下で、培地 を標的および非標的ヌクレオチド重合体プローブそれぞれと接触させる。これに よって標的プローブは、存在する標的（即ち、存在し得る標的）とハイブリダイ ズすることができる。しかしながら、標的および非標的重合体は非常に類似して いるので、プローブは偶然、存在している非標的ポリヌクレオチド配列ともハイ ブリダイズし得る。非標的プローブは、非標的プローブが存在しない時に起こり 得る標的プローブ／非標的のハイブリダイゼーションの程度を低減するが、標的 プローブ／標的のハイブリダイゼーションを不当に低減しない（即ち、実用の場 で検定を行ない得ないようにする程度まで低減しない）ことを目的とし、この様 なハイブリダイズ条件下、存在している非標的ポリヌクレオチド配列とハイブリ ダイズするように選ばれる。

本発明は、いずれの標準的ハイブリダイゼーション法についても使用することが できる。この方法は通常、ハイブリダイズされていない標的プローブの量を過度 に検出せずに、標的プローブ／標的ハイブリッドを検出できるような方法で、表 面上または溶液中での標的プローブ／標的ハイブリッドの形成を利用する。これ は通常、以下の方法を使用して行なうことができる：１、固形支持体の表面で標 的プローブ／標的ハイブリッドを形成させ、次いでハイブリダイズしていない標 的プローブから該ハイブリッドを分離する。

２、溶液中で標的プローブ／標的ハイブソソドを形成させ、次いで該ハイブリッ ドと該ハイブリダイズしていない標的プローブを分離する。

これらの方法を使用して存在する標的ヌクレオチド配列の量を定量的または定性 的に調べるためには、ハイブリダイズしているかまたはハイブリダイズしていな い標的プローブの量をめ、形成したハイブリッドの量に関連づけることができる 。通常、標的プローブが、先にハイブリダイズされた標識（ラベル）プローブと 置換する場合以外、ハイブリダイズされた形態中の標的プローブの量がめられる （例えばＣｌ１ｎ、Ｃｈｅｍ、３２．１６９６　１７０１（１９８６）参照）。

しかしながら、この方法は、分離工程を必要とするハイブリダイゼーション法に 限定されない。例えば、改善されたホモジニアスな検定法が利用できるようにな った時、ここに記載のこの発明方法はホモジニアスな検定形態においても有用と なるであろう。

本発明は、幾つかの形態で使用することができる。ハイブリダイゼーション検定 のある時点で、非標的プローブは、標的配列と有意にハイブリダイズすることな く、非標的配列とハイブリダイズし得ることが必要である。この様な、非標的配 列の“キャッピング（おおい）”は、標的プローブと標的配列のハイブリダイゼ ーションの前、間、または後に起こり得る。好ましい態様は、標的プローブと標 的配列のハイブリダイゼーションの間に該“キャッピングを使用することである 。本発明のこの用途は、幾つかの形態で行なうことができる。これらには、 １、等温　一定温度でハイブリダイゼーションを行なう２、徐々に冷却　通常、 標的プローブ／標的ヌクレオチド配列ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）を包含す る低下していく温度範囲に渡っ別法として、標的プローブを加える前に非標的配 列をキャッピングするために、標的プローブより前に非標的プローブを加えても よい。高温および／または高ストリンジエンシーな条件下で標的プローブ／標的 配列ハイブリダイゼーションを行ない、次いで、標的プローブ／非標的配列のハ イブリダイゼーションを防ぐために、温度および／またはストリンジエンシーが 低下した時に非標的プローブを加えるのも好適である 非標的プローブ／非標的配列ハイブリッドの融解温度が標的プローブ／非標的配 列ハイブリッドの融解温度より高くなるようにプローブを選択するのが好ましい 。ハイブリダイゼーション条件は、少なくともプローブと、存在している標的配 列を変性させるために培地をまず加熱しく好ましくは存在する全てのヌクレオチ ド重合体を変性させる温度まで）、次いで標的プローブが標的配列とノ・イブリ ダイズし得るような（好ましくは全てのハイブリダイゼーションが終了する）温 度まで培地を徐々に冷却することによって設定されるのが好ましい。

