JPH02223596A - 魚類の成長ホルモンポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、魚類の成長ホルモンポリペプチド、及び、そ
れをコードする遺伝子を組み込んだ組換え体微生物によ
る魚類の成長ホルモンボリペプチドの高収率な製法、及
び、該成長ホルモンポリペプチドによる広範囲の魚類の
生育促進方法に関するものである。

〔従来の技術〕

魚類の成長ボルモンボリペブチドを魚類の脳下垂体から
単離する報告は多数ある。その−例をあげると、テイラ
ビア　（Ｓ、Ｎ、Ｆａｒｍｅｒ等、Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ。

Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、、３０．９１（１９７６））、チョ
ウザメ（Ｓ、Ｎ、Ｆａｒｍｅｒ等、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌｏｇｙ＋　１（と８，３７７（１９８１））　、コイ
（八、Ｆ。

Ｃｏｏｋ等、Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎ、、
５０，３３５（１９８３））、シロサケ（特開昭６０−
２１４７９８号）および本発明者らのマグｏ（特開昭６
３−１３３９５１号）等である。またそめコードする遺
伝子の単離に成功している例も多数あり、その例はシロ
サケ　（特開昭６１−９３１９７号）、ハマチ（Ｎ、Ｗ
ａｔａｈｉｋｉ等、Ｇｅｎ、Ｃｏｍｐ、　Ｅｎｄｏｃｒ
ｉｎ、　。

刊、　４０１　（１９８８）　）および本発明者らのマ
グロ（′１１榊誘４１−７２７２ヲ（）等である。

従来、魚類の組み換え成長ホルモンポリペプチドは魚類
の成長ポルモンボリペプチドをコードする遺伝子を微生
物に取り込ませ培養し、培養物を精製後、尿素で再生し
、活性型（２個のＳ−Ｓ環を有する単量体の分子）にし
て得てきた。活性型にする理由は、成長ホルモンポリペ
プチドを構成している４個のシスティンの環をまいて２
個のＳＳ環にしないと成長促進活性を保持しないからで
ある。しかし、尿素では、低い収率でしか再生できなか
った。

〔発明が解決しようとする課題〕

魚類の成長ホルモンは魚類の成長促進効果を有し栽培漁
業に於いて極めて有用な将来的飼料である。しかし、現
在該ホルモンを安価に且つ大量に供与することは魚類の
脳下垂体を大量に必要とし、本質的に不可能な問題であ
る。

本発明者等は先にマグロ類の成長ホルモンを単離し、そ
の性質と一次構造とを明らかにすると共に、このマグロ
類の成長ホルモンが硬骨魚類の優れた成長促進因子とな
り得ることを明らかにした（特開昭６３−１３３９５１
号）。また、この遺伝子を単離しプラスミドに組み込み
大腸菌に導入することにより、成長ホルモンを発現させ
ることに成功した（４’ｉ々印輯１ｊ３−７：ｚ’７２
う子）。

本発明者らはさらに研究を進めて魚類の成長ホルモンを
安価に大量に供給する方法を開発すべく研究を行ない本
発明を完成するにいたった。

〔課題を解決する手段〕

本発明者らは、組換えＤＮＡ技法で微生物に生産させた
魚類の成長ホルモンポリペプチドを効率良く活性型の分
子に製造する方法について研究を行い成功した。即ち、
大腸菌に生産させたマグロの成長ホルモンポリペプチド
を塩酸グアニジン処理および尿素処理することにより効
率良く活性型の分子に再生することができるのみでなく
、得られた分子は従来未知の新規物質であることを発見
した。そして更に、この方法は上記したマグロの成長ホ
ルモンポリペプチドのみでなく他の成長ホルモンポリペ
プチドに適用可能であることも発見した。そして、これ
らの分子は、これを硬骨魚類に投与したところ、すぐれ
た成長促進効果も発見した。

本発明はこれらの新知見を基礎として、更に研究の結果
、遂に完成されたものである。

本発明の骨子とするところは、魚類の成長ホルモンポリ
ペプチドを尿素と塩酸グアニジンとを用いて効率的に精
製、再生し、目的とするペプチドを大量に採取する点で
ある。

