JPH0219398A

JPH0219398A - 新規な抗腫瘍性ポリペプチド、該ポリペプチドをコードするｄｎａ及び該ポリペプチドを含有する医薬組成物

Info

Publication number: JPH0219398A
Application number: JP63166913A
Authority: JP
Inventors: Takashi Shirai; 孝白井; Shuichi Kuroda; 修一黒田; Hirataka Ito; 伊東　平隆
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1988-07-06
Filing date: 1988-07-06
Publication date: 1990-01-23

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は新規な抗腫瘍性ポリペプチド、該ポリペプチド
をコードするＤＮＡ及び該ポリペプチドを含有する医薬
組成物に関する。

（従来の技術）近年、遺伝子工学の進歩によって生体内に微量しか存在
しないサイト力イン類の構造が遺伝子レベルで解明され
ており、これらの中には、大腸菌、動物細胞での大量生
産が可能になったものも多数ある。

腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）もその中の１つである。ヒトＴ
ＮＦは、本発明者ら及びその他のグループによりその遺
伝子クローニングが行なわれ（Ｎａｔｕｒｅ３１３．８
０３（１９８５）、　Ｎａｔｕｒｅ　　３１２．７２４
　（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ　２２８　、１４９　　
（１９８５））、また、ウサギＴＮＦ遺伝子も本発明者
らによりクローニングされた（　　ＤＮＡ　　旦−，１
４９（１９８６）、ＤＮＡ　　５　　．１５７　　（１
９８６））　　。　これによって、天然型ＴＮＦ高度精
製品を大量に使用することが可能となっている。

（発明が解決しようとする問題点）しかしながら、天然型ＴＮＦは、Ｉ！ｆｆ！瘍細胞に対
する細胞障害作用の他に、内皮細胞に対する白血球の接
着亢進、血液凝固作用亢進、白血球に対して、内皮細胞
への接着亢進、亥食充進、スーパーオキシド産生元進、
繊維芽細胞に対する増殖促進、脂肪細胞に対するリボプ
ロティンリパーゼ産生の低下等の極めて多様な作用を有
することが知られており、腫瘍に対する治療には必須で
あるとは考えられない作用も多い。この為、天然型ＴＮ
Ｆの種々の機能、性質を変化させた医薬用途に有用な改
変ＴＮＦの出現が望まれていた。

本発明の主たる目的は、上記の要望にこたえるために、
医薬用途として有用な新規ポリペプチドを提供すること
である。

（問題点を解決するだめの手段）蛋白の改変には、（１）蛋白そのものの化学的改変、（
２）酵素的改変、（３）遺伝子の化学的、酵素的変異あ
るいは合成オリゴヌクレオクドを用いる、部位特異的変
異等の方法によって作製した改変遺伝子を、適当な宿主
中で発現させることによる改変などが知られている。

本発明者らは、ウサギＴＮＦとヒトＴＮＦのアミノ酸配
列およびｃＤＮＡの塩基配列が、高いホモ口ジ−を有す
ることに着目しく第１図参照）、鋭意研究を重ねた結果
、ウサギＴＮＦとヒ）　ＴＮＦをコードするＤＮＡを組
み換える事により、ヒト・ウサギキメラＴＮＦをコード
するＤＮＡを作製し、このキメラＴＮＦ発現プラスミド
で形質転換した大腸菌を培養することによって高い抗腫
瘍活性を有する新規ポリペプチドが製造できることを見
い出し、さらに２種の遺伝子を組換えることにより得ら
れた新規なポリペプチドは、天然型と異なる抗腫瘍性を
示し、また、種特異性等の性質も変化しているので、医
薬用途として極めてを用であることを確認して本発明を
完成するに至った。

即ち、本発明は、下記の一般式（１）で表わされるアミ
ノ酸配列を有するポリペプチド及びその製造法を提供す
るものである。

Ｘ０ｌ−３ｅｒ−八５ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＸＯ２−Ａ
ｌａ−Ｈｉｓ−Ｖａｌ−ＶａｌＡｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ
−Ｇｉｎ−ＸＯ３−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−
ＧｉｎＴｒｐ−１ｅｕ−ＸＯ４−へｒｇ−へ１ａ−Ａｓ
ｎ−八１ａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｌａ八５へ−Ｇｌｙ−
ＸＯ５−Ｌｅｕ−ＸＯ６−八５ｐ−Ａｓｎ−Ｇｉｎ−Ｌ
ｅｕ−ＶａｌＶａｌ−Ｐｒｏ−ＸＯ７−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ
−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−１１ｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒ−Ｇｉｎ−
Ｖａｔ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＸＯ８−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ−Ｇ
ｌｙ−Ｃｙｓ−ＸＯ９Ｓｅｒ−Ｘ１０−Ｖａｌ−Ｌｅｕ
−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−１１ｉｓ−Ｔｈｒ−Ｘｌｌ−Ｓｅｒ
＾ｒｇ−Ｘ１２−八１ａ−Ｖａｌ−５ｅｒ−Ｔｙｒ−Ｘ
１３−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−ＡｓｎＬｅｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ
−Ａｌａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−
Ｘ１４Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｘ１
５−八ｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ１６−ＴｒｐＴｙｒ−Ｇｌｕ−
Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖ
ａｌ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｘ１７−Ｇｌｕ
−Ｘ１８−Ａｓｎ−Ｘ１９−Ｐｒｏ−Ｘ２０−Ｔｙｒ−
Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｘ２１Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ
−１１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（但し、ＸＯＩは水素原子又は１個〜８個のアミノ酸残
基、ＸＯ２，Ｘ０３．Ｘ０６．Ｘ０８．Ｘ０９．Ｘｌｌ
、Ｘ１２．Ｘ１４゜Ｘ１５．Ｘ１７．Ｘ１Ｂ、Ｘ１９．
　Ｘ２０．Ｘ２１は１個のアミノ酸残基、Ｘ０４．ＸＯ
５，ＸＯ７，Ｘ１３は２個のアミノ酸残基、Ｘ１６は３
個のアミノ酸残基、ＸＩＯは１個又は２個のアミノ酸残
基を表わす。）上記一般式（１）で表されるアミノ酸配列を有するポリ
ペプチドの中で望ましいものとして、ＸＯＩがＳｅｒ　
Ｓｅｒ　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ｔｒｐ　ＰｒｏあるいはＳｅ
ｒ八Ｉへ　　Ｓｅｒ　Ａｒｇ　Ａｌａ　Ｌｅｕ、　ＸＯ
２がＶａｌ　あるいはＬｙｓ　ＸＯ３がＡｌａあるいは
Ｖａｌ、　ＸＯ４がＡｓｎ　ＡｒｇあるいはＳｃｒ　Ｇ
ｌｎ、　ＸＯ５がＭｅｔ　ＬｙｓあるいはＶａｌＧｌｕ
、　ＸＯ６がＴｈｒあるいはＡｒｇ、　ＸＯ７がＡｌａ
　ＡｓｐあるいはＳｅｒ　Ｇｌｕ、　ＸＯ８がＳｅｒあ
るいはＬｙｓ　。

