JPH0236200A - フイブリン／フイブリノゲン誘導体およびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は酸化剤で処理されたフィブリンの、またはフィ
ブリンもしくはフィブリノダン分解産物または部分配列
の誘導体の製法、かかる製法によシ調製された生成物お
よびそれらの医薬としての使用または診断への使用に関
する。

ヒトの血液は生成した凝血塊を再溶解させうる酵素系す
なわち繊維素溶解系を有する。

繊維素溶解における中心的酵素であるプラスミンはその
前駆体ブラスミノーケ゛ンかう、内皮細胞および他の細
胞群から遊離されるアクテベーターにより形成される。

これらアクチベーターは２種類に分けられる。すなわち
一方は組織型ブラスミノーゲンアクチベータ−（ｔ−Ｆ
Ａバそしてもう一方はウロキナーセ型プラスミノーゲン
アクチベーター（ｕ−ＦＡ　）である。

ｔ　−ＦＡはフィブリン、ヘパリン、およびフイブリノ
ゲンのプラスミンによるかまたはＢｒＣＮによる分解産
物に対し高いアフイニテイを有し、そしてそれらの存在
下にプラスミノーゲン分解活性が刺激される。

かかるｔ　−ＦＡ刺激剤は治療および診断にとって重要
である。これらは投与すべきｔ　−ＦＡの量をかなシ減
少させることができ、そして血漿中のｔ　−ＦＡの感度
の良い検出が可能となる。さらに、それらによシ例えば
細胞上清のような生物学的液体からｔ　−ＰＡを簡単な
アフイニテイクロマトグラフイーにより精製することが
できる。

しかＬながらフイブリノゲンのＢｒＣＮ分解産物のよう
な刺激剤は毒性が高いので治療に使用することができな
い。ヘパリンはインビボでｔ−ＰＡの刺激剤としては処
方が低い。

多形核白血球およびマクロファージはブロテイナーゼ特
にクロキナーゼ、コラ−ゲナーゼおよびエラスターゼ、
ならびに酸化生成物ここでは特にＮ−クロラミンを分泌
することによ）生理学的鷹維素溶解に関与している。

今、漢りべぎことにクロラミンＴのようなＮクロラミン
によシフイブリン、およびフィブリンもしくはフィブリ
ノダン分解産物（以下ＦＤＰと称する）を酸化するとこ
れら産物のｔ−ＦＡ刺激性質が劇的に（約５〜１０倍）
改善されることが見出された（刺激剤なしのｔ　−ＦＡ
に比較して、未酸化）ＦＤＰの刺激＝約５倍、酸化され
たＦＤＰの刺激ツ約２５倍）。フイブリノゲンのＤ領域
がこの効果の原因をなすドメインであることが判明した
。。

それゆえ本発明は基本的なアミノ酸配列中のメチオニン
基の全部または一部がメチオニンスルホキシド基に変換
されていることからなる、フィブリンの、またはフィブ
リンもしくはフィブリノダン分解産物または部分配列の
誘導体に関する。

本発明はまたフィブリン、またはフィブリンもしくはフ
ィブリノダン分解産物または部分配列を酸化剤で処理す
ることからなる、フィブリンの、またはフィブリンもし
くはフィブリノダン分解産物または部分配列の誘導体の
製法にも関する。

本発明はまたフイブリノゲンまたはフィブリンを酸化剤
で処理しそして生成物を分解させることからなる方法に
も関する。酵素による分解は詳細には例えばプラスミン
、トロンビンまたはバトロキソビンを酸化されたフイブ
リノゲンに作用させるのが好ましい。

出発物質としてへ溶性フィブリン（いわゆるフィブリン
モノマーノは例えば１〜／−の第ｘｕｉ−因子不含フイ
ブリノゲン例えばＦ’ＸＩＩ＋試薬（Ｂｅｈ−ｒｉｎｇ
ｗｅｒｋｅ社）を２５ミリモル／ｌトリス、５ミリモル
／　ｔ　ｃ’ａｃｔ２および２ミリモル／１Ｇ１３’Ｐ
ｒｏ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ、　ｐＨ７，８、中でＣＬ５工Ｕ
の試験トロンビンと６７℃で１０分間インキュベートし
そして５　ＩＵ、４のヒルジンを添加することによシ調
製される。

