JPH02459A - 新規なプラスミド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、トリプトファナーゼを司る遺伝子を含むＤＮ
Ａ断片（ｔｎａＡ　）とこの遺伝子を発現させうるプロ
モーターを含むＤＮＡ断片と、好ましくは、このプロモ
ーターを調節することができる調節遺伝子とを含有する
新規なプラスミド１こ関し、更に詳しくは、トリプトフ
ァナーゼを司る遺伝子を発現させうるプロモーター、お
よび調節遺伝子がトリプトファンオペロンのプロモータ
ーおよびオペレーターを含むＤＮＡ断片であり、コピー
数が多く宿主内での安定保持性にすぐれており、細胞増
殖に際し、脱落することなく、親細胞から娘細胞に確実
に受は継がれる特徴を有するグラスミドに関する。 一般に造成プラスミドの宿主内での安定性に関して、従
来より、培養時に宿主からのグラスミドの脱落や挿入遺
伝子の欠落等種々の遺伝子的不安定性が報告されており
、その対応策が検討されている。 例えば、エシェリヒア属のストレプトマイシンに依存し
ないという性質を司る染色体遺伝子ＤＮＡ断片が組み込
まれたプラスミドを、エシェリヒア属のストレプトマイ
シン依存性変異株に含有せしめて、プラスミドを含有す
る微生物の性質を安定化する方法が提案されている（特
開昭５５−１５６５９１号公報）。 しかしながら、かかる方法は経済的に問題があるのみな
らず、目的のプラスミドに複雑な機能を組み込む必要が
あるため、宿主の分裂増殖時にプラスミドが安定に娘細
胞に分配され難いことが予想され、工業的に応用するに
はかなりの問題がある。 一方、トリプト７アーナーゼの遺伝子発現機構は、゛カ
タボライト・リプレッション゛′と呼ばれる発現ｌｉ１
ｗＪ機構で制御されており（Ｂｏｔｓｆｏｒｄ、　Ｊ。 Ｌ、、　ａｎｄ　Ｒ，Ｄ、　ＤｅＭｏｓｓ　；　Ｊ、　
Ｂａｃ、、　１９７１．１０５゜３０３〜３１２参照）
、該酵素含有菌体を培養する際にグルコースを主炭素源
として含む培地を用いた場合、トリプトファナーゼ遺伝
子の極めて強い発現抑制が認められ、上記酵素の生合成
が抑制されてしまう。従って、該酵素含有大腸菌の培養
においては、一般に用いられるグルコースを主炭素源と
する培地を使用することは困難であった。 そこで、本発明者らは、前記二つの問題点を解決すべく
鋭意検討した結果、今回、トリプトファナーゼの生合成
を司る遺伝子を含有するプラスミドに関し、そのプラス
ミドの安定性に対してはＦプラスミド由来の成る種のＤ
ＮＡ断片をプラスミドに導入することによりプラスミド
の高安定化を図ることができ、そしてトリプトファナー
ゼ構造遺伝子の発現については発現調節遺伝子を改質す
ることによりグルコースによるトリプトファナーゼ構造
遺伝子の発現抑制を回避することができることを見い出
し、本発明を完成するに至った。 より具体的には、本発明者らは、Ｆプラスミドの分配制
御系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片がプラスミドの安定
化に大きく寄与する能力があること、そしてさらに、エ
シェリヒア・コリのＣｏ１Ｅｌ系プラスミドが通常細胞
染色体当り数十個のコピー数を有することに着目し、今
回、Ｃｏ１Ｅｌ系グラスミドの自律増殖能を司る遺伝子
を含むＤＮＡ断片と、Ｆプラスミドの分配制御系を司る
遺伝子を含むＤＮＡ断片と、上記のトリプトファナーゼ
の生合成を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片と、カタボライ
ト・リプレッションを受けない発現調節遺伝子として着
目したトリプトファンプロモーター及びオペレーターを
含むＤＮＡ断片とを組合わせることにより、コピー数が
多く、継代的に安定に分配可能でありかつカタボライト
・リプレッションを受けない新規なプラスミドを創製す
ることに成功した。 しかして、本発明によれば、 （ａ）トリプトファナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片
と、 （ｂ）トリプトファナーゼ構造遺伝子を発現制御しうる
トリプトファンプロモーター及びオペレーターを含むＤ
ＮＡ断片と、 （ｃ）　Ｃｏ１Ｅｌ系プラスミドの自律増殖能を司るＤ
ＮＡ断片と、 （Ｄ）　Ｆプラスミド由来の分配制御系を司る遺伝子を
含むＤＮＡ　断片 とから成ることを特徴とする新規なプラスミドが提供さ
れる。 本発明のプラスミドを構成する「トリプトファナーゼ構
造遺伝子を含むＤＮＡ　断片」　（以下、ＦＴ断断片上
略称することがある）は、トリプトファンをインドール
とピルビン酸とアンモニアに分解する役割をもつ酵素、
すなわちトリプトファナーゼの生合成を司る遺伝子を含
むＤＮＡ断片を意味し、また、［トリプトファナーゼ構
造遺伝子を発現制御しうるトリプト７アンプロモーター
及びオペレーターを含むＤＮＡ断片」　（以下、Ｐ断片
と略称することがある）は、トリプトファンオペロンの
プロモーター及びオペレーター画分を含むＤＮＡ断片で
あって、下流に結合される遺伝子の発現制御を司る遺伝
子を意味する。Ｐ断片の由来としては、プラスミドｐＤ
Ｒ７２０（７アルマシア製）由来断片でもよいし、大腸
菌染色体由来の断片であってもよい。また、Ｔ断片及び
Ｐ断片の両方を含む断片としては、実用的には、大腸菌
由来のものが好適に使用される。このＴ断片及びＰ断片
の供給源となる微生物は特に制限されるものではないが
、エシェリヒア・コリＡＴＣＣ２３２８２、エシェリヒ
ア・コリＡＴＣＣ２３４３７、エシェリヒア・コリＡＴ
ＣＣ２７３２５等が有利に使用される。 これら供給源微生物から本発明の目的に適うトリプトフ
ァナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片を調製するための
詳細な方法は後記実施例１の（Ａ）に示すが、基本操作
としては、染色体遺伝子中にトリプトファナーゼオペロ
ンをもつ大腸菌の染色体遺伝子を抽出し、制限酵素Ｂａ
ｍＨＩ及び１口ｄｎ［を用いてトリプト７アナーゼオベ
ロンＤＮＡ断片を切り出すと、トリプトファナーゼ構造
遺伝子を含むＤＮＡ断片が得られる。 また、Ｐ断片の調製するため詳細な方法は後記実施例１
（ｆ）に示すが、基本操作としては、Ｔ断片と同様にし
て大腸菌の染色体Ｄ　Ｎ　Ａより制限酵素ＳａｌＩ及び
Ｘｈｏ　Ｉを用いてトリプトファンオペロンを切り出す
と、そのＤＮＡ断片中にトリプトファンプロモーター及
びオペレーターが含まれている。 本発明は前述したようｊこ、上記のＴ断片とＰ断片をＦ
プラスミド由来のプラスミドの分配制御系を司る遺伝子
を含むＤＮＡ断片と組合わせる点Ｉこ１つの特徴を有す
る。Ｆプラスミドは例えば「蛋白質　核酸　酵素」第２
７巻第１号（１９８２）の９８′にの図１の遺伝子地図
及びＥｅｏｌ？　Ｉによる物理的地図に示される如き構
造をもつ、分子量が約９４．５ｋｂ（６２ＸｌＯ“ダル
トン）の既知のプラスミドであり、大腸菌などの腸内細
菌中に通常細胞染色体当り１〜２個のコピー数で存在し
、このプラスミドは細胞分裂後にそれぞれの娘細胞中に
正確に伝達されるような機構を備えている（このように
、コピー数を低いレベルに保ちつつ、正確に宿主の増殖
とベースを合わせて増やす仕組みをＳＬ口＋ｉｇｅｎｔ
な増殖の制御と呼んでいる）。Ｆプラスミドにおけるこ
のようなｓｔｒｉｎｇｅｎｔな増殖の制御機能がｍ１ｎ
ｉ−Ｆと呼ばれる分子量が約９．２ｋｂの自律増殖でき
るＤＮＡ断片に担われていることも既に究明されており
［”Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　＆　　Ｇｅｎｅｒａｌｇｅｎ
ｅｔｉｃｓ　　１９６，１８５〜１９３　（１９８４）
］、このｍ１ｎｉ−ＦがＦプラスミドより制限酵素Ｅｃ
ｏＲＩにより切り出し可能であることも知られている。 本発明は二〇ｍ１ｎｉ−Ｆに担われている分配制御系を
利用するものであり、しかして「Ｆプラスミド由来の分
配制御系を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」（以下、「Ｆ
断片Ｊと略称することがある）は、上述したようなＦプ
ラスミドを娘細胞に正確に伝達する機構を備えた遺伝子
画分を意味し、そのようなＦ断片の代表例としては約９
．２ｋｂの分子量を有する一１ｎｉ−Ｆ断片が挙げられ
るが、本発明では特に、ＥｃｏＲＩで切り出される約９
．２ｋｂのｍｉｎｉＦ断片中のＢａｗｌ量■及び５ａｌ
ｔで切り出される約６．６ｋｂのＤＮＡ断片並びにＢ　
ａａ＋ＨＩ及びＥ　ｃｏＲＩで切り出される約６．７ｋ
ｂのＤＮＡ断片を有利に用いることができる。このＤＮ
Ａ断片中には、ａ＋１ｎｉＦが有する２つのプラスミド
安定化機構である、細胞分裂共役機構及び均等分配機構
