JPH02207788A - ヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチド及びそれをコードするｄｎａ並びにそれらの製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はヒト単球走化性因子活性を有するポリペプチド
をコードするＤＮＡ、及び該ＤＮＡを組み込んだ形質発
現ベクターを用いて製造し得るポリペプチド並びに該Ｄ
ＮＡ及びポリペプチドの製造法等に関する。

単球走化性因子（以下、ＭＣＦと記す）は、例えばヒト
単球系細胞をリポポリサッカライド（ＬＰＳ　）と共に
培養したとき産生誘導される生理活性物質で、単球を動
員する活性や単球の有する腫瘍細胞増殖抑制作用を増強
させる活性化作用を有しており、単球が動員され更に活
性化されることにより、ある種の細菌感染症や癌の治療
薬としての臨床応用が期待される。

本発明者のうち、松島綱治、ジュストオッペンハイム等
はヒト単球系白血病細胞を適当な誘導剤の存在下で培養
し、その培養上清中より、いわゆる天然型ヒトＭＣＦを
単離した。そして、その天然型ヒトＭＣＦを解析し、そ
の部分アミノ酸配列を解明すると共に、その分子量は約
１５ｋＤａと決定した。

本発明者等は、この天然型ヒトＭＣＦの部分アミノ酸配
列に基づいて、ヒトＭＣＦをコードするｃＤＮＡの単離
に成功し、このクローン化ｃＤＮＡの塩基配列の解析に
より、ヒトＭＣＦ前駆体の全アミノ酸配列を解明し、そ
のＣ末端側の７６残基のアミノ酸からなるヒトＭＣＦの
分子量は、約９ｋＤａと計算される低分子量のポリペプ
チドであることを明らかにした。

更に、このクローン化ＤＮＡ及びその主要部を組み込ん
だ形質発現ベクターを作製し、゛これを用いて、ヒトＭ
ＣＦ活性を有するポリペプチドを製造することができる
ことが判明し、本発明を完成した。

本発明の第１の目的は、ヒトＭＣＦ活性を有し、下記の
アミノ酸配列［１１又はその主要部の配列を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ及びその製法を提供するこ
とにある。

Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｉｌｅ　Ａｓｎ　Ａ
ｌａ　Ｐｒｏ　Ｖａｌ　ＴｈｒＣｙａ　Ｃｙｓ　Ｔｙｒ
　Ａｓｎ　Ｐｈｅ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ａｒｇ　Ｌｙｓ　
ｌ１ｅＳｅｒ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　ＡｒｇＬｅｕ　Ａｌａ
　Ｓｅｒ　Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ａｒｇｌｌｅ　Ｔｈｒ　Ｓ
ｅｒ　Ｓｅｒ　Ｌｙｓ　Ｃｙｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌ
ｕ　ＡｌａＶａｌ　Ｉｌｅ　Ｐｈｅ　Ｌｙｓ　Ｔｈｒ　
Ｉｌｅ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ｌｙｓ　ＧｌｕＩＩｓ　Ｃｙ
ｓ　　Ｘ　　Ａｓｐ　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　Ｇｌｎ　Ｌｙ
ｓ　　Ｔｒｐ　ＶａｌＧｉｎ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｍｅｔ
　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｌｅｕ　Ａｓｐ　Ｌｙｓ　ＧｌｎＴ
ｈｒ　　Ｇｌｎ　Ｔｈｒ　　Ｐｒｏ　　Ｌｙｓ　　Ｔｈ
ｒ［１］ （但し、式［１］中Ｘは、Ａｌａ又はＴｈｒである。） 本発明の第２の目的は、上記ＤＮＡを組み込んだ形質発
現ベクターを用いて製造し得る上記式［１］で示される
アミノ酸配列又はその主要部の配列を有し、ヒトＭＣＦ
活性を有するポリペプチドを提供することにある。

本発明の第３の目的は、上記ポリペプチドの遺伝子工学
的手法による製造法を提供することにある。

本発明の他の目的は、以下の記載から明らかになるであ
ろう。

本発明によれば、ヒトＭＣＦ活性を有し、式［！］で示
されるアミノ酸配列又はその主要部の配列を有するポリ
ペプチドをコードするＤＮＡ　（以下単に本発明のＤＮ
Ａと記す）を用い、遺伝子組み換え技術を応用して、ヒ
トＭＣＦの活性を有し、式［夏コで示されるアミノ酸配
列又はその主要部の配列を有するポリペプチド（以下単
に本発明のポリペプチドと記す）を製造することができ
る。

本発明のＤＮＡのうち、式［１１で示されるアミノ酸配
列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ（以下ヒト
ＭＣＦをコードするＤＮＡと略記することもある）の具
体的塩基配列としては、下記の式［Ａ］で示される塩基
配列からなるＤＮＡが挙げられる。

［Ａ］ （但し、式［Ａ］中Ｙは、Ｃ又はＴであり、Ｒは、Ｇ又
はＡである。） ヒトＭＣＦをコードするＤＮＡは、実施例１に記載の方
法又はそれに準じた方法に従って単離することが出来る
。更に、化学的に全合成してもよい、ヒトＭＣＦの主要
部のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡは、ヒトＭＣＦをコードするＤＮＡの余分な領域又
は欠損している領域を、例えば適当な制限酵素による切
断及び／スは化学合成オリゴデオキシリボヌクレオチド
の結合による修復や部位特異的変異誘導法（Ｋｕｎｋｅ
　ｌ　、　Ｔ、　Ａ、ら。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌ、、　１５４巻
、　’３６７頁、　１９８７年等）等の方法により製造
することができる。

本発明のポリペプチド生産用の形質発現ベクターは、遺
伝子組み換え技術及び形質発現に関する基本的理論（例
えば１Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、ら、　Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒＣｌｏｎｌｎｇ、　ａ　１ａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａ
ｎｕａｌ；　　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ出版、　１９８２年を参照）に則
り、本発明のＤＮＡの５′末端（上流側）に翻訳開始コ
ドンＡＴＧを、かつ３°末端（下流側）には終止コドン
を有するＤＮＡ断片を作製し、これを適当なプロモータ
ー（例えばｍ、ｌａｃ、白Ｓ、　ＰＬ、　ＳＶ４０初期
プロモーター等）及びＳＤ配列に続いて結合させ、更に
これを宿主中で増殖可能な適当なベクター（例えばプラ
スミドＰＢＲ３２２等）に組み込むことにより作製する
ことができる。