冷却させる間に非標的プローブと非標的配列がハイブリダイズし、標的プローブ が非標的配列と交差反応する温度に到達した時の交差反応を防ぐことができる。

本発明の１つの態様では、液体媒質が吸収される固相支持体が存在しない場合、 液体媒質中に存在する全てのポリヌクレオチドについて、前記の方法によるハイ ブリダイズ条件が設定される。この様な固相には、ニトロセルロースの様な固形 支持体が包含される。。

本発明のその他の態様では、標的プローブを、これらを容易に検出するのに役立 つ１またはそれ以上の原子または分子で標識する。

この様な標識は、放射標識、酵素、化学発光標識、比色分析用標識、または蛍光 標識を包含するがこれらに限定されない。更に、既述した様に、標的プローブの 存在の試験段階は、ヌクレオチド重合体とハイブリダイズした標的プローブを、 ハイブリダイズしていない標的プローブから分離（および好ましくは単離）する 段階を含むのが好ましい。この様な分離（または単離）は、コーン（Ｋｏｈｎｅ 、　Ｄ、　Ｅ、）およびブリラテン（Ｂ　ｒｉｔｔｅｎ、　Ｒ，Ｊ　、）の“核 酸の研究”、Ｖｏｌ、　２．　ｐ、　５００−ｉ２（１９７１）に記載された様 な方法を使用し、ヒドロキシアパタイトの様な固形支持体上にポリヌクレオチド ハイブリッドを選択的に吸収させることによって行ない得る。しかしながら、標 的ヌクレオチド配列が、標的プローブより実質上長いポリヌクレオチド上にある 場合（これはポリヌクレオチドが臨床的試料を起源とする場合、通常の状況であ る）、より長い標的配列およびハイブリダイズした標的プローブを、イオン性親 和力によって多価陽イオン粒子に選択的に固定化することによって分離するのが 好ましい。

図面 第１図および第２図を参照して、本発明の態様を記載する。

第１図は、以下に記載の実験で形成したハイブリッドの熱安定性を示すグラフで ある。

第２図は、生じ得る種々のハイブリッドについてのＴｍの関係を示す図式である 。

本発明を説明するために、４種類の合成オリゴデオキシヌクレオチド、即ち“プ ローブ、“標的”、“ミスプローブおよび“ミス標的”を調製した。プローブは 、”標的”に対する正確な相補体である３５塩基配列である。ミス標的は、２個 の置換を有する標的配列（ミスマツチ）である：１２位はＴと置換したＡを有し 、２４位はＧと置換したＣを有する。ミスプローブは、ミス標的の正確な相補体 である。２個の置換は、°プローブの末端から１／３の距離に位置する。

プリンおよびピリミジンの含有量は、Ｇ十〇の含有量と同様に、全ての配列間で 一定である。アプライド・バイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍｓ、Ｉｎｃ、）のモデル３８０Ａ　ＤＮＡシンセサイザーを使用してプロー ブを合成し、通常の方法（テトラヘドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）、３９　 ３　２２（１９８３））で精製した。

上のオリゴヌクレオチドの配列は、以下の通りであるニブローブ：　５’　ＣＡ Ｇ　ＴＣＡ　ＡＡＣＴＣＴ　ＡＧＣＣＡＴ　ＴＡＣＣＴＧ　ＣＴＡ　ＡＡＧ　Ｔ ＣＡ　ＴＴ　３゜標的：　３’　ＣＴＣＡＧＴ　ＴＴＧ　ＡＧＡ　ＴＣＧ　ＧＴ Ａ　ＡＴＧ　ＧＡＣＧＡＴ　ＴＴＣＡＣＴ　ＡＡ　５’ミスプローブ＝５°　Ｃ ＡＧ　ＴＣＡ　ＡＡＣＴＣＡ　ＡＧＣＣＡＴＡＡＣＣＴＣＣＴＡ　ＡＡＧ　ＴＣ Ａ　ＴＴ　３゜ミス標的：　３°ＧＴＣＡＧＴ　ＴＴＧ　ＡＧＴ　ＴＣＧ　ＧＴ Ａ　ＡＴＧ　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＴＣＡＧＴ　ＡＡ　５”以下の実験では、プロ ーブおよびミスプローブはヌクレオチド重合体プローブとして作用し、標的およ びミス標的はそれぞれ、標的または非標的ヌクレオチド重合体のいずれかとして 作用する（それぞれの全配列は標的または非標的ヌクレオチド配列のいずれかで ある）。