がとも！こ含まれている（ｆ［白質　核酸　酵素」第２
９巻第６号（１９８４）４３０〜４４３頁参照）。 さらに、本発明において上記Ｔ断片、Ｐ断片及びＦ断片
ともに組合わせて使用されるｒｃｏｌＥｌ系プラスミ系
内ラスミド由来能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片」　（
以下、「Ｓ断片」と略称することがある）は、コピー数
が１細胞染色体当り２０〜３０個であるＣｏ１Ｅｌ系プ
ラスミドの自律増殖能を司る遺伝子を含むＤＮＡ断片を
意味し、そのようなＳ断片の代表例としては約４．３ｋ
ｂの長さを有するプラスミドｐＢＲ３２２由来のＳ断片
が挙げられ、その他にプラスミドｐＢＲ３２２由来のＳ
断片がある。 本発明により提供されるプラスミドは、以上に述べＩ；
Ｔ断片、Ｐ断片、Ｆ断片及びＳ断片の４つの必須のＤＮ
Ａ断片を有する限り、他の遺伝情報を担うＤＮＡ断片、
例えば抗生物質耐性マーカーであるアンピシリン耐性遺
伝子を含むＤＮＡ断片、カナマイシン耐性遺伝子を含む
ＤＮＡ断片等をさらに含みうるが、典型的な具体例は、
Ｔ断片、Ｐ断片、Ｆ断片及びＳ断片の４つのＤＮＡ断片
から実質的メこ成り、分子量が約８．５メガダルトン（
約１３、０ｋｂ）のプラスミド及び分子量が約８．２メ
ガダルトン（約１２．７ｋｂ）のプラスミドで、本発明
者らがそれぞれ「プラスミドｐＭＴＰ−２Ｊ、並びに「
プラスミドｐＭＴＰ−３及びＰＭＴＰ−３ＲＪ　と命名
しｌ；ものである。 なお、本明ｍ書において、グラスミドの分子量はアガロ
ースゲル電気泳動法により測定した値である。 以下、これらのプラスミドｐＭＴＰ−２、ｐＭＴＰ−３
及びｐＭＴＰ−３Ｈについてさらに詳細に説明する。 プラスミドｐＭＴＲ−２、ｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−
３Ｒの下記の制限酵素の感受性（認識部位の数）及び該
制限酵素による切断断片の分子量（メガダルトン）は下
記の表に示すとおりである。 プラスミドｐＭＴＲ−２ 認識部位　　切断断片の分子量 制限酵素　Δ！（メガダルトンネ〕 Ｈｉｎｄｌ［Ｉ　　　　　ｌ　　　　約８．５　　（１
３，０）Ｘｈｏ　Ｉ　　　　　ｌ　　　　約８．５　　
（１３，０）ＥｃｏＲＩ　　　　２　　　　約８．４３
（１２，９）約０．０７（０，１）Ｐｖｕ　Ｉ　　　　
　２　　　　約３、２（４，９）　　約５．３（８，１
）Ｂｇｌ　Ｉｆ　　　　　２　　　　約１．３（２，０
）　　約７．２（ＩＩ）零〇内の数字は切断断片の分子
量を長さ（ｋｂ）に換算した値。以下同様。 グラスミドｐＭＴＲ−３ 認識部位　　切断断片の分子量 制限酵素　Δμ　　　　（メガダルトン）ＥｃｏＲＩ　
　　　２　　　１．３（２，０）　　６．９（１０，７
）Ｂｇｌ　Ｉ［２１，３（２，０）　　６．９（１０，
７）Ｘｈｏ　Ｉ　　　　　ｌ　　　　８．２（１２，７
）ＢａｍＨＩ　　　　２　　　２−６（４，１）　　５
．６（８，６）Ｓａｌ　　Ｅ　　　　　３　　　１．３
（２，０）　　２．４（３，８）４．５（６，９） プラスミドｐＶＴＲ−３Ｒ 認識部位　　切断断片の分子量 の数　　　　（メガダルトン） ２　　　１．３（２，０）　　６．９（１０，７）２　
　　１．３（２，０）　　６．９（１０，７）１　　　
８．２（１２，７） ２　　　３、８（６，８）　　４．４（５，９）３　　
　０．１（０，２）　　３、６（５，６）４．５（６，
９） プラスミドｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｒは、トリプ
トファンの生産性がより一層向上するよう制限酵素 ＥｃｏＲＩ Ｂｇｌ　ＩＩ Ｘｈｏ　Ｉ Ｒａｍ）ｆ　Ｉ Ｓａｌ　　Ｉ にプラスミドｐ　Ｍ　Ｔ　Ｐ　−２を分子生物学的にさ
らに改良したちのそある。すなわち、プラスミドｐＭＴ
Ｐ−３及びｐＭＴＰ−３Ｒは、プラスミドｐＭＴＰ−２
の構成遺伝子のうち、Ｆプラスミド由来の分配制御系を
司る遺伝子を含むＤＮＡ断片として、創ｎｉＦ断片中の
制御酵素Ｂ　ａｍＨＩ及びＳａｌ■で切り出される約６
．６ｋｂのＤＮＡ断片から、同じ＜ｍｉｎｉＦ断片中制
限酵素Ｂ　ａｍＨＩ及びＥ　ｃｏＲＩで切り出される約
６．７ｋｂのＤＮＡ断片にすることにより、菌体の増殖
性が、著しく向上し、これによってトリプトファン生成
の全活性を増大させたものである。 以上に述べた如き特性をもつ本発明のグラスミドｐＭＴ
Ｐ−２、ｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｒは例えば次の
ようにして製造することができる。 プラスミドｐＭＴＰ−２の製造 まず、Ｔ断片及びＦ断片の調製は、例えばエシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　Ｉ　
２　（Ｙ　Ｋ３００２、ＦＥＲＭ−Ｐ−８８４４）の培
養菌体から常法［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　ＥＦＦｒ
ｉｔｓｃｈ、　５ａｎｂｒｏｏｋ　；“Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣＩｏｎｊｎｇ　　　（１９８２）ｐ８６〜９４］
に従ってＴ断片及びＦ断片を含むｐＭＴＰ−１を抽出し
、Ｔ断片の場合は、制限酵素旧ｎｄｌ及びＢａｍＨＩで
切りだすことにより、Ｔ断片を含むＤＮＡが調製され、
一方、Ｆ断片は制限酵素ＢａｍＨＩ及び５ａｌｌにより
切断することによって、Ｆ断片を含むＤＮＡ断片を調製
することができる。 さらに、Ｐ断片は例えば市販のプラスミドｐＤＲ７２０
（ファルマシア製）をＥ　ｃｏＲＩで切り出してもよい
し、またはエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　（ＹＫ３００４．　ＦＥＲＭ
Ｐ−７８３８）の培養菌体より逆洗に従ってＰ断片を含
むグラスミドを抽出し、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏ　
Ｉで切り出すことによってもＰ断片を含むＤＮＡ断片を
調製することができる。以上の如くして調製したＴ断片
、Ｆ断片及びＰ断片のそれぞれを含む各ＤＮＡ断片をＴ
４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによりプラスミドｐＢ
Ｒ３２２に結合させることにより、プラスミドｐＭＴＰ
−２を取得することができる。 なり１プラスミドルＭＴＰ−２の具体的調製法について
は後記実施例１でさらに詳細に説明する。 プラスミドｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｒの製造 Ｔ断片及びＦ断片の調製は、プラスミドｐＭＴＰ−２に
おけると同様例えばエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ
ｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２　（ＹＫ３００２．　
　ＦＥＲＭ−Ｐ−８８４４）の培養菌体から常法［Ｔ、
　ＭａｎｊａＬｊｓ、　ＥＦＦｒｌｔＳｃｈ、　５ａｎ
ｂｒｏｏｋ　；Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　
　　（１９８２）ｐ８６−９４］に従ってＴ断片及びＦ
断片を含むｐＭＴＰ−１を抽出し、Ｔ断片の場合は、′
Ｍ限酵素Ｈ４ｎｄ　Ｉ及びＢａａｒＨＩで切りだすこと
により、Ｔ断片を含むＤＮＡが調製され、一方、Ｆ断片
は′Ｍ限酵素ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩｆこより切断す
ることによって、Ｆ断片を含むＤＮＡ断片を調製するこ
とができる。 他方、Ｐ断片はプラスミドｐＭＴＰ　　２におけると同
様にして調製することができ、以上の如くして調製した
Ｔ断片、Ｆ断片及びＰ断片のそれぞれを含む各ＤＮＡ断
片をＴ４ファージ由来のＤＮＡリガーゼによりプラスミ
ドｐＢＲ３２２に結合させることにより、プラスミドｒ
＋ＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｒを得ることができる。 なＪイ、／ラスミドｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｒの
具体的調製法ｊ；ついては後記実施例５でさらに詳細に
説明する。 このようにして調製される本発明のプラスミドは、コピ
ー数が多く、宿主の細胞分裂に際して娘細胞に受は継が
れる際に脱落することが少なく安定であり、ざら１こ、
トリプトファナーゼ遺伝子が発現する際に、カタポライ
［・・リプレッションがかからないという漫れた特性を