好ましいＳＤ配列から翻訳開始コドンまでの塩基配列と
しては、下記式［Ｂ］で示される塩基配列が挙げられる
。

５’−Ｘ’ＧＧＡＧＧＴＴＴＹ’ＡＴＴ−３’　　　［
Ｂ］但し、式［Ｂ］中、ｘ’は（Ａ）ｘを意味し、Ｘは
１〜５である。Ｙ”は（Ａ　）　ｙ　（Ｔ　）　ｚを意
味し、ｙはＯ〜３を、２は０又は１である。

この形質発現ベクターを適当な宿主、例えば大腸菌にコ
ーエンらの方法（Ｃｏｈｅｎ、　Ｓ、　Ｎ、ら＊　Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃ１．、　（ＪＳＡ、　　６９
巻、　２１１０頁、　　１９７２年）に準じて導入する
ことにより形質転換体を得ることができる。

本発明のポリペプチドは、この形質転換体の培養、該形
質発現ベクターを用いた転写・翻訳系により製造するこ
とができる０本発明のポリペプチドは、粗製物から除核
酸処理、塩析、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イ
オン交換クロマトグラフィー、限外濾過、ゲル濾過操作
、必要に応じて透析、電気泳動、ヘパリン・担体カラム
を用いるクロマトグラフィー、抗体カラムを用いるアフ
ィニティー　りロマトグラフィー等の方法及びその組み
合せにより精製できる。

遺伝子組み換え技術により製造されるポリペプチドのＮ
末端には、製造系等の違いによって翻訳開始コドンに由
来するメチオニン残基が付加される場合がある。このよ
うなポリペプチドも、ヒトＭＣＦ活性を有する限り、本
発明のポリペプチドに含まれる。

本発明に係わるポリペプチドとは、前記式［１Ｆで示さ
れるアミノ酸配列を有するポリペプチド又はそのアミノ
酸配列の主要部の配列を含むポリペプチドであり、なん
らかのＭＣＦ活性、例えば単球を動員する作用或いは単
球の有する腫瘍細胞増殖抑制作用を増強させる活性化作
用を示すポリペプチドを意味する。又、ヒトＭＣＦをコ
ードするＤＮＡの対立遺伝子変異体ＤＮＡがコードする
ポリペプチド及びその主要部のアミノ酸配列を有するポ
リペプチドも包含される。又、前記式［ｚｌで示される
アミノ酸配列を有するポリペプチドのＮ末端に他のアミ
ノ酸又はペプチド、例えばヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチ
ドの前駆部分のＣ末端側の一部に相当するアミノ酸又は
ペプチドが付加したポリペプチドも、本発明のポリペプ
チドに包含される。

遺伝子組み換え技術の応用により製造される本発明のポ
リペプチドの諸性状については、以下の方法により分析
できる。

分子量は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法
により、分子量既知蛋白標準品（ファルマシア社、スウ
ェーデン）の移動度との対比により算出する。アミノ酸
配列は、エドマン分解法により決定できる。即ち、本発
明のポリペプチドを、フルマーの方法（Ｆｕｌｌｍａｒ
、Ｃ，Ｓ、、　Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、。

１４２巻、３３６頁、　１９８４年）に従って、尿素存
在下での２−メルカプトエタノール処理にて分子内のジ
スルフィド結合を開裂させ、Ｃｙｓ残基を４−ビニルピ
リジン処理にて、ピリジルエチル化ポリペプチドを調製
する。更に、ピリジルエチル化ポリペプチドをメタロエ
ンドペプチダーゼ（ＥＣ３，４，２４）等にて消化し、
得られたペプチド断片をシンクロパック（５ｙｎＣｈｒ
ｏｐａｋ　）　　ＲＰ−Ｐカラム（ジンクロム社、米国
）を用い、トリフルオロ酢酸中、アセトニトリルの濃度
勾配溶出による高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ
）にて単離する。このピリジルエチル化ポリペプチド及
び各ペプチド断片のＮ末端部分のアミノ酸配列をプロテ
インシークエンサー自動分析装置（アプライドバイオシ
ステム社、米国）を用いて解析する。

単球走化性活性は、ボイデン走化性活性検定槽（Ｂｏｙ
ｄｅｎ　ｃｈｅｍｏｔａｘｌｓ　ｃｈａｍｂｓｒ：ニュ
ーロ９プローブ社、米国）を用いて検定できる。即ち、
ポリカーボネート腹（孔径８μｍ：ヌクレオボア社、米
国）で隔てた一方の室に本発明のポリペプチド液を入れ
、他室にヒト単核球を入れる。３７℃にて加温の後、膜
の検体液室側の面に移動した細胞数を、メタノール固定
及びギムザ染色の後、顕微鏡下にて計測する０本発明の
ポリペプチドの希釈及び培養用培地には、０．５Ｘウシ
血清アルブミン含有培養培地ＲＰＭＩ−１６４０培地を
用いればよい。

腫瘍細胞増殖抑制活性は、次ぎの方法にて検定できる。

即ち、ヒト単球や単球／マクロファージ様細胞を９６穴
培養プレートに播き、３７℃で培養後、浮遊性細胞を除
去し、プレート粘着性細胞を準備する。この粘着性細胞
に本発明のポリペプチド液及び標的腫瘍細胞（例えば、
ヒト悪性黒色腫細胞Ａ３７５細胞：　ＡＴＣＣ株番号Ｃ
ＲＬ−１６１９）を添加し、３７℃にて３日問培養する
。培養終了の６〜２４時間前に、トリチウム標識チミジ
ンを添加し、標的腫瘍細胞内への取り込み量の低下によ
り評価する１本発明のポリペプチドの希釈及び培養用培
地には、５％ウシ胎児血清含有ＲＰＭＩ−１６４０培地
を用いればよい。

本発明のポリペプチドの製剤化に際しては、賦形剤や安
定化剤を添加するのが好ましい、安定化剤としては、例
えばアルブミン、グロブリン、ゼラチン、プロタミン、
プロタミン塩、グルコース、ガラクトース、キシロース
、マンニトール、グルクロン酸、トレハロース、デキス
トラン、ヒドロキシエチルデンプン、非イオン界面活性
剤等が挙げられる。