最初に各プローブと各標的重合体の熱安定性を調べた。プローブおよびミスプロ ーブを、Ｔ４キナーゼｓｔｐおよびガンマアデノシントリホスフェ−）（ＡＴＰ ）でキナーゼ末端標識し、次いで、それぞれを、０．４８Ｍリン酸バッファー、 ｐＨ６，８，０，１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中、５０℃にて、標的 およびミス標的の両者と別個にハイブリダイズさせた（合計４種類の別個のハイ ブリダイゼーション）。次ぎに、溶液の１部（１０μＱ）を０．１Ｍリン酸バッ ファー、ｐＨ６，８および０．１％ＳＤＳからなる“反応バッファー”３ｊ１１ ２中で希釈し、第１図に示した種々の温度で５分間加熱した。

コーンの方法（前掲）を使用し、０．０８Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６゜８．０ ．０２％ＳＤＳ中、４５℃でヒドロキシアパタイトに結合させることによって、 ハイブリダイズしたプローブの百分率をめた。

結果を、残留している１本鎖ヌクレオチドの百分率として第１図にプロットする 。２分の１のプローブがハイブリダイズしており２分の１のプローブが１本鎖で ある温度は融解温度（Ｔ　ｍ）として知られており、熱安定性の基準として使用 される。各プローブの正確な相補体（標的重合体）が非標的重合体で置換された （即ち各プローブの相補体を２塩基のみが異なったヌクレオチド重合体で置換し た）時、Ｔｍが６−７℃低下する。

第２図は、起こり得る種々の反応および交差反応についてのハイブリダイゼーシ ョンＴｍを示す。

第１図については、標的またはミス標的のいずれか一方についての検定（検定が 望まれる一方を“標的ヌクレオチド重合体”と呼び、他方を“非標的ヌクレオチ ド重合体”と呼ぶ）において、両者が一緒に存在し得る場合、同時に実質的な割 合の標的プローブを非標的重合体とハイブリダイズさせることなく、大部分の標 的重合体がその相補的なプローブ（“標的プローブ）とハイブリダイズされる温 度を選択するのは困難であろう。従って、ごくわずかの標的ヌクレオチド重合体 のみがハイブリダイズされる温度が選択されないと、非標的ヌクレオチド重合体 は標的ヌクレオチド重合体の検定を妨害するであろう。

本発明は、ハイブリダイゼーション中に標的プローブおよび非標的プローブの両 者を存在させることによって、非標的ヌクレオチド配列から生じ得る妨害を実質 上低減し、それによって、ストリンジェントな温度制御の必要を排除することが できる。

このことを説明するために、更に実験を行なった。プローブとミスプローブを反 応バッファー中、以下の第１表に示されるモル比で混合した。水浴を使用し、反 応を７０’Ｃで５分間加熱し、次いで２時間で５０″Ｃまで徐々に冷却した。次 に、５０°Ｃで１時間インキュベートを続けた。反応をまず加熱することによっ て、開始時に全ての配列が１本鎖である（即ち“変性している”）ことを保証し ；最後に５０℃の温度にすることによって全ての組合わせのプローブと標的配列 のハイブリダイゼーションが生じるのを可能にした。なぜならこの温度は全ての Ｔｍ値より十分低いからである。後述する様に、温度がそれぞれのＴｍを通って 徐々に低下するので、徐々に冷却することは、誤った相補体より正確な相補体と のベアリングに有利である。反応を、前記の様にしてヒドロキシアパタイトに結 合させることによって検定した。

第１（Ａ）表の結果を得るために、標的プローブを標識し、標的およびミス標的 はそれ°ぞれ標的および非標的ヌクレオチド重合体とし、ミスプローブは標識し なかった。第１（Ａ）表の結果は、（１）標的プローブと標的重合体のハイブリ ダイゼーション（反応Ａ−Ｄ）は、４倍過剰量までの非標的プローブの存在では 不当に低減されず；（２）同一条件下、おおよそ予想される様に（実験的不確実 さの限度内で）過剰量の非標識プローブは標識プローブと競合しく反応Ｅ−Ｇ） ；（３）標的プローブは非標的と有意にハイブリダイズする（反応Ｈ）が、この ハイブリダイゼーションは、比較的少量の非標的プローブ（標的プローブと１： １のモル比）が存在する時、非常に効果的に排除され（反応１−Ｋ）；そして（ ４）両プローブと両型合体を一緒に混合した場合、非標的プローブは外見上、非 標的プローブがか存在しない時に起こり得る標的プローブ／非標的重合体のハイ ブリダイゼーションの程度を低減するが標的プローブ／標的重合体のハイブリダ イゼーションにほとんど影響しない（そして確実にそれを不当に低減しない）様 に、非標的重合体とハイブリダイズする（反応し−０）。