有する。 従って、本発明のプラスミドはトリプトファンもしくは
トリプトファン誘導体の製造において工業的に応用する
ことが大いに期待される。トリプトファンの製造に際し
ては、本発明のグラスミドで宿主が形質転換される。こ
の形質転換に利用できる宿主菌きしては、大腸菌が好ま
しい。 また、これら宿主菌に対する本発明のプラスミドの導入
はそれ自体公知の方法、例えば、Ｍ、　Ｍａｎｄｅｌ、
　　Ａ、　　Ｈｉｇａ　　；　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　
Ｂｉｏｌ、　　５３、１５９（＋９７０）等の文献に記
載の方法で行うことができる。 このようにして形質転換された宿主菌はそれ自体公知の
方法で培養することにより、トリプトファナーゼを菌体
内メこ十分ｌこ生産蓄積させることができる。 トリプトファナーゼは、トリプトファンをインド−４，
ピルビン酸及びアンモニアに分解するばかりでなく、Ａ
ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　ａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａ
ｌ　Ｃｈｏｔｍｉｓｔ、ｒｙ　Ｖｏｌ　３６、Ｎｏ１３
、Ｐ２５２３〜２５２８（１９７２）、特公告昭４９−
４６９１７号公報などの文献により知られているように
、インドール、５〜ヒドロキ／インドール、５−アミノ
インドール、５−メチルインドールなどのインドール類
と、ピルビン酸、オキザロ酢酸、リンゴ酸、フマール酸
、グリオキシル酸、乳酸などの何機酸の少なくとも１つ
と、アンモニウムイオンとがら；あるいはＬ記インドー
ル類とンスｊイン、シスチン、Ｓ〜、メチルシーくデ１
″ン、セリンなどのアミノ酸のうちの少なくとも１つと
から、Ｌ−トリプリファンまたはＬ−トリプリファン誘
導体を製造する際の酵素反応に利用することができる。 しかして、培養された菌体を該酵素反応に利用する場合
、該菌体はそのままで使用することかでさるが、該菌体
を超音波処理等で破砕した破砕物、又はその破砕物をさ
らに水等で抽出した抽出物、或いは該抽出物をさらに硫
安等で処理して酸素成分を沈澱させたｆｆｉ清製物の形
で使用することもでき、さらに、該菌体又はそれら処理
物は必要により固体化して用いることもできる。 該菌体又はその処理物の存在下でのインドールとピルビ
ン酸またはその塩とアンモニウムイオンとの反応は、通
常の酵素反応と同様に例えば０゜１Ｍリン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，５〜１０．０）あるいは水（ｐＨ７，５〜１０．
０）等の溶媒中で、約２（］〜約５（）℃、好ましくは
約３０〜約４０°Ｃの温度で通常約１０〜約７２時間で
行われる。 インドールとピルビン酸またはその塩とアンモ−ラムイ
オンの反応時の使用量は、酵素反応に対し阻害がない程
度の濃度であれば特に制限はないが、一般にはそれぞれ
を０．１〜２０％（ｖｔ／ｖｏｌ）の濃度範囲で使用す
るのが適当である。また、該菌体又はその処理物の使用
量も特に制限されるものではないが、一般Ｋｌ−１０％
（ｖｔ／ｖａｔ）の濃度で使用することができる。 なお、上記形質転換された菌の培養は、宿主菌の種類に
よって異なるが、一般には、通常用いられる合成或いは
天然培地を用いて行うことができる。しかして炭素源と
しては、グルコース、グリセロール、７ラクトース、シ
ュクロース、ＭＳｌｌ”Ｊの種々の炭水化物が使用でき
る。また、窒素源としては、トリプトン、酵母エキス、
コーン・スチーブ・リカー、カゼイン加水分解物等の天
然有機窒素源が使用できる。天然有機窒素源の多くは窒
素源と共に炭素源にもなり得る。また、培地にインドー
ルアクリル酸を加えることによりトリプトファナーゼ活
性を誘導することも可能である。 培養は、振盪培養あるいは通気撹拌深部培養などの好気
的条件下に行うことができる。培養温度は一般に２０〜
５０°Ｃであり、培地中の培地のｐＨは中性または微ア
ルカリ性付近に維持することが望ましい。培養期間は、
通常１〜５日である。 上記のような培養方法によって得られた菌体又はその処
理物を用いてインドールとピルビン酸またはその塩とア
ンモニウムイオンとを反応せしめて得られる、反応液中
に生成したし一トリプトファンの分離・精製は、イオン
交換樹脂、活性炭等による吸着、脱着処理等の公知の方
法により行うことができる。 また、本発明のプラスミドで形質転換した宿主菌はＬ−
１−リプトファンの発酵法による生産にも利用すること
ができる。すなわち、本発明のプラスミドで形質転換し
た宿主をインドールを含む培地で培養すれば、培地中に
Ｌ−トリプトファンが生産蓄積し、これを採取すること
によりＬ−トリプトファンを製造することができる。 次に実施例により本発明のプラスミドの調製についてさ
らに具体的に説明する。 実施例１ニプラスミドｐ　Ｍ　Ｔ　Ｐ　−２の作製（Ａ
）プラスミドｐＭＴＰ−１の調製 り培地（トリプトンｌＯｇ、酵母エキス５ｇｘグルコー
スＩｇＳＮａＣ１５ｇ、蒸留水ＩＩ２、ｐＨ７，２）ｉ
ｏＯｎ＋１を容量５００ｍ１の三角フラスコに分注し、
Ｉ２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。 この培地にアンピシリンを最終濃度が５０μｇ／ＩＩＩ
Ｑになるように添加し、さらにエシェリヒア・フリ（Ｅ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｙ　Ｋ　３００２　
（Ｆ　Ｅ　ＲＭｐ−８８４４）を植菌し、３７°Ｃで１
５時間培養を行った後、この培養液２ｍｌを採り、新た
に上記培地１００ｍ＋に接種し、再度３７℃で４時間培
養を行なった。 培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８０００Ｘｇ
％　１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体からアルカリ
−５ＤＳ法［Ｔ、　Ａｌａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、
　Ｆｒ１Ｌｓｃｈ、　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　；　“
Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　”（１９８２）
　ｐ９０〜９１参照］によりプラスミドを抽出し、ｐＭ
ＴＰ−１を得た。 （Ｂ）　ｍｉ旧−Ｆ画分の調製及びプラスミドｐＢ　Ｒ
３２２ｍ１ｎｉ−Ｆ　（ＢａｍＨＩ　／　Ｓａｌ　Ｉ　
ｆｒａｇｍｅｎｔ）の作製面記（Ａ）で調製したプラス
ミドｐＭＴＰ−１２５μｇを制限酵素Ｂａｍ）Ｉ　Ｉ及
び５ａｌｌ（各々５ｕｎｉｔｓ）を用い３７℃、１時間
反応で切断した。反応終了後、アガロースゲル電気泳動
にかけ、分子量のちがいを利用し、分子量約６．６ｋｂ
のＤＮＡ断片を２μｇ調製した。 次にｐＢＲ３２２（宝酒造製）ＬｐｇをＢａｍＨＩ及び
ＳａｌＩ（各５　ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃、１時間
反応させることにより切断し、６５°Ｃで１０分間保温
することにより、ＢａｍＨ１及び５ａｌｌを失活させた
後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５０ｍＭ
トリス緩衝液ｐＨ７，６、ｌｏｍＭＭｇＣＩ、、１０ｍ
Ｍジチオスレイトール、ｌｎ＋ＭＡＴＰ及びＴ４リガー
ゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで
１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｉ）Ｋ　ｌ　２系
株（トリズトファナーゼ欠損変異及びトリプトファン要
求性変異株）を常法に従って形質転換させ、アンピシリ
ンを最終濃度５０μｇ／ｍＱ含むし培地に塗抹し、３７
°Ｃで２日間培養した。 成育してきた株につき、アルカリＳＤＳ法によりプラス
ミドを抽出し、制限酵素ＢａｍＨＩ　（５ｕｎｉｔｓ）
及びＳａｌＩ（５ｕ旧ｔｓ）を用いてプラスミドを切断
し、アガロースゲル電気泳動を用いて分子量を測定した
ところ、プラスミドｐＭＴＰ−１に含まれているｍ１ｎ
ｉ−Ｆ断片の約６．６ｋｂ画分がＢａｍＨＩ　、　Ｓａ
ｌＩ部位に組み込まれているグラスミドＥｐＢＲ３２２
ｍｉｎｉ−Ｆ（ＢａｍＨＩ　、／　Ｓａｌ　Ｉ　ｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）］　ｔ　５つ得ｌこ　。 （Ｃ）トリプトファナーゼオペロンを含むＤＮＡ断片の
