JPH0241526B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、モノマーとして (1) アクリルアミド、メタクリルアミド、メチレ
ン−ビス−アクリルアミドおよび−メタクリル
アミドの群からの化合物少なくとも１種
30〜95重量％ （重合可能なモノマーの全重量に対して） (2) 場合によりその他の親水性のラジカル重合性
コモノマー (3) オキシラン基を有する不飽和、ラジカル重合
性モノマー ５〜60重量％ (4) 場合により親水性のより低い、他のラジカル
重合性コモノマー 25重量％まで およびその中で重合性二重結合を少なくとも２
個有するモノマー少なくとも５重量％並びに希釈
剤を含有し、かつ水性有機媒体中で分配されて滴
とされ、かつこの形でラジカル重合されるモノマ
ー相を反転パール重合することによる、パール状
の、架橋し、親水性の、たん白質に対して結合活
性の担体ポリマーの製法に関する。 西ドイツ国特許出願公告第2237316号公報から
たん白質に対する結合活性のモノマー、架橋性モ
ノマーおよび親水性モノマーから成るモノマー混
合物の反転パール重合によりパー状の、架橋し、
水中で膨潤性の共重合体を製造することは既に公
知である。良好な膨潤性および網目の荒い架橋を
達成するために、モノマー混合物は非極性有機重
合媒体と混合性ではない溶剤に溶かし、溶液を前
記の媒体中で懸濁させて滴にし、かつこの形状で
重合する、モノマー混合物の溶剤として例えばホ
ルムアミド、ジメチルホルムアミドまたはジメチ
ルスルホキシドが使用される。 西ドイツ国特許出願公開第2722751号公報によ
ればこうして製造される親水性のパール重合体の
結合活性は、モノマー混合物における架橋性モノ
マーの割合が５重量％以上であり、かつアクリル
−またはメタクリルアミドまたはメチレン−ビス
−アクリルアミドまたは−メタクリルアミドの総
割合が一定の限界値を越えた場合に更に高めるこ
とができる。この反応特性により高い結合活性に
は必要とされた中空パール構造を有する重合体が
生成する。 公知の親水性パール重合体はたん白質に対して
結合活性の基としてオキシラン基（エポキシ基）
を有するモノマー単位、例えばグリシジルメタク
リレートまたはアクリルグリシジルエーテルを含
有する。この単位は水溶性たん白質をその生物学
的活性の維持下に重合体に共有結合させ得る。こ
のようにして若干の酵素との高い結合能力が得ら
れたが、他の若干の酵素では結合能力は不十分な
ままであつた。結合能力とはパール重合体に一定
の酵素を最高に負荷させた際に得ることができる
酵素活性と理解される。パール重合体のオキラン
基含量を高めるかまたはより高濃度の酵素溶液を
負荷に使用することによつては酵素特異性の限界
を上回る結合能力が高められないかまたは著しく
は高められないことが示された。 本発明の課題は、たん白質をオキシラン基で共
有結合する親水性パール重合体の結合能力を高め
ることである。狭意ではこの課題はパール状担体
ポリマーの結合能力をその都度結合すべきたん白
質に対して最適にすることである。 該課題は本発明による方法により解決される。
該方法はモノマー相の希釈剤としてＡ）水、ホル
ムアミド、グリコールおよびジメチルスルホキシ
ドの群からの溶剤少なくとも１種およびＢ）成分
Ａとは別種の、モノマーと成分Ａの混合物と均一
相を形成し、200を下回る分子量を有し、かつ酸
素少なくとも20重量％を含有する有機液体少なく
とも１種から成る混合物を使用することより成
る。 この方法において高められ、かつ場合により特
定の酵素に対して最適化された結合能力を有する
パール重合体が生成することが判明した。結合能
力は本発明によれば希釈剤の特別な組合せをモノ
マー混合物に添加することにより調節することが
できる。 希釈剤の成分Ａとして水、ホルムアミド、グリ
コールおよびジメチルホキシドまたはこれの混合
物を使用することができる。意外にも水はたん白
質結合に必要なエポキシド基と容易に反応する
が、水を使用する際にもたん白質に対する結合性