本発明に係る尿素・塩酸グアニジン処理の対象は、魚類
の成長ホルモンポリペプチドを広く指すものであって、
遺伝子組換えや細胞融合の手法によって得たもの及び抽
出によって得たもののいずれも問わないし、魚類の種類
についても格別の限定はなく、各種の魚類が広範に使用
できる。

上記した遺伝子組換え技術による魚類の成長ホルモンポ
リペプチドの製造は、１４４％ｏ；’Ｊ′１（−ｑλ’
７ｕ了（に記載したように例えば次のようにして行えば
よい。

先ず、マグロの新鮮な脳下垂体より全ＲＮＡを抽出し、
之をオリゴｄＴセルロース（ｏｌｉｇｏ　ｄＴｃｅｌｌ
ｕｌｏｓｅ）カラムに導通してポリアデニル酸（ポリＡ
）を有するＲＮＡ　（ポリＡ−ＲＮＡ）を調製する。次
にこれを鋳型とし、逆転写酵素によりＲＮΔ−ＤＮＡ二
重鎖を合成する。これを、ＤＮＡ組換え技術を用い、オ
リゴｄＴ付ベクターブライマーｐｓＶ７１８６（ファル
マシア社製）等のプラスミドＤＮＡに挿入してマグロ成
長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミド（例え
ばｐＴＴＳ３３９）を得る。

次いで、このようにして得たマグロ成長ホルモンをコー
ドするＤＮＡを含むプラスミドから該ＤＮＡを切り出し
、これをベクターＤＮＡに組み込み得られた組換え体Ｄ
ＮＡを微生物に導入し、得られる形質転換体を培養する
ことによってマグロ成長ホルモンポリペプチドを培地中
に生成蓄積させ、これを採取することにより、マグロ成
長ホルモンポリペプチドを製造するのである。マグロ成
長ホルモンをコードするＤＮＡを含むプラスミドとして
は、上記したようにｐＴＴＳ３３９が好適な例としてあ
げられる。

ベクターＤＮＡとしては、挿入したＤＮＡを微生物中で
発現させることができるものなら、いかなるものでも用
いることができるが、好ましくは、ｔａｃ（ｔｒｐ−１
ａｃ）、　　ｔｒｐ＋λＰＬ　、ａｒａ、　ｒｅｃＡプ
ロモーターなどをもち、その下流にシャインダルガルノ
（ＳＤ）配列をもつ発現ベクターに、ＳＤ配列と挿入遺
伝子の開始コドン（ＡＴＧ）が６−２０塩基に調整した
ベクターＤＮＡが用いられる。具体的に好適なベクター
ＤＮＡとしてｐＫＫ２２３−３やｐＫＫ２３３−２　（
ファルマシア・ジャパン社製）をあげることができる。

マグロ成長ホルモンをコードするＤＮＡとベクタ−ＤＮ
Ａとの組換え体は一般的な方法である制限酵素やその関
連酵素により作成することができ、例えば、シグナル部
分を除いたマグロ成長ホルモンをコードする遺伝子ＤＮ
Ａを含む組換え体プラスミド（ｐＴＥＳ　８　Ｓ）を作
成する。

次に発現ベクターとしては、ｐＫＫ２２３−３の複製開
始点をｐＵｃ１９に置換させてなるｐｕｇ　１を使用し
、これに上記した成長ホルモンをコードするＤＮＡを含
むｐＴＥＳ　８　Ｓを挿入する。これを更に、非翻訳領
域の除去、末端平滑化した後、結合して、成熟クロマグ
ロ成長ホルモンをコードするプラスミドｐＵＥｓ１３ｓ
を作成する。

これと同様に処理して、マグロ成長ホルモン遺伝子を２
個含むプラスミドｐ［ｌＥｓ１３ｓ−２を作成する。

これらのプラスミドを常法によって大腸菌ＪＭ１０９に
形質転換して形質転換体を作成する。これらのプラスミ
ドｐＵＥｓ１３ｓ、　ｐＵＥｓ１３ｓ−２を含む大腸菌
（それぞれｐＵＥｓ　１３Ｓ／Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
　ｃｏｌｔ　ＪＭ１０９．　ｐＵＥｓ１３Ｓ／Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＪＭ１０９）は、それぞれ
昭和６３年３月２２日、昭和６３年３月１６日付でそれ
ぞれＦＥＲＭ　ＢＰ−１８０７，ＦＥＲＭ　ＢＰ−１７
９９として工業技術院微生物工業技術研究所に国際寄託
し、受託されている。