調製 前記（Ａ）で調製したプラスミドｐＭＴＰ−１２５μｇ
を制限酵素ＢａｍＨＩ及び旧ｎｄｌｌ［（各５ｕｎｉｔ
Ｓ）を用い３７℃、１時間反応で切断し、反応終了後ア
ガロースゲル電気泳動Ｉこかけ、分子量のちがいを利用
し、分子量約３、２ｋｂのＤＮＡ断片を１゜８μｇ！Ｉ
ＩＩした。 （Ｄ）プラスミドｐ　Ｕ　Ｃｌ　８　ＬｎａＡ■の作製
前記（Ｃ）で調製したＢａ５ＨＩ　／　Ｈｉｎｄ　ＩＩ
Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片ｌｐｇをＳｐｈ　Ｉ　　（５ｕｎｉ
ｔｓ）を用い、３７°Ｃ，１時間反応で切断し、さらに
プラスミドｐＵｃ１３（宝酒造製）０．５μｇを旧ｎｄ
ｌＩＩ及びＳａｌＩ（各々５　ｕｎｉｔｓ）を用い、３
７℃、１時間反応で切断した。 両者を混合し、６５°Ｃで１０分間保温することにより
、制限酵素を失活させた後、該失活溶液中の成分が最終
濃度として各々５ＱｍＭ）リス緩衝液ｐＨ７，６、ｌ　
ＯｍＭ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ　！、１０ｍＭジチオスレイト
ール、ｌａＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕ口已にな
るように各成分を強化し、１６℃で１５時間保温した。 この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪ　Ｍ　Ｉ　Ｏ９
（宝酒造Ｉａ）を常法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ。 １０１、２０〜７８（１９８３）参照］に従って形質転
換し、形質転換株を得た。次にこの形質転換株（ＪＭＩ
０９　　ｐＵｃ１８　５ｐｈｌ／旧ｎｄ　１１ｌ　ｆｒ
ａｇｍｓｎＬ）をアンピシリンを５０℃ｇ／ｍＱの濃度
で含むし培地にて培養し、プラスミドをアルカリＳＤＳ
法で抽出しｔ二。 このプラスミド１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ及びｓｐｈ
！　（各５　ｕｎｉｔｓ）を用いて、３７°Ｃ，１時間
反応で切断した。さらに前記（Ｃ）で調製した。Ｂａｌ
ｌ１ＨＩ／　）ｌｉｎｄｎＩ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片１ｐｇを
制限酵素５ａｕ３ＡＩ及び５ｐｈｌ（各５ｕｎｉｔｓ）
を用いて、３７°ｃ、　　ｉ時間反応にて切断した。両
者を混合し、６５°Ｃで１０分間保温することにより、
制限酵素を失活させた後、該失活溶液中の成分が最終濃
度として各々５ＱｍＭ）リス緩衝液ｐＨ７，６、ｌＱｍ
Ｍ　　Ｍｇｃｉｉ、ＩＯｉ＋Ｍジチオスレイトール、Ｉ
＋ｅＭＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉｔになるように
各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間保温した。この溶
液を用いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｅｈｉ
ａ　ｅｏｌｉ）Ｋ１２系株（トリプトファナーゼ欠損変
異及びトリプトファン要求性変異株）を常法に従って形
質転換させ、選択培地（Ｋ、ＨＰＯ４７ｇ、ＫＨ！ＰＯ
４２ｇ、（Ｎ　Ｈ４）　ｚ　Ｓ　Ｏ＊　ｌ　ｇ　、　Ｍ
　ｇ　Ｓ　Ｏ＊　７　Ｈ！００．１　ｇ、カザミノ酸５
ｇ、塩酸アデニン５０ｍｇ１　グリセリン２ｇ、アンビ
シリ”　２０　ｍｇ、寒天２０ｇ１純水１ｌｌ）に塗抹
し、３７℃で２４時間培養し、生育した菌株を得た。生
育してさた株につき、アルカリＳ　Ｄ　Ｓ法Ｋｌリプラ
スミドを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ　　（５ｕｎｉｔ
ｓ）およびＨｉｎｄｌｌＩ（５ｕｎｉｔｓ）を用いてプ
ラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて分
子量を測定したところ、約２．２ｋｂのＤＮＡ断片の挿
入が認められた。 （Ｅ）　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２ＬｎａＡの作製前記（Ｄ）で
得た形質転換株よりプラスミドＩ）　ＵＣｌ　８ｔｎａ
ＡをアルカリＳＤＳ法ｌこより抽出し、２５℃ｇｌ−得
た。制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｎＩ（各５ｕｎｉｔ
ｓ）を用い、３７°Ｏ，１時間反応により切断した。反
応終了後、アガロースゲル電気泳動にかけ、分子量のち
がいを利用し、分子量約２　、２　ｋｂのＤＮＡ断片２
μｇを得た。 次に、前記（Ｂ）で得たプラスミドｐＢＲ３２２ｍｉｎ
ｉ−ＦＢａｍＨＩ　／　Ｓａｌ　Ｉ　ｆｒａｇｍｅｎｔ
　ｌ　ｐ　ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄｌｌｌ　
（５ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃、１時間反応により切
断１〜だ。両者を混合して、６５°Ｃで１０分間保温す
ることにより、ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄ■を失活させた後
、該失活溶液中の成分が最終１農度として各々５０１Ｍ
トリス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭ　　ＭｇＣｌ２．１
０ｍＭジチオスレイトール、ｌｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４
リガーゼＩ　ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１
６°Ｃで１５時間保温した。 この溶液を用いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒ　
１ｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　１２系株（トリプトファナ
ーゼ欠損変異及びトリプトファン要求性変異株）を常法
に従って形質転換させ、アンピシリンを最終濃度５０μ
ｇ／ｍＱ含むし培地に塗沫し、３７°Ｃで１日間培養し
た。生育してきた株につき、アルカリＳＤＳ法によりグ
ラスミドを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ（５ｕｎｉｔｓ
）及び旧ｎｄｌｌ！　（５ｕｎｉｔｓ）を用いてプラス
ミドを切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて分子量
を測定したところ、プラスミドｐＢＲ３２２ｉｉｎｉ−
ＦＢａｍ＋ＨＩ　／　Ｓａｔ　Ｉ　ｆｒａｇｍｅｎｔの
ＥｃｏＲｒ、Ｈｉｎｄｌｌ［部位に約２．２ｋｂのＤＮ
Ａの挿入が認められるプラスミドを得ることができた。 このプラスミドｐＢＲ３２２にプラスミド安定か因子＋
１ｉｎｉ−Ｆの一部（ＢａｍＨＩ　／　Ｓａｔ　Ｉ　ｆ
ｒａｇｍｅｎｔ）とトリプトファナーゼの構造遺伝子（
ｔｎａＡ）を含むプラスミドである。 （Ｆ）　ｐ　Ｂ　Ｒ３２２ｔｎａＡとトリプトファンプ
ロモーター及びオペレーターの結合 前記（Ａ）と同様の方法で、エシェリヒア・コリＹＫ２
００４　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−７８３８）を培養し、それ
に含まれるプラスミド、９ＭＴＹ−２を、アリカリＳＤ
Ｓ法により調製した。 プラスミドｐＭＴＹ−２２５μｇを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉ
及び５ａｉｌ（各５　ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃、１
時間反応にて切断し、アガロースゲル電気泳動により分
子量のちがいを利用して、約７ｋｂのＤＮＡ断片２μｇ
を得た。次にこのＤＮＡ断片２μｇを制限酵素Ａｌｕｌ
及びＴａｑＩ　（ＡＩｕＩ　５ｕｎｉｔｓ、Ｔａｑｌ’
ｌ　ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃、１時間反応にて部分
分解した。さらに制限酵素Ｂａ１３１　（ｌ　ｕｎｉｔ
）を用い３０°０．３分間反応にてＤＮＡ断片の末端を
平滑末端にしｊ；。６５°Ｃ″′Ｃ″ｌＯ分間保温する
ことにより、制限酵素を失活させた後、合成オリゴヌク
レオチド（両末端にＥｃｏＲ１部位を有する）を力Ｕえ