尚、本明細書では記載の簡略化のために以下の略号を使
用する。

Ａ　　　　　　　アデニン Ｃシトシン Ｇ　　　　　　　グアニン Ｔ　　　　　　チミン ＲＮＡ　　　　　　リボ核酸 ｍＲＮＡ　　　　　伝令ＲＮＡ ＤＮＡ　　　　　　デオキシリボ核酸 ｃＤＮＡ　　　　　相補性ＤＮＡ ５ｓｃＤＮＡ　　　単鎖ｃＤＮＡ ｄｓｃＤＮＡ　　　二重鎖ｃ　ＤＮＡ ＡＴＰ　　　　　　アデノシン三リン酸ｄＡＴＰ　　　
　　デオキシアデノシン三リン酸ｄＣＴＰ　　　　　デ
オキシシチジン三リン酸ｄＧＴＰ　　　　　デオキシグ
アノシン三リン酸ｄＴＴＰ　　　　　デオキシチミジン
三すン酸ＳＤ配列　　　　シャイン・ダルガーノ配列キ
ロ塩基 キロ塩基対 塩基対 リポポリサッカライド エチレンジアミン四酢酸 ジチオスレイトール キロダルトン ラウリル硫酸ナトリウム ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパン スルホン酸 以下に実施例及び参考例を挙げて本発明を更に具体的に
説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるもの
ではない。

実施例１ ヒ　ＭＣＦ　　コー　　　ＤＮＡの ヒト前骨髄性白血病細抱株ＨＬ−６０細胞（ＡＴＣＣ株
番号ＣＣＬ−２４０）を組織培養用シャーレ（９０ｘ１
６ｍｍ　）に、培養液１ｍｌあたり約百万個の細胞密度
で播いた。培養液には、１０％ウシ胎児血清含有ＲＰＭ
Ｉ−１６４０培地を用い、ホルボール−１２−ミリステ
ート−１３−アｂ ｂｐ Ｐ ＬＰＳ ＥＤＴＡ ＴＴ Ｄａ ＤＳ ＯＰＳ セテート（ＰＭＡ）及びビタミンＡ酸を、それぞれ最終
濃度として５００ｎｇ／ｍｌ及び１μｇ／ｍｌになるよ
うに添加した。この培養液中で、３７℃、５Ｘ炭酸ガス
含有空気中、湿度９０〜１００％にて、２日間培養した
。

培養終了後、培養液及び非付着性細胞を吸引除去した。

シャーレに付着した分化細胞を、ＬＰＳ及びシクロヘキ
シミドを、それぞれ最終濃度として１０μｇ／ｍｌ及び
１μｇ／ｍｌになるように添加した１０％ウシ胎児血清
含有ＲＰＭＩ−１６４０培地中で、上記と同条件下で、
更に６時間培養した。培養終了後、培養液を吸引除去し
、シャーレ上に残った細胞を、０．５％ラウロイルサル
コシン酸ナトリウム、５ｍＭクエン酸ナトリウム及び０
．１Ｍ２−メルカプトエタノールを含む６Ｍグアニジル
チオシアネート液にて溶解し、均質化した。この液をＯ
，ＩＭ　ＥＤＴＡを含む５．７Ｍ塩化セシウム水溶液上
に重層し、超遠心分離機（日立工機、ＲＰ２）−２０−
ター）にて２６．５００ｒｐｍで２０時間遠心分離する
ことにより、全ＲＮＡをベレットとして得た。この全Ｒ
ＮＡベレットを、０．３５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭ
）リス及び２０ｍＭ　ＥＤＴＡを含む７Ｍ尿素液の少量
に溶解し、エタノールを添加し沈澱として回収した。

この全ＲＮＡを、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含む１０ｍＭ）リ
ス塩酸・緩衝液（ｐＨ７，４）に溶解し、６５℃で５分
間加熱した。これに塩化ナトリウムを最終濃度として０
．５Ｍになるように添加したのち、予め１ｍＭ　ＥＤＴ
Ａ及び０．５Ｍ塩化ナトリウムを含む１０ｍＭ）リス塩
酸＊Ｗ液（ｐＨ７，４）にて平衡化したオリゴ（ｄＴ）
セルロースカラムに負荷し、同カラムに吸着したｍＲＮ
Ａを、１ｍＭ　ＥＤＴＡを含むｌｏｍＭ）リス塩酸緩衝
液（ｐＨ７，４）にて溶出することにより単離した。

上記で得られたｍＲＮＡを鋳型として、グブラーとホフ
マンの方法（Ｇａｍｅ、　２５巻、２６３頁、　１９８
３年）に準じてｃＤＮＡを合成した。即ち、ｍＲＮＡの
約６μｇを蒸留水に溶解（６μｇ／６μｌ）　Ｌ、これ
に０．６μｍの１００ｍＭ水酸化メチル水銀水溶液を添
加し、室温で１０分間放置した０次いで、約２０単位の
ＲＮＡ分解酵素阻害剤（ＲＮａｓｉｎ、プロメガバイオ
チク社、米国）を含む０．５Ｍ２−メルカプトエタノー
ル液の１．８μｌを添加した。室温で５分間放置の後、
１０ｍＭ塩化マグネシウム、１．２５ｍＭ　ｄＧＴＰ、
１．２５ｍＭ　ｄＡＴＰ、１．２５ｍＭ　ｄＴＴＰ、０
．５ｍＭ　ｄＣＴＰ、０．１７μＭ　　ａ−３２Ｐ−ｄ
ＣＴＰ（放射比活性６，０ＯＯＣＩ／ｍｍｏｌｅ）　、
４μｇのオリゴ（ｄＴ）　１２〜１８，１２０単位のト
リ骨髄性白血病ウィルス由、来逆転写酵素（バイオ・ラ
ット社、米国）を含む３２μｍの５０ｍＭ　）リス塩酸
緩衝液（ｐＨ８，３）を添加し、４２℃で６０分間反応
させた後、０．５Ｍ　ＥＤＴＡ液の２μｌを添加して反
応を停止させた。この反応液に、フェノール／クロロホ
ルム混液（１：１）を添加し、反応生成物（ｓｓｃＤＮ
ＡとｍＲＮＡの複合体）を、水層に抽出した。その水層
に酢酸アンモニウムを最終濃度として２．５Ｍになるよ
うに添加し、更にエタノールを加えることにより、上記
複合体を沈澱として回収した。