は維持される。 希釈剤の成分Ｂとして酸素によつて与えられ
る、中間から高い極性を有する有機液体が好適で
あると示された。酸素の含量が少なくとも20重量
％であり、かつ分子量が200を下回る場合に十分
な極性が与えられる。酸素をカルボニル基または
ヒドロキシル基の形状で含有する脂肪族有機液体
が優れている。それに比べてカルボニル基はオキ
シラン基に対する高い反応性のために余り有利で
はない。エーテル性結合した酸素原子も所望の極
性に寄与し、かつ例えば脂肪族または脂環式エー
テルおよび脂肪族エステルに見られる。本発明の
方法に好適な成分Ｂは主として総溶解パラメータ
δ9〜15、有利に11〜14.5ヒルデブラント単位又は
分散性溶解パラメータδ_D７〜９、有利に7.4〜8.5
ヒルデブラント単位によつて優れている〔“ポリ
マー−ハンドブツク（Polymer−Handbook）”、
第２版、S.337頁以下。1975年〕。 次表に希釈剤成分Ｂの例とその特徴を挙げる：

【表】 ン

【表】 ル
モノマーと希釈剤成分ＡとＢから成る混合物は
できる限り既に室温（20℃）で均一相を形成しな
ければならないが、このことは考え得る組合せの
すべての場合には該当しない。更にこの混合物は
少なくとも重合温度で有機媒体と非相容性でなけ
ればならない。そのために別個に懸濁されたモノ
マー相が形成される。希釈剤成分が有機媒体中で
一定の溶解性を持つ場合には、モノマー相が貧化
して結合能力の変化を惹起する場合がある。結合
能力を所定通りに調節し得るために、有機媒体を
予めこれに可溶な希釈剤成分ＡもしくはＢで飽和
させるかまたは相応する平衡濃度を調節すること
が推奨される。これにより有機媒体の極性が上昇
する。有機媒体への希釈剤成分の添加はモノマー
相が有機媒体に溶解する限界を下回らなければな
らない。 十分に非極性の有機溶剤を選択することにより
この限界への接近を避けることができる。脂肪族
炭化水素およびクロル炭化水素およびその混合物
が優れている。 成分ＡとＢができる限り既に室温で相互に完全
に混合可能である場合に有利である。成分Ｂの有
機液体からの優れた群は室温で水と完全に混合可
能な液体、例えばメタノール、エタノール、プロ
パール、アセトン、ジメチルホルムアミドまたは
テトラヒドロフランである。工業的観点からも特
に有利な組合せはメタノールと水の混合物であ
る。 成分ＡとＢ相互の混合比は広範囲、例えば99：
１〜１：99重量部内で選択されるが、その際90：
10〜10：90の範囲が有利である。ＡとＢから成る
希釈剤のモノマー相に対する割合は20〜90重量％
であつてよく、かつ有利に50〜90重量％である。
この割合およびＡ対Ｂの比の設定には有利に一連
の種々のパールポリマーを試験バツチで製造し、
かつその都度特定のたん白質に対する結合能力を
測定して行なう。その際通常Ａ：Ｂの比を変える
際に、以下のモノマー相の反転パール重合の例で
PC−アシラーゼ（ペニシリンアシラーゼ）での
最適化の際に示されるように結合能力の最高値ま
での増加、その後の低下が見られる： モノマー相 メタクリルアミド 30重量部 Ｎ，N′−メチレン−ビス−メタクリルアミド
30 〃 グリシジルメタクリレート 20 〃 アリル−グリシジルエーテル 20 〃 メタノール／ホルムアミド混合物 73 〃

【表】 他の酵素については活性の最大値は他の比Ａ：
Ｂにある場合がある。 パールポリマーの親水性を保証するために、基
礎となるモノマー混合物は主要な部分親水性モノ
マーから成つていなければならない。該モノマー
にはアクリル−およびメタクリルアミドおよびそ
のメチレン−ビス−アミド並びに室温で少なくと
も10％の水溶液を形成し、かつ有利にはイオン性
のまたは酸または塩基の添加によりイオン化可能
な基を含まない不飽和の、ラジカル重合性モノマ
ーが含まれる。優れた親水性コモノマーの例は不
飽和、重合性カルボン酸のヒドロキシアルキルエ
ステル、例えばヒドロキシエチルアクリレートお
よび−メタクリレート、２−ヒドロキシプロピル
アクリレートまたは−メタクリレート、およびＮ
−ビニルピロリドンである。アクリル−またはメ