フイブリノゲン分解産物は５ｔｉｅｆ他によシ記載され
た方法（Ｔｈｒｏｍｂ、　Ｒｅｓ、　４８　、６０３−
６０９゜１９８７）により生成されうる１、この目的に
はフイブリノゲン溶液（１〜１０η／−）を２５ミリモ
ル／ｌトリスおよび５ミリモル／　Ａ　Ｆ！ＤＴＡ、−
１８、中でプラスミンの作用により分解させる、好まし
くはフイブリノゲン溶液を流速毎時的６０−でプラスミ
ンセファロース（タンパク質２．５η／ｄゲル）に通す
ことによシ分解させる、。

出発物質（−フイブリノゲン溶液または形成されたフィ
ブリンモノマ・もしくは分解産物ンの酸化は場合によ、
６ａｏｉ〜ａ２好ましくは（１１慢（１１／ｖ）の界面
活性剤例えば、トリトン（Ｔｒｉ　−ｔｏｎ）■×１０
０を添加しそして場合によシ溶解度を改善させるために
好ましくは５〜２０ミリモル／ｌのマンニトールを添加
して好ましくは緩衝液、特にトリス緩衝液中用７〜９．
５で実施される。

酸化剤としてはクロラミンＴのようなりロラミンが詳細
には１〜２０ミリモル／ｌ、好ましくは５〜１０ミリモ
ル／ｌの濃度で使用されるのが好ましい。酸化はアスコ
ルビン酸、アセチルシスティンまたはアセチルメチオニ
ンのような還元剤の過剰を添加することによ）停止させ
うる。

酸化は４〜４５℃、好ましくは２０〜４０℃で実施でき
、そして数秒内で進行する（５分以内几最終生成物はア
ミノ酸分析により特徴を調べる。タン・βり質の酸化後
ではメチオニンは痕跡量でしか検出できず一方メチオニ
ンスルホキシドはタンパク質に存在するメチオニン含量
に相当する量で検出される。プラスミンによシ分解され
そして酸化された誘導体はさらに未酸化の誘導体よシ蒸
留水ｃＰＫおける溶解度が高い。

フイプリノゲンのＤ−領域からの配列を有する合成メチ
オニン含有ペプチドも本発明による方法の出発物質とし
て適する。酸化されたＦＤＰはセファロース４ＢＩＣ共
有結合されたＦＤＰでの実験で示され５るように、未酸
化のＦＤＰよ、Ｉｔ−ＦＡおよび５ｃ−ｕＰＡ（−本鎖
クロキナーゼ）に対する結合アフイニテイが高い。それ
ゆえ酸化されたフィブリンまたはフイブリノゲン誘導体
はｔ−ＦＡまたは５ｃ−ｕＰＡを例えば細胞上清からア
フイニテイクロマトグラフイーにより精製するのに特に
適する。

酸化剤として特に適当なものをあげれば、好ましくはア
ルカリ性媒体中でメチオニンをメチオニンスルホキシド
に変換するメチオニン特異的な酸化剤好ましくはクロラ
ミン類（例えはクロラミンＴまたはクロラミンＢ）、ま
たは次亜塩素酸の塩（例えばＮａ０Ｃ１）である。メチ
オニンをメチオニンスルホキシドに変換するのに適する
のは、ＳａｖｉｇｅおよびＰｏｎｔａｎａ　（Ｍｅｔｈ
ｏｄｓ　ｉｎＫｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　４７：４５３〜４
５９　、１９７７　）の記載によれば色素（例えばメチ
レンブルー）によ）仲介された光酸化、ならびにブロモ
スクシンイミド、Ｎ−クロロスクシンイミド、　　２，
４．５−　トリフロモー４−メチルシクロヘキサジエノ
ン、ＢＮＰＳ−スカトール（２−（２−ニトロフェニル
スルホニル）−３−メチル−５−ブロモインドールアミ
ン）、クロラミンＴ１次亜塩５７．ｆＩＩｔ−”；ｆチ
ル、トリクロロメタンスルホニルクロライド、さらに１
−クロロベンゾトリアゾール、水性ピリジン中のヨード
ベン七ンジクロライド、ピリジンブロマイド複合体キノ
リンおよび特に水性酢酸中の１．４−ジアゾビシクロ（
２，２，２）オクタンである。。