このようにして得た組換え体プラスミドｐＵＥｓ１３Ｓ
、　ｐＵＥｓ１３ｓ−２を保持するＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭ
１０９を、例えば８％トリプトン、５％イーストエキス
トラクト、５％ＮａＣｌ　（ｐＨ７，２）を含むＹＴ培
地といった適宜培地で、３０分〜１０時間程度誘導培養
すれば、目的とするポリペプチドが産生される。目的と
するポリペプチドが菌体外に産生される場合は直ちに常
法によりポリペプチドを採取することができるが、菌体
内に産生される場合は、集菌した後、菌体を破壊ないし
溶解する必要がある。

本発明においては、上記工程において尿素、塩酸グアニ
ジン処理を行うのであるが、上記したいずれかの工程に
おいて処理すればよく、その回数も問わない。また、尿
素処理と塩酸グアニジン処理は同時に行ってもよいし、
別々に行ってもよく、その際、処理の順序、回数につい
て格別の限定はない。また、上記によって製造されたポ
リペプチド含有液ないしはその濃縮液ないしはそれから
単離されたポリペプチド自体に、尿素、塩酸グアニジン
を添加、混合したりすることも可能である。

また更に、ポリペプチドの分離、精製時、例えばクロマ
トグラフィーにおける展開時、溶出時に尿素、塩酸グア
ニジン処理をしてもよい。これらの処理における尿素及
び塩酸グアニジン溶液の濃度は、それぞれ０．５〜ＩＯ
Ｍ及び０．１〜２０Ｍ程度が好適であるが、必要ある場
合は上記範囲外とすることもできる。

本発明に係る精製・再生法は、上記したＤＮＡ組換え技
術によって製造した魚類の成長ボルモンボリペプチドに
適用できるのみでなく、魚類から抽出法によって製造し
た成長ポルモンポリペプチド、その他すべての魚類の成
長ホルモンポリペプチドに対して広く適用することがで
きる。

抽出法による成長ホルモンポリペプチドの製造例として
は、例えば、魚類の脳下垂体をホモゲナイズした後に、
塩基性水溶液を用いて成長ホルモンを抽出する本発明者
の発明に係る方法（特開昭６３−１３３９５１号）が例
示される。尿素、グアニジン処理は前記したところにし
たがって適宜実施されるが、例えば、上記方法の実施例
Ｉにおける４Ｍ尿素処理の際に塩酸グアニジン処理を併
用してもよい。

以上、主としてマグロを出発原料とした場合について説
明したが、本発明に係る精製、再生法は、マグロのほか
、サバ、マダイ、スズキといったスズキ類、ニシン、ニ
ジマスその他のニシン類、及び中生類その他の硬骨魚類
についてもマグロの場合と全く同様に適用することがで
きる。

このようにして各種魚類より調製した成長ホルモンポリ
ペプチドは、これを魚類に投与すると、魚類の成長が著
しく促進され、顕著な体重増加、体長増加等が認められ
る。投与方法としては、魚体の腹腔その他体内に直接投
与したり、水中に入れておき間接的に投与したり、ある
いは餌料に混合したり、また魚体に直接スプレーしたり
して外部表面に直接適用したりする方法が適宜用いられ
る。その際、本発明に係る成長ボルモンボリペブチドは
、後記する実施例からも明らがなように体重１３〜１７
ｇのマダイ稚魚に対してｊμｇ程度の腹腔内投与量で充
分であり、他の投与方法の場合もこれに準じたごく微量
の投与量で充分である。しかも、本発明に係る成長ホル
モンポリペプチドは、マグロ起源のものであってもスズ
キ、マダイ、ニジマス、ニシン等の成長促進に有効であ
り、またその逆も確認されているところからも、きわめ
て汎用性が高く、ある魚類起源のペプチドは他の魚類の
成長促進に広く利用することができるという著効も奏さ
れる。

このように本発明に係る成長ホルモンポリペプチドは、
本来、天然起源であるので安全であるのみでなく、極く
少量の投与量でよく、しがも他の種類の魚類にも通用す
ることができ、各種の投与方法も広く選択できるので、
栽培漁業、魚類の養殖産業の技術分野において特に好適
である。