タクリルアミドおよびそのメチレン−ビス−アミ
ドは少なくとも30重量％、有利に少なくとも50重
量％である。他の親水性コノマーは場合により重
合性モノマーの65重量％までで存在してよい。 オキシラン基を有するモノマー混合物に対して
５〜60重量％の量で含まれる。該モノマーの例は
グリシジル−アクリレートおよび−メタクリレー
トおよびアリルグリシジルエーテルであり、場合
により一緒に使用することもできる。パールポリ
マーとたん白質との反応および水性媒体との持続
的な接触によりオキシラン基は次第に完全にヒド
ロキシ基に移行し、これによりポリマーの親水性
は更に増加する。余り親水性ではなく、室温で10
％よりも低い飽和度の水溶液を与えるその他のコ
モノマーはポリマーの親水性を減少させ、使用す
る場合には25重量％を下回る量で使用する。 本発明により製造されるパールポリマーは著し
く架橋される。分子中にエチレン性不飽和の重合
性の基を２個以上有する、架橋剤として有効なコ
モノマーはモノマー混合物の少なくとも５重量％
で存在する。有利にメチレン−ビス−アクリルア
ミドまたは−メタクリルアミドが架橋剤として用
いられる。この場合には架橋するモノマーの割合
は重合性モノマーの90重量％を上回つてよい。し
かしその代わりにまたはそれと一緒に他の架橋性
モノマーを使用する場合には、その割合は最高45
重量％に制限される。 他の成分として懸濁されたモノマー相は重合開
始剤および場合により公知技術から公知であるよ
うな他の助剤を含有する。 パール重合の方法は自体公知である。モノマー
相を撹拌下に有利に可溶な分散剤を含んでいる有
機媒体中に懸濁させて大きさほぼ10〜1000μmの
滴にする。滴の大きさは分散剤の種類と量および
撹拌速度の選択により所望の値に調節することが
できる。重合はモノマー滴内で起り、かつこれを
固体のパールポリマーに変え、パールポリマーは
重合終結後有機媒体から分離することができる。
この方法の有利な実施形は西ドイツ国特許第
2009218号明細書、西イツ国特許出願公告第
2237316号公報および西ドイツ国特許出願公開第
2722751号公報に記載されている。 多くの場合パールポリマーは付着してより大き
な凝集体になる傾向があるが、これは取扱い性の
点で一般に不所望である。この欠点はモノマー相
にその粘度を高めるポリマーを溶かすことにより
避けることができる。最終生成物の親水性を損な
わないためにこのポリマーの添加は同様に親水性
であるべきであり、かつ例えば架橋性モノマーを
除いたパールポリマーと同じモノマーから形成さ
れていてよい。希釈剤として水／メタノール混合
物を使用する場合には例えばポリメタクリルアミ
ドが好適である。かかるポリマー添加の有効的な
量は例えばモノマー相の重量に対して0.1〜20重
量％である。その他の使用可能なポリマーの添加
は例えば低級アクリル酸アルキルエステル、例え
ばブチルアクリレートとアクリル−またはメタク
リルアミドまたはグリシジルメタクリレートとの
共重合体である。 パール重合終結後重合体パールを有機媒体から
濾取することができる。希釈剤として水または他
の活性水素原子を有する化合物、例えばアルコー
ルまたはグリコールを使用した場合にはこれをパ
ールから除去しなければならない、それというの
もさもなければ長期貯蔵の際にオキシラン基との
反応をする場合があるからである。揮発性希釈
剤、例えば水およびメタノールは乾燥により容易
に除去することができる。難揮発性希釈剤、例え
ばグリコール、ホルムアミドまたはジメチルスル
ホキシドは揮発性溶剤、例えばアセトンで洗うこ
とにより容易に除去することができる。引続き溶
剤の残量を蒸発させる。パールポリマーは乾燥後
固く、かつ乾燥し、かつ空中湿度の排除下に任意
の時間貯蔵可能である。 たん白質を負荷するためにパールにたん白質の
できる限り濃縮された溶液を加える、そのために
は実際には水溶液しか該当しない。きわめて重要
な用途は酵素、例えばペニシリン−アシラーゼ、
トリプシンまたはラクターゼの免疫化である。 以下の例は希釈液１種の使用（例２、ホルムア