好ましくは關８〜９における酸化は１ｌＬＯ５〜α１チ
の界面活性剤例えばトリトン×１００の添加によシ改善
される 酸化されたＦＤＰはまた凝固された血漿での試験で示さ
れうるように未酸化ＦＤＰよシもフィブリンに対する結
合アフイニテイがかなシ高い。

それゆえそれらは血栓の診断および治療に価値ある物質
をインビボで凝血塊の方向に向けるのに特に適する。

従来法によれば血栓は放射性標識されたフイブリノゲン
を用いてインビボで検出される（Ｍａｈｎ。

工、ｌおよびＭｕｌｌｅｒ−Ｂｅｒｑｈａｕｓ　、に）
、　、　Ｈａｅｍｏｓｔａｔｉａ　。

４：４０：５０，１９７５）。酸化されたＦＤＰは血栓
に対しフイブリノゲンよυかなシ高いアフイニテイを有
するので、放射性標識された酸化ＦＤＰ好ましくはＦＤ
Ｐ　−Ｄの使用がよシ好ましい、何故なら （１）診断剤の投与後比較的短時間内（１時間以内）で
臨床的な所見が得られうろこと、および（２）　　アフ
イニテイが高いゆえに標識されたタンパク質の必要量が
よシ少なくて済むので、人体に負荷される放射線量がよ
シ低くて済む、からである。

他方、従来法によれば、フィブリ／抗体に共有結合した
プラスミノーゲンアクチベーター（以下ＦＡと称する）
またはＦＡとフィブリン抗体とからの遺伝子工学的に作
られたキメラを用いることによシＰＡがフィブリン凝血
塊に輸送される。

この方法の欠点は外来タンパク質に対する抗体が誘発さ
れることである。ヒトの酸化されたＦ’Ｉ）Ｐを用いる
ことによシ関連する副作用（例えば免疫複合体疾患）が
回避されうる。

ＨＯＣｔおよびクロラミンを産生ずる酵素例えばミエロ
はルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼおよびキサ
ンチンオキシダーゼも、それらが酸化されたＦＤＰと共
有結合した状態で存在するならば、酸化されたＦＤＰに
よυ血栓に輸送されうる。この酵素反応は適当な無毒性
基質（例えばグルコース、キサンチン、ヒボキサンチン
）を注入することにより開始されうる。フィブリンポリ
マーをインビボで酸化すると血栓を溶解させるための内
因性ｔ−ＦＡおよび必要ならば外来ｔ　−ＦＡへの必要
性が低下し、従って溶解が達成されるのに少量のｔ　−
ＰＡ　Ｌか投与する必要がない。血栓中に結合された繊
維素溶解阻害剤α−２−アンチプラスミンが前記と関連
して酸化的に不活化されることによシプロ繊維素溶解作
用が強化される。

その上酸化されたＦＤＰを静脈投与することによりｔ　
−ＦＡおよび５ｃ−ｕＰＡの一般的刺激が強ま）。

従ってこれらＰＡの投与量を減少できるしまたは全くそ
れらを使用せずに済ますこともできる。

さらに、酸化されたフィブリン／フィブリノダン誘導体
はｔ　−ＦＡのような刺激可能をプラスミノーゲンアク
チベーターを血漿または他の生物学的液体中でインビト
ロ試験系によυ高感度かつ特異的に検出するのにも適す
る。この目的にはｔ−ＦＡの色原体による検出法におい
て反応混合物１−当シ例えば５０〜２００Ｍの酸化され
たフイブリノゲン分解産物を３０７人−０のプラスミノ
ーゲンおよびα６μＭの色原体性プラスミン基質と一緒
に用いる。