常法（ｎｏ！ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｒｉｇ＋　ｐ３
９Ｂ、　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ、　９８２参照）に従って合成オリゴヌク
レオチドを結合させた。 前記Ｅで調製したプラスミド１／’ｇを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩ　（３ｕｎｉｔｓ）３７℃、１時間反応で切断した
。 両者を混合し、溶液中の成分が最終濃度として各々５０
ｍＭ）リス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇｃｌ、、１
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガ
ーゼ１ｕｎｉｔになるように各成分を強化し、１６℃で
１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃａｌｉ）Ｋ　ｌ　２系
株（トリプトファナーゼ欠損変異及びトリプトファン要
求性変異株）を常法に従って形質転換させ、上記選択培
地に塗沫し、３７℃で２日間培養した。生育してきた株
につき、アルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、
制限酵素ＥｃｏＲＩ　（５ｕｎｉｔｓ）を用いてプラス
ミドを切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて分子量
を測定したところ、プラスミドのＥｃｏＲＩ部位に約１
００　ｂｐのＤＮＡの挿入が認められた。さらに、この
株を下記のＡ、Ｂ、Ｃ及びＤの培地でそれぞれ培養し、
後述する参考例に従ってトリプトファナーゼ活性を調べ
たところ表１に示すとおりであった。 培地組成　　　　　　　　培　　地 ＢＣＤ トリプト７　　　　　　　ｌｏｇ　　ｌｏｇ　　ｌｏｇ
　　１０ｇ酵母エキス　　　　　　５ｇ　　　５ｇ　　
　５ｇ　　　５ｇＮａＣ１５ｇ　　　５ｇ　　　５ｇ　
　　５ｇグルコースネ　　　　　　Ｉｇ　　　−１ｇイ
ンドールアクリル 純水　　　　　　　　　　ＩＱ　　　ＩＱＩＱ１１２ネ
はｊｉｌ１１殺菌 零ネは別添波 表　　１ 培地　　　　　　　相対活性 Ａ　　　　　　　　　１００ Ｂ　　　　　　　　　１００ Ｃ　　　　　　　　　　８０ Ｄ　　　　　　　　　　　８０ 表１の結果より、このプラスミド中のトリプトファナー
ゼ構造遺伝子はトリプトファンオペロンのプロモーター
オペレーターの制御下に発現調節されていることが確認
され、ｐＭＴＰ−２を完成するに至った。 本プラスミドの制限酵素切断地図は図１に示すとＪダリ
である。 Ｓ考例　１　：　トリプトファナーゼ活性の測定前記培
地Ａ、Ｂ、Ｃ及びＤをそれぞれｌｏｏ＋ａｌずつ５００
１容三角フラスコに分注し、１２０℃で１５分間滅菌処
理したものに、形質転換株を植菌し、３７℃にて１日振
盪培養後、同様にして調製したそれぞれの前記培地１０
０ｍ１に２＋１１１接種し、同じく３７°Ｃにて８時間
振盪培養した。該培養液を遠心分離することにより菌体
を集菌し、１００ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８，０）５０
ｍｌにて洗浄し、再び遠心分離を行い集菌後、湿菌体を
２００１１１ｇ採取し、１ｍｌの１００ｍＭ）リス緩衝
液（ｐＨ８，０）に懸濁し超音波処理を行なった。処理
後の菌体破砕物を適当Ｋｌ００　ｍ　Ｍ　トリス！ｌｔ
衝液（ｐＨ８，０）で希釈して、１ｍｌ中Ｋｌ００　μ
ｍｏ！ｅトリス緩衝液（ｐＨ８，０）、ｌ　００　、ｕ
ｍｏｌｅＫ　Ｃ１，１０，ｕｍｏｌｅ　　Ｌ−）リプト
ファン、０．０３μｍｏｌｅピリドキサールー５−リン
酸を含む反応液ｌこ加えて３７°Ｃ１５分間反応させた
後、常法［０゜Ｈ，Ｓｍ１ｔｈ　ａｎｄ　Ｃ，Ｙａｎｎ
ｆａｓｋｙ　：　′Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍ
ｏｌｏｇｙ　”、Ａｃａｄｅｍｉｃ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒ
ｋ　（１９６２）、ｖｏｌ　　５、ｐ７９４〜８０６ｊ
に従い生成するインドールを定量した。 実施例２：大腸菌へのプラスミドｐＭＴＰ−２の導入 ■５培地（トリプトンＩＯｇ、酵母エキス５ｇ。 ＮａＣｌ１５ｇ、グルコースＩｇ、蒸留水１１２゜ｐＨ
７，２）１００＋１を容量５００ｍ１の三角フラスコに
分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理した。 この培地にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉ
ａ　ｃ。 １ｉ）ＫＩ２　　ＡＴＣＣ２７３２５株を既知の方法［
［実験農芸化学」　（下）第３版ｐ２２６〜２３０（東
京大学農学部農芸化学教室編、朝食書店、昭和５３年５
月２５日発行）参照］で処理した変異株（トリプトファ
ン要求、アデニン要求トリプトファナーゼ欠失）を植菌
し、３７°Ｃで１５時間培養を行なった後、この培養液
２ｍｌを採り、新たｌこ上記培地１００巾１に接種し、
再度３７℃で２時間培養を行なった。培養終了後、この
培養物の３ｆｏｗｌを無菌的に遠心分離（８００ｘｇ、
５分間４℃）して集菌した。滅菌処理を行なった１００
ｍ　Ｍ　　Ｍ　ｇ　ＣＩ　、溶液３０ｉ１に懸ｌｌＯ後
、遠心分離（８０００Ｘｇ　　５分間　４°Ｃ）を行な
い、あらかじめ０℃に冷却しておいた滅菌処理済の１０
０ｍＭ　　ＣａＣＩｚｌＯｍｌに再懸濁し、この懸濁液
を水中にて、１時間冷却した。 冷却終了後、この懸濁液１００μｌにプラスミドｐ　Ｍ
　Ｔ　Ｐ　−２０、５ｉｔ　ｇを添加し、水中にて３０
分間冷却した。次に４２゛Ｃにて２分間加温し、選択培
地［Ｋ２ＨＰＯ４７ｇＳＫＨ２ＰＯ４２ｇ。 （ＮＨ，）ｊｓＯ，Ｉ　ｇ、Ｍｇ５Ｏｔ７ＨｚＯＯ−１
ｇ、カザミノ酸５ｇ１塩酸アデニン５０Ｂ、グルコース
２ｇ、アンピシリン２０１１ｇ、寒天２０ｇ、純水１１
Ｎに塗床し、３７°Ｃにて２４時間培養し、生育した菌
株を得た。プラスミドｐＭＴＰ−２で形質転換された株
をＹＫ３００４と命名した。 このプラスミドｐＭＴＰ−２を保持する形質転換株エシ
ェリヒア・コリＫＩ２　　ＹＫ３００４は、茨城県筑波
郡谷田部町東１丁目１番地３号の工業技術院微生物工業
技術研究所に、昭和６２年２月２６日付で受託番号：微
工研寄第９２１９号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９２１９）とし
て寄託されている。 実施例３：形質転換株の安定性 前記の選択培地１００ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコ
に分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに、実
施例２で得た形質転換株を植菌し、３７°Ｃにて２４時
間振盪培養を行なった後、同様にして調製したし培地１
００ｍ１を５００ｍ１容三角７ラスフに分注し、１２０
°Ｃで１５分間滅菌したものＫｌ１当り５Ｑｃｅｌｌｓ
の割合になるように植継し、同じく３７°Ｃにて２４時
間振盪培養を行なった。次に遠心分離機を用いて集菌し
、菌体を洗浄債、アンピシリンを５０μｇ／ｍｌの割合
で添加したし培地および無諷加のし培地として調製した
平板培地に一定量塗抹し、３７℃にて１日培３１後生育
コロニーをカウントする。 この結果、形質転換株をアンピリジン添加および無添加
培地に生育したコロニーはどちらも同数であること、さ
らにＬ培地生育コロニーは全て実施例２で用いｔ；選択
培地に生育すること、すなわち該プラスミドの高度の安
定性を確認した。 実施例４：Ｌ−トリプトファンの製造 下記組成の培地５０ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコに
分注し、１２０℃で１５分間滅菌処理したものに上記実
施例２で得た形質転換株エシェリヒア・コリＫ１２　　
ＹＫ３００４　（ＦＰＲＭ　　Ｐ−９２３９）を植菌し
、３７℃にて１日振盪培養後、同様にして調製したイン
ドールアクリル酸を１００μｇ／ｍｌの濃度で含有する
同培地１００１１１に２ｍｌ接触し、同じく３７℃にて
１２時間振盪培養した。 培地組成 ＫＨ，ＰＯ。 Ｋ、ＨＰＯ。 （ＮＨ＊）ｔｓＯａ ＭｇＳ０４・７Ｈ２０ 塩酸アデニン 酵母エキス トリプトン グルコース　　　　　　　１ インドールアクリル酸　１００ｍｇ １）Ｈ７，２ 遠心分離機を用いて菌体を回収し、これをインドール１
．５ｇ、ピルビン酸ナトリウム１．５ｇ。 酢酸アンモニウム１．５　ｇ、ピリドキサールリン酸０