第１（Ｂ）表は、標識プローブとしてミス標的プローブを用い、非標識プローブ として標的プローブを用いて行なわれた同じ実験の結果を示す。従って、ミス標 的および標的はそれぞれ、標的および非標的ヌクレオチド重合体と見なすことが できる。これらの結果はまた、上の（１）−（４）の結論を支持する。具体的に は、第１Ｂ表中の反応ＡおよびＨは、２種類の標的重合体が１種類の標識プロー ブによって識別され得なかった（８２％ニア８％のハイブリダイゼーション）と いう状況を表わす。標的プローブ（ここでは、非標的“キャッピングプローブと して使用された）の存在が、むしろハイブリダイゼーションの程度に明らかな差 を生じさせる。この場合、標識ミスプローブとミス標的の所望のハイブリダイゼ ーションは、標識ミスプローブと標的に対し、５６％対Ｏ％であった（反応りお よびＫ）。

徐々に冷却する方法と等混法を比較するために、試験を行なった。

第２表に示される様に、７０″Ｃの予備加熱段階の後、温度が５０″Ｃまたは５ ５Ｃのインキュベージ５ン温度に直ちに低下された（反応溶液を含有しているチ ューブをこれらのそれぞれの温度の水浴に入れることによって）ということ以外 、第１（Ａ）表における反応Ａ−ＤとＨ−Ｋを繰り返した。次いで、インキュベ ーション温度で２時間、インキュベーションを続け、前記の様にしてヒドロキシ アパタイト上で反応を検定した。結果を第２表に示す。“キャッピングミス標的 プローブの存在下、直ちに冷却した時には、標的プローブ／標的重合体ハイブリ ダイゼーションの量は幾分低下するが（反応Ａ−Ｄ）、標的プローブ／ミス標的 重合体のハイブリダイゼーションの量は、幾分増大する（反応Ｈ−Ｋ）というこ とが第２表かられかる。

従って、ハイブリダイゼーションの確立の一部として徐々に冷却することは、本 発明の方法に有利であるらしい。

第１表 標識プローブ　１＊１１１１１１１１Ｌ１１１１１非標識プローブ　１２４ 非標的プローブ　１２４　１２４　１２４標的　１　１　１　．１　１　１　１ 　１　１　１　１ミス標的　１１１１１１１１ ゼーシヨン（％’）　８４７０７６７６３１２０１１４０　５　３　２８５７９ ７１７ｇ正常なハイブリダ イゼーション（％）　１００８３９０９０３１２４１３４８　６　４２１０１９ ４８５９３標識ミスプローブ　１１１１１１１１１１１１１１１非標識ミスプロ ーブ　１２４ 標的プローブ　１２４　１２４　１２４ミス標的　１１１１１１１　１１１１ 標的　１１１１１１１１ ハイブリダイ ゼーション（％）　８２５４５４５６３７２２１３７８１１　０　０８０６８５ ６５２正常なハイブリダ イゼーション（％）　１００６６６６６８４５２７１６９５１３　０　０９ｇ＋ １１３７１６３注：ハイブリダイゼーション反応１０ｕ１中プローブ０．１ピコ モルに対応する。

第２表 標識プローブ　ｌ＊１１１　１１１１ 標的　１１１１ ミス標的　１１１１ 標的プローブを使用する標的ヌクレオチド配列の検定では、非標的ヌクレオチド 重合体ハイブリッドとハイブリッドを形成する標的プローブ／非標的プローブの Ｔｍより高いＴｍを有する、非標的ヌクレオチド重合体とハイブリッドを形成す る非標的プローブを与えることによって、非標的ヌクレオチド配列（通常、その 他のヌクレオチド重合体上）からの妨害を低減することができるということが上 で説明された。従って、与えられた標的ヌクレオチド配列の検定において、非常 に類似している非標的ヌクレオチド配列から起こり得る妨害を低減することがで きる。更に、上記かられかる様に、ハイブリダイズ条件が、徐々に冷却すること によって設定されるなら、上記の有利な効果が更に高められる。