実施例　１ 酸化されたフイブリノケ゛ン分解産物の調製ａ）プラス
ミンによる分解産物 ５ミリモル／ｌのＥＤＴＡを含有する５０−の蒸留水中
に溶解した２５０Ｍ１の試験フイブリノゲン（Ｂｅｈｒ
ｉｎｇｗｅｒｋｅ　）をプラスミン−セファロース４Ｂ
（プラスミン２．５■／ＷＬｔゲン）２５１１Ｉ７！に
流速毎時６０−で室温で通した。流出１（ｘｆｆ）を≠
ａ５に調製し、１００ミリモル／ｌのクロラミンＴ１２
．５＋ｎｔを加えそしてこの混合物を３７℃で１５分間
インキュベートした。次に酸化混合物を２００倍ｉ＆）
５０ミリモル／ｌトリス（ｐＪ（ａｓ）で透析した（４
８時間、４℃）、Ｊ あるいはまた酸化された分解性Ｆ４１１Ｊはプラスミン
−セファロースに通す前に酸化を行いそして次にプラス
ミンによるタンパク分解を行うことによシ得ることもで
きた。

ｂ）　　）ロンビンによる分解産物 酸化されたフイブリノゲンの本発明によるトロンビン分
解産物は、１η／−のフイブリノケ゛ンをはじめに２．
５ミリモル／ｌの濃度のクロラミンＴで酸化しそして次
にａ５ＩＵの試験トロンビン（Ｂｓｈｒｉｎｇｖｒｅｒ
ｋｅ　）と３７℃およびｐＩ（７，８で１０分間インキ
ュベートしそして５工Ｕ／ｌｎｔのヒルジンを添加する
ことによ）得られる。

実施例　２ 酸化剤濃度の函数としてのＦＤＰによるｔ　−ＰＡのプ
ラスミノーゲン分解活性の刺激−酸化されたＦＤＰによ
るｔ−ＦＡの検出 ａ）５０　　　ミ　　！ｊ　　　モ　ル　／ｚ　　　ト
　’）　　ス　　１　０　０　　ミ　　リ　　モ　ル／
ｌ　ＮｈＣｌ、　［ＬＯ１＊トリドアＸ１００（Ｉｌｌ
Ｈａ５）およびＦＤＰを含有しないトリス緩衝液１００
μを中のＦＤＰ−ＢｒＣＮ　（ＢｒＣＮ分解によりｘｉ
されたＦＤＰ　）１００μｇおよびｐｐｐ−ｇＤＴＡ（
ＫＤＴＡの存在下にプラスミン分解により調型されたＦ
ＤＰ）１００μＩを蒸留水中の種々の濃度（０〜２０ミ
リモル／ｌのクロラミンＴ５０μｔと３７℃で１０分間
インキュベートした。蒸留水中の３ミリモル／ｌのＨＤ
−Ｎｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　１００　ｐＬ、　
　１００ミリモル／ｌトリス、１００ミリモル／　Ｌ　
ＮａＣｔ、　　１％へマクセル（Ｈａｅｍａｃｃｅｔ■
）および（ｌｉ＊トリトン×１００（…＆　４　）　（
ＴＮＨＴ緩衝液）中の１．３μモル／ｌのＧｌｕ−プラ
スミノーゲン２００μｔ、およびＴＮＨＴ緩衝液２００
μを中の１０１Ｈの二本鎖ｔ　−ＦＡを添加したのち３
７℃でさらに１２分間インキュベートした。基質の変換
は５．４モル／を酢酸５００μｔの添加によシ停止させ
そして生じた吸光度変化を４０５ｎｍで検出した。

ｂ）　　変法の一つにおいては、１０ミリモル／ｌのク
ロラミンＴ５０μｔを添加して１０分間（５７℃）イン
キュベートしたのち５ミリモル／ｌのジチオトレイトー
ルｓ　ｏ　ｉｔｔを添加することによ、９　ＦＤＰの酸
化を終了させそして次にプラスミノーゲン活性化を行っ
た。

実施例２ａおよびｂの結果 筑１表 ０ミリモル／１ １ミリモル／１ ２．５ミリモル／１ ５ミリモル／ｌ Ｚ５ミリモル／１ １０ミリモル／１ １５ミリモル／１ ２０ミリモル／１ 漸増濃度のクロラミンＴによＪｔ−ｐＡ刺激能力が高ま
る。ＦＤＰ７ＦＤＴＡおよびＦＤＰ−ＢｒＣＮはｔ−Ｐ
Ａに対するそれらの刺激が低クロラミンＴ濃度で改良さ
れることを示す。クロラミンＴ濃度が高くなるとｔ−Ｐ
Ａ刺激が損われる。