ミド）に比べて本発明による希釈剤組合せ（例１
メタノール／水）を使用することによる結合能力
の増加を示す。 最高の結合能力は希釈剤成分ＡとＢの混合比を
変えることにより測定することができる（一連の
例７〜10の中の例９および表参照）。ポリマーの
組成を変える際に能力最大の位相は一連の例３〜
５と例１との比較から明らかであるように混合比
Ａ：Ｂに関して移行する。その際架橋するモノマ
ーをモノマー混合物の重量に対して30％以上、特
に50％以上含む利点が認められる。 同じポリマー組成では希釈剤成分を他の液体と
代えることにより著しい活性変化が生じる場合が
あり（例６と７の比が示すように）、そのために
最大値は各混合物Ａ／Ｂに関して独立に測定しな
ければならない。次表は実施例の一覧表である。

【表】 例 １ 温度計、水分離器、還流冷却器、窒素導入管を
備えた6l−撹拌フラスコ中にｎ−ヘサン1740g、
パークロルエチレン1100g、ポリマー乳化剤（ｎ
−ブチルメタクリレート95部、２−トリメチル−
アンモニウムエチルメタクリレート−クロリド５
部から成る共重合体）9gおよびドライアイス5g
を装入する。撹拌および窒素導通下にメタノール
640g、水160g、メチレン−ビス−メタクリルア
ミド240g、アリルグリシジルエーテル30g、グリ
シジルメタクリート30g、４，4′−アゾビス−（４
−シアノバレリアン酸）6gから成る混合物を50
℃で添加し、有機相中で分配し、引続き沸騰する
まで65〜70℃で加熱する。約６時間の期間中メタ
ノール／水混合物は殆ど完全に循環させる。この
バツチを更に４時間後まで反応させ、かつ引続き
室温に冷却させる。生じたパールを吸引濾過し、
かつ真空で40℃で12時間乾かす。 以下に記載するようにPC−アシラーゼを負荷
した後の活性は122U／ｇである。 PC−アゼラ−ゼとの結合 パール500mgを、PH7.5の0.1m−酢酸ナトリウム
含有リン酸カリウム緩衝液中に酵素1.05mlを含有
するPC−アシラーゼ溶液1.6mlとともに23℃で72
時間恒温維持する。次いでパールを吸収濾過し、
1m−食塩溶液で３度、かつホスフエート緩衝液
（PH7.5）で２度洗う。得られる酵素パールを
0.05m−硫酸ナトリウム緩衝液（PH7.5）中の２％
−カリウム−ペニシリンＧ−溶液20mlとともに37
℃で恒温維持し、かつ遊離したフエニル酢酸を
0.5mNaoHで滴定する。酵素活性を湿潤パール
1gに対するもので、その際1U／ｇは１分および
湿潤パール1g当りNaOH1μモルの消費に相応す
る。 例 ２ 比較試験 装置と反応実施は例１と同様、ただし溶剤は循
環させない。 装 入：ｎ−ヘプトン1740g、パークロルエチレ
ン1100g、乳化剤5.6gおよびドライアイス5g。 モノマー混合物：ホルムアミド1200g、メチレン
−ビス−メタクリルアミド240g、アリルグ
リシジルエーテル30g、グリシジルメタクリ
レート30g、過酸化ベンゾイル6g。 反応終了時に沈殿したパールの上の相をデカン
テーシヨンし、パールをアセトン各2000mlで３度
洗い、かつ吸引濾過する。アセトンで更に３度後
洗浄し、かつパールを真空中で12時間乾かす。
PC−アシラーゼ結合後活性73U／ｇが認められ
た。 例 ３ 装置、装入物および反応実施は例１と同様 モノマー相：メタノール480g、水320g、メタク
リルアミド90g、メチレン−ビス−メタクリ
ルアミド90g、アリルグリシジルエーテル
60g、グリシジルメタクリレート60g、４，
4′−アゾビス−（４−シアノバレリアン酸） PC−アシラーゼの結合のための試験後酵素活
性は認められなかつた。 例 ４ 例３をメタノール160gと脱塩H₂O640gを用い
て繰返す。部分的に凝集したパールが得られる。 PC−シラーゼ結合後酵素活性65U／ｇが認め
られた。 例 ５ 例３をメタノール80gおよび水720gを用いて繰
返す。 PC−アシラーゼ結合後酵素活性7U／ｇが認め
られた。 例 ６ 装置、装入物および反応実施は例１と同様。 モノマー相：メタノール240g、水560g、メチレ
ン−ビス−メタクリルアミド150g、メタク