この反応生成物（ｓｓｃＤＮＡとｍＲＮＡの複合体）を
、二次合成緩衝液［組成：　５ｍＭ塩化マグネシウム、
１０ｍＭ　ＩＥ酸アンモニウム、１００ｍＭ塩化カリウ
ム、０、１５ｍＭβ−ニコチンアミドアデニンジヌクレ
オチド、４０μＭ　ｄＧＴＰ１４０μＭ　ｄＡＴＰ、　
　４０μＭ　ｄＴＴＰ、　　４０μＭ　ｄＣＴＰ、　５
μｇのウシ血清アルブミン、１．２５単位の大腸菌リボ
ヌクレアーゼＨ１２４単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ
！を含む２０ｍＭ　）リス塩酸ＭＩｆｌＩＩ液（ｐＨ７
，５＞　１の１００μｌに溶解した。これを１２℃で６
０分間反応させた後、２．５単位の大腸菌ＤＮＡリガー
ゼを添加し、更に２２℃で６０分間反応させた。　ＥＤ
ＴＡを添加することにより、反応を停止させた０反応生
成物（ｄｓｃＤＮＡ　）は、フェノール／クロロホルム
混液（１：１）による抽出及びエタノール処理により、
沈澱として回収した。

この反応生成物（ｄｓｃＤＮＡ）を、オリゴ（ｄＣ）鎖
付加Ｍ衝液［組成：　２ｍＭ塩化コバルト、０．２ｍＭ
　ＤＴＴ、０、１ｍＭ　ｄＣＴＰ及び１０単位のターミ
ナルデオキシヌクレオチジル　トランスフェラーゼを含
有する１００ｍＭカコジル酸ナトリウムＣＰＨ７，２）
　］の１００μｍに溶解し、３７℃で３０分間反応させ
ることにより、ｄｓｃＤＮＡの３′末端にオリゴ（ｄＣ
）　Ｍを付加させた０反応生成物［オリゴ（ｄＣ）ＷＩ
付加ｄｓｃＤＮＡ　］は、フェノール／クロロホルム混
液（１：１）による抽出及びエタノール処理により、沈
澱として回収した。

上記のオリゴ（ｄＯ鎖付加ｄｓｃＤＮＡを、オリゴ（ｄ
Ｇ）鎖付加ｐＢＲ３２２，ＰｓｔＩ−ｃｕｔ　（ベセス
ダリサーチラボラトリーズ、米国）とともに、アニーリ
ング緩衝液［組成：　１ｍＭ　ＥＤＴＡ及び１００ｍＭ
塩化ナトリウムを含む１０ｍＭトリス塩酸ＭＷＩ液（ｐ
Ｈ７，４）　］中に溶解混合し、６５℃で１０分間、５
７℃で２時間、更に４５℃で２時間反応させることによ
り、オリゴ（ｄＣ）　ｌとオリゴ（ｄＧ）鎖を結合させ
、環状二重鎖の組み換えプラスミドを調製した。

上記の組み換えプラスミドを、次の方法に従って大腸菌
）（８１０１株に導入しヒトｃＤＮＡライブラリーを作
製した。即ち、大腸菌ＨＢＩＯＩ株をＬ培地［組成：Ｉ
Ｘトリプトン、０．５％酵母エキス、０．５％塩化ナト
リウム、０．１％ブドウ糖（ｐＨ７，２）　］に接種し
、濁度（波長６００ｎｍの吸光度）が約０．５に達する
まで、３０℃で培養した。この培養菌体液を氷水中で３
０分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採取した。

この菌体を５０ｍＭ塩化カルシウム液中に再懸濁させ、
氷水中で６０分間静置したのち、遠心分離にて菌体を採
取し、これを２０％グリセリンを含む５０ｍＭ塩化カル
シウム液中に懸濁させた。この菌体液に上記の組み換え
プラスミド溶液を添加混合し、氷水中で２０分間、室温
で１０分間反応させたのち、Ｌ培地を添加して３７℃で
６０分間振盪培養した。その菌体液の一定量を、６．２
５μｇ／ｍｌ濃度のテトラサイクリンを含むし培地寒天
平板（寒天濃度１．５％）に播き、３７℃で一夜培養し
、テトラサイクリン耐性クローンを選択して、ヒトｃＤ
ＮＡライブラリーとした。

このヒトｃ　ＤＮＡライブラリーから、ヒトＭＣＦをコ
ードするｃＤＮＡを、下記の化学合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドをプローブとして用い、ハナハンとメセ
ルソンの方法（Ｇｅｎｅ、　１０巻、６３頁、　１９８
０年）に準じたコロニー・ハイブリダイゼーション法に
より選択した。

即ち、ヒト培養細胞株ＴＨＰ−１細胞から単離された、
いわゆる天然型ヒトＭＣＦの部分アミノ酸配列、Ｍｅ　
ｔ−Ａｓ　ｐ　−Ｈ１５−Ｌｅｕ−Ａｓ　ｐ−Ｌｙｓ−
Ｇｌ　ｎ−Ｔｈ　ｒ−Ｇｉｎ−Ｔｈ　ｒ−Ｐｒｏ　−Ｌ
ｙｓ−Ｔｈｒ、に基づいて下記式［１］　〜［４］で示
される４Ｍ類のオリゴデオキシリボヌクレオチドを化学
合成し、プローブとして用いた。

５’　−ＡＴＧＧＡＹＣＡＹＴＴＲＧＡ−３’　　　［
１］５’−ＡＴＧＧＡＹＣＡＹＣＴＮＧＡ−３°　　　
　［２］５’−ＧＡＹＡＡＲＣＡＲＡＣＹＣＡ−３″　
　　　［３コ５′−ＧＡＹＡＡＲＣＡＲＡＣＲＣＡ−３
′　　　　［４］但し、上記式中、ＹはＴ及びＣを意味
し、ＲはＡ及びＧを意味し、ＮはＴ、　Ｃ，Ａ及びＧを
意味する。従って、式［１］で示されるプローブは、８
種類のＤＮＡ（１４−ｍａｒ）の混合物であり、式［２
］〜［４〕で示されるプローブは、いずれも１６種類の
ＤＮＡ　（１４−ｍａｒ　）の混合物である。

上記式［１］〜［４］のそれぞれの合成プローブ（１０
０ｐ１００ｐ　）について、γ−３２Ｐ−ＡＴＰ　（５
０ｐｍｏ　ｌｅ相当量：比活性５．０００Ｃ１／ｍｍｏ
ｌｅ　）及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０単位
）を用いる基本反応条件下で、３２ｐにて末端標識をし
た。

ヒトｃＤＮＡライブラリーの中から、式［１］と［２］
のプローブを混ぜたもの又は、式［３］と［４］のプロ
ーブを混ぜたものの２種類の混合７０−ブのいずれのプ
ローブとも結合する塩基配列を含むクローンを検索しな
、コロニー・ハイブリダイゼーションの条件は、３６℃
で４０時間とした。その結果、約３，６万クローンの中
から、３５クローンが選択された。これら−次選択され
たクローンから単離したｃＤＮＡについて、各種制限酵
素を用いた制限酵素地図解析を行い、いずれも共通の塩
基配列を含むものであることを確認した。