標的プローブに対する非標的プローブの割合は実質上変えることができる。この 割合は９：１以下であるのが好ましく、とりわけ好ましい比は、４：１以下であ る。

使用される非標的プローブの量は、広範囲に変えることができるが、なお上記の 改善された結果を与える。しかしながら、非標的プローブが、非標的配列の量に ほぼ等しいモル量で存在するのが好ましく、試料中に存在する非標的配列より過 剰量のモル量であるのがとりわけ好ましい。これは、試料中の標的および非標的 ＲＮＡ配列の量より大きい量のプローブを使用することによって行なうことがで きる。　上の実験では、標的および非標的ヌクレオチド配列は、標的および非標 的ヌクレオチド重合体の全長からなるが、これは必然的でなくてもよいというこ とは明らかであろう。事実、大部分の臨床的応用では、両配列は、実質上より長 い標的および非標的ポリヌクレオチドの長さの一部分のみとなろう。以下の実施 例は、このような臨床上の検定を説明する。

実施例■ この場合、臨床上の検定の場合と同様に、合成標的プローブおよび非標的プロー ブを細胞ＲＮ　Ａにハイブリダイズした。この系は、ネイセリア・ゴノＯＸア（ Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（所望の標的としてのｇｏｎＲ ＮＡ）およびネイセリア・メニンギティディス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ＩＩｌｅ ｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）（望ましくない誤った標的としてのｍｅｎＲＮＡ）で構 成された。実施例■と同様に誤った２個の塩基以外は両方のＲＮＡに相補的なプ ローブを合成した。プローブ配列は、以下の通りであった： ｇｏｎプローブ：５’　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣＣＧＣＡ　ＣＡＴ　ＧＴＣＡＡＡ 　ＡＣＣＡＧＧ　ＴＡＡ　３’ｍｅｎブローフ゛：５°　ＧＡＧ　ＧＡＴ　ＴＣ ＣＧＴＡ　ＣＡＴ　ＧＴＣＡＡＧ　ＡＣＣＡｉｌ：Ｇ　ＴＡＡ　ＧＧ　３’実施 例■と同様にしてプローブを合成した。非常に近縁の生物の配列整列を行ない、 所望の生物に固有の領域を選択することによってプローブ配列を得る。

プローブと標的ＲＮＡの各組合わせのＴｍ値をめた：ｇｏｎプローブ＋ｇｏｎ　 ＲＮＡ　５９．２℃、ｇｏｎプローブ＋ｍｅｎ　ＲＮＡ　４８．２℃、ｍｅｎプ ローブ＋ｍｅｎ　ＲＮＡ　６１．５°Ｃ，ｍｅｎプローブ＋ｇｏｎＲＮＡ５５℃ 。上の最初の実施例の場合と同様に、正確に合ったハイブリダイゼーションは、 対応する誤ったハイブリダイゼーションより約６−１０°高いＴＭを有した。

第２表の５５℃等温条件と同様で、更に５５°Ｃ→４０’Ｃの冷却段階が徐々に 行なわれるハイブリダイゼーション検定をおこなった。

（この場合、０．４８Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６，８，０，５％ＳＤＳ中でハ イブリダイゼーションを行ない、０．１２Ｍリン酸バッファー、ｐＨ６，８，０ ，０２％ＳＤＳ中、４ｏ℃でヒドロキシアパタイト上離を行なった。）全ての成 分が完全に変性するのを保証するために反応を７０℃で５分間加熱し、直ちに５ ５°Ｃに冷却し、１５時間インキュベートし、４時間かけて徐々に４０℃に冷却 し、さらに１時間、４０℃でインキュベートを続けた。これらのプローブはより 徐々にハイブリダイズすることがわかっているので、最初の実施例より長（、よ り大過剰量のプローブを用いてこれらの反応をインキュベートした。

第３表の結果は、最初の実施例で見られたのと同様の、非標的ＲＮＡに対する非 標的プローブ（ｍｅｎ）のキャッピング効果を示す。標的ＲＮ　Ａに対する標的 プローブのハイブリダイゼーションは、２倍過剰量の非標的プローブの存在下で はあまり低減されなかった。非標的ＲＮＡに対する標的プローブの望ましくない 交差ハイブリダイゼーションは、少量はあったが、標的プローブに対して非標的 キャッピングプローブの１＝１比で完全に排除された（反応Ｊ）。