．５ｍｇ及び［トリトンＸＸ−１００Ｊ５を含むｌｏｏ
ｍＭ）リス緩衝液（ｐＨ８，５）５０ｍｌに懸濁し、振
盪しなから３７°Ｃで２時間反応を行なった。反応終了
後、反応物を水で１０倍に希釈したのち、遠心分離によ
り得た上澄液について高速液体クロマトグラフィーで生
成したＬ−トリプトファンの分析を行なったところ、２
　、１　ｍｇ／ｍｌのＬ−トリプトファンの生成が認め
られた。 反応終了後５０ｍ１の１０倍希釈液５００ｍ１をアンモ
ニア型強酸性イオン交換樹脂（ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ
、三菱化成製）のカラムを通してＬ−トリプトファンを
吸着させたのち、アルカリ溶液で溶出後、濃縮しＬ−ト
リプトファンの粗結晶を析出させた。これをアセトンで
洗浄し乾燥してＬ−トリプトファンの結晶を０．７ｇを
得た。 実施例５ニプラスミドｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｈ
の作製 （Ａ）プラスミドｐＭＴＰ−１の調製 り培地（トリプトンｌＯｇ、酵母エキス５ｇｓグルコー
ス１　ｇ、ＮａＣＩ　５ｇ、蒸留水Ｎ２゜ｐＨ７，２）
１００ｍｌを容量５００ｍ１の三角フラスコに分注し、
１２０℃で１５分間滅菌処理した。 この培地にアンピシリンを最終濃度が５０μｇ／ｍ（２
になるように添加し、さらにエシェリヒア・コリ（Ｅｓ
ｃｈａｒｉｃｈｉａ　ｃｏＪｊ）Ｙ　Ｋ　３００２　　
（Ｆ　Ｅ　ＲＭｐ−８８４４）を植菌し、３７°Ｃで１
５時間培養を行った債、この培養液２１を採り、新たに
上記培地１００ｍ１に接種し、再度３７°Ｃで４時間培
養を行なった。 培養終了後、この培養液全量を遠心分離（８０００Ｘｇ
、１５分間、４°Ｃ）して集菌し、菌体からアルカリ−
５ＤＳ法［Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ、　Ｅ、　Ｆ、　Ｆ
ｒ１ｔｓｃｈ、　Ｊ、　Ｓａｍｂｒｏｏｋ　；　”　Ｍ
ｏ１ｅｃｕｌａｒ　ｃｌｏｎｉｎｇ　”（１９８２）　
ｐ９０〜９１参照１によりプラスミドを抽出し、ｐＭＴ
Ｐ−１を得た。 （Ｂ）　ｍ１ｎｉ−Ｆ画分の調製及びプラスミドｐＢ　
Ｒ３２２ｍ１ｎｉ−Ｆ　（ＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲｒ
　ｆｒａｇｍｅｎｔ）の作製前記（Ａ）で調製したプラ
スミドｐＭＴＰ−１２５μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＩ　（各々５ｕｎｉｔｓ）を用い３７°Ｃ，１
時間反応で切断した。反応終了後、アガロースゲル電気
泳動にかけ、分子量のちがいを利用し、分子量的６．７
ｋｂのＤＮＡ断片を２μｇ調製した。 次にｐＢＲ３２２（宝酒造製）ｌｐｇをＢａｍＨＩ及び
ＥｃｏＲＩ　（各５　ｕｎｉｔｓ）を用い、３７℃、１
時間反応させることにより切断し、６５℃で１０分間保
温することにより、ＢａｍＨＩ及びＥｃｏＲＩを失活さ
せた後、該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５Ｑ
ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭＭｇＣ１２，１
０ｍＭジチオスレイトール、１ｍＭＡＴＰ及びＴ４リガ
ーゼｌｕ旧

【になるように各成分を強化し、１６°Ｃで
１５時間保温した。この溶液を用いてエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｃｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ１２系株（
トリプトファナーゼ欠損変異及びトリブトファン要求性
変異株）を常法に従って形質転換サセ、アンピシリンを
最終濃度５０μｇ／＋＋＋１２含むし培地に塗抹し、３
７°Ｃで２日間培養しＩ；。成育してきた株につさ、ア
ルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、制限酵素Ｂ
ａｗｌ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）及びＥｃｏＲＩ　　（５
ｕｎｉｔｓ）を用いてプラスミドを切断し、アガロース
ゲル電気泳動を用いて分子量を測定したところ、プラス
ミドｐＭＴＰ−１に含まれているｍ１ｎｉ−Ｆ断片の約
５．７ｋｂ画分がＢａｌ１ｌＨＩ　５ＥｃｏＲＩ部位に
組み込まれているプラスミド［ｐＢＲ３２２ｍｉｎｉ−
Ｆ（ＢａｍＨＩ　／　ＥｃｏＲＩ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）
］　を５つ得た。 （Ｃ）　ｌ−リブト７アナーゼオペロンを含むＤＮＡ断
片の調製 前記（Ａ）で調製したプラスミドｐＭＴＰ−１２５μｇ
を制限酵素ＢａｍＨＩ及び旧ｎｄＩ［［（各５ｕｎｉｔ
Ｓ）を用い３７℃、１時間反応で切断し、反応終了後ア
ガロースゲル電気泳動にかけ、分子量のちがいを利用し
、分子量約３、２ｋｂのＤＮＡ断片を１゜８μｇ調製し
た。 （Ｄ）プラスミドｐ　Ｕ　Ｃｌ　８　ｔｎａＡ”の作製
前記（Ｃ）で調製したＢａｍＨＩ　／旧ｎｄｌＩ［Ｄ　
Ｎ　Ａ断片ｌμｇをＳｐｈ　Ｉ　　（５ｕｎｉｔｓ）を
用し＼、３７’Ｃ！、１時間反応で切断し、さらにプラ
スミドｐＵｃ１８（宝酒造製）Ｑ、５ｐｇを旧ｎｄＩ［
Ｉ及び５ａｉｌ（各々５ｕ旧ｔｓ）を用い、３７℃、１
時間反応で切断しｔ：０両者を混合し、６５°Ｃで１０
分間保温すること番こより、制限酵素を失活させた後、
該失活溶液中の成分が最終濃度として各々５ＱｍＭ）リ
ス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭ　　ＭｇＣ１，、ｌｏｉ
Ｍジチオスレイトール、１ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガ
ーゼ１ｕｎｉＬになるように各成分を強化し、１６°Ｃ
で１５時間保温しＩ；。 この溶液を用いてエシェリヒア・コリＪＭＩ　Ｏ９（宝
酒造製）を常法［Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏ
ｌｏｇｙ。 １０１、２０〜７８（１９８３）参照〕に従って形質転
換し、形質転換株を得た。次にこの形質転換株（ＪＭＩ
０９　　ｐＵｃ１８　５ｐｈＩ／Ｈｉｎｄｌｌｌｆｒａ
ｇｍｅｎｔ）をアンピシリンを５０℃ｇ／ｍＱの濃度で
含むし培地ｌこて培養し、プラスミドをアルカリＳＤＳ
法で抽出しｌ；。 このプラスミド１μｇを制限酵素ＢａｍＨＩ及び５ｐｈ
ｌ　（各５　ｕｎｉｔｓ）を用いて、３７°Ｃ１１時間
反応で切断した。さらに前記（Ｃ）で調製した、Ｂａａ
＋ＨＩ／　ＨｉｎｄＩ［Ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａ断片１ｐｇを制
限酵素５ａｕ３Ａ！及び５ｐｈ（（各５　ｕｎｉｔｓ）
を用いて、３７°Ｃ，１時間反応にて切断した。両者を
混合し、６５°Ｃで１０分間保温することにより、制限
酵素を失活させた後、該失活溶液中の成分が最終濃度と
して各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７，６，１０ｍＭＭ
ｇＣｌ！、ＩＯ＋ｎＭジチオスレイトール、１ｍＭ　　
ＡＴＰ及びＴ４リガーゼｌｕ旧【になるように各成分を
強化し、１６°Ｃ″ｒ１５時間保温した。この溶液を用
いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉａ　ｃ
ｏｌｉ）Ｋ１２系株（トリプトファナーゼ欠損変異及び
トリプトファン要求性変異株）を常法に従って形質転換
させ、選択培地（ＫｚＨＰＯ−７ｇ、ＫＨｘＰ０１２ｇ
ｓ　　（ＮＨｔ）ｚｓＯ４１ｇｓ　ＭｇＳＯ４７１（。 ００．１ｇ、カザミノ酸５ｇ、塩酸アデニン５０ｒｍ　
ｇ　ｓ　グリセリン２　ｇ　ｓアンピシリン２０ｍｇ、
寒天２０ｇ、純水Ｉｎに塗抹し、３７°Ｃで２４時間培
養し、生育した菌株を得た。生育してきた株につき、ア
ルカリＳＤＳ法によりプラスミドを抽出し、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ　（５ｕｎｉｖｓ）および旧ｎｄｌｎ（５ｕｎ
ｉｔｓ）を用いてプラスミドを切断し、アガロースゲル
電気泳動を用いて分子量を測定したところ、約２．２ｋ
ｂのＤＮＡ断片の挿入が認められた。 （Ｅ）　ｐＤＲ７２０ｔｎａＡ 曲記（Ｄ）で得た形質転換株よりプラスミドｐｕＣＩ　
８　ｔｎａＡをアルカリＳＤＳ法により抽出し、２５℃
ｇを得た。制限酵素Ａｖａ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）を用