実施例　５ 種々のＦＤＰによるｔ　−ＰＡのプラスミノーゲン分解
活性の刺激−ＦＤＰによるｔ−Ｐム検出ＦＤＰ−ＢｒＣ
Ｎ　、　ＦＤＰ−ＥＤＴＡ　、フイブリノゲンおよび酸
化されたフイブリノゲン（実施例１参照）をプラスミン
−セファロースに通すことＫよシ得られるＦＤＰ−１１
！ＤＴＡの各１００１ｔｌｌを実施例２ａに記載される
試験条件に従い２０ミリモル／ｌのクロラミンＴ５０μ
ｔおよび対照としての蒸留水を添加して二本鎖ｔ−ＦＡ
に対するそれらの刺激能力に関して検ぺた。酸化は１０
分（３７℃）後に＆２５ミリモル／ｌのジチオトレイト
ール１００μｔの添加によシ停止させ、基質の変換は９
分（３７℃）後に五４モル／を酢酸５００μｔの添加に
よシ停止させた。

結果を第２表に示す。

ＦＤＰ−ＫＤＴＡの場合試験では酸化によ＃）ｔ−ｐＡ
刺激能力が著明に上昇する。、ＦＤＰ−ＢｒＣＮおよび
予め酸化されたフイブリノゲンからのＦＤＰ−ＥＤＴＡ
　ハＥ験で酸化する前にすでに緩衝液対照に比較して１
０倍以上の刺激能力を有する。フイブリノゲンの酸化も
その刺激能力を増大させる。。

第２表 ＦＤＰ−ＢｒＣＮ　　　　　　　　　　４４３　　　　
　　　　　　６１４ＦＤＰ−ＥＤＴＡ　　　　　　　　
　　２７６　　　　　　　　１１７２フイブリノケ゛ン
　　　１１７　　　　　　１５６緩衝液対照　　　　　
５０２７ 実施例　４ 酸化され固１・定、、（Ｌ’＝、されたフィブリンまた
はフイブリノゲ゛ン分解産物および誘導体によるｔ−Ｆ
Ａおよび５ｃ−ｕＰＡのアフイニテイクロマトグラフイ
ー精製 ＴＮＨＴ緩衝液中の一本鎖（ｓｃ）−ｔ−ｐＡ、　ｅｃ
−ｕＰＡ。

および二本鎖（ｔｃ）−ｕｐＡ（１ｐ９／ｄ”）の１−
ずつを５０％ＦＤＰ−ＩＣＤＴＡ溶液または酸化された
ＦＤＰ−□Ａ−セファロース４Ｂ（タンパク質２ｗ９／
−ゲル）のそれぞれ０〜６００μｔと共に軽く振盪しな
がら室温で４５分間インキュベートした。遠心し、上清
をと９出してそのプラスミノーゲン分解活性について検
査した１、残留活性を当初活性の嘩で表わした。沈降物
中に残留するセファロース４Ｂに１００倍量のＴＮＥＴ
緩衝液を加え、全体を充分に混合しそして再び遠心した
。上清をデカンテーションしそして溶離剤１−を加えた
。これには２　Ｍ　ＫＳＣＮおよび１慢ドデシル硫酸ナ
トリウムが用いられた。振盪下に１０分間（室温）イン
キュベーションしたのち遠心しそして２００倍量のＴＮ
ＨＴ緩衝液で透析した（４８時間、４℃）。

次に検体をブラスミノーケ゛ン分解活性に関して検べた
。

ブラスミノーケ゛ン分解活性は検体（上清）５０ｐｔを
６００　ｐｔの容量で１００　ｐＬのＦＪ）Ｐ−ＢｒＣ
Ｎ　、２７８ｐＭのＧｌｕ−ブラスミノーデンおよび０
．３μモルのＨＤ−Ｎｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ−ｐＮＡと
３７℃で５分間インキュベーションすることにより測定
した。基質の変換は五４モル／Ｌ酢酸５００μｔの添加
によシ停止させそして生ずる吸光度を４０５ｎｍで測定
した。