第３表 ｇｏｎ標的プローブ　３＊３３３３３３３ｍｅｎ非標的プローブ　２３６　２３ ６ｇｏｎ標的（ＲＮＡ）　１　１　１　１ｍｅｎ非標的（ＲＮＡ）　１　１　１ 　１最大可能なハイブリ グイゼーション％　５３４８３８５２１０　１　０　０最大可能な正常な ハイブリダイズー ション％　１００９１７２９８１９　２　０　０＊注：ハイブリダイゼーション 反応３０マイクロリツトル中プローブ０．３ピコモルに対応する。

実施例■ キャッピングの有効性を調べるために、臨床上の検定でよくあるように大過剰量 のプローブおよび低濃度のＲＮＡを使用し、更に実−を行なった。この実施例で は、プローブとＲＮＡを記載の割合で混合しく０．４８Ｍリン酸バッファー、ｐ Ｈ６，８，０，５％ＳＤＳ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１ｍＭ　ＥＧＴＡ中）、７０℃ で５分間加熱し、１１／４時間かけて５５℃に徐々に冷却し、５５°Ｃで２時間 インキ二ヘ一トシ、３０分間で４５°Ｃに徐々に冷却し、次いで４５℃で３０分 間インキュベートした。次に、上の様にして、ヒドロキシアパタイト上、ハイブ リダイゼーション体を分離した。このインキュベーション法は、５５°Ｃの中間 （ストリンジェントな）温度を越えて徐々に冷却し、その温度でさらにインキュ ベートするので、正確なマツチハイブリダイゼーションを最大限に識別すること ができる。

第４表に見られる様に、キャッピング（非標的）プローブはまた、標的プローブ と非標的ＲＮＡの交差反応を完全に排除したが、特異的ハイブリダイゼーション （標的プローブ／標的ＲＮＡ）を２６％低下させただけであった。

！土嚢 ｇｏｎプローブ　１５＊　１５　１５　１５ｍｅｎプローブ　３０３０ ｇｏｎＲＮＡ　１　１ ｍｅｎＲＮＡ　ｌ　１ 最大可能なハイブリ グイゼーシジン％　１２９　９５　５　０最大可能な正常な ハイブリダイゼー シ田ン％　１００　．７４　４　０ 注：ハイブリダイゼーション反応１００マイクロリツトル中プローブ０．２ピコ モルに対応する。

標的プローブは、当業者に既知の多数の標識によって標識され得るということも 、当然、前記から理解されるであろう。更に、類似した非標的ヌクレオチド配列 が存在し得ることがある培地中の標的ヌクレオチド配列の存在の確認に使用する ためのキットであって、標的および非標的プローブを別個にまたは混合して含有 しているキットを組み立てることができる。

当業者には明らかな様に、上に記載の態様の種々の改良法および変法が可能であ る。従って、本発明の範囲は、上に詳細に記載された態様によって限定されるも のではない。

第１図 ハイブリッドの融解温度 摂氏度 第２図８ 標的プローブ　ミス標的プローブ ＊ホされた温度は最初の実施例におけるマ・ソチおよびミスマ・ノチハイブリッ ドの融解温度である。