ＸＯ９がＡｒｇあるいはＰｒｏ、　ＸＩＯがＴｙｒある
いはＴｈｒ　Ｈｉｓ、　ＸｌｌがＶａｌあるいはｌｉｅ
、　Ｘ１２がＰｈｅあるいはＩｌｅ、　Ｘ１３がＰｒｏ
　ＡｓｎあるいはＧｉｎ　Ｔｈｒ。

Ｘ１４がｌ１ｉｓあるいはＧｌｎ、　Ｘ１５がＧｌｕあ
るいはＧｕｙ、Ｘ１６がＰｒｏ　Ｍｅｔ　Ａｌａあるい
はＡｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒ。

Ｘ１７がＴｈｒあるいはＡｌａ、　Ｘ１８がＶａｌある
いは１１ｅ、　Ｘ１９がＧｉｎあるいはＡｒｇ、　Ｘ２
０がＧｌｕあるいは４５１）、　Ｘ２１がＬｅｕあるい
はＰｈｅであるところのポリペプチドが挙げられる。

さらに望ましいポリペプチドとしては以下のものが挙げ
られる。

（ａ）　　一般式（１）においてＸＯＩがＳｅｒ　Ｓｅ
ｒ　Ｓｅｒ　ＡｒｇＴｒｐ　　Ｐｒｏ、　ＸＯ２がＶａ
ｔ、ＸＯ３がＡｌａ、　ＸＯ４がＡｓｎ　Ａｒｇ。

ＸＯ５がＭｅｔ　Ｌｙｓ、　ＸＯ６がＴｈｒ、Ｘ０７が
八ｌａ　Ａｓｐ、　ＸＯ８がＳｅｒ、　ＸＯ９力＜Ａｒ
ｇ、　ＸＩＯがＴｙｒ、　ＸｌｌがＶａｌ、　Ｘ１２が
Ｐｈｅ、　Ｘ１３がＰｒｏ　Ａｓｎ、　Ｘ１４が旧ｓ、
　Ｘ１５がＧｌｕ。

Ｘ１６がＰｒｏ　Ｍｅｔ　Ａｌａ、　Ｘ１７がＴｈｒ、
　Ｘ１８がＶａｌ、　Ｘ１９がＧｉｎ、　Ｘ２０がＧｌ
ｕ、　Ｘ２１がＬｅｕ　＋であるポリペプチド（ｂ）一般式（Ｉ）　ＸＯＩがＳｅｒ　Ａｌａ　Ｓｅｒ
　Ａｒｇ　Ａｌａ　ＬｅｕＸＯ２がＬｙｓ　、　ＸＯ３
がＶａｌ、　ＸＯ４がＳｅｒ　Ｇｉｎ、　ＸＯ５がＶａ
ｌ　Ｇｌｕ、　ＸＯ６がＡｒｇ、　ＸＯ７がＳｅｒ　Ｇ
Ｉｕ＋　ＸＯ８がｌｙｓ。

ＸＯ９がＰｒｏ、　ＸＩＯがＴｈｒ　Ｉｆ！ｉ＋　Ｘｌ
ｌがｌｉｅ、Ｘ１２がｌｉｅ、　Ｘ１３がＧｉｎ　Ｔｈ
ｒ、　Ｘ１４がＧｉｎ、　Ｘ１５がＧｌｙ、　Ｘ１６が
Ａｌａ　ＬｙｓＰｒｏ、　Ｘ１７カ（Ａｌａ、　Ｘ１８
がｌｉｅ、Ｘ１９が八ｒｇ、　Ｘ２０が八Ｓ＋）＋　Ｘ
２１がＰｈｅ、であるポリペプチド。