結果： 酸化され固定化されたＦＤＰ−ＦｔＤＴＡはｔ−ＰＡに
対し未酸化のＦＤＰよシかなシ高いアフイニテイを示し
た。ｕ−ＦＡと対照的に５ｅ−ＦＡは酸化されたＩＰＤ
Ｐに７フイニテイ結合した。結合されたＦＡ分子は２モ
ル／ｌ　ＫＢＣＮまたは１９ｋ　ＳＤＢにより溶離され
た。

第３表 Ｉ　ＤＯ５５（８７） １ｏｏ（１ｏｏ）　　１ｏｏ（１ｏｏ）１ｏｏ（１ｏｏ
）　　１ｏｏ（９ｓ） 実施例　５ ＤＥＡＥ−セファセル（Ｓｅｐｈａｃｅｌ）および続く
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥｉ）による
酸化および未酸化フイブリノゲン分解産物の分離、およ
びそれぞれの７ラグメントによる刺激についてのアッセ
イ 実施例１に記載されるプラスミン−セファロースの流出
液をｐｉｔａ６０１０ミリモル／Ｔ’Ｓ酸ナトリウム緩
酸液トリウム緩衝液再透析した。

透析物を次にカラム容量の３倍の１０ミリモル／を燐酸
ナトリウムで予め平衡としたＤＥ！ＡＫ−セファセル１
００ｄに加えた。室温および流速毎時６０−でイオン強
度な斯増させ−を低下させるグラジェント溶離を行った
（−ａ６の１０ミリモル／を燐酸ナトリウムおよびｐＨ
４，３の６００ミリモル／を燐酸水素カリウム、それぞ
れ１００ｄ）、５−ずつのフラクションを集めた。。

流出液（グラジェントをつける前）および個個のピーク
を２８０　ｎｍでの光学濃度ならびにドデシル硫酸ナト
リウム−ＰＡＧＥについて検べた（結果は第４表および
第５表参照）。プラスミン分解によるフイプリノゲン分
解産物は下記の犬よその分子量を有する（ＫＤａ）　：
フィブリノダン５４０、ｘ　３００．ｙ　１５０．Ｄ　
９０　、’８７　、ａｓ、Ｅ６ｏ。

第４表 未酸化出発物質 流出液　１４〜２９　　α７９０ ピーク１　４７〜５０　　４．４　　　９０．８５ピー
ク２　５１〜５４　　５．６　　　９０（３００，６０
，１５０）ピーク３　５５〜５８　　　（１４６９０，
６０（３００，１５０）ピーク５　　８３〜８９　　　
ｎ、３　　　６０，３００（１５０）ピーク６　９０〜
９８　　α３２　　６０（３００）ピーク７１０９〜１
１３　０．１　　　　（９０，３００）ピーク１はフイ
ブリノゲンフラグメントＤに相当する。

第５表 酸化された出発物質 流出液１２〜３０　　［１３４（９０，６０，１５０，
，５００）ピーク１　５３−５５　　　（１４９ＣＪピ
ーク２　５６〜６０　　　ＣＬ９８　８５ピーク５６１
〜６７　　２．２　　９０ピーク４８５〜９８　　　α
７２　６０，３００，１５０ピーク５１０９〜１２０　
　α０８　３００（９０）ピーク１〜３はフイブリノゲ
ンフラグメントＤに相当する 未酸化ＦＤＰ（ＥＤＴＡ）のＤＫＡＫ分離で得られるそ
れぞれのフラクション１００μｔを実施例２に従い未酸
化および酸化状態でそれらのｔ　−ＦＡ刺激活性につい
て検べた。その結果を第６表に示す、。