国際調査報告

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非常に類似した非標的ヌクレオチド配列または配列群を含有していることも ある被験試料中の標的ヌクレオチド配列の検定方法であって、以下からなる方法 ： （ａ）標的プローブと非標的ヌクレオチド配列の間のあらゆる望ましくないハイ プリダイゼーションを最少にしつつ標的プローブと標的ヌクレオチド配列の間の ハイプリダイゼーションを可能にする条件下、被験試料を標的プローブおよび少 なくとも１種の非標的プローブと接触させ、該あらゆる望ましくないハイブリダ イゼーションを、検定工程の少なくとも１つにおいて存在するあらゆる非標的ヌ クレオチド配列とハイプリダイズしうる非標的プローブの存在によって減少させ て、標的プローブ／標的ヌクレオチド配列ハイプリダイゼーションの標的プロー ブ／非標的ヌクレオチド配列ハイプリダイゼーションに対する割合を増加させる こと；および（ｂ）該標的プローブの被験試料ヌクレオチド配列に対するハイプ リダイゼーションについて検定すること。 ２．非標的プローブ／非標的配列ハイプリッドの融解温度が標的プローブ／非標 的配列ハイプリッドの融解温度より高いようにプローブを選択する請求項１に記 載の方法。 ３．初めに培地を加熱し、存在しているあらゆる標的配列および少なくともプロ ーブを変性させ、次いで標的プローブが標的配列とハイプリダイズしうる温度ま でこの培地の温度を外部の熱交換媒体によって徐々に低下させることによりハイ プリダイゼーション条件が設定される請求項１または２に記載の方法。 ４．ハイプリダイゼーションが一定の温度で起こる請求項１または２に記載の方 法。 ５．固相支持体の全く存在しない液体培地中に存在するすべてのヌクレオチド重 合体についてハイプリダイゼーション条件が設定される請求項１、２、３、また は４のいずれかに記載の方法。 ６．標的および非標的ヌクレオチド配列がハイプリダイゼーション時に固体支持 体に結合している請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。 ７．標的プローブがラベルされており、ラベルされていないプローブのラベルさ れているプローブに対するモル比が９対１を越えないものであり、そして液体培 地を吸収する固相支持体の全く存在しない、液体培地中に存在するすべてのヌク レオチド重合体についてハイプリダイゼーション条件が設定される請求項１、２ 、３、または４のいずれかに記載の方法。 ８．標的プローブがラベルされており、ラベルされていない非標的プローブのラ ベルされているプローブに対するモル比が９対１を越えないものであり、そして 固体支持体に結合させた標的および非標的配列についてハイプリダイゼーション 条件を実施する請求項１、２、３、または４のいずれかに記載の方法。 ９．非標的プローブの標的プローブに対するモル比が４対１を越えない請求項１ 、２、３、または４のいずれかに記載の方法。 １０．非常に類似した非標的ヌクレオチド配列を含有していることもある被験試 料中の標的ヌクレオチド配列の液体培地中での検定方法であって、以下からなる 方法： （ａ）標的プローブと非標的ヌクレオチド配列の間のあらゆる望ましくないハイ プリダイゼーションを最少にしつつ標的プローブと標的ヌクレオチド配列の間の ハイプリダイゼーションを可能にする条件下、液体培地中の被験試料を標的プロ ーブおよび少なくとも１種の非標的プローブと接触させ、該あらゆる望ましくな いハイプリダイゼーションを、検定工程の少なくとも１つにおいて存在するあら ゆる非標的ヌクレオチド配列とハイプリダイズしうる非標的プローブの存在によ って減少させて、標的プローブ／標的ヌクレオチド配列ハイプリダイゼーション の標的プローブ／非標的ヌクレオチド配列ハイプリダイゼーションに対する割合 を増加させること；および （ｂ）該標的プローブの被験試料ヌクレオチド配列に対するハイプリダイゼーシ ョンについて検定すること。 １１．非標的プローブ／非標的重合体ハイプリッドの融解温度が標的プローブ／ 非標的重合体ハイプリッドの融解温度より高いようにプローブを選択する請求項 １０に記載の方法。 １２．非標的プローブ／非標的重合体ハイプリッドの方が標的プローブ／非標的 重合体ハイプリッドよりも相補性ヌクレオチドの数が多いようにプローブを選択 する請求項１０に記載の方法。 １３．初めに液体培地を加熱し、存在しているあらゆる標的重合体および少なく ともプローブを変性させ、次いで標的プローブが標的重合体とハイプリダイズし うるようにこの液体培地を徐々に冷却することによりハイプリダイゼーション条 件が設定される請求項１０に記載の方法。 １４．