い、３７°Ｃ，１時間反応により切断した。反応終了後
、アガロースゲル電気泳動にかけ、分子量のちがいを利
用し、分子量約１．９ｋｂのＤＮＡ断片２μｇを得た。 次にプラスミドｐＤＲ７２０（ファルマシア製）を制限
酵素＾ｖａ　Ｉ　（５ｕｎｉｔｓ）を用い、３７°Ｃ１
１時間反応により切断した。６５℃、１０ｍ１ｎ保温し
て制限酵素を失活させた後、両者を混合して該溶液中の
成分が最終濃度として各々５０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ７
，６，１０ｍＭ　　ＭｇＣＯ２、ｌＯｎ＋Ｍジチオスレ
イトール、１ｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉ
ｔになるように各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間保
温した。この溶液を用いてエシェリヒア・フリ（Ｅｓｃ
ｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　ｌ　２系株（トリプ
トファナーゼ欠損変異及びトリプトファン要求性変異株
）を常法に従って形質転換させ、選択培地（Ｋ　２ＨＰ
　０４７　ｇ　１Ｋ　Ｈ２Ｐ　０２２　ｇ、（ＮＨ＋）
ｉｓ○４１　ｇ、ＭｇＳＯ４７Ｈ，００，１ｇ。 カザミノ酸５ｇ、塩酸アデニン５０ｏ＋ｇ、グリセリン
２ｇ、アンピシリン２０ｍｇ、寒天２０ｇ、純水「０に
塗沫し、３７℃で２４時間培養し、生育した菌株を得た
。生育してきた株につき、アルカリＳＤＳ法によりプラ
スミドを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（５ｕｎｉｔｓ
）を用いてプラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳
動を用いて分子量を測定したところ、約２．ＯｋｂのＤ
ＮＡの挿入が認められＩこ。 （Ｆ）ｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｈの作製前記（Ｅ
）で得Ｉ；形質転換株よりｐ　Ｄ　Ｒ７２０ｔｎａＡ７
をアルカリＳＤＳ法により抽出し、２５μｇを得た。制
限酵素ＥｃｏＲＩ　（５ｕｎｉｃｓ）を用い、３７℃、
１時間反応により切断した。反応終了後、アガロースゲ
ル電気泳動にかけ、分子量のちがいを利用し、分子量的
２．０ｋｂのＤＮＡ断片２μｇを得た。 次に、前記（Ｂ）で得たプラスミドｐＢＲ３２２ｍｉｎ
ｉ−Ｆ　ＢａｒｒｒＨＩ　／ＥｃｏＲＩ　　ｆｒａｇｍ
ｅｎｔ　１　ｔｔ　ｇを制限酵素ＥｃｏＲＩ　（５ｕｎ
ｉｔｓ）を用い、３７℃、】時間反応で切断した。両者
を混合して、６５℃で１０分間保温することにより、Ｅ
ｃｏＲＩを失活させた後、該失活溶液中の成分が最終濃
度として各々５０１１１Ｍ）リス緩衝液ｐＨ７，６、ｌ
ｏｍＭ　　ＭｇＣＱ、、１０ｍＭジチオスレイトール、
ＩｍＭ　　ＡＴＰ及びＴ４リガーゼ１ｕｎｉＬになるよ
うに各成分を強化し、１６°Ｃで１５時間保温した。こ
の溶液を用いてエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ　ｃｏｌｉ）Ｋ　ｌ　２系株（トリプトファナー
ゼ欠損変異及びトリプトファン要求性変異株）を常法に
従って形質転換させ、選択培地（Ｋ、ＨＰＯ４７ｇ％ｌ
（Ｈ２ＰＯｚ２ｇ−（ＮＨ４）！５０４１　ｇ、ＭｇＳ
Ｏ４７Ｈ！００．１　ｇ。 カザミノ酸５ｇ１塩酸アデニン５０＋＋＋ｇ、グリセリ
ン２ｇ、アンピシリン２０ｍｇ、寒天２０ｇ１純水Ｌす
に塗沫し、３７℃で２４時間培養し、生育した菌株を得
た。生育してきた株につき、アルカリＳＤＳ法によりプ
ラスミドを抽出し、制限酵素ＥｃｏＲＩ　（５ｕｎｉＬ
ｓ）を用いてプラスミドを切断し、アガロースゲル電気
泳動を用いて分子量を測定したところ、約２　、　Ｏｋ
ｂのＤＮＡの挿入が認められた。 さらに制限酵素ＢａｍＨＩ　（５ｕｎｉｔｓ）を用いて
プラスミドを切断し、アガロースゲル電気泳動を用いて
分子量を測定したところ、グラスミドのＥｃｏＲＩ部位
の約２．Ｏｂｐ挿入ＤＮＡ断片の方向性が異なるプラス
ミドがそれぞれ３ケ所ずつ得られた。次に、異なる方向
性のプラスミドをもつ形質転換株を下記のＡ、Ｂ、Ｃ及
びＤの培地でそれぞれ培養し、後述する参考例に従って
トリプトファナーゼ活性を調べたところ表２に示すとお
りであった。 培地組成 トリプトン 酵母エキス ａＣ１ グルコース本 インドールアク 純水 本は別殺菌 ＊ネはＥｌ添加 表　　２ 培　　　地 １０ｇ　　　１０ｇ ５ｇ　　　５ｇ ５ｇ　　　５ｇ ｇ リ　ル酸零ネ　２００１Ｉｇ　　２００ｍｇ１Ｑ　　　
　ｌａ ０ｇ ｇ ｇ ｌａ ｐＭＴＰ−３保有株 相対活性 Ｏ０ ｐＭＴＰ−３Ｒ保有株 相対活性 表２の結果より、このプラスミド中のトリプトファナー
ゼ構造遺伝子はトリブトファンオペロンのプロモーター
オペレーターの制御下に発現ＩＲ１ｅｉされ−〔いるこ
とが確認され、ｐＭＴＰ−３およびｐ〜ｆＴＰ−３Ｒを
完成するに至った。 本プラスミドの制限酵素切断地図は図２及び図３に示す
とおりである。 Ｌ培地（トリプトンｌＯｇ、酵母エキス５ｇ、ＮａＣＱ
　１５ｇ、グルコースＩｇ、蒸留水ｉ、ｐｐＨ７−２）
ｌｏＯ＋を容量５００１の三角フラスコに分注し、１２
０℃で１５分間滅菌処理した。 この培地にエシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈａｒｉｃｈｉ
ａｃｏｌｉ）Ｋ１２　　ＡＴＣＣ２７３２５株を既知の
方法［「実験農芸化学」　（下）第３版ｐ２２６〜２３
０（東京大学農学部農芸化学教室編、朝食１店、昭和５
３年５月２５日発行）参照Ｊで処理した変異株（トリプ
トファン要求、アデニン要求トリプトファナーゼ欠失）
を植菌し、３７°Ｃで１５時間培養を行なった後、この
培養液２層１を採り、新たに上記培地１００１に接種し
、再度３７℃で２時間培養を行なった。培養終了後、こ
の培養物の３０ｍ１を無菌的に遠心分離（８００Ｘｇ、
５分間１１°Ｏ）して集菌した。滅菌処理を行なった１
００ｍＭ　　ＭｇＣＱｚ溶液３０ｍ１に懸濁後、遠心分
離（８０００Ｘｇ　　Ｓ分間　４℃）を行ない、あらか
じめＱ　’（３に冷却しておいた滅菌処理済の１００ｍ
Ｍ　　Ｃａ　ＣＱ　ｚｌ　Ｏｎ＋Ｉに再懸濁し、この懸
濁液を水中にて、１時間冷却した。 冷却終了後、この懸濁液１００μＩにプラスミドｐＭＴ
Ｐ−３またはｐＭＴＰ−３ＲＯ，５層ｇを添加し、水中
にて３０分間冷却した。次に４２°Ｃにて２分間加温し
、選択培地［ＫｓＨＰｏ、７ｇ、ＫＨ！ＰＯ＋２　ｇ−
（ＮＨ＊）ｙｓｏ＜ｌ　ｇ、Ｍｇ５ｏ。 ７ＨｚＯＯ，Ｉｇ、カザミノ酸５ｇ、塩酸アデニン５０
ｍｇ、グルコース２ｇ、アンピシリン２０ｍｇ。 寒天２０ｇ１純水ＩＮＩに塗床し、３７°Ｃにて２４時
間培養し、生育した菌株を得た。プラスミドｐ　Ｍ　Ｔ
　Ｐ　−３で形質転換された株をＹＫ３００５、プラス
ミドｐＭＴＰ−３Ｒで形質転換された株をＹＫ３００６
と命名した。 このグラスミドｐ　Ｍ　Ｔ　Ｐ　−３を保持する形質転
換株エシェリヒア・コリに−２２ＹＫ３００５は、茨城
県筑波郡谷田部町東１丁目１番地３号の工業技術院微生
物工業技術研究所に、昭和６２年９月２６日付で受託番
号：微工研寄第９６２２号（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６２２
）として寄託されている。また、プラスミドｐＭＴＰ　
　３Ｒを保持する形質転換株エシェリヒア・フリに−１
２ＹＫ３００６は、茨城県筑波郡谷田部町東１丁目１＃
地３号の工業技術院微生物工業技術研究所に、昭和６２
羊９月２６日付で受託番号：微工研寄第９６２：３号（
ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６２３）として寄託されている。 実施例７：形質転換株の安定性 前記の選択培地１００ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコ
に分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理したものに、
実施例２で得た形質転換株を植菌し、３７°Ｃにて２層
詩間振盪培養を行なった隆、同様ｌこして調製したし培
地１００ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコに分注し、１
２０°Ｃで１５分間滅菌したものＫｌｍｌ当り５０ｃｅ
ｌｌｓの割合になるように植継し、同じく３７°Ｃにて
２４時間振盪培養を行なった。次に遠心分離機を用いて
集菌し、菌体を洗浄後、アンピシリンを５０ｇｇ／ｍ１
の割合で添加したし培地および無添加のし培地として調