（Ｃ）一般式（Ｉ）においてＸＯＩがＳｅｒ　Ｓｅｒ　
Ｓｅｒ　ＡｒｇＴｒｐ　ＰｒＯ＋　ＸＯ２がＶａｌ、Ｘ
Ｏ３が八ｌａ、　ＸＯ４がＡｓｎ　Ａｒｇ。

ＸＯ５がＶａｔ　Ｇｌｕ、　ＸＯ６が八ｒｇ、　ＸＯ７
がＳｅｒ　Ｇｌｕ、　ＸＯ８がＬｙｓ、　ＸＯ９がＰｒ
ｏ　　ＸＩＯがＴｈｒ　Ｈｉｓ、　Ｘｌｌがｌｉｅ。

Ｘ１２がＩｌｅ、　Ｘ１３がＧｉｎ　Ｔｈｒ、　Ｘ１４
が旧ｓ、　Ｘ１５がＧｌｕ、　Ｘ１６がＰｒｏ　Ｍｅｔ
Ａｌａ、　Ｘ１７がＴｈｒ、　Ｘ１Ｂがνａｌ。

Ｘ１９がＧｉｎ、　Ｘ２０がＧｌｕ、　Ｘ２１がＬｅｕ
、であるポリペプチド。

（ｄ）一般式（１）においてＸＯＩがＳｅｒ　Ａｌａ　
Ｓｅｒ　ＡｒｇＡｌａ　Ｌｅｕ、　ＸＯ２がＬｙｓ、　
ＸＯ３がＶａｌ、　ＸＯ４がＳｓｒ　Ｇｌｎ。

ＸＯ５力（Ｍｅｔ　Ｌｙｓ、ＸＯ６がＴｈｒ、　ＸＯ７
がＡｌａ　Ａｓｐ、　ＸＯ８がＳｅｒ、　ＸＯ９がＡｒ
ｇ、　ＸＩＯがＴｙｒ、　ＸｌｌがＶａｌ、　Ｘ１２が
Ｐｈｅ、　Ｘ１３がＰｒｏ　Ａｓｎ＋　Ｘ１４がＧｌｎ
、　Ｘ１５がｃｘｙ、　Ｘ１６カ＜Ａｌａ　Ｌｙｓ　Ｐ
ｒｏ、　Ｘ１７がＡｌａ、　Ｘ１８がＩｌｅ、　Ｘ１９
がＡｒｇ。

Ｘ２０がＡｓｐ、　Ｘ２１がＰｈｅ、であるポリペプチ
ド。

（ｅ）一般式（１）においてＸＯＩがＳｅｒ　Ｓｅｒ　
Ｓｅｒ　ＡｒｇＴｒｐ　Ｐｒｏ＋　ＸＯ２がＶａ　ｌ　
、　ＸＯ３がＡｌａ、　ＸＯ４がＡｓｎ　Ａｒｇ。

ＸＯ５がＶａｔ　Ｇｌｕ、　ＸＯ６がＡｒｇ、　ＸＯ７
がＳｅｒ　Ｇｌｕ、　ＸＯ８がＬｙｓ、　ＸＯ９がＰｒ
ｏＸｌｏがＴｈｒ　Ｈｉｓ、Ｘ１１がｌ１ｅＸ１２がＩ
ｌｅ、　Ｘ１３がＧｉｎ　Ｔｈｒ、　Ｘ１４がＧｉｎ、
　Ｘ１５がｃｉｙ、　Ｘ１６がＡｌａ　Ｌｙｓ　Ｐｒｏ
＋　Ｘ１７がＴｈｒ、　Ｘ１ＢがＶａｌ。

Ｘ１９がＧｉｎ、　Ｘ２０がＧｌｕ、　Ｘ２１がＬｅｕ
、であるポリペプチド（ｆ）一般式（１）においてＸＯＩがＳｅｒ　Ａｌａ　
Ｓｅｒ　ＡｒｇＡｌａ　Ｌｅｕ、　ＸＯ２がＬｙｓ、　
ＸＯ３がＶａｌ、　ＸＯ４がＳｅｒ　Ｇｌｎ。

ＸＯ５がＭｓｔ　Ｌｙｓ　ＸＯ６がＴｈｒ、　ＸＯ７が
Ａｌａ　Ａｓｐ、　ＸＯ８がＳｅｒ、　ＸＯ９が八ｒｇ
、ＸＩＯがＴｙｒ、　ＸｌｌがＶａｌ、　Ｘ１２がＰｈ
ｅ、　Ｘ１３がＰｒｏ　Ａｓｎ、Ｘ１４が！ｌ　ｈ　ｓ
　＋　Ｘ　１５がＧｌｕ、　Ｘ１６がＰｒｏ　Ｍｅｔ　
Ａｌａ、Ｘ１７がＡｌａ、　Ｘ１８がＩｌｅ、　Ｘ１９
がＡｒｇ。

Ｘ２０が八ｓｐ、　Ｘ２１がＰｈｅ、であるポリペプチ
ドまた本発明によれば、上記ポリペプチドを有効成分と
して含有する医薬組成物が提供される。

さらに、本発明は、下記の一般式（１）で表わされるア
ミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ及
びその製造法を提供する。

Ｘ０ｌ−５ｅｒ−へ５ｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−ＸＯ２−八
ｌａ−ｆｉｔｓ−Ｖａｌ−ＶａｌＡｌａ−Ａｓｎ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｎ−ＸＯ３−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ
−Ｇｌｎ−Ｔｒｐ−１ｅｕ−ＸＯ４−Ａｒｇ−Ａｌａ−
八５ｎ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ＡｌａＡｓｎ−Ｇｌ
ｙ−ＸＯ５−Ｌｅｕ−ＸＯ６−八５ｐ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ
−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−ＸＯ７−Ｇｌｙ−
Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−ｌｉｅ−Ｔｙｒ−５ｅｒＧｉ
ｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−ＸＯ８−Ｇｌｙ−Ｇｉｎ
−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＸＯ９Ｓｅｒ−ＸＩＯ−Ｖａｌ−Ｌ
ｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ−Ｘｌｌ−５ｅ
ｒＡｒｇ−Ｘ１２−Ａｌａ−シａｌ−Ｓｅｔ−Ｔｙｒ−
Ｘ１３−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−へ５ｎＬｅｕ−Ｌｅｕ−５ｅ
ｒ−八Ｉａ−１１ｅ−Ｌｙｓ−５ｅｒ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ
−Ｘ１４Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｘ
１５−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｘ１６−Ｔｒｐ↑ｙｒ−Ｇｌｕ
−Ｐｒｏ−１１ｅ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−
シａｔ−ＰｈｅＧｉｎ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌ
ｙ−＾ｓｐ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−３ｅｒ−Ｘ１７Ｇｌｕ−
Ｘ１８−Ａｓｎ−Ｘ１９−Ｐｒｏ−Ｘ２０−Ｔｙｒ−Ｌ
ｅｕ−八５ｐ−Ｘ２１Ａｌａ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｙ
−Ｇｉｎ−Ｖａｌ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−１１ｅ１
１ｅ−Ａｌａ−Ｌｅｕ（但し、ＸＯＩは水素原子又は１個〜８個のアミノ酸残
基、Ｘ０２．Ｘ０３．Ｘ０６．Ｘ０８．Ｘ０９．Ｘｌｌ
、Ｘ１２．Ｘ１４゜Ｘ１５．Ｘ１７．Ｘ１８．Ｘ１９．
Ｘ２０．Ｘ２１　は１個ノアミノ酸残基、Ｘ０４．ＸＯ
５，ＸＯ７，Ｘ１３は２個ノアミノ酸残基、Ｘ１６は３
個のアミノ酸残基、ＸＩＯは１個又は２個のアミノ酸残
基を表わす。）上記ＤＮＡの中の望ましいＤＮＡとしては以下のものが
挙げられる。

（ａ）　　　ＡＧＣ，ＧＣＴ、ＴＣＴ、ＣＧＧ、ＧＣＣ
，ＣＴＧ、ＡＧＴ、ＧＡＣ，ＡＡＧ、ＣＣＴ。

ＣＴＡ、ＧＣＣ，ＣＡＣ，ＧＴＡ、ＧＴＡ、ＧＣＡ、Ａ
ＡＣ，ＣＣＧ、ＣＡＡ、ＧＴＧ。

ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＣＡＧ、ＴＧＧ、Ｃ
ＴＧ、ＡＧＣ，ＣＡＧ、ＣＧＴ。

ＧＣＧ、ＡＡＣ，ＧＣＣ，ＣＴＧ、ＣＴＧ、ＧＣＣ，Ａ
ＡＣ，ＧＧＣ，ＡＴＧ、ＡＡＧ。

ＣＴＣ，八ＣＧ、ＧＡＣ，ＡＡＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、Ｇ
ＴＧ、ＧＴＧ、ＣＣＧ、ＧＣＣ。

ＧＡＣ，ＧＧＧ、ＣＴＧ、ＴＡＣ，ＣＴＣ，ＡＴＣ，Ｔ
ＡＣ，ＴＣＣ，ＣＡＧ、ＧＴＴ。

ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＡＧＣ，ＧＧＴ、ＣＡＡ、ＧＧＣ，Ｔ
ＧＣ，ＣＧＣ，ＴＣＣ，ＴＡＣ。

ＧＴＧ、ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＡＣＴ、ＣＡＣ，ＡＣＴ、Ｇ
ＴＣ，ＡＧＣ，ＣＧＣ，ＴＴＣ。

ＧＣＣｌＧＴＣ，ＴＣＣ，ＴＡＣ，ＣＣＧ、ＡＡＣ，Ａ
ＡＧ、ＧＴＣ，ＡＡＣ，ＣＴＣ。

ＣＴＣ，ＴＣＴ、ＧＣＣ，ＡＴＣ，ＡＡＧ、ＡＧＣ，Ｃ
ＣＣ，ＴＧＣ，ＣＡＣ，ＡＧＧ。

ＧＡＧ、ＡＣＣ，ＣＣＡ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＧＣＴ、Ｇ
ＡＧ、ＧＣＣ，ＡＡＧ、ＣＣＣ。

ＴＧＧ、ＴＡＴ、ＧＡＧ、ＣＣＣ，ＡＴＣ，ＴＡＴ、Ｃ
ＴＧ、ＧＧＡ、ＧＧＣ，ＧＴＣ。

ＴＴＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＧＡＧ、へへＧ、ＧＧＴ、Ｇ
ＡＣ，ＣＧＡ、ＣＴＣ，八ＧＣ。

ＧＣＴ、ＧＡＧ、八ＴＣ，ＡＡＴ、ＣＧＧ、ＣＣＣ，Ｇ
ＡＣ，ＴＡＴ、ＣＴＧ、ＧＡＣ。

ＴＴＴ、ＧＣＣ，ＧＡＧ、ＴＣＴ、ＧＧＧ、ＣＡＧ、Ｇ
ＴＣ，ＴＡＣ，ＴＴＴ、ＧＧＧ。

八ＴＣ，ＡＴＴ、ＧＣＣ，ＣＴＧ。

（ｂ）　　　八ＧＣ，ＴＣＴ、ＴＣＴ、ＣＧＡ、ＡＣＣ
，ＣＣＧ、ＡＧＴ、ＧＡＣ，ＡＡＧ、ＣＣＴ。

ＧＴＡ、ＧＣＣ，ＣＡＴ、ＧＴＴ、ＧＴＡ、ＣＣＡ、Ａ
ＡＣ，ＣＣＴ、ＣＡＡ、ＧＣＴ。

ＧＡＧ、ＧＧＧ、ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＣＡＧ、ＴＧＧ、Ｃ
ＴＧ、ＡＡＣ，ＣＧＣ，ＣＧＧ。

ＧＣＣ，へへＴ、ＧＣＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ、ＧＣＣ，八
ＡＴ、ＧＧＣ，ＧＴＧ、ＧＡＧ。

ＣＴＧ、ＡＧＡ、ＧＡＴ、八ＡＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、Ｇ
ＴＧ、ＧＴＧ、ＣＣ八、ＴＣＡ。

ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＣＴＧ、ＴＡＣ，ＣＴＣ，ＡＴＣ，Ｔ
ＡＣ，ＴＣＣ，ＣＡＧ、ＧＴＣ。

ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＡＡＧ、ＧＧＣ，ＣＡＡ、ＧＧＣ，Ｔ
ＧＣ，ＣＣＣ，ＴＣＣ，ＡＣＣ。

ＣＡＴ、ＧＴＧ、ＣＴＣ，ＣＴＣ，へＣＣ，ＣＡＣ，Ａ
ＣＣ，へＴＣ，へＧＣ，ＣＧＣ。

八ＴＣ，ＧＣＣ，ＧＴＣ，ＴＣＣ，ＴＡＣ，ＣＡＧ、へ
ＣＣ，ＡＡＧ、ＧＴＣ，へへＣ６ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＴＣ
Ｔ、ＧＣＣ，ＡＴＣ，ＡＡＧ、ＡＧＣ，ＣＣＣ，ＴＧＣ
，ＣＡＣ。

ＣＧＧ、ＧＡＧ、ＡＣＣ，ＣＣＣ，ＧＡＧ、ＧＡＧ、Ｇ
ＣＴ、ＧＡＧ、ＣＣＣ，八ＴＧ。

ＧＣＣ，ＴＧＧ、ＴＡＣ，ＧＡＧ、ＣＣＣ，＾ＴＣ，Ｔ
ＡＣ，ＣＴＧ、ＧＧＣ，ＧＧＣ。

ＧＴＣ，ＴＴＣ，ＣＡＧ、ＴＴＧ、ＧＡＧ、ＡＡＧ、Ｇ
ＧＴ、ＧＡＣ，ＣＧＧ、ＣＴＣ。

ＡＧＣ，ＡＣＣ，ＧＡＧ、ＧＴＣ，ＡＡＣ，ＣＡＧ、Ｃ
ＣＴ、ＧＡＧ、ＴＡＣ，ＣＴＧ。

ＧＡＣ，ＣＴＴ、ＧＣＣ，ＧＡＧ、ＴＣＣ，ＧＧＧ、Ｃ
ＡＧ、ＧＴＣ，ＴＡＣ，ＴＴＴ。

ＧＧＧ、ＡＴＣ，ＡＴＴ、ＧＣＣ，ＣＴＧ。

ＡＧＣ，ＴＣＴ、ＴＣＴ、ＣＧ八、ＡＣＣ，ＣＣＧ、Ａ
ＧＴ、ＧＡＣ，Ａ４〇、ＣＣＴ。

ＧＴＡ、ＧＣＣ，ＣＡＴ、ＧＴＴ、ＧＴＡ、ＧＣ八、Ａ
ＡＣ，ＣＣＴ、ＣＡＡ、ＧＣＴ。

ＧＣＣ，ＡＡＴ、ＧＣＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ、ＧＣＣ，Ａ
ＡＣｏＧＧＣ，ＡＴＧ、ＡＡＧ。

ＣＴＣ，ＡＣＧ、ＧＡＣ，ＡＡＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、Ｇ
ＴＧ、ＧＴＧ、ＣＣＧ、ＧＣＣ。

ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＡＧＣ，ＧＧＴ、Ｃ＾八、ＧＧＣ，Ｔ
ＧＣ，ＣＧＣ，ＴＣＣ，ＴＡＣ。

ＧＴＧ、ＣＴＣ，ＣＴＣ，へＣＴ、ＣＡＣ，へＣＴ、Ｇ
ＴＣ，ＡＧＣ，ＣＧＣ，ＴＴＣ。

ＧＣＣ，ＧＴＣ，ＴＣＣ，ＴＡＣ，ＣＣＧ、ＡＡＣ，Ａ
ＡＧ、ＧＴＣ，ＡＡＣ，ＣＴＣ。

ＣＴＣ，ＴＣＴ、ＧＣＣ，ＡＴＣ，ＡＡＧ、ＡＧＣ，Ｃ
ＣＣ，ＴＧＣ，ＣＡＣ，ＣＧＧ。

ＧＡＧ、ＡＣＣ，ＣＣＣ，ＧＡＧ、ＧＡＧ、ＧＣＴ、Ｇ
ＡＧ、ＣＣＣ，ＡＴＧ、ＧＣＣ。

ＴＧＧ、ＴＡＣ，ＧＡＧ、ＣＣＣ，八ＴＣ，ＴＡＣ，Ｃ
ＴＧ、ＧＧＣ，ＧＧＣ，ＧＴＣ。

ＴＴＣ，ＣＡＧ、ＴＴＧ、ＧＡＧ、八ＡＧ、ＧＧＴ、Ｇ
ＡＣ，ＣＧＧ、ＣＴＣ，ＡＧＣ。

ＡＣＣ，ＧＡＧ、ＧＴＣ，ＡＡＣ，ＣＡＧ、ＣＣＴ、Ｇ
ＡＧ、ＴＡＣ，ＣＴＧ、ＧＡＣ。

ＣＴＴ、ＧＣＣ，ＧＡＧ、ＴＣＣ，ＧＧＧ、ＣＡＧ、Ｇ
ＴＣ，ＴＡＣ，ＴＴＴ、ＧＧＧ。

へＴＣ，へＴＴ、ＧＣＣ，ＣＴＧ。

ＡＧＣ，ＧＣＴ、ＴＣＴ、ＣＧＧ、ＧＣＣ，ＣＴＧ、Ａ
ＧＴ、ＧＡＣ，ＡＡＧ、ＣＣＴ。

ＣＴＡ、ＧＣＣ，ＣＡＣ，ＧＴＡ、ＧＴＡ、ＧＣＡ、Ａ
ＡＣ，ＣＣＧ、ＣＡ＾、ＧＴＧ。

ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＣＡＧ、ＴＧＧ、Ｃ
ＴＧ、八ＧＣ，ＣＡＧ、ＣＧＴ。

ＧＣＧ、Ａ４Ｃ，ＧＣＣ，ＣＴＧ、ＣＴＧ、ＧＣＣ，Ａ
ＡＴ、ＧＧＣ，ＧＴＧ、ＧＡＧ。

ＣＴＧ、へＧへ、ＧＡＴ、ＡＡＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、Ｇ
ＴＧ、ＧＴＧ、ＣＣＡ、ＴＣＡ。

ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＣＴＧ、ＴＡＣ，ＣＴＣ，八ＴＣ，Ｔ
ＡＣ，ＴＣＣ０ＣＡＧ、ＧＴＣ。

ＣＴＣ，ＴＴＣ，ＡＡＧ、ＧＧＣ，ＣＡ八、ＧＧＣ，Ｔ
ＧＣ，ＣＣＣ，ＴＣＣ，ＡＣＣ。

ＣＡＴ、ＧＴＧ、ＣＴＣ，ＣＴＣ，＾ＣＣ，ＣＡＣ，八
ＣＣ８八ＴＣへ八ＧＣ，ＣＧＣ。

ＡＴＣ，ＧＣＣ，ＧＴＣ，ＴＣＣ，ＴＡＣ，ＣＡＧ、Ａ
ＣＣ，ＡＡＧ、ＧＴＣ，ＡＡＣ。

ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＴＣＴ、ＧＣＣ，ＡＴＣ，＾ＡＧ、Ａ
ＧＣ，ＣＣＣ，ＴＧＣ，ＣＡＧ。

ＡＧＧ、ＧＡＧ、八ＣＣ，ＣＣＡ、ＧＡＧ、ＧＧＧ、Ｇ
ＣＴ、ＧＡＧ、ＧＣＣ，八ＡＧ。

ＣＣＣ，ＴＧＧ、ＴＡＴ、ＧＡＧ、ＣＣＣ，八ＴＣ，Ｔ
ＡＴ、ＣＴＧ、ＧＧＡ、ＧＧＧ。

ＧＴＣ，ＴＴＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＧＡＧ、へＡＧ、Ｇ
ＧＴ、ＧＡＣ，ＣＧへ、ＣＴＣ。

ＡＧＣ，ＧＣＴ、ＧＡＧ、ＡＴＣ，ＡＡＴ、ＣＧＧ、Ｃ
ＣＣ，ＧＡＣ，ＴＡＴ、ＣＴＣ。

ＧＡＣ，ＴＴＴ、ＧＣＣ，ＧＡＧ、ＴＣＴ、ＧＧＧ、Ｃ
ＡＧ、、ＧＴＣ，ＴＡＣ，ＴＴＴ。

ＧＧＧ、ＡＴＣ，ＡＴＴ、ＧＣＣ，ＣＴＧ。

（ｅ）　　　ＡＧＣ，ＴＣＴ、ＴＣＴ、ＣＧＡ、＾ＣＣ
，ＣＣＧ、八ＧＴ、ＧＡＣへ八ＡＧ、ＣＣＴへＧＴＡ、
ＧＣＣ，ＣＡＴ、ＧＴＴ、ＧＴＡ、ＧＣＡ、ＡＡＣ，Ｃ
ＣＴ、Ｃ４八、ＧＣＴ。

ＧＣＣ，ＡＡＴ、ＧＣＣ，ＣＴＣ，ＣＴＧ、ＧＣＣ，八
ＡＴ、ＧＧＣ，ＧＴＧ、ＧＡＧ。

ＣＴＧ、ＡＧ＾、ＧＡＴ、ＡＡＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、Ｇ
ＴＧ、ＧＴＧ、ＣＣＡ、ＴＣ八。

ＣＡＴ、ＧＴＧ、ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＡＣＣ，ＣＡＣ，へ
ＣＣ０八ＴＣ，ＡＧＣ，ＣＧＣ。

八ＴＣ，ＧＣＣ，ＧＴＣ，ＴＣＣ，ＴＡＣ，ＣＡＧ、Ａ
ＣＣ，＾ＡＧ、ＧＴＣ，ＡＡＣ。

ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＴＣＴ、ＧＣＣ，へＴＣ，へＡＧ、へ
ＧＣ，ＣＣＣ，ＴＧＣ，ＣＡＧ。

ＣＣＣ，ＴＧＧ、ＴＡＴ、ＧＡＧ、ＣＣＣ，ＡＴＣ，Ｔ
ＡＴ、ＣＴＧ、ＣＧＡ、ＧＧＧ。

ＧＴＣ，ＴＴＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、ＧＡＧ、ＡＡＧ、Ｇ
ＧＴ、ＧＡＣ，ＣＧＧ、ＣＴＣ。

八ＧＣ，ＡＣＣ０ＧＡＧ、ＧＴＣ，ＡＡＣ，ＣＡＧ、Ｃ
ＣＴ、ＧＡＧ、ＴＡＣ，ＣＴＧ。

ＧＧＧ、八ＴＣ，ＡＴＴ、ＧＣＣ，ＣＴＧ。

八ＧＣ，ＧＣＴ、ＴＣＴ、ＣＧＧ、ＧＣＣ，ＣＴＧ、Ａ
ＧＴ、ＧＡＣ，ＡＡＧ、ＣＣＴ。

ＧＡＧ、ＧＧＣ，ＣＡＧ、ＣＴＣ，ＣＡＧ、ＴＧＧ、Ｃ
ＴＧ、＾ＧＣ，ＣＡＧ、ＣＧＴ。

ＣＴＣ，へＣＧ、ＧＡＣ，へＡＣ，ＣＡＧ、ＣＴＧ、Ｇ
ＴＧ、ＧＴＧ、ＣＣＧ、ＧＣＣ。

ＧＴＧ、ＣＴＣ，ＣＴＣ，ＡＣＴ、ＣＡＣ，へＣＴ、Ｇ
ＴＣ，へＧＣ，ＣＧＣ，ＴＴＣ。

ＴＴＣ，ＣＡＧ、ＴＴＧ、ＧＡＧ、ＡＡＧ、ＧＧＴ、Ｇ
ＡＣ，ＣＧＡ、ＣＴＣ，ＡＧＣ。

ＧＣＴ、ＧＡＧ、ΔＴＣ，八ＡＴへＣＧＧ、ＣＣＣ，Ｇ
ＡＣ，ＴＡＴ、ＣＴＣ，ＧＡＣ。

ＡＴＣ，ＡＴＴ、ＧＣＣ，ＣＴＧまた、本発明によれば、上記ＤＮＡを組込んだベクター
及びその製造法も提供される。

以下、詳細に本願発明を説明する。

本発明のポリペプチドは該ポリペプチドをコードするＤ
ＮＡを蛋白に翻訳させることによって製造することがで
きる。このような方法としては、例えば、本発明のポリ
ペプチドを発現せしめるための適当なプロモーター配列
、必要であれば、適当なタミネーター配列、宿主中での
複製を可能とするための配列、更に、遺伝子により形質
転換されたことを容易に判定するためのマーカーの機能
を有する配列等を該ポリペプチドをコードするＤＮＡに
連結し、適当な宿主中へ形質転換せしめ、目的遺伝子を
発現せしめることによって、宿主中もしくは、培養液中
に蓄積させるという方法が挙げられる。

本発明によって開示される新規なポリペプチドには、そ
のアミン末端に２個アミノ酸が付加したものも含まれる
。

本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡはヒト由来の
ＴＮＰをコードするＤＮＡ及びウサギ由来ＴＮＦをコー
ドするＤＮＡから構成され、これらのＤＮＡとしてはｃ
ＤＮＡまたは染色体ＤＮＡから得られるＤＮＡなどが利
用できるが、各々のＴＮＦをコードしているものであれ
ばすべて利用することができる。

これらのＤＮＡから両種で保存されている共通の制限酵
素切断部位でＤＮＡを切断できる制限酵素を用いて各々
のＤＮＡ断片を切り出し、各々の断片を遺伝子組換え法
によって組み換えることにより、キメラＴＮＦをコード
するＤＮＡを有するプラスミドを作製することができる
。

両者で保存されている共通の制限酵素切断部位としては
、たとえばＡｌｕ　Ｉ　＋　Ｐｖｕ　ＩＩ　、　Ｂｓｔ
Ｎ　ＩＭｂｏ　ＩＩ　＋　Ｂｂｖ　Ｉ　＋Ｈｘｎｃ　Ｉ
［＋　ＢｓｔＥ　ＩＩ等が挙げられる。

また、これらの制限酵素を複数用いれば、種々な組合せ
のキメラＴＮＦをコードするプラスミドも作製できる。

共通の制限酵素切断部位がない場合は、該ＴＮＦのアミ
ノ酸が変化しない範囲で合成りＮＡを作製し、制限酵素
切断部位を部位特異的変異法により新たに作り出してい
くこともできる。又、異なった制限酵素切断部位でもフ
レームを合せることにより、目的の新規ポリペプチドを
コードするプラスミドを作製できる場合もある。

また、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、合
成オリゴヌクレオチドを適当な方法で結合させることに
より、あるいは、合成オリゴヌクレオチドと、天然型Ｄ
ＮＡを適当な方法で結合させることによっても得ること
ができる。

さらに、このような方法により制限酵素切断部位等の人
工的な塩基配列を導入することもできる。

本発明の新規なポリペプチドをコードするＤＮＡにおい
て、遺伝子コードの縮重により、そのコードするアミノ
酸配列を変えることなく、塩基配列を変化させることも
できるので、該ポリペプチドをコードする塩基配列をも
つすべてのＤＮＡは、本発明のＤＮＡに含まれる。

また、遺伝形質多望などにより、遺伝子配列、更には、
これに基くアミノ酸配列に、個体差が認められることも
あるが、ウサギ及びヒトＴＮＦの遺伝子多望に起因する
変異体もまた、本発明に含まれる。

本発明のポリペプチドを大腸菌中で発現させるためのプ
ロモーターとしてはたとえば、ラクトースプロモーター
系、トリプトファンプロモーター系、大腸菌アルカリ性
ホスファターゼプロモーター系等があげられるが、大腸
菌で発現するプロモーターであればすべて用いることが
できる。

又、本発明のポリペプチドを酵母で発現させる場合の酵
母ベクターは２ミクロン酵母プラスミドからの複製起源
または、自律的複製配列、プロモーター、キメラＴＮＦ
、並びにポリアデニル化及び転写終止の為の配列及び選
択性遺伝子配列を含有するものを用いる。

又、宿主として動物細胞を用いることもできる。宿主細
胞の例としてはＣｌｌ０．ＣＶ−１，ＣＯ５−１，ＣＯ
５７、Ｃ−１２７等が挙げられる。プロモーターとして
はＳν４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモータ
ー等があげられる。選択マーカーとしてはネオマイシン
耐性遺伝子（Ｎｅｏ）　、デヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨ
ＦＲ）などが挙げられる。動物細胞を用いる場合、本゛
発明のポリペプチドをコードするＯＮへのアミノ末端に
いわゆるシグナル配列を接続し、細胞外へ分泌させるこ
とも可能である。

具体的に本発明の実施方法の１例を示すと以下の通りで
ある。

（１）　　実施例１及び２に従って、ヒ）　ＴＮＦをコ
ードするｐ　ＨＮｔｒｐ　５３５　、ウサギＴＮＦをコ
ードするｐＲＮｔｒｐを得る。

（２）第６図に示すようにｐ　ＨＮＴＲＰ　５３．５及
びＰＲＮｔｒｐをＢｓ　ｔＥ■、ＰｓｔＩで切断し、そ
れぞれのＤＮＡ断片を組合わせることにより、ｐＨＲＢ
ｓｔｐＲｔ（Ｂｓｔを得る。

（３）　　さらに、第４図に示すようにして、ｐＨＲＢ
ａＥ。

ｐ’ＲＨＢａｊ２を、第５図に示すようにしてｐＨＲＨ
ｉｎｃ、　　ｐ　ＨＲＨｉｎｃを構築する。

（４）　　このようにして得られたプラスミドを用いて
、Ｅ、ｃｏｌｉｓｔｒａｉｎ　０１２１０を形質転換し
、アンピシリン耐性のコロニーから目的とするＥ、ｃｏ
　Ｉ！、ｉを選択する。

（５）　　ＰＨＲＢｓｔ　、ｐＲＨＢｓｔ　、ｐＨＲＢ
ａｆｆｐＲＨＦ３ａｌ、　　ｐ　ＨＲＨｉｎｃまたはｐ
　ＲＨｌｌｉｎｅを有するＥ、ｃｏ　ｌ　ｉを培養し、
培養終了後、その菌体を集めて破砕した後、遠心分離等
を行なうことにより本発明のポリペプチド含有の粗抽出
液を得る。

このような方法により製造された本発明のポリペプチド
の精製は、ポリペプチドや、蛋白の精製方法として知ら
れる方法を組合わせることによって達成される。

このような方法としては、例えば、高速液体クロマトグ
ラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動、塩
析、硫安沈澱などを適宜組合せることができる。

このような方法により精製された本発明のポリペプチド
は、マウス由来細胞であるＬ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ
ｌ、２）に対する障害活性及びヒト由来筋肉腫細胞ＫＹ
Ｍに対する障害活性等によって評価される。尚、粗抽出
液をそのまま活性測定に用いることもできる。

また、本発明のポリペプチドを医薬として使用するには
、抗腫瘍効果を発現するのに好適な形態で投与すること
が望ましい。本発明のポリペプチドを単独で投与しても
良いが医薬的に許容しうる希釈剤で希釈しても良い。こ
のような希釈剤としてはたとえばマンニトール、ヒト血
清アルブミン、グリシン等をあげることができる。本発
明のポリペプチドの投与量は、成人の患者１日当たり１
μｇ以上が望ましいが、人種、性別、年齢、体重、投与
方法、間隔体調、調剤の種類等により変動するため、こ
の投与量よりも少なくてもよい。

次に本発明を実施例により説明する。

（実施例）実施例１（組換え体プラスミドｐ　ＨＮ　ｔｒｐ　５３５の製法
）プラスミドｐＨＮｔａｃ４　（Ｎａｔｕｒｅ　３１３
．８０３．１９８５）を制限酵素ＥｃｏＲＩとｌｌ１ｎ
ｃＩＩを用いて完全に分解し、ｔａｃプロモーターの一
部を含む約２２０　ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。この
ＤＮＡ断片と４本の化学合成（Ａｐｐｊｌ！ｊｅｄ　Ｂ
ｉｏｓｙｓｔｅｍ社３８０　Ａ　　ＤＮＡ　５ｙｎｔｈ
ｅｓｉｚｅｒを用いた）したＤＮＡ　５　’　−ＧＡＣ
ＡＡＴ　ＴＡＡ　ＴＣＡ　ＴＣＧＡＧＧ　　ＴＡＧ　　
ＴＴＡ　　ＡＣＴ−３′　、　　５　　　’　　−ＡＧ
Ｔ　　ＡＣＧ　　Ｃへへ　ＧＴＴＣＡＣＧＴＡ　　ＡＡ
Ａ　　ＡＧＧ　　ＧＴＡ　　ＴＣＧ−３′　、　　５　
　　”　　−ＧＡＴ　　ＣＣＧＣＧＡ　　ＣＣＣＴＴＴ
　　ＴＴＡ　　ＣＧＴ　　ＧＡＡ　　ＣＴＴ　　（、３
”、　　５　　　−ＣＧＴＣＴＴ　　ＡＧＴ　　ＴＡＡ
　　ＣＴＡ　　ＧＴＴ　　ＣＧＡ　　ＴＧＡ　　ＴＴＡ
　　ＡＴＴ　　ＧＴＣ−３’を混合し、Ｔ４ＯＮＡ　リ
ガーゼを用いて連結した。その後ＥｃｏＲＩとＢａｍＨ
Ｔを用いて完全に分解し、構築された約２７０　ｂｐの
ｔｒｐプロモーター断片を分離した。

一方、ｐＨＮｔａｃ４をＸｈｏ　ＩＩとＨｔｎｄｌｎで
完全分解し、ヒトＴＮＦ遺伝子を含む約６００　ｂｐ　
　のＤＮＡ断片を分離した。この両ＤＮＡ断片及びプラ
スミドｐＢＲ３２７のＥｃｏＲＩと旧ｎｄｌＩ［切断断
片的３２５０ｂｐを混合し、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼを加
えて結合し、ｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５を作製した（第１
図参照）。

実施例２（組換体プラスミドｐ　ＲＮ　ｔｒｐの製法）ブ′ラス
ミドｐＮｔａｃ　Ｉ　（ＤＮＡ　５　、１４９　、１９
８６　）をＢａｍ　ｔｌ　ＩとＡｃｃ　Ｉを用いて切断
し、ウサギＴＮＦ遺伝子の大部分を含む約４５０　ｂｐ
　　ＤＮＡ断片を分離した。一方、実施例１で構築した
ｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５をＢａｍＨｒとＳａｉ■を用い
て切断し、約２９００　ｂｐ　ＤＮＡ断片を分離した。

また、同じ（ｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５を５ａｆｌで切断
後、Ａｃｃ　Ｉで切断して、約７７０　ｂｐＤＮＡ断片
を分離した。このようにして分離した３つのＤＮＡ断片
を混合し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いて連結し、ρＲＮ
　ｔｒｐを作製した（第２図参照）。

実施例３（組換え体プラスミドｐＨＲＢａｊｌ！の製法）実施例
１で作製したプラスミドｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５を第３
図で示す様に５ａｎＩとＰｓｔｌを用いて切断し、約１
１４０　ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。一方、実施例２
で作製したプラスミドｐＲＮｔｒｐを５ａｆｌとＰｓｔ
ｌを用いて切断し、約２９８０ｂｐのＤＮＡ断片を分離
した。両ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼを
加えて結合させ、ｐＨＲＢａｆを構築した。

実施例４（組換え体プラスミドｐＲＨＢａｆの製法）実施例１で
得られたｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５をＢａｆｌとＰｓｔｌ
を用いて切断し、約２９８０　ｂｐのＤＮＡ断片を分離
した。また、実施例２で得られたｐＲＮｔｒｐを５ａｆ
ｌとＰｓｔｌを用いて切断し、約１１４０　ｂｐののＤ
ＮＡ断片を分離した。両ＤＮＡ断片混合し、Ｔ４ＤＮＡ
リガーゼを加えて結合させ、ｐＲＨＢａｆｆｉを構築し
た。

実施例５（＆Ｉｌ換え体プラスミドｐＨＲＩ（Ｉｎｃの製法）実
施例１で得られたｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５をＲａｍ　Ｈ
Ｉと１１ｉｎｃＩＩで切断後、ヒｌ−ＴＮＦのＮ末端側
をコードする約２７０　ｂｐの断片を分離した。また、
同じ（ｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５をとＢａｍ１ｌ　Ｉと５
ａｆｌで切断後、約２９００　ｂｐの断片を分離した。

一方、実施例２で得られたｐＲＮｔｒｐをＢａｆｌで切
断後、旧ｎｃＩＩで切断し、ウサギＴＮＦのＣ末端側を
　コードする約９５０　ｂｐ　　ＤＮＡ断片を分離した
。これら３つのＤＮＡ断片を混合しＴ４ＤＮＡ　リガー
ゼを用いて結合