液体培地を吸収する固相支持体の全く存在しない液体培地中に存在するす べてのヌクレオチド重合体についてハイプリダイゼーション条件が設定される請 求項１３に記載の方法。 １５．初めに少なくとも標的プローブおよびあらゆる標的重合体を変性するであ ろう温度まで培地を加熱し、次いで標的プローブが標的配列とハイプリダイズし うる温度までこの培地の温度を外部の熱交換媒体によって徐々に低下させること によりハイプリダイゼーション条件が設定される請求項１０に記載の方法。 １６．非標的プローブの標的プローブに対するモル比が９対１を越えないもので あり、液体培地を吸収する固相支持体の全く存在しない液体培地中に存在するす べてのヌクレオチド重合体についてハイプリダイゼーション条件が設定される請 求項１３に記載の方法。 １７．非標的プローブの標的プローブに対するモル比が４対１を越えないもので ある請求項１０、１１、１２、１３、または１５のいずれかに記載の方法。 １８．プローブが部分的な共通領域を有するオリゴヌクレオチドである請求項１ ３に記載の方法。 １９．標的重合体がＲＮＡおよびＤＮＡからなる群からのものである請求項１０ に記載の方法。 ２０．検定工程が、初めにハイプリダイズしていないラベル化プローブからハイ プリッドを分離し、次いでこのハイプリッド中のラベルの存在を確認することか らなる請求項１０、１１、または１５のいずれかに記載の方法。 ２１．プローブがオリゴヌクレオチドであり、標的および非標的重合体がプロー ブより実質的に長いポリヌクレオチドであり、そして検定工程が以下の工程から なる請求項１０、１１、または１５のいずれかに記載の方法： （ａ）長さが１００ヌクレオチドより短いすべてのオリゴヌクレオチドを有意に 結合させることなく、ポリヌクレオチドおよびそのハイプリッドを非共有結合に よって結合させることができる適当なポリカチオン性固体支持体に液体培地を接 触させて、ポリヌクレオチドとハイプリダイズした標的プローブをそのようにハ イプリダイズしていない標的プローブから分離すること；（ｂ）該そのようにハ イプリダイズしていない標的プローブを含む液体培地から固体支持体を分離する こと；および（ｃ）該固体支持体に結合しているラベルの存在を検出すること。 質．非標的重合体を含有していることもある被験試料中の標的重合体を検定する のに有用なキットであって、以下からなるキット：（ａ）ラベルされているヌク レオチド重合体プローブであって、ハイプリダイゼーション条件下で標的プロー ブ／標的配列ハイプリッドを形成することができるが、標的プローブ／非標的配 列ハイプリッドも付随的に形成することができるように選択したプローブ；（ｂ ）標的プローブとは異なるラベルされていないヌクレオチド重合体非標的プロー ブであって、ハイプリダイゼーション条件下で非標的プローブ／非標的重合体ハ イプリッドを形成することができ、それによって、非標的プローブが存在しなけ れば生成するであろう標的プローブ／非標的重合体ハイプリッドの量を減少させ るが、生成しうる標的プローブ／標的重合体ハイプリッドの量はそれほど減少さ せることがないように選択したプローブ。 ２３．標的および非標的プローブが部分的な共通領域を有するヌクレオチド配列 をそれぞれ有している請求項２２に記載のキット。 ２４．非標的プローブ／非標的配列ハイプリッドの融解温度が標的プローブ／非 標的配列ハイプリッドの融解温度より高いようにプローブを選択する請求項２２ に記載のキット。 ２５．ラベルされていない非標的プローブ／非標的重合体ハイプリッドの方がラ ベルされている標的プローブ／非標的重合体ハイプリッドよりも相補性ヌクレオ チドの数が多いようにプローブを選択する請求項２２に記載のキット。 ２６．プローブが１〜３個のヌクレオチドだけが異なっているオリゴヌクレオチ ドである請求項２５に記載のキット。 ２７．非標的プローブの標的プローブに対するモル比が９対１を越えない請求項 ２４、２５、または２６のいずれかに記載のキット。 ２８．非標的プローブの標的プローブに対するモル比が４対１を越えない請求項 ２４、２５、または２６のいずれかに記載のキット。 ２９．プローブがＲＮＡおよびＤＮＡからなる群からのポリヌクレオチドとハイ プリダイズすることができるものであり、キットがこれらのポリヌクレオチドの １つを検定するのに有用である請求項２４、２５、または２６のいずれかに記載 のキット。 ３０．ラベルされているプローブのラベルが放射ラベル、酵素、化学発光ラベル 、比色分析用ラベル、および蛍光ラベルからなる群がら選ばれる請求項２４、２ ５、または２６のいずれかに記載のキット。 ３１．標的プローブがハイプリダイゼーション時に固体支持体に固定されている 請求項１に記載の方法。 ３２．ハイプリダイゼーションが一定の温度で起こる請求項１０に記載の方法。