最終的に選択した３種類の組み換えプラスミド（プラス
ミド番号：　ｐＨＭｃＦ７、ｐＨＭｃＦ２５及びＰ）１
ＭＣＦ２９　）について、その塩基配列をジデオキシ法
にて決定した。　ｐＵｃ１８及びＰｔｊＣ１９をクロー
ニングベクターとし、ＴａＫａＲａフーＤＥＡＺＡシー
クエンスキッ゛ト（宝酒造）を用い、操作手順書（宝酒
造編）に従って実施した。

ヒトＭＣＦ前駆体をコードする塩基配列及び塩基配列か
ら演絆されるアミノ酸配列を、第１表にまとめて示す、
　ｐＨＭＣＦ７及びＰＨＭＣＦ２９に組み込まれたヒト
ＭＣＦ前駆体をコードする塩基配列は、第１表に示した
配列中、塩基番号１０５及び２２６番目の塩基が、それ
ぞれＴ及びＧであった。一方、ｐＨＭＣＦ２５に組み込
まれたヒトＭＣＦ前駆体をコードする塩基配列中、塩基
番号１０５及び２２６番目の塩基は、それぞれＣ及びＡ
であった。

第１表 ＧｌｙＬｓ＋ｕＡ１ａＧ１ｎＰｒｏＡｓｐＡ１ａｌｌａ
ＡｓｎＡ１ａ　　（３０）ＣＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣＴ
ＧＹＴＡＴＡＡＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴ　　１２０Ｐｒｏ
ＶａｌＴｈｒＣｙｓＣｙｓＴｙｒＡｓｎＰｈｅＴｈｒＡ
ｓｎ　　（４０）ＴｙｒＡｒｇＡｒｇＩｌｅＴｈｒＳｅ
ｒＳｅｒＬｙｓＣｙｓＰｒｏ　　（６０）第１表中、数
字は塩基番号を示す、括弧内の数字はアミノ酸番号を示
す、＊＊＊は、翻訳終止コドンを意味する。塩基番号１
〜２９７番目迄の塩基配列は、ヒトＭＣＦＩｔｉｎ体を
コードする塩基配列、塩基番号７０〜２９７番目迄の塩
基配列（式［Ａ］で示される塩基配列に相当）は、ヒト
ＭＣＦをコードする塩基配列である。塩基番号１０５番
目のＹは、Ｃ又はＴである。塩基番号２２６番目のＲは
、Ｇ又はＡである。

アミノ酸番号１〜９９番目迄のアミノ酸配列は、ヒ）　
ＭＣＦ前駆体のアミノ・酸配列（式［Ｉ［］で示される
アミノ酸配列に相当）、アミノ酸番号２４〜９９番目迄
のアミノ酸配列（式［Ｉ］で示されるアミノ酸配列に相
当）は、ヒトＭＣＦのアミノ酸配列である。アミノ酸番
号７６番目のアミノ酸（Ｘ）は、Ａｌａ又はＴｈｒであ
る。

実施例２ ヒ　ＭＣＦ　　ｌベプ　　の （１）形質発現プラスミ・ドＰＨＭＣＯ７６の構築第１
表に示すヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの第２４〜９９
番目のアミノ酸配列、即ち式［１１で示されるアミノ酸
配列（但し、式［１１中、ＸはＡｌａである）を有する
ポリペプチドを生産するための形質発現プラスミドを、
以下の方法で構築した。即ち、実施例１に記載のプラス
ミドｐＨＭｃＦ７から制限酵素ＰｓｔＩによる消化にて
、第１表に示すヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの全領域
をコードする塩基配列を含む大きなりＮＡ断片を単離し
た。このＤＮＡ断片をＭ１３ｍｐ１Ｂファージベクター
（宝酒造）のポリリンカー領域にある制限酵素ＰｓｔＩ
の切断部位の領域に挿入した。この組み換えファージＤ
ＮＡを用い、クンクルらの方法（Ｋｕｎｋａ　１　、　
Ｔ、　Ａ、ら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｌｎＥｎｚｙｍｏｌ
、、　１５４巻、３６７頁、　１９８７年）に準じた部
位特異的変異誘導法により、ヒトＭＣＦ前駆体ポリペプ
チドのＮ末端から第２３番目のＡｌａと第２４番目のＧ
ｉｎをコードするコドンの間に ５’　−ＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧ−３’の塩基配列を、
更に該前駆体ポリペプチドのＣ末端アミノ酸であるＴｈ
ｒに続く翻訳終止コドン（ＴＧＡ）と３°非翻訳領域の
塩基配列との間に Ｓ’　−ＴＧＡＣＴＣＧＡＧ−３’ の塩基配列を挿入した０部位特異的変異誘導には、ＭＵ
ＴＡ−ＧＥＮＥインビトロムタジェネシスキット（バイ
オ・ラット社）を用い、操作手順書（バイオ・ラッド社
編）に従って行った。即ち、上記の組み換えファージＤ
ＮＡを大腸菌ＪＭ１０５株に感染させ、これを培養して
ファージを採取した０次いで、このファージを大腸菌Ｃ
Ｊ２３６株に感染させるとともに、ウリジン（１μｇ／
ｍｌ　）及びクロラムフェニコール（２０）ｔ　ｇ／ｌ
ｅｌ　）を含有する２ｘＴＹ培地［組成：１．６Ｘ）−
リプトン、１％酵母エキス、０．５％塩化ナトリウム］
中、３７℃で５時間培養し、その培養上清からウラシル
が導入された単鎖ファージＤＮＡを単離した。

別途、下記式［５］及び［６］で示される塩基配列を有
する２種類の変異誘導プライマーを常法に従って化学合
成した。

５　’　＜ＡＡＧＧＧＣＴＣＧＣＴＴＴＴＡＡＡＴＴＡ
ＴＧＣＡＧＣＣＡＧＡＴＧＣ−３’［５］ ５　’　−ＣＣＧＡＡＧＡＣＴＴＧＡＴＧＡＣＴＣＧＡ
ＧＡＣＡＣＴＣＡＣＴＣＣＡＣ−３’［６］ この変異誘導プライマーの５°末端にリン酸基を付加し
、このリン酸化プライマーを先に調製したウラシルが導
入された単鎖ファージＤＮＡとアニル緩衝液［組成：　
２ｍＭ塩化マグネシウム及び５０ｍＭ塩化ナトリウムを
含む２０ｍＭ　トリス塩酸Ｗ街液（ｐＨ７，４）］中、
７０℃で１０分間反応させのち、１分間に１℃の割合で
３０℃まで徐々に冷却することにより、変異誘導プライ
マーをファージＤＮＡに結合させた。