リルアミド30g、アリルグリシジルエーテル
60g、グリシジルメタクリレート60g、４，
4′−アゾビス−（４−シアノバレリアン酸）
6g。 PC−アシラーゼの結合後酵素活性30U／ｇが
認められた。 例 ７ 装置、装入物および応実施は例２と同様。 モノマー相：ホルムアミド553g、メタノール
237g、メチレン−ビス−メタクリルアミド
150g、アリルグリシジルエーテル60g、グリ
シジルメタクリレート60g、メタクリルアミ
ド30g、過酸化ベンゾイル6g、ジメチルアニ
リン（モノマー相を有機相に分配した後に添
加）6g。 PC−アシラーゼ結合後酵素活性125U／ｇが認
められた。 例 ８ 例７をホルムアミド79gおよびメタノール711g
を用いて繰返す。 PC−アシラーゼの結合後71U／ｇの酵素活性
が認められた。 例 ９ 例７をホルムアミド711およびメタノール79g
を用いて繰返す。 PC−アシラーゼ結合後酵素活性125U／ｇが認
められた。 例 10 （比較試験） 例７をホルムアミド791gを用いて繰返す。PC
−アシラーゼの結合後酵素活性95U／ｇが認めら
れた。 例 11 装置、装入物および反応実施は例１と同様。 モノマー相：ポリメタクリルアミド30g、メタノ
ール160g、水640g、メタクリルアミド81g、
Ｎ，N′−メチレン−ビス−メタクリルアミ
ド81g、アリルグリシジルエーテル54g、グ
リシジルメタクリレート54g、４，4′−アゾ
ビス−（４−シアノバレリアン酸）6g。 例４とは異なり一様に丸いパールが得られる。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ モノマーとして (1) アクリルアミド、メタクリルアミド、メチレ
   ン−ビス−アクリルアミドおよび−メタクリル
   アミドの群からの化合物少なくとも１種
   30〜95重量％ （重合可能なモノマーの全重量に対して） (2) 場合によりその他の親水性のラジカル重合性
   コモノマー (3) オキシラン基を有する不飽和、ラジカル重合
   性モノマー ５〜60重量％ (4) 場合により親水性のより低い、他のラジカル
   重合性コモノマー 25重量％まで およびその中で重合性二重結合を少なくとも２
   個有するモノマー少なくとも５重量％並びに希釈
   剤を含有し、かつ非水性有機媒体中で分配されて
   滴とされ、かつこの形でラジカル重合されるモノ
   マー相を反転パール重合することによりパール状
   の、架橋し、親水性の、たん白質に対して結合活
   性の担体ポリマーを製造するための方法におい
   て、該モノマー相の希釈剤として Ａ）水、ホルムアミド、グリコールおよびジメ
   チルスルホキシドの群からの溶剤少なくとも１種
   およびＢ）成分Ａとは別種の、モノマーと成分Ａ
   の混合物と均一相を形成し、200を下回る分子量
   を有し、かつ酸素少なくとも20重量％を含有する
   有機液体少なくとも１種から成る混合物を使用す
   ることを特徴とする、パール状の、架橋し、親水
   性の、たん白質に対して結合活性の担体ポリマー
   の製法。 ２ 希釈剤の成分Ｂとして酸素をカルボニル基お
   よび／またはヒドロキシル基の形で含む液体を使
   用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 ３ 希釈剤の成分Ｂとして総溶解パラメータ９〜
   15ヒルデブラント単位または分散性溶解パラメー
   タ７〜９ヒルデブラント単位を有する有機液体を
   使用する、特許請求の範囲第１項または第２項記
   載の方法。 ４ 希釈剤の成分Ｂとして室温で水と完全に混合
   可能な液体を使用する、特許請求の範囲第１項〜
   第３項のいずれか１項に記載の方法。 ５ 希釈剤として水とメタノールからの混合物を
   使用する、特許請求の範囲第１項〜第４項のいず
   れか１項に記載の方法。 ６ 重合の開始前にモノマー相にポリマーを溶か
   す、特許請求の範囲第１項〜第５項のいずれか１
   項に記載の方法。