製した平板培地に一定ｉ塗抹し、３７°Ｃにて１日培Ｉ
Ｉ後生育コロニーをカウントする。 この結果、形質転換株をアンピリジン添加および無添加
培地に生育したコロニーはどちらも同数であること、さ
らにＬ培地生育コロニーは全て実施例６で用いた選択培
地に生育すること、すなわち該プラスミドの高度の安定
性を確認した。 実施例８：Ｌ−）リブトファンの製造 下記組成の培地５９ｍ１を５００ｍ１容三角フラスコに
分注し、１２０°Ｃで１５分間滅菌処理したものに上記
実施例６で得た形質転換株エシェリヒア・コリＫ１２　
　ＹＫ３００５　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６２２）、ＹＫ
３００６（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９６２３）及びＹＫ３００
４　（ＦＥＲＭ　　Ｐ−９２１９）を植菌し、３７°Ｃ
にて１日振盪培養後、同様にして調製＋、１ニインドー
ルアクリノし酸を１００μｇ／ｉｔの濃度で含有する同
培地１００ｍ１に２ｍｌ接触し、同じく３７°Ｃにて１
０時間振盪培養した。 培地組成 ＫＨ２ＰＯ＊　　　　　　　２　　Ｉ？に、ＨＰｏ、　
　　　　　　７　２ （ＮＨ，）ｚｓＯａ　　　　　Ｉ　　ｌＭｇ５ｏ４−７
ＨｔＯＩ　００ｍｇ 塩酸アデニン　　　　　５０ｍｇ 酵母エキス　　　　　　１２ トリプトン　　　　　　１２ グルコース　　　　　　　１２ インドールアクリル＃１００ｍｇ 水　　　　　　　　　　　　　　１０００ａ＋ＪｔｐＨ
７，２ 遠心分離機を用いて菌体を回収し、菌体収量を測定した
後、これを全量インドール１．５ｇ、ピルビン酸ナトリ
ウム１．５ｇ、酢酸アンモニウム１．５ｇ、ピリドキサ
ールリン酸０．５ｆｆ１ｇ及び「トリトンＸ−１００Ｊ
　５ｇを含むｌＯＯｍＭｔ−リス緩衝液（ｐＨ８，５）
５０ｍｌに懸濁し、振盪しながら３７°Ｃで１時間反応
を行なった。反応終了後、反応物を水で１０倍に希釈し
たのち、遠心分離により得た上ｔ！ｌ液については高速
液体クロマトグラフィーで生成したＬ−トリプトファン
の分析を行なったところ、下記表３に示すとおりであっ
た。 表　　　３ 生成Ｌ−トリプト 相対菌体収量　７アン［ｌＩＩ／パｊ ＹＫ３００５　　　　１００　　　　１．６ＹＫ３００
６　　　　１００　　　　１．５ＹＫ３００４　　　　
　６０　　　　１．０また、ＹＫ３００５培養物で生成
したＬ−）リブドアアンはアンモニア型強酸性イオン交
換樹脂（ダイヤイオン５Ｋ−ＩＢ、三菱化成製）のカラ
ムを通してＬ−トリプトファンを吸着させたのち、アル
カリ溶液で溶出後、濃縮しＬ−トリシトファンの粗結晶
を析出させた。これをアセトンで洗浄し乾燥させてＬ−
トリプトファンの結晶を０．５ｇを得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は実施例１で作製した本発明のプラスミドｐＭＴ
Ｐ−２の制限酵素切断地図である。 第２図及び第３図は、実施例５で作製した本発明のプラ
スミドｐＭＴＰ−３およびｐＭＴＰ−３Ｒの制限酵素切
断地図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）トリプトファナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ
   断片と、 （ｂ）トリプトファナーゼ構造遺伝子を発現制御しうる
   トリプトファンプロモーター及びオペレーターを含むＤ
   ＮＡ断片と、 （ｃ）ＣｏｌＥ１系プラスミドの自律増殖能を司る遺伝
   子を含むＤＮＡ断片と、 （ｄ）Ｆプラスミド由来の分配制御系を司る遺伝子を含
   むＤＮＡ断片 とからなることを特徴とする新規なプラスミド。 ２、ＣｏｌＥ１系プラスミドの自律増殖能を司るＤＮＡ
   断片（ｃ）がｐＢＲ３２２由来のものである特許請求の
   範囲第１項記載のプラスミド。 ３、Ｆプラスミドの分配制御系を司る遺伝子（ｄ）がｍ
   ｉｎｉＦ断片である特許請求の範囲第１項又は第２項記
   載のプラスミド。 ４、Ｆプラスミド由来の分配制御系を司る遺伝子（ｄ）
   がｍｉｎｉＦ断片中の制限酵素ＢａｍＨ I 及びＳａｌ
   I で切り出される約６．６ＫｂのＤＮＡ断片である特
   許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプラスミド
   。 ５、トリプトファナーゼ構造遺伝子を含むＤＮＡ断片（
   ａ）が、大腸菌Ｋ１２系株の染色体ＤＮＡを制限酵素Ｂ
   ａｍＨ I 及びＨｉｎｄIIIで切り出すことによって得ら
   れる約３．２Ｋｂのトリプトファナーゼ構造遺伝子含有
   ＤＮＡ断片から、トリプトファナーゼ構造遺伝子よりも
   上流部分のプロモーター及び調節遺伝子画分を削除した
   ＤＮＡ断片である特許請求の範囲第１〜４項のいずれか
   に記載のプラスミド。 ６、トリプトファナーゼ構造遺伝子を発現制御しうるト
   リプトファンプロモーター及びオペレーターを含むＤＮ
   Ａ断片（ｂ）が、大腸菌Ｋｌ２系株の染色体ＤＮＡを制
   限酵素Ｓａｌ I 及びＸｈｏ I で切り出すことができる
   約７．０ＫｂのトリプトファンオペロンのＤＮＡ断片由
   来である特許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の
   プラスミド。 ７、プラスミドｐＭＴＰ−２である特許請求の範囲第１
   〜６項のいずれかに記載のプラスミド。 ８、分子量が約８．５メガダルトンであり、制限酵素Ｈ
   ｉｎｄIII、Ｘｈｏ I 、ＥｏＲ I 、Ｐｖｕ I 及びＢｇ
   ｌIIによる切断部位が、それぞれ１ケ所、１ケ所、２ケ
   所、２ケ所及び２ケ所であり、且つＨｉｎｄIII及びＸ
   ｈｏ I による切断断片の分子量がそれぞれ約８．５メ
   ガダルトンであり、ＥｃｏＲ I による切断断片が約８
   ．４３メガダルトン及び約０．０７メガダルトンであり
   、Ｐｖｕ I による切断断片が約３．２メガダルトン及
   び約５．３メガダルトンであり、ＢｇｌIIによる切断断
   片が約１．３メガダルトン及び約７．２メガダルトンで
   あることを特徴とするプラスミドｐＭＴＰ−２である特
   許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記載のプラスミド
   。 ９、Ｆプラスミド由来の分配制御系を司る遺伝子（ｄ）
   がｍｉｎｉＦ断片中の制限酵素ＢａｍＨ I 及びＥｃｏ
   Ｒ I で切り出される約６．７ＫｂのＤＮＡ断片である
   特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに記載のプラスミ
   ド。 １０、プラスミドｐＭＴＰ−３及びｐＭＴＰ−３Ｒであ
   る特許請求の範囲第１〜３、５及び９項のいずれかに記
   載のプラスミド。 １１、分子量が約８．２メガダルトンであり、制限酵素
   ＥｃｏＲ I ，ＢｇｌII、Ｘｈｏ I 、ＢａｍＨ I 及び
   Ｓａｌ I による切断部位がそれぞれ２ケ所、２ケ所、
   １ケ所、２ケ所及び３ケ所であり、且つＸｈｏ I によ
   る切断断片の分子量が約８．２メガダルトン、ＥｃｏＲ
   I 及びＢｇｌIIによる切断断片の分子量が約１．３メ
   ガダルトンと約６．９メガダルトンであり、ＢａｍＨ
   I による切断断片の分子量が約２．６メガダルトン及び
   約５．６メガダルトンであり、Ｓａｌ I による切断断
   片の分子量が約１．３メガダルトン、約２．４メガダル
   トン、約４．５メガダルトンであることを特徴とするプ
   ラスミドｐＭＴＰ−３である特許請求の範囲第１０項記
   載のプラスミド。 １２、分子量が約８．２メガダルトンであり、制限酵素
   ＥｃｏＲ I 、ＢｇｌII、Ｘｈｏ I 、ＢａｍＨ I 及び
   Ｓａｌ I による切断部位がそれぞれ２ケ所、２ケ所、
   １ケ所、２ケ所及び３ケ所であり、且つＸｈｏ I によ
   る切断断片の分子量が約８．２メガダルトン、ＥｃｏＲ
   I 及びＢｇｌIIによる切断断片の分子量が約１．３メ
   ガダルトン、約６．９メガダルトンであり、ＢａｍＨ
   I による切断断片の分子量が約３．８メガダルトン、約
   ４．４メガダルトンであり、Ｓａｌ I による切断断片
   の分子量が約０．１メガダルトン、約３．６メガダルト
   ン、約４．５メガダルトンであることを特徴とするプラ
   スミドｐＭＴＰ−３Ｒである特許請求の範囲第１０項記
   載のプラスミド。 １３、プラスミドｐＭＴＰ−２、ｐＭＴＰ−３又はｐＭ
   ＴＰ−３Ｒで形質転換されたエシエリヒア・コリＫ−１
   ２系微生物。