次いで、合成ｌＩ衝液丁組成：各０．４ｍＭのデオキシ
ヌクレオシド三リン酸（ｄＧＴＰ、　ｄＣＴＰ、　ｄＡ
ＴＰ、　ｄＴＴＰ）、０．７５　　ｍＭ　ＡＴＰ、３．
７５ｍＭ塩化マグネシウム及び１、５ｍＭ　ＤＴＴを含
む１０ｍＭ）リス塩酸緩衝液（ｐＨ７，４）］中、水中
に５分間、２５℃で５分間及び３７℃で９０分間の反応
条件下で、Ｔ４　ＤＮＡポリメラーゼを作用させ鋳型の
ファージＤＮＡに対して相補的なりＮＡを合成し、その
末端をＴ４　ＤＮＡリガーゼにて結合させ、反応を一２
０℃での凍結にて停止させることにより、環状二重鎖Ｄ
ＮＡを作製した。これを大腸菌ＪＭ１０５株に感染させ
、その各クローンについてそれぞれ培養し、培養菌体か
ら変異型複製型二重鎖ＤＮＡを単離した。単離した変異
型複製型二重鎖ＤＮＡの塩基配列が意図した塩基配列に
変換されていることを、上記の培養上清から単離した単
鎖ＤＮＡを用いた塩基配列の解析（ジデオキシ法）によ
り確認した。

次いで、変異型複製型二重鎖ＤＮＡから制限酵素Ｄｒａ
　ＩとＸｈｏＩによる消化にて、ヒトＭＣＦポリペプチ
ドをコードする領域を含むＤＮＡ断片を切り出した。

このＤＮＡ断片を、ＭＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片
という。

別途、参考例１に記載の形質発現ベクターｐＥＰ２０５
から制限酵素ＤｒａｌとＸｈｏＩを用いて、アンピシリ
ン耐性遺伝子及び複製開始点を含む大きなりＮＡ断片（
この断片を、ＥＰ２０５　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片と
いう）を切り出し、これを上記のＭＣＦ　（ＤｒａＩ−
Ｘｈｏ　Ｉ）断片と７４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合
させることにより、ヒトＭＣＦ生産用形質発現プラスミ
ドｐＨＭｃ０７６を構築した。

形質発現プラスミドｐＨＭｃ０７６を、実施例１に記載
の方法に準じて、大腸菌ＨＢ　１０１株に導入した。

該プラスミドが導入された形質転換体を、２５μｇ／ｍ
ｌ濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地寒天平板（寒天濃
度１．５％）で、３７℃にて一夜培養し、アンピシリン
耐性クローンを選択することにより得た。

このアンピシリン耐性クローン、即ち形質転換体を大腸
菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨＭｃＯ７６と名付けた。

（２）ヒトＭＣＦポリペプチドの製造 上記で得た形質転換体く大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨＭｃＯ
７６）を培養し、常法に従って形質発現プラスミドＰＨ
ＭＣＯ７６を抽出し、塩化セシウム・エチジウムプロミ
ド超遠心分離法にて精製した（Ｍａｎｉａｔｉｓ、Ｔ、
ら。

Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｌｎｇ、　ａ　１ａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ；　、７５〜９６頁、　Ｃ
ｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ出版。

１９８２年）、上記の形質発現プラスミドＤＮＡを用い
、原核細胞由来ＤＮＡ翻訳キット（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔ
ｌｃ　ＤＮＡ−Ｄｌｒｅｃｔｅｄ　Ｔｒａｎｓｌａｔｉ
ｏｎ　Ｋｌｔ、商品コード番号Ｎ、　３８０、アマジャ
ム社）にて、ヒトＭＣＦポリペプチドを生産した。形質
発現プラスミド及び上記の翻訳キットを用いたポリペプ
チドの生産は、該キットに添付の操作手順書に従い、必
要に応じて、リボヌクレアーゼ阻害剤（ヒト胎盤由来：
アマジャム社）を添加した。

このヒトＭＣＦポリペプチドがヒト単球に対する走化性
活性を有することを、前記の方法に従って確認した。

ヒトＭＣＦポリペプチドは、次ぎの方法により精製され
る。即ち、硫酸アンモニウムを７０％飽和になるように
添加し、静置ののち遠心分離により沈澱を採取する。こ
の沈澱を蒸留水に溶解させ、５ｍＭリン酸塩＆！衝化生
理食塩液（ｐＨ６，５）に対して透析したのちセファク
リルＳ−２００カラム（ファルマシア社）を用いるゲル
ー過に付し、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
分析にて、ヒトＭＣＦポリペプチドを含む両分を集める
。これを、２０ｍＭリン酸塩＊＊液（ＰＨ６，５）に対
して透析し、同緩衝液にて平衡化したＣＭ−セファロー
ス（ファルマシア社）に負荷し、同カラムに吸着したヒ
トＭＣＦポリペプチドを、塩化ナトリウムの濃度勾配（
０〜０．５Ｍ）にて溶出する。ヒトＭＣＦポリペプチド
の溶出画分を気め限外濾過にて濃縮したのち、トヨパー
ルＨＷ−５５（東ソー）を用いるゲル濾過により精製す
ることにより、ヒトＭＣＦポリペプチドの精製品を得る
ことができる。

ヒトＭＣＦポリペプチドの分子量は、５ＤＳ−ポリアク
リルアミドゲル電気泳動法により、約１３±１ｋＤａと
求められた。

実施例３ ヒトＭＣＦ　　　　　　るボｉペプ　ドの（１）形質発
現プラスミドの構築 第１Ｉ！に示すヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドのアミノ
酸配列（但し、第１表中のＸはＡｌａである）のＮ末端
から第２７又は３０番目のアミノ酸をＮ末端とするヒト
ＭＣＦ活性を有するポリペプチド、即ち実施例２に記載
のヒトＭＣＦポリペプチドのＮ末端部分が欠失した種々
のポリペプチド生産用の形質発現プラスミドを構築した
。

