JPH02296142A - センサー - Google Patents

センサー

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JPH02296142A
JPH02296142A JP2103270A JP10327090A JPH02296142A JP H02296142 A JPH02296142 A JP H02296142A JP 2103270 A JP2103270 A JP 2103270A JP 10327090 A JP10327090 A JP 10327090A JP H02296142 A JPH02296142 A JP H02296142A
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JP
Japan
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antigen
manufacturing
sensor according
sensor
immunochemical
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Pending
Application number
JP2103270A
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English (en)
Inventor
Claudio Colapicchioni
クローディオ・コラピッキオーニ
Filippo Porcelli
フィリッポ・ポルチェリ
Carlo A Nuzzolo
カルロ・アントニオ・ヌッゾーロ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Eni Tecnologie SpA
Original Assignee
Eniricerche SpA
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Filing date
Publication date
Application filed by Eniricerche SpA filed Critical Eniricerche SpA
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Pending legal-status Critical Current

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    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54393—Improving reaction conditions or stability, e.g. by coating or irradiation of surface, by reduction of non-specific binding, by promotion of specific binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
    • C07F7/00—Compounds containing elements of Groups 4 or 14 of the Periodic System
    • C07F7/02—Silicon compounds
    • C07F7/08—Compounds having one or more C—Si linkages
    • C07F7/18—Compounds having one or more C—Si linkages as well as one or more C—O—Si linkages
    • C07F7/1804—Compounds having Si-O-C linkages
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    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
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    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 原でなる単層又は抗原及びタンパク質でなる高分子多層
から構成される免疫化学膜とを含有するＥＯＳ　（電解
質酸化物半導体）又はＣＨＥＭＦＥＴ　（化学電界硬化
型トランジスター）タイプの半導体素子に係る。
現在の臨床診断法においては、代謝物、ホルモン又はタ
ンパク質の血中濃度は、免疫蛍光法（ＦＩＡ等）、免疫
放射測定法（ＲＩＡ，　ＩＲＩＪＡ等）又は免疫酵素法
（ＥＬＩＳＡ等）を利用する各種の方法を使用して測定
されている。
最近では、研究者等の注目は、トランスデユーサ−とし
てＦＥＴの如きトランスデユーサ−の活性領域（すなわ
ちゲート）上に存在する非常に少量の電荷を検知できる
固体素子を使用する免疫センサーの作成に向けられてい
る。従来の方法と比較して、この種のセンサーの利点は
、達成される感度が少なくとも理論的に高いこと（被分
析物濃度１０−７ないし１０−１１Ｍに関して信号ＩＱ
ｍＶ）に加えて、装置をかなり小型化できること、トラ
ンスデユーサ−のコストが低いこと及びセンサ一応答が
迅速であることである［　Ｊ　、　Ｊａｎａｔａ及びＧ
．Ｆ．ＢｌａｃｋｂｕｒｎｒＡｎｎａｌｓ　Ｎ．Ｙ．Ａ
ｃａｄ　ｏｆ　ＳｃｉｅｎｃｅｓＪ　４２８，２８６（
１９８４）参照］。
これまでのところ、抗体がＦＥＴゲート上に吸着され、
被測定抗原との結合によって電荷の変動を生じ、この変
動がトランスデユーサ−によって記録される各種の基本
装置が開発されている［Ｍ。
Ａｉｚａｗａ，　Ｓ．Ｋａｔｏ及びＳ．Ｓｕｚｕｋｉ　
ｒＪ．Ｍｅｍｂｅｒ．ｓｃ．Ｊ　２。
１２５　（１９７７）及びＪ．Ｊａｎａｔａ及びＲ．Ｊ
．Ｈｕｂｅｒ　ｒＩｏｎ−Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ　Ｅｌｅ
ｃｔｒｏｄｅｓ　ｉｎ　Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ　Ｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙｊ（１９８０）（Ｆｒｅｉｓｅｒ　Ｈ編）
２，１０７−１７４，　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ発行
、参照］。
しかしながら、得られた免疫化学膜はかなり不安定であ
り、特に溶液中に存在するイオン又はタンパク質の如き
他の化学剤による干渉を受ける。
驚（べきことには、発明者らは、ポリシロキサンマトリ
ックスによって素子の表面酸化ケイ素に化学的に結合し
た官能化抗原（及び必要であればタンパク質）でなる免
疫化学膜を作成することにより、かかる膜は、ｐＨ７．
８に緩衝された溶液中に保存される際、１ケ月以上も生
理官能性を一定に維持するとの知見を得た。
さらに、被測定抗原に対して作成された抗体、又はこの
抗体に対して作成された二次抗体を、グルコースオキシ
ダーゼ又はウレアーゼの如き酵素（反応の間に、トラン
スデユーサ＝（　ＥＯＳ又はＣＨＥＭＦＥＴ）によって
検知される電荷を生成する）でマーキングすることによ
って上述の干渉の問題を解消できるとの知見を得た。
本発明の第１の態様は、免疫化学膜及び該膜にボリシロ
キサンマトリッスによって接合される表面酸化ケイ素を
含有するＥＯＳ又はＣＨＥＭＦＥＴタイプの素子を包含
してなるセンサーにおいて、前記免疫化学膜が、抗原で
なる単層又は抗原及びタンパク質でなる高分子多層から
構成され、前記免疫化学膜が、前記抗原上に存在する官
能基によって又は前記タンパク質を結合する二官能性カ
ップリング剤によってポリシロキサンマトリックスに化
学的に結合しており、該ポリシロキサンマトリックスが
一般式（１）。
■一Ｓｉ−Ｒ１ｎ Ｒ１υ ［式中、Ｒ１、Ｒ１１１及びＲＩｖは同一又は異なるも
のであって、Ｃ，−ｔ。アルキル基又はアルコキシ基で
あり：Ｒは（ＣＨＩ）ｍＸ（ＣＨりｎ　（ここでＸはＣ
Ｈｉまたはモノ又は多結合芳香族基、ＮＨ又は０であり
；ｍ及びｎは互に等しい又は異なるものであって、Ｏな
いしｌＯの整数であり、ただしＸがＮＨ又は０の場合、
０ではない）であり；ＹはーＮＨ２、−ＯＨ又は−ＳＨ
である］で表されるオルガノシラン又は一般式（２）（
ここで、Ｒ１及びＲ，は同一又は異なるものでありて、
■、Ｂｒ、　ＣＨ，、Ｎｏ、、ＮＨ，又はＨであり；　
ＲＲ１１＋及びＲＩＶは同−又は異なるものであって、
Ｃｌ−１０アルキル基又はアルコキシ基であり、Ｒ１は
Ｃｌ−１０アルキル基、アミノアルキル基、アミノアル
キルアリール基又はアルキルアリール基である）で表さ
れる官能性オルガノシランの中から選ばれるものである
ことを特徴とするセンサーにある。
前記ポリシロキサンマトリックスとして、たとえばアミ
ノエチルアミノプロビルトリメトキシシラン（ＡＥＡＰ
Ｓ）又はアントラニルアミドプロピルトリエトキシシラ
ン（＾ＡＰＳ）がある。
表面酸化ケイ素を含有する以外にも、ＥＯ８素子は、酸
化ケイ素以下の部分に蒸発によって析出されたアルミニ
ウム又は金の属を含有していなければならない。
一般式（２）で表される官能性オルガノシランを使用す
る場合、その調製は、下記のスキームに従って、イサト
酸無水物又は誘導体をアミノシランと反応させることに
よって行われる。
本発明の目的に適する官能性オルガノシランを調製する
ための好適なシランは次のとおりである。
３−アミノプロピルトリエトキシシランＨＪ−（ＣＨｔ
）ｓ−５Ｌ−（ＯＣＪａ）ｓアミノメチルトリエトキシ
シラン ＨＪ−ＣＨＩ−３１−（ＯＣＪｓ）　ａ２−アミノエチ
ル−アミノプロビルトリメトキシシラン ＨＪ−（ＣＨｔ）＊−ＮＨ−（ＣＨｔ）ｓ−３ｉ−（Ｏ
ＣＨｓ）＊２−アミノエチル−アミノプロピルトリエト
キシシラン ＨＪ−（ＣＨｔ）　＊−ＮＨ−（ＣＨ２）ｓ−Ｓｉ−（
ＯＣＪｓ）ｓ２−アミノエチル−アミノプロビルメチル
ジメトキシシラン ＨＪ−（ＣＨｔ）＊−ＮＨ−（ＣＨｔ）ｍ−３ｉ−（Ｏ
ＣＨｓ）２ＣＨｌ 合成は、溶媒の存在下又は不存在下、イサト酸無水物を
アミノシランに徐々に添加することによって行われる。
反応を溶媒で行う場合には、溶媒はイサト酸無水物と反
応するものであってはならない。ヒドロキシル溶媒の場
合、温和な反応条件（たとえば触媒を使用しない）を採
用しなければならない。溶媒として、アルコール、エー
テル、塩素化溶媒等を使用できる。操作は水（アルコキ
シ基を加水分解する）の不存在下で行われなければなら
ない。
反応がわずかに発熱性であること（冷却が必要である）
及び脂肪族アミン（アミノシラン）と芳香族アミン（反
応生成物）との間にかなりの反応性の差異があるにも拘
らず、タイプ のオリゴマー生成物（少量ではあるカリが生成されるこ
とを配慮しながら、イサト酸無水物を一度に添加するこ
とによっても反応を実施できる。
触媒反応の間に電荷を生ずるタイプの酵素を該素子に導
入できる。
使用されるタンパク質は、たとえばアルブミン、ヘモシ
アニン等から選ばれる。
かかるトランスデユーサ−は、生物学的液体中における
特殊な循環抗体（たとえば四日熱マラリア又はＡＩＤＳ
ウィルス（ＨＴＬＶ　ＩＩＩ）に対して作成されたもの
の測定（臨床診断に重要である）に使用される。これら
の抗体は、触媒反応の間にトランスデユーサ−（ＥＯＳ
又はＦＥＴ）によって検知される電荷を生ずる酵素（た
とえばグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ等）でマー
キングされた遊離の抗原又は同じ特異性を有する類似の
抗原との競合関係に当該抗体を置くことによって測定さ
れる。
別の測定法は、第１の抗体に対して作成した第２の抗体
、又は微生物を源とするタンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ
であって、上述の特性を有する酵素（たとえばグルコー
スオキシダーゼ又はウレアーゼ等）でマーキングしたも
のを使用するものである。
さらに、本発明の免疫センサーは、除草剤であるアトラ
ジン、パラコート、モリナート等の汚染物質（これらに
対して官能化抗原が作成される）の測定に使用される。
アトラジンは、主としてトウモロコシの栽培に関し農業
の分野で広く使用されている除草剤であり、雑草の光合
成系を阻害することによって作用する。
トウモロコシに関する選択性は、特異な酵素又はポリフ
ェノールによる培養によって活性成分が非毒性物質（ヒ
ドロキシアトリジン）に分解されるとの事実によるもの
である。
この除草剤の使用は、除草剤を散布した栽培地（自然の
分解を受けるまで長期間残留する）周辺の水質汚染を生
ずる。
水溶液中のアトリジンの測定は、一般に１次精製処理後
、複雑な分析法（たとえばガスクロマトグラフィー（Ｇ
Ｃ）　、ＨＰＬＣ又はＧＬＣ）によって行われる。
本発明の免疫センサーを使用する場合には、これら方法
に比べて、溶液状のサンプルを直接に分析できるとの利
点を有する。しかも、携帯可能な装置の作成により、そ
の場で直接アトラジンを測定することが可能である。
本発明による免疫センサーによってアトラジンを測定す
るためには、この物質に対して作成された抗体を使用し
なければならない。
アトラジンは小形分子であり、これ自体免疫原性でない
（すなわち抗体の生成を誘発しない）ため、アトラジン
類似体（すなわちアメトリン）を使用し、アメトリンス
ルホキシドとして官能化し、この反応性基によってキャ
リヤー（一般にアルブミン、ヘモシアニン等の如きタン
パク質）に結合させる。この複合体は、−旦ウサギ（又
は他の好適な実験動物）に接種されると、アメトリン及
びアトラジン自体の両方を認識する抗体の生産を誘発す
る。
同様のシステムを使用して、各種文献に記載された如く
、他の汚染物質（パラコート、モリナート等）に対する
抗体を得ることができる［たとえばＪ、Ｖａｎ　Ｅｍｏ
ｎ、　Ｂ、ＨａｍｍｏｃｋＳＪ、Ｎ、５ｅｉｂｅｒ　ｒ
ＡｎａｌＣｈｅｍ、Ｊ　　（１９８６）　、　５８．　
１８６６−１８７３：　　Ｓ、Ｊ、Ｇｅｅ、　ＴＭｉｙ
ａｍｏｔｏ、Ｍ、Ｈ，ＧｏｏｄｒｏｗＳＤ、Ｂｕｓｔｅ
ｒ、　Ｂ、Ｄ、ＨａｍｍｏｃｋｒＪ、Ａｇｒｉｃ、Ｆｏ
ｏｄ　Ｃｈｅｍ、Ｊ　（１９８８）、３６．８６３−８
７０］。
上述の免疫センサーの作成に当たっては、アメトリンー
タンパク質複合体を二官能性カップリング剤によって素
子に化学的に結合させるか、又はアメトリンスルホキシ
ドを該反応性基によって素子に直接結合させることもで
きる。
タンパク質の膜を形成することなくアメトリンを直接結
合させる第２の方法では、膜の抵抗性が増大する。
本発明は、さらに免疫化学膜を有する素子の形成に使用
される方法を提供するものである。
官能化抗原でなる単層から構成された免疫化学膜を有す
るセンサーを作成する第１の方法は、シロキサンプレポ
リマーを調製し、つづいてＥＯＳ又はＣＨＥＭＦＥＴ素
子上に該プレポリマーを１回以上析出させ、熱硬化を行
い、これによりシランアルコキシ基の完全重合化を行い
、加水分解してポリシロキサンマトリックスを得た後、
他のアルコキシ基を酸化表面上に存在する５ｉ−ＯＨヒ
ドロキシル基と反応させて該マトリックスを酸化ケイ素
に化学的に接合させ；予め官能化した抗原をポリシロキ
サン層上に存在する脂肪族アミノ基と反応させるもので
ある。
官能化抗原及びタンパク質でなる高分子多層から構成さ
れた免疫化学膜を有するセンサーを作成する第２の方法
は、シロキサンプレポリマーを調製し、つづいてＥＯＳ
又はＣＨＥＭＦＥＴ素子上に該プレポリマーを１回以上
析出させ、熱硬化を行い、これによりシランアルコキシ
基の完全重合化を行い、加水分解してポリシロキサンマ
トリックスを得た後、他のアルコキシ基を酸化表面上に
存在するＳト０１１ヒドロキシル基と反応させて該マト
リックスを酸化ケイ素に化学的に接合させ；ポリシロキ
サン層上に存在する脂肪族アミノ基を二官能性カップリ
ング剤によって活性化し；タンパク質に結合した官能化
抗原でなる免疫化学プレポリマーを調製し；該免疫化学
プレポリマーを前記ポリシロキサン層の（活性化）アミ
ノ基と反応させるものである。
上述の方法で使用される二官能性カップリング剤は、ジ
アルデヒド（たとえ・ばグルタルアルデヒド）又はジイ
ソシアネート（たとえばトルエン２．４−ジシアネート
）から選ばれる。
上記方法におけるシロキサンプレポリマーの析出工程は
、スピン−オン技術によって行われ、ロッキングプレー
ト上でポリシロキサンを活性化し、抗原及びタンパク質
と反応させる。
シロキサンプレポリマーの熱硬化を温度８０ないし１４
０℃で行い、つづく免疫化学膜の固定化処理を２５ない
し３７℃で行う。
析出するシロキサンプレポリマーの厚さは０，５ないし
３μｍ１免疫化学ｊ漠の厚さは０５ないし２μｍである
。
ポリシロキサン層を形成するためには、ロータリーディ
スク装置を、析出工程の間、好ましくは４００ないし４
５００ｒｐｍの速度で作動させなければならない。
シロキサンプレポリマーは、プラズマ析出法によっても
、好ましくは下記の条件下において、ＥＯＳ又はｌ５Ｆ
ＥＴ素子のケイ素又は酸化ケイ素基板上に析出される。
電カニ２０ないし５０Ｗ 放電圧ツノ＝０．１ないし１トル 温度：室温ないし使用したシロキサンプレポリマーの分
解温度 特にアトリジンｆｆｐｌ定用センサーの場合、好適なシ
ランはＡＥＡＰＳ及び３−ＡＰＴＳである。
本発明は、トランスデユーサ−としてＥＯＳ又はＣＨＥ
ＭＦＥＴ電子装置を使用する未知の抗原濃度を測定する
方法を提供するものである。
抗原濃度の測定は、抗原自体に対して作成された抗体、
又は抗原を認識する抗体に対して作成された第２の抗体
を、触媒反応の間にトランスデユーサ−（ＥＯＳ又はＣ
ＨＥＭＦＥＴ）によって検知される電荷を生成する酵素
（たとえばグルコースオキシダーゼ、ウレアーゼ等）で
マーキングすることによって行われる。
第１の場合では、抗体−酵素複合物を被測定抗原と競合
させる。素子上に存在する免疫化学膜に結合した標識抗
体の量は、その基板に存在す酵素の電気的応答によって
測定される。従って、この量は、被測定溶液中に存在す
る抗原の量に反比例する。
これに対して、第２の場合では、素子上に固定化された
抗原に抗体を結合させた後、第１の抗体に対して作成し
た第２の抗体（酵素でマーキングしている）を添加する
。この場合にも、被測定抗原の濃度は、第１の抗体に結
合した標識抗体の惜（トランスデユーサ−に記載された
酵素の電気応答に基づいて測定される）に反比例する。
従って、本発明による方法は、酵素（抗原に対して作成
された抗体、又は第１の抗体に対して作成された第２の
抗体（基質が存在する場合）をマーキングする）の電気
応答によって測定が行われるため、被検サンプル中に存
在するイオン又は他のタンパク質による干渉が少ないと
の利点を有する。
本発明をさらに説明すため以下に実施例を例示するが、
これら実施例は本発明を限定するものではない。
実施例１ アメ　リン−ＥＯ３のｒｆｆ″ Ｈｕｂｅｒ　Ｓ、Ｊ、によってｌ”Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅ
ｒｅＪ　（１９８５）ｖｏ１１４、Ｎｏ、１１／１２．
ｐｐ１７９５−１８０３に開示された如くして、市販の
アメトリンからアメトリンスルホキシドを調製した。
アメトリンスルホキシドの形成をＥＴＩＲによって監視
したところ、第１図から明らかなように、該スルホキシ
ドは１０３ｃｍ−’に強い吸収を示した。なお、第１図
の横軸は波長（ｃｍ　−’　）を示し、縦軸は透過率（
％）を示す。
ポリシロキサンマトリックスに化学的に結合した官能化
抗原（アメトリンスルホキシド）でなる単層から免疫化
学膜が構成された免疫センサーを形成した。
無水エタノール中にアミノエチルアミノプロビルトリメ
トキシシラン（ＡＥＡＰＳ）　２１％、酢酸３％及びＨ
２Ｏ１％を含有する部分解氷分解ポリシロキサンの水性
アルコール溶液を使用し、ＥＯ３素子のバー　（０，５
ｃｍＸ０，５ｃｍ）上で析出処理した。ロータリーディ
スク装置により、３５ＱＯｒｐｍ、　２０秒間で３回析
出処理を行った。
ＥＯＳ上に析出した該オリゴマー溶液の過剰分を、キャ
リープレートの回転運動に由来する遠心作用によって除
去した。１２０℃で１６時間熱硬化した後、バーを冷却
した。各バーを、無水エタノールｌＯ％を含有する５０
ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）にアメトリンスルホキ
シド０５■を含む溶液１−内の秤量フィルターに配置し
、ロッキングプレート上、室温で５日間攪拌し、ついで
無水エタノール１０％を含有する５０ｍＭ　ＴＲｌ５緩
衝液（ｐＨ７，８）で３回洗浄し、さらにエタノールを
含有しない同じ緩衝液で２回洗浄した。
タンパク　−アメトリンスルホキシド　Ａアフトリンス
ルホキシド１２ｍｇを含有する無水エタノール２００μ
Ｑを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９，６）５−に溶解
したウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）　５０ｍｇに添加し
た。
混合物を３７℃において暗所で５日間インキユベートシ
、０．９％Ｎａ（Ｑ溶液５Ｑに対して透析し、凍結乾燥
した。凍結乾燥生成物を、次表に示すような抗体の調製
に使用した。
ＢＳＡ−アメトリンによるウサギの免疫全フロイドアジ
ュバン ト０．５−中において１■ １１　　　　　　　間　　　上　　　　皮内注射１９　
　　　　　　同　　　上　　　　皮内注射２７　　　０
．９％Ｎａ（Ｑ溶液０．５−中に　静脈内注射おいて１
ｍｇ ４１　　　　血液サンプル採取 ８８　　　　Ｑ、９％Ｎａ■溶液０．５ｍＱ中に　静脈
内注射おいて１ｍｇ １０２　　　　血液サンプル採取 第２ａ−第２ｃ図は、それぞれＢＳＡの吸収スペクトル
、市販アメトリンの吸収スペクトル、及び複合ＢＳＡ−
アメトリンの吸収スペクトルを示す（横軸は波長（１μ
ｍ）、縦軸は光学密度を示す）。
同様にして、ヘリックス・ポマティア（Ｈｅｌｉｘｐｏ
ｍａｔｉａ）ノヘモシアニンをアメトリンスルホキシド
と複合させた。
レート　でのアフト１ンのコーチ　ン プレート（Ｎｕｍｃ　Ｉｍｍｕｎｏｐｌａｔｅ　Ｍａｘ
ｉｓｏｒｐｔ　Ｆ　９６）の各種の凹み（ウェル）の各
々において、ＢＳＡ−アメトリン溶液（５０ｍＭ　ＴＢ
Ｓ　（ｐＨ７，８）中に３００μｇ／−を含む）１００
μＱを室温で１夜インキユベートした。
同じプレートのいくつかのウェルにおいて、ＢＳＡ溶液
（５０ｍＭ　ＴＢＳ　（ｐＨ７，８）中に３００μｇ　
／−を含む）１００μＱを室温で１夜インキユベートし
た。
同じプレートの他のいくつかのウェルにおいて、ヘモシ
アニンーアメトリン溶液（５０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，
８）中に３００μｇ／−を含む）１００μＱ（各ウェル
当たり）を室温で１夜インキユベートした。
同じプレートのさらに他のいくつかのウェルにおいて、
ヘモシアニン溶液（５０ｍＭ　ＴＢＳ　（ｐＨ７，８）
中に３００μｇ／−を含む）１００μＱを室温で１夜イ
ンキユベートした。
ついで、プレートをＴｗｅｅｎ　２００．０５％を含有
する２５ｍＭ　ＴＢＳ　（ｐ）１７．８）　２００μＱ
　（各ウェル当たり）で５回洗浄した。
つづいて、各ウェルにおいて、Ｂ５Ａ３％を含有する５
０ｍＭ　ＴＢＳ　（ｐ）１７．８）　２００μＱを室温
で１時間インキュベートした。
ついで、プレートを２５ｍＭ　ＴＢＳ　（＋〇、０５％
Ｔｗｅｅｎ２０）　（ｐＨ７，８）２００μＯ（各ウェ
ル当たり）で５回洗浄した。
２５ｍＭ　ＴＢＳ　（ｐＨ７，８）（＋２．５％ＢＳＡ
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中に１：５００ないし１
　：　３２０００で希釈した免疫血清又は非免疫血清１
００μＱ（各ウェル当たり）を、同じプレートにおいて
、室温で１時間インキュベートした。
ついで、プレートトを、２５ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８
）（＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０）　２００μＱ　（
各ウェル当たり）で５回洗浄した。
その後、２５＋ｎＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（＋２．５
％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅ口２０）中に含有される
ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−）ＩＲＰ　（１：　４０００）
　１００μＱを使用し、室温で１時間インキュベートし
た。
ついで、プレートを２５ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ　２０）　２００μＱ　（各ウ
ェル当たり）で５回洗浄した。
さらに基質（ＴＭＢ）　１００μＱを使用して室温でイ
ンキュベーションを行い、５分後に０．５Ｍ硫酸１００
μＱで反応を停止させた。硫酸で停止させたブランク−
基質に対して４５０ｎｍにおける吸光度を読み取った。
基質（ＴＭＢ）は、０．１Ｍ酢酸塩緩衝液（ｐＨ５，０
）９　ｍＱ及び３．３’、５．５’−テトラメチルベン
ジジン溶液（０１Ｍクエン酸＋３５％過酸化水素１．５
μθ中に１ｍｇ／−を含有する）　１　ｍＱでなる。
第３図は、プレート上に担持されたＢＳＡ−アメトリン
（＊）及びヘモシアニンーアメトリン（＃）による抗ア
メトリン抗血清の力価ｌｊ定の結果を示すグラフである
（横軸は希釈度（Ｘ１０３）、縦軸は光学密度を示す）
。
ＥＯＳ−アメトリン及びブランクとして使用する他のＥ
ＯＳ　（ＡＥＡＰＳ）を、５０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，
８）（＋０．５％カゼイン＋Ｏ１％ＴｒｉｔｏｎＸ　ｌ
ｏＯ＋　２％ＰＧＥ　６０００）中に１５００ないし１
：４０００で希釈した免疫血清０５ｉと共に室温で３０
分間インキュベートした。
ついで、５０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（＋　０．１
％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００）　１−により滞留時間５分
間で４回洗浄した。
その後、５０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐ）１７．８）（＋０．５
％カゼイン　＋〇、１％ＴｒｉｔｏｎＸ　１００＋　２
％ＰＥＧ　６０００）中に含有されるヤギ抗−ウサギＩ
ｇＧ−ＨＲＰ　（１：　４０００）　０．５−と共に室
温で３０分間インキュベートした。
ついで、５０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（＋〇、１％
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００）　１−により滞留時間５分間
で４回洗浄した。
さらに基質（ＴＭＢ）　０．５−と共に室温でインキュ
ベーションを行い、１０分後に０．５Ｍ硫酸０．５ｎρ
で反応を停止させた。
２００μＱをＥＬＩＳＡプレートのウェルに移し、ブラ
ンク−基質に対して４５０ｎｍにおける吸光度を読み取
った。力価曲線を第４図に示す（横軸は希釈度（ＸＩＯ
”）、縦軸は光学密度を示す）。
アトリジン　　による　宙　の ＥＯＳ　（ＡＥＡＰＳ）及びＥＯＳ−アメトリンを、５
０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（＋　０．５％カゼイン
＋〇、１％ＴｒｉｔｏｎＸ　１００＋２％ＰＥＧ　６０
００）中に１　：　２０００で希釈した免疫血清０５ｍ
１＋アトリジン（０，０５，１，５及び２５μ９／Ｑ）
と共に室温で３０分間インキュベートした。
ついで、５０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（＋Ｏ，１％
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００）　１　ｍＱにより滞留時間５
分間で４回洗浄した。
その後、５０ｍ）Ｊ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（＋０．５
％カゼイン＋Ｏ１％ＴｒｉｔｏｎＸ　１００＋　２％Ｐ
ＥＧ　６０００）中に含有されるヤギ抗−ウサギＩｇＧ
−ＨＲＰ（１：　４０００）０．５−と共に室温で３０
分間インキュベートした。
ついで、５０ｍＭ　ＴＢＳ（ｐＨ７，８）（＋０．１％
Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ１００）　１−により滞留時間５分間
で４回洗浄した。
さらに基質（ＴＭＢ）　０．５ｍＱを使用してインキュ
ベーションを行い、１０分後に０．５Ｍ硫酸０．５ｍＱ
で反応を停止させた。
各４を合物２００μＱをＥＬＩＳＡプレートのウェルに
移し、ブランク−基質に対して４５０ｎｍにおける吸光
度を読み取った。
阻害率を第５図に示す（横軸はアトラジン濃度（μｇ／
Ｑ）を示す）。
実施例２ ＦＥＴ　　　　におけるアメトリンの　定サイズ１．２
８ｍｍＸ　２．１６ｍｍを有し、ゲート（４００μｍ×
２０μｍ）　２個を包含するチップ（ＨＥＤＣＯ，ユタ
大学）を、粘着テープ（３Ｍ　ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ　
ｔａｐｅ　９２）によって、電気接触領域及びエツジを
保護し、ただしゲートをフリーの状態としてスライド上
に積載した。次いで、上述の如くして、チップ上にＡＥ
ＡＰＳ　（３（２−アミノエチル）アミノプロピルトリ
メトキシシラン）の層を析出させた。ポリシロキサンの
析出後、チップを超音波ウエルダ−（Ｋｕｌｉｃｋｅａ
ｎｄ　５ｏｆｆａ　ｓｏｄ、　４１２３）と接続したＴ
Ｏ−５タイプの・支持体に積載し、エポキシ樹脂Ｅｐｏ
ｔｅｋ　Ｈ−７７でカプセル化した。
いくつかのＦＥＴ素子を、それぞれ無水エタノールｌＯ
％を含有する５０ｍＭ炭酸塩緩衝液（ｐＨ９、６）中に
アメトリンスルホキシド約１ｒＩＩｇ／１ＴＩＱを含有
する溶液０．５ｍＱを使用し、攪拌下、室温で５日間反
応させた。次いで、これら素子を、エタノールｌＯ％を
含有する５０ｍＭ　ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７，８）で３回
、エタノールを含有しない同じ緩衝液で２回洗浄した。
素子を、２，５％ＢＳＡ、　　０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ
−１００及び２％ＰＥＧ　６０００を含有する５０ｍＭ
　ＴＢＳ　（ｐＨ７，８）　　（インキュベーション緩
衝液）中に１＋５００で希釈した免疫血清０．５＋ｎＱ
と共に、室温で３０分間インキュベートした。
ついで、Ｏ１％Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ−１００を含有する５
０關ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ７，８）（洗浄緩衝液）０．５
−で４回（滞留時間５分）洗浄した。
その後、インキュベーション緩衝液に希釈したヤギ抗−
ウサギｒｇＧ−ＧＯＤ溶液０．５ｍＱを使用し、室温で
３０分間インキュベートした。ついで、洗浄緩衝液で４
日洗浄した。
最後に、グルコースの存在下、ＣＯＤの活性によって生
じた電気応答を１ｌｌ１１定した。
第６図は、０．０５Ｍグルコースの添加（時間ａ）後及
び洗浄緩衝液及び２０ｍＭリン酸塩溶液（ｐＨ７，０）
の添加（時間ｂ）後における免疫センサーの電気応答を
示すグラフである。グラフの横軸は時間（分）、縦軸は
電気応答（ｍＶ）を示す。
実施例３ ＦＥＴの　　ロ いくつかのＦＥＴを、攪拌しながら、０１％グルタルア
ルデヒドの存在下、２０ｍＭリン酸塩緩衝液（ｐＨ７０
）中にＢＳＡ−アストリン１０ｍｇ／ＩＴＩｏを含有す
る溶液０２５０−と室温で１時間反応させ、ついで緩衝
液のみで洗浄した。
インキュベーション緩衝液中に１　：　５００で希釈し
た免疫血清０．５−と共に室温で３０分間インキュベー
トし、洗浄緩衝液で４回洗浄した。
さらにヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＧＯＤのインキュベーシ
ョン緩衝液溶液０．５−を使用して室温で３０分間イン
キュベートし、洗浄緩衝液で４回洗浄した。
最後に、グルコースの存在下、ＧＯＤの活性によって生
じた電気応答を測定した。
電気測定の後、チップを０．１Ｍグリシン−〇ＣＩ緩衝
液（ｐＨ２，０）と共に約１０分間インキュベートして
抗原−抗体の分離を行い、次の測定に使用できるように
素子を再生した。
上述の如くして免疫血清及びヤギ抗−ウサギＩｇＧ−Ｇ
ＯＤと共にインキュベートし、電気応答を測定した。
第７図は、同一の素子を使用して行った測定サイクルの
間にえられた応答（ｍＶ；縦軸）を示す。
アトラジンの　　　に　　る　史　の ＦＥＴ−ＢＳＡ−アメトリンを、インキュベーション緩
衝液中に１　：　５００で希釈した免疫血清０．５−と
共に室温で３０分間インキュベートし、ついで洗浄緩衝
液で４回洗浄した。
その後、ヤギ抗−ウサギＩｇＧ−ＧＯＤのインキュベー
ション緩衝液溶液０．５−と共に室温で３０分間インキ
ュベートし、洗浄緩衝液で４回洗浄した。
ついでグルコースの存在下における電気測定を行った。
この測定をアトラジンの不存在下で行った後、再生（す
なわち抗原の抗体からの分離）を、０．１Ｍグリシン−
ＨＧ２緩衝液（ｐＨ２，０）を使用して行った。抗血清
に対して１又は５１）１）ｂに等しい量のアトラジンを
添加した後、上述の如くしてインキュベーションを再度
行った。
第８図は、アトラジン０ｐｐｂ　（＊）　、１ｐｐｂ　
（＋）及び５ｐｐｂ（＝）の存在下における電気応答、
すなわち０．０５Ｍグルコースの添加（時間ａ）後、洗
浄！！街液及び２０ｍＭリン酸塩（ｐＨ７、０）の添加
（時間ｂ）後における電気応答曲線である（横軸は時間
（分）、縦軸は電気応答（ｍＶ）を示す）。
【図面の簡単な説明】
第１図はアメトリンスルホキシドのＩＲ吸収スペクトル
を示す図、第２３−第２Ｃ図はそれぞれＢＳＡ、市販ア
メトリン及び複合ＢＳＡ−アメトリンの吸収スペクトル
を示す図、第３図はＢＳＡ−アメトリン及びヘモシアニ
ンーアメトリンによる抗アメトリン抗血清の力価測定の
結果を示すグラフ、第４図はＥＬＩＳＡによる抗血清の
力価Ｄ１定の結果を示すグラフ、第５図はアトリジンに
よる阻害率の変化を示すグラフ、第６図は免疫センサー
の電気応答を示すグラフ、第７図は免疫センサーの再生
処理サイクルと性能との関係を示すグラフ、第８図はア
トラジンによる電気応答の変化を示すグラフである。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １　免疫化学膜及び該膜にポリシロキサンマトリックス
    によって接合される表面酸化ケイ素を含有するＥＯＳ又
    はＣＨＥＭＦＥＴタイプの素子を包含してなるセンサー
    において、前記免疫化学膜が、官能化抗原でなる単層又
    は官能化抗原及びタンパク質でなる高分子多層から構成
    され、前記免疫化学膜が、前記抗原上に存在する官能基
    によって又は前記タンパク質上に存在する二官能性カッ
    プリング剤によってポリシロキサンマトリックスに化学
    的に結合しており、該ポリシロキサンマトリックスが一
    般式（１） ▲数式、化学式、表等があります▼ ［式中、Ｒ＾II、Ｒ＾III及びＲ＾IVは同一又は異なる
    ものであって、Ｃ＿１＿−＿１＿０アルキル基又はアル
    コキシ基であり；Ｒは（ＣＨ＿２）ｍＸ（ＣＨ＿２）ｎ
    （ここでＸはＣＨ＿２またはモノ又は多結合芳香族基、
    ＮＨ又はＯであり；ｍ及びｎは互に等しい又は異なるも
    のであって、０ないし１０の整数であり、ただしＸがＮ
    Ｈ又はＯの場合、０ではない）であり；Ｙは−ＮＨ＿２
    、−ＯＨ又は−ＳＨである］で表されるオルガノシラン
    又は一般式（２） ▲数式、化学式、表等があります▼ （ここで、Ｒ＿１及びＲ＿２は同一又は異なるものであ
    って、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＨ＿３、ＮＯ＿２、ＮＨ＿２又は
    Ｈであり；Ｒ＾II、Ｒ＾III及びＲ＾IVは同一又は異な
    るものであって、Ｃ＿１＿−＿１＿０アルキル基又はア
    ルコキシ基であり、Ｒ＾ I はＣ＿１＿−＿１＿０アル
    キル基、アミノアルキル基、アミノアルキルアリール基
    又はアルキルアリール基である）で表される官能性オル
    ガノシランの中から選ばれるものであることを特徴とす
    る、センサー。 ２　請求項１記載のものにおいて、前記官能化抗原がア
    メトリンスルホキシドである、センサー。 ３　請求項１記載のセンサーを得る方法において、シロ
    キサンプレポリマーを調製し、つづいてＥＯＳ又はＣＨ
    ＥＭＦＥＴ素子上に該プレポリマーを１回以上析出させ
    、熱硬化を行い、これによりシランアルコキシ基の完全
    重合化を行い、加水分解してポリシロキサンマトリック
    スを得た後、他のアルコキシ基を酸化表面上に存在する Ｓｉ−ＯＨヒドロキシル基と反応させて該マトリックス
    を酸化ケイ素に化学的に接合させ；予め官能化した抗原
    をポリシロキサン層上に存在する脂肪族アミノ基と反応
    させると共に、前記シロキサンプレポリマーの析出をロ
    ータリーディスク装置又はプラズマ析出法によって行う
    ことを特徴とする、センサーの製法。 ４　請求項１記載のセンサーを得る方法において、シロ
    キサンプレポリマーを調製し、つづいてＥＯＳ又はＣＨ
    ＥＭＦＥＴ素子上に該プレポリマーを１回以上析出させ
    、熱硬化を行い、これによりシランアルコキシ基の完全
    重合化を行い、加水分解してポリシロキサンマトリック
    スを得た後、他のアルコキシ基を酸化表面上に存在する Ｓｉ−ＯＨヒドロキシル基と反応させて該マトリックス
    を酸化ケイ素に化学的に接合させ；ポリシロキサン層上
    に存在する脂肪族アミノ基を二官能性カップリング剤に
    よって活性化し；タンパク質に結合した官能化抗原でな
    る免疫化学プレポリマーを調製し；該免疫化学プレポリ
    マーを前記ポリシロキサン層の（活性化）アミノ基と反
    応させると共に、前記シロキサンプレポリマーの析出を
    ロータリーディスク装置又はプラズマ析出法によって行
    うことを特徴とする、センサーの製法。 ５　請求項３又は４記載の製法において、前記シロキサ
    ンプレポリマーの熱硬化を温度８０ないし１４０℃で行
    う、センサーの製法。 ６　請求項３又は４記載の製法において、前記シロキサ
    ンプレポリマーの１回以上の析出を、厚さ０．５ないし
    ３μｍの膜が形成されるように行う、センサーの製法。 ７　請求項３又は４記載の製法において、前記シロキサ
    ンプレポリマーの１回以上の析出に使用するロータリー
    ディスク装置を４００ないし４５００ｒｐｍで作動させ
    る、センサーの製法。 ８　請求項３又は４記載の製法において、前記カップリ
    ング剤がジアルデヒドの中から選ばれるものである、セ
    ンサーの製法。 ９　請求項８記載の製法において、前記ジアルデヒドが
    グルタルアルデヒドである、センサーの製法。 １０　請求項３又は４記載の製法において、前記カップ
    リング剤がジイソシアネートの中から選ばれるものであ
    る、センサーの製法。 １１　請求項１０記載の製法において、前記ジイソシア
    ネートがトルエン２，４−ジイソシアネートである、セ
    ンサーの製法。 １２　請求項４記載の製法において、前記タンパク質が
    アルブミン又はヘモシアニンである、センサーの製法。 １３　請求項３又は４記載の製法において、前記免疫化
    学膜の析出を、厚さ０．５ないし２μｍの膜が形成され
    るように行う、センサーの製法。 １４　請求項１記載のセンサーを使用して抗原の濃度を
    測定する方法において、抗原に対して作られた抗体を、
    ＥＯＳ又はＣＨＥＭＦＥＴ素子によって検知される電荷
    を生ずる酵素でマーキングすることを特徴とする、抗原
    濃度の測定法。 １５　請求項１記載のセンサーを使用して抗原の濃度を
    測定する方法において、該抗原を認識する抗体に対して
    作られ、かつＥＯＳ又はＣＨＥＭＦＥＴ素子によって検
    知される電荷を生ずる酵素、又はタンパク質Ａ−酵素複
    合体又はタンパク質Ｇ−酵素複合体でマーキングされた
    他の抗体を使用することを特徴とする、抗原濃度の測定
    法。 １６　請求項１４又は１５記載の方法において、酵素が
    グルコースオキシダーゼ及びウレアーゼの中から選ばれ
    るものである、抗原濃度の測定法。 １７　請求項３又は４記載の製法において、前記プラズ
    マ析出を、電力１０ないし１００Ｗ及び放電圧力０．１
    ないし１トルで行う、センサーの製法。
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