以下、本発明を実施例により更に詳細に説明する。

実施例１　（大腸菌で生産したマグロ成長ホルモンの精
製と再生） 発現ベクターはｐＫＫ２２３−３（イソプロピル−β−
Ｄ−チオガラクトシドで発現可能なプラスミド）の複製
開始点をｐＵｃ１９に置換させて用いた。このベクター
に、マグロ成長ホルモン構造遺伝子の５′末端側に開始
コトパン（ＡＴＧ）　？こ付加させ、５Ｄ−ＡＴＧ間の
距離を１３ベースペアにしたプラスミドをタンデムに連
結して挿入した。これらを大腸菌ＪＭ１０９に形質転換
し、５時間誘導培養した。

すなわち、マグロ成長ホルモンｃＤＮＡ保持プラスミド
ｐＵＥｓ１３ｓ−２／Ｊ門１０９を２ＬのＹＴ培地中で
誘導後、集菌洗浄し、菌体を得た。菌体を凍結、解凍を
３回繰り返した後、１０ｍＭ（２４０ｍｇ）　　）リス
塩酸、１　ｍＭ　（９ｍｇ）　ＥＤＴＡ、　ｐＨ８，０
溶液２（１０ｍｊ！で水冷下で５分間超音波処理し、遠
心分離した。得られた沈澱物をｌ　Ｍ　シュツｏ　−ス
（６８ｇ）溶液２（１０ｍＲ。

続いて２％（２ｍｆｉ））ライドンＸ、５　ｍＭ　（２
２ｍｇ）ＥＤＴＡ、１０ｍＭ（１２１ｍｇ）　　トリス
塩酸、ｐＨ９，０溶液１（１０ｍ！で洗浄し、５（１０
ｍｇマグロ成長ホルモン封入体を得た。この封入体を１
０ｍＭ（２４０ｍｇ）　　トリス塩酸、１ｍＭ（４，５
ｍｇ）　Ｆ、ＤＴＡ、　６　Ｍ（１１４ｇ）塩酸グアニ
ジン、ｐｌ＋９．０溶液２（１０ｍ１に溶解させ、４°
Ｃで２日間放置後、５ｍＭの重炭酸アンモニウム（７９
０ｍｇ）　溶液２　Ｌで透析した。その結果、沈澱物が
生じたため遠心分離し、上清を凍結乾燥した。また、沈
澱物を１０ｍＭｔ□リス塩酸（２４Ｄｒｎｇ）　、４　
Ｍ　（４８ｇ）尿素、ｐ）１９．０溶液２（１０滅に溶
解させ、４°Ｃで２日間放置後、５ｍＭの重炭酸アンモ
ニウム（７９０ｍｇ）溶液２して透析後凍結乾燥した。

乾燥物は合計３４０ｍｇであった。

一方、５（１０ｍｇマグロ成長ホルモン封入体を１０ｍ
Ｍトリス塩酸、１ｍＭ　ＥＤＴＡ　、８　Ｍ尿素、ｐＨ
９，０溶液に溶解させ、４°Ｃで２日間放置後、５ｍＭ
の重炭酸アンモニウム溶液で透析した。その結果、得た
上清を凍結乾燥した。乾燥物は１（１０ｍｇであった。

実施例２　（大腸菌で生産したマグロ成長ホルモンの性
質） 実施例１と同様に精製し、再生した成長ホルモンを５Ｄ
Ｓ−ゲル電気泳動では、分子量２２，（１００であった
。等電点は７．１であった。また、０，１％トリフロロ
酢酸に溶解後、ＴＳＫ（Ｈｅｌ　０ＤＳ−１２０Ｔ逆相
カラムの高速液体クロマトグラフィーに添加した。

その結果を第２図に示す。以上の結果、分子量、等重点
、高速液体クロマトグラフでの溶出時間とも天然のマグ
ロ成長ホルモンと一致した。アミノ酸配列分析の結果を
第１図に示した。その結果、天然マグロ成長ホルモンの
アミン末端側に１残基のＡｌａが付加した新規な構造を
有していることがわかった。