即ち、実施例２に記載の形質発現プラスミドｐＨＭｃ０
７６から制限酵素ｍＩと５ａｌｌにより、実施例２に記
載のＭＣＦ　（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片を含む大きな
りＮＡ断片を単離し、これをＭ１３ｍｐ１９ファージベ
クター（宝酒造）のポリリンカー領域にある制限酵素５
ａｌＩとＸｂａＩの切断部位の領域に挿入して組み換え
ファージＤＮＡを作製した。この組み換えファージＩ）
ＮＡを鋳型とし、下記の種々の化学合成変異誘導プライ
マーを用い、実施例２に記載の部位特異的変異誘導法に
従って、　ＭＣＦ（ＤｒａＩ−ＸｈｏＩ）断片の塩基配
列中、ヒトＭＣＦポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸
をコードする塩基配列を部分的に欠失させ、これを実施
例２に記載のＥＰ２０５　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片と
結合させることにより、構築した。

この部位特異的変異誘導に用いる変異誘導プライマーの
塩基配列は、下記の通りである。

第１表に示したヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの第２７
〜９９番目のアミノ酸配列（但し、第１表中のＸはＡｌ
ａである）　（以下、Ｎ３−ＭＣＦポリペプチドと略す
）を有するポリペプチド生産用形質発現プラスミド構築
の場合、 ５’　−ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＣＡＡＴＣＡＡ
ＴＧＣＣＣ−３’ヒトＭＣＦ前駆体ポリペプチドの第３
０〜９９番目のアミノ酸配列（但し、第１表中のＸはＡ
ｌａである）（以下、Ｎ６−ＭＣＦポリペプチドと略す
）を有するポリペプチド生産用形質発現プラスミド構築
の場合、Ｓ’　−ＧＧＴＴＴＡＡＡＴＴＡＴＧＧＣＣＣ
ＣＡＧＴＣＡＣＣＴＧＣ−３’である。

実施例２に記載の方法に従って、それぞれの変異型複製
型二重ｇ　ＤＮＡを作製し単離した０次いで、それぞれ
の変異型複製型二重鎖ＤＮＡから制限酵素ＤｒａＩと祖
）ＯＩによる消化にて、該ポリペプチドをコードする塩
基配列を含むＤＮＡ断片を単離した。これらの各ＤＮＡ
断片を、形質発現ベクターｐＥＰ２０５由来のＥＰ２０
５　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片と結合させることにより
、それぞれのポリペプチド生産用の形質発現プラスミド
を構築した。

Ｎ５−Ｍ０Ｐポリペプチド生産用形質発現プラスミドを
ｐＨＭｃＯ７３と名付け、Ｎ６−ＭＣＦポリペプチド生
産用形質発現プラスミドをＰＨＭＣＯ７０と名付けた。

各形質発現プラスミドを、前記の方法に従って、大腸菌
８８１０１株に導入し、形質転換体を得た。

（２）ヒトＭＣＦ活性を有するポリペプチドの製造上記
”Ｃ’　得り形質転換体（大腸＠ＨＢＩＯ１／ｐＨＭｃ
Ｏ７３及び大腸菌ＨＢＩＯＩ／ｐＨＭｃＯ７０）を培養
し、実施例２に記載の方法に従って各形質発現プラスミ
ドを単離した。これらの形質発現プラスミドを用い、実
語例２に記載の方法に従って、Ｎ３−ＭＣＦポリペプチ
ド及びＮ６−ＭＣＦポリペプチドを製造し、それらのヒ
ト単球に対する走化性活性を確認した。

Ｎ３−ＭＣＦポリペプチド及びＮ６−ＭＣＦポリペプチ
ドの分子量、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
分析により、いずれも約１２±１　ｋＤａと求められた
。但し、前者のポリペプチドの泳動距離はやや短く、後
者のポリペプチドよりも若干高分子量であった。

参考例１ ベク　−ＥＰ２０５の プラスミドｐＢＲ３２２を、制限酵素Ａｖａ　ＩとＰｖ
ｕ　Ｉ　Ｉにて消化し、得られた大きな断片（約３．７
ｋｂｐ　）を単離した。このＤＮＡ断片の両端を、ＤＮ
ＡポリメラーゼＩ（クレノー　フラグメント）及びｄＧ
ＴＰ、　ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＴＴＰを用いて平滑
末端としたのち、Ｔ４ＤＮＡリガーゼにて結合させるこ
とにより、プラスミドｐＢＲ３２２の複製開始点近傍の
コピー数制御領域を欠失させたプラスミドベクター（ｐ
ＢＲ３６という）を作製した。

このベクターｐＢＲ３６を、制限酵素ＰｓｔｌとＥｃｏ
ＲＩにて消化し、アンピシリン耐性遺伝子の上流領域を
含む小さなりＮＡ断片（約０．７５ｋｂｐ　）を単離し
た。このＤＮＡ断片をＡｍｐ　（Ｐｓ　ｔ　Ｉ−Ｅｃｏ
ＲＩ）断片という。

このＡｍｐ　（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ）断片を、実施例
２に記載した方法に従ってＭ１３ｍｐ１Ｂファージベク
ター（宝酒造）に挿入した。この組み換えファージＤＮ
Ａを用い、実施例２に記載の方法による部位特異的変異
誘導法により、Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ）断片中
の一塩蔦（Ａ）を他の塩基（Ｇ）に変換することにより
、制限酵素ＤｒａＩの切断認識配列（ＴＴＴＡＡＡ）を
消去した。

即ち、ウラシルが導入された単鎖ファージＤＮＡを、上
記の組み換えファージＤＮＡを感染させた大腸菌ＣＪ２
３６株の培養上清から単離した。

別途、下記式［７］で示される塩基配列を有する変異誘
導プライマーを常法に従って化学合成した。

５’　−ＣＡＧＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＣＴＣ−３
’　　　　［７］この変異誘導プライマーの５゛末端に
リン酸基を付加し、このリン酸化変異誘導ブライマーを
、上記のウラシルが導入された単鎖ファージＤＮＡと結
合させ、実施例２に言己載の方法に従って、目的とする
変異型複製型二重鎖ＤＮＡを単離した。

この変異型複製型二重鎖ＤＮＡから制限酵素已ｓｔＩと
ＥｃｏＲＩによる消化にて、Ａｍｐ（Ｐｓｔｌ−Ｅｃｏ
Ｒｒ）断片に対応し制限酵素辺ＩＩの切断認識配列が消
去されたＤＮＡ断片（変異Ａｍｐ（ＰｓｔＩ−ＥｃｏＲ
Ｉ）断片という）を単離した。この変異Ａｍｐ　（Ｐｓ
ｔＩ　−ＥｃｏＲＩ）断片を、前記のベクターｐＢＲＳ
６から制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｓｔＩにて切り出される
大きなりＮＡ断片にＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合
させることにより、プラスミドベクターＰＢＲＳ６の塩
基配列中、アンピシリン耐性遺伝子領域に存在する制限
酵素ＤｒａＩの切断認識配列が消去されたプラスミドを
作製し、これをｐＢＲｓ６０１と名付けた。