第６表 中の主バンド）　　　　　１８４　　　　　　７０３ピ
ーク１（ＩＦＤＰ−Ｄ）　　　　　３２０　　　　　　
　１８９０ビーク２（ＦＤＰ−Ｄ）　　　　　　４５１
　　　　　　　１７２８ピーク３（ＦＤＰ−Ｄ、Ｅ）　
　　　　　５８３　　　　　　　　　１　１４５ピーク
５（Ｉ、り　　　　　　２６６　　　　　　　　２２３
ピーク６　（Ｋ）　　　　　　　　１９７　　　　　　
　　２９１プラスミン活性の測定から、刺激の原因およ
び酸化によシ強化された刺激の原因であるフィブリノケ
゛ン分子のドメインはＤ−領域であることが認められる
。

実施例　６ 酸化および未酸化ＦＤＰ−Ｄのアミノ酸分析フイブリノ
ゲン分解産物Ｄ（ピーク１、実施例５により精製）Ｉｗ
ＩＩ／−を実施例１に従い、５ミリモル／ｌのクロラミ
ンＴを添加または添加しない５０ミリモル／ｌトリス緩
衝液（ｐＪｉａ５　）中３７℃で３０分間インキュベー
ションした。

それに続いて１００倍量の蒸留水で４℃で４８時間透析
しそしてＩ、ＫＢ４１５０アミノ酸アナライザー中で標
準加水分解条件を変えて（２４時間、真空中１１０℃、
５Ｎｐ−トルエンスルホン酸）１分析当シ１．２ｎＭの
タンパク質を用いた。結果は３回の測定の平均値である
。用いられた条件下でアミノ酸トリプトファンは測定で
きなかった（第７表参照）、。

ｓｐ ｈｒ ｅｒ １ｕ Ｐｒ。

ＩＩＬ ｙｓ ａ１ ｅｔ 工１ｅ ａｕ ｙｒ ｈｅ ｉｓ ｙｓ ｒｇ 第７表 ２種のタンパク質は酸化されたＤにおいてはメチオニン
が欠けている点で決定的に相違する。

メチオニンスルホキシドはアナライザー中で他の場所に
移動してメチオニンとしては示されない。

実施例　７ 未酸化ＩＦＤＰに比較した酸化ＦＤＰのフィブリン血栓
に対するアフイニテイ増犬：血栓の検出血漿α５ｄを［
１２モル／ｌのＣａＣ４２５０ｐＬおよびα５工Ｕのト
ロンビンの添加により凝固させた。得られた凝血塊を次
に２０倍量の燐酸塩緩衝食塩水（ＩＰＢｓ）中で３回遠
心することによシ洗いそして、酸化ＦＤＰ　（ＩＰＤＰ
　−５ミリモル／１ＫＤＴＡの存在下におゆるフイブリ
ノゲンのプラスミンによる分解）（１岬／ｙ）（１５ｍ
、未酸化ＦＤＩ’（１１１１／−）Ｃｌ５−またはフイ
ブリノゲン（１■／ｍｔ）　Ｃｌ３−のＰＢ８溶液中で
それぞれ室温で１時間インキュベーションした（対照−
凝血塊なしのＦＤＰ溶液）ｏ次にＥＢＢ中の組織ブラス
ミノーゲンアクチベーター溶液（５００Ｉｆｆ　ｔｃ−
ｔ−ＦｖｔＲｔ）　５０μｔを上清１００μｔ１プラス
ミノーゲン２００μｔ（１００ミリモル／χ　トリス、
１００ミリモル／１ＮａＣｔ、　　１　％　（ｗ／ｖ）
　　Ｈａｅｍａｃｃｅｌ■、　α１　つｇ（ｗ／ｖ）　
　ト　１ノ）ンｉ　１００．ｐＨａＡ中ノ１ｃＴｈ−ｒ
ｙ　）および蒸留水中の３ミリモル／ｌのＤ−ノルレノ
（リル−シクロヘキシルーアラニルーリジル−７ソラニ
トロアニリド（ＨＤ−Ｈｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ
）　１００μｔと３７℃で８分間インキュベーションし
、ａ５モル／’を酢＃ｌ５ＯＯμｔを用いて停止させそ
して４Ｑ５ｎｍでの吸光度を測定することによシ上清中
に残留するＦＤＰの刺激能力を検査した。

結果を第８表に示す。

第８表 凝血塊なし １酸化Ｆ’ＤＰ　　　　Ｉ、２３５±１４　　　　１５
．４２未酸化ＩＦＤＰ　　　　５８７±６　　　１５３
　フイブリノゲン　　　　　２１６±　１２・７凝血塊
あ） １酸化ＦＤＰ　　　　７５５±４　　　６１壬２未酸化
ＰＤＰ　　　　４６５±１　　　８０鴫３フイプリノゲ
ン　　　１７壮２　　　　８０％対照（刺激物） ＄　　　　　　　　　８Ｏ−１＝３ 串　刺激物ありのｔ−ＦＡ活活性態刺激物しのｔ−ＰＡ
活性の比 −凝血塊なしの慢 酸化されたＦＤＰの場合、上清のｔ−Ｐム刺激能力が最
も大きく低下することが認められ、このことは酸化ＦＤ
Ｐが未酸化ＦＤＰまたはフイプリノゲンよりもフィブリ
ンに対するアフイニテイが高いことを意味している。。

実施例　８ フィブリンモノマーの酸化はｔ　−ＰＡに対するその刺
激性質を増大させる 緩衝液中のフィブリンモノマー１００１１ｔ（１岬／ｄ
）を種々の濃度のクロラミンＴと３７℃で１０分間イン
キュベーションした。次に　ミリモル／ＬのＮ−ア’ｅ
ｆル）ｆオニ／（ｐＨａ４）１００μｔの添加によシ酸
化を停止させそして緩衝液中のｔｃ−ｔ−ＰＡ　２０Ｄ
μｔ（−１ＤＩ［）、緩衝液中のプラスミノーゲン（Ｉ
　ＣＡＴ−Ｕ）２００μｔおよび蒸留水中の５ミリモル
／　Ｌ　ＨＤ−Ｎｖａ−ＣＨＡ−Ｌｙｓ−ｐＮＡ　１０
０μｔを加えて６７℃で２４分間インキュベートした。

ａ５モル／を酢酸５００μｔの添加によシ基質の変換を
停止させそして生じた吸光度を４０５ｎｔｏで測定した
。

結果： 第９表 ０　　　　　　　１２７４±５　　２４４±３１　　　
　　５５１±５ ５　　　　　　　７９５±１１ １０　　　　　　　２０９５±４５ ２０　　　　　　　２２８７±４ ４０　　　　　　２２７６±４　　２４８±８漸増濃度
のクロラミンは初めｔ−ＦＡ刺激が低下したのち後程増
大することが認められる５メチオニンの添加は緩衝液対
照で示されるようにこの測定法を損わなかった

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １）基本的なアミノ酸配列中のメチオニン基の全部また
   は一部がメチオニンスルホキシド基に変換されている、
   フィブリンの、またはフィブリンもしくはフイブリノゲ
   ン分解産物または部分配列の誘導体。 ２）分解産物または部分配列がＤドメインまたはその部
   分配列を含有する請求項１記載の誘導体。 ３）医薬としての請求項１記載の誘導体。 ４）メチオニン基の全部または一部がメチオニンスルホ
   キシド基に変換されている医薬としてのフイブリノゲン
   。 ５）フィブリン、フィブリンもしくはフイブリノゲン分
   解産物またはフィブリンもしくはフイブリノゲン部分配
   列を、これら物質のアミノ酸配列中に含まれるメチオニ
   ン基の全部または一部がメチオニンスルホキシド基に変
   換されるような条件下に酸化剤で処理することからなる
   請求項１記載の誘導体の製法。 ６）酸化剤がハロゲノアミン好ましくはクロラミンであ
   る請求項５記載の誘導体の製法。 ７）キレート形成剤の存在下に調製された分解産物が使
   用される請求項５記載の製法。 ８）反応混合物に界面活性剤が添加される請求項５記載
   の製法。 ９）酸化がｐＨ７〜９．５で実施される請求項５記載の
   製法。 １０）請求項１記載の誘導体の診断への使用。 １１）請求項１記載の誘導体のアフイニテイ試薬として
   の使用。 １２）メチオニン基の全部または一部がメチオニンスル
   ホキシド基に変換されているフイブリノゲンのアフイニ
   テイ試薬としての使用。