実施例３　（スズキ類に対するマグロ成長ホルモン活性
の測定） ふ死後９０日のマダイ　（１３−１７ｇ）の稚魚（１群
１０尾）に個体識別し、それぞれの腹腔内に実施例１と
同様にして単離、再生した成長ホルモンを５ｇｇ（０，
１ｍり／尾、１ｇｇ（０，１ｍβ）７尾、対照区として
０．９％食塩水を０．１　ｍＲ７尾ずつ、それぞれ７目
おきに５回投与した。飼育は水温２２．０−１５．０°
Ｃの条件下で行い、朝夕２回食糧を投餌した。第１回目
の投与から３０日後の体長、体重増加率を第３図に示す
。第３図の結果から、本発明の成長ホルモンがスズキ類
の一部であるマダイの成長を促進することが明らかにな
った。

実施例４　にシン類に対するマグロ成長ホルモン活性の
測定） ふ化後４−７カ月齢のニジマス（６−８ｇ）の稚魚（１
群１０尾）に個体識別し、それぞれの腹腔内に実施例１
と同様にして単離、再生した成長ホルモンを５　μｇ（
０，１ｍＲ）７尾、１　μｇ（０，１ｍｌり／尾、対照
区として０．９％食塩水をＯ，ＩｍＲ／尾ずつ、それぞ
れ７日おきに５回投与した。飼育は水温１６°Ｃの条件
下で行い、朝夕２回食糧を投餌した。第１回目の投与か
ら３０日後の体重増加率を第４図に示す。第４図の結果
から、本発明の成長ホルモンがニシン類の一部であるニ
ジマスの成長を促進することが明らかになった。

〔発明の効果］ １、本発明により、微生物を用いて生産させた及び／又
は抽出した魚類の成長ホルモンポリペプヂトを効率よく
、大量に活性型の分子にすることができる。

２、本発明により、微生物で生産させた及び／又は抽出
した活性型の魚類の成長ホルモンポリペプチドを硬骨魚
類に投与することにより、その成長を促進することがで
きた。

【図面の簡単な説明】

第１図は大腸菌で生産させたマグロ成長ホルモンのアミ
ノ酸配列を示す図である。 第２図は大腸菌で生産させたマグロ成長ホルモンをＯ，
］％トリフロロ酢酸に溶解後、アセトニ１〜リル濃度４
０％から１（１０％の勾配を用いて、ＴＳＭｇｅ１（１
０３−１２０Ｔ逆相カラム（４，６Ｘ　２５０ｍｍ）の
高速液体クロマトグラフィーに添加した図である。流速
は１分間に１　ｍｌ、カラム温度は４０゛Ｃ１吸光度は
２１０％ｍでおこなった。 第３図は大腸菌で生産させたマグロ成長ホルモンのタイ
稚魚に対する成長促進効果を体長および体重の増加割合
（％）で示す図である。 第４図は大腸菌で生産させたマグロ成長ホルモンのニジ
マス稚魚に対する成長促進効果を体長および体重の増加
割合（％）で示す図である。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. （１）第１図に示したペプチド配列を有する魚類の成長
   ホルモンポリペプチド。
2. （２）魚類がスズキ類である請求項１記載の成長ホルモ
   ンポリペプチド。
3. （３）スズキ類がマグロである請求項１又は２記載の成
   長ホルモンポリペプチド。
4. （４）第１図に示したペプチド配列を有する魚類の成長
   ホルモンポリペプチドをコードするＤＮＡを組み込んだ
   組換え体ＤＮＡを含む微生物を栄養培地に培養し、該培
   養物中に魚類の成長ホルモンポリペプチドを蓄積せしめ
   た後、該培養物から塩酸グアニジンおよび尿素を用いて
   該ポリペプチドを採取する魚類の成長ホルモンポリペプ
   チドの精製、再生法。
5. （５）微生物がエシェリヒア属に属する微生物である請
   求項４記載の方法。
6. （６）魚類がスズキ類である請求項４又は５記載の方法
   。
7. （７）スズキ類がマグロである請求項４、５又は６記載
   の方法。
8. （８）請求項１記載の魚類の成長ホルモンポリペプチド
   を魚類に投与してそして成長を促進する方法。
9. （９）魚類がスズキ類である請求項８記載の成長促進方
   法。
10. （１０）スズキ類がマグロである請求項８又は９記載の
    成長促進方法。
11. （１１）魚類の成長ホルモンポリペプチド自体及び／又
    はその製造、精製工程中に、尿素及び塩酸グアニジン処
    理を行うことを特徴とする魚類の成長ホルモンポリペプ
    チドの精製、再生法。