更に、このプラスミドベクターＰＢＲ３６０１を、制限
酵素ＤｒａＩによる消化にて得られた大きなりＮＡ断片
に、Ｓｍａｒリンカ−（宝酒造）をＴ４　ＤＮＡリガー
ゼにて結合させることにより、新規プラスミド　ベクタ
ーを作製した。この新規プラスミドベクターは、プラス
ミドｐＢＲ３２２の変異誘導体であり、その塩基配列中
、制限酵素ＤｒａＩの切断認識塩基配列が完全に消去さ
れたものであり、ｐＢＲ３６０２と名付けた。尚、Ｓｍ
ａＩリンカ−の塩基配列は下記のとおりである。

５’　−ＣＣＣＧＧＧ−３’ 更に、この新規ベクターｐＢＲ３６０２より、制限酵素
ＡａｔＩＩと５ａｌｌにて消化して得られる大きなりＮ
Ａ断片を単離した［この断片を、ｐＢＲ３６０２（Ａａ
ｔＩＩ−３ａｌＩ）断片というコ。

別途に参考例２に記載したヒト　インターロイキン１α
生産用形質発現プラスミドＰＨＩＰＨ３８３ａから制限
酵素ＡａｔＩＩと５ａｌＩによる消化にて単離したＤＮ
Ａ断片、即ちトリプトファンプロモーター領域及びヒト
　インターロイキン１αをコードする領域を含むＤＮＡ
断片（ｔｒｐ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ／ＩＬＩ　ａ　ＤＮＡ
断片という）を単離した。このｔｒｐ　ｐｒｏｍｏｔｅ
ｒ／ＩＬＩ　ａ　−ＤＮＡ断片を、ｐＢＲｓ６０２（Ａ
ａｔＩＩ−３ａｌｌ）断片とＴ４　ＤＮＡリガーゼを用
いて結合させることにより、新規の発現プラスミドを構
築した。この発現プラスミドをｐＥＰ２０５と名付けた
。

参考例２ ベ　　　−　１（ＩＰＨ３８３ａの ヒトインターロイキン１α前駆体ポリペプチドをコード
するクローン化ｃＤＮＡは、ヨーロッパ公開特許第０１
８８９２０号に記載の方法に従って単離した。

このヒトインターロイキン１　ａ　ｃＤＮＡが組み込ま
れた組み換えプラスミドｐＨＬ４　（Ｆｕｒｕｔａｎｌ
、Ｙ、ら。

Ｎｕｃｌａｊｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｇ、、　１３巻、　
５８６９頁、　１９８５年）から、制限酵素ＰｓｔＩに
よる消化にて、　ｃＤＮＡ領域を切り出し、更に制限酵
素ＥｃｏＲＩとジ■ＮＩにて消化し、成熟型ヒト　イン
ターロイキン１αをコードする領域の中央部に相当する
約４１１ｂｐのＤＮＡ断片を単離した。このＤＮＡ断片
は、ヨーロッパ公開特許第０１８８９２０号の第５表記
載の塩基番号第３９８〜８０８番目の塩基配列に相当す
る。

このＤＮＡ断片に、下記の式［８］及び［９］で示され
る２種類の化学合成オリゴデオキシリボヌクレオチド　
アダプターをＴ４　ＤＮＡリガーゼを用いて結合させた
。ここで得られたＤＮＡ断片を、　５Ｏ−ＩＬＩ断片と
いう。

式〔８〕の化学合成オリゴデオキシリボヌクレオチドア
ダプターとは、下記式［ａｌ〜【＠１で示される５種類
のＤＮＡ断片を、順次結合゛させて作製したＤＮＡアダ
プターである。

式［９〕の化学合成オリゴヌクレオチドアダプターの塩
基配列は、次の通りである。

別途に、形質発現ベクターｐＥＰ３０２　（Ｆｕｒｕｔ
ａｎｉ、Ｙ、ら、　Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
ｓ、、　　１３巻。

５８６９頁、　　１９８５年）を、制限酵素ＨＲＡＩと
Ｂａｍ）ＩＩにて消化し、大腸菌トリプトファンプロモ
ーター領域部分及びアンピシリン耐性遺伝子を含む大き
なりＮＡ断片（以下、ＥＰ３０２　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮ
Ａ断片という）を単離した。

このＥＰ３０２　ｖｅｃｔｏｒ−ＤＮＡ断片を、上記の
５Ｏ−Ｉ　Ｌ　Ｌ断片と、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼを用い
て結合させることにより、成熟型ヒトインターロイキン
ｌαポリペプチド生産用の形質発現プラスミドＰＨＩＰ
Ｈ３８３ａを構築した。

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト単球走化性因子活性を有し、下記のアミノ酸
   配列［ I ］又はその主要部を有す るポリペプチドをコードするＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります】 ［ I ］ （但し、式［ I ］中Ｘは、Ａｌａ又はＴｈｒである。
   ）
2. （２）下記のアミノ酸配列［II］を有するヒト単球走化
   性因子前駆体ポリペプチドをコー ドするＤＮＡ又はその対立遺伝子変異体Ｄ ＮＡにおいて、その５’末端側の２４〜２ ９個のコドンが欠失した塩基配列を有する ＤＮＡ。 【アミノ酸配列があります】 ［II］ （但し、式［II］中Ｘは、Ａｌａ又はＴｈｒである。）
3. （３）特許請求の範囲第１項記載のＤＮＡを組み込んだ
   形質発現ベクターを用いることを 特徴とするヒト単球走化性因子活性を有す るポリペプチドの製造法。
4. （４）特許請求の範囲第２項記載のＤＮＡを組み込んだ
   形質発現ベクターを用いることを 特徴とするヒト単球走化性因子活性を有す るポリペプチドの製造法。
5. （５）ヒト単球走化性因子活性を有し、特許請求の範囲
   第１項の式［ I ］で示されるアミ ノ酸配列又はその主要部の配列を有するポ リペプチド。
6. （６）特許請求の範囲第１項の式［ I ］で示されるア
   ミノ酸配列において、そのＮ末端側 の１〜６個のアミノ酸が欠失したアミノ酸 配列を有し、ヒト単球走化性因子活性を有 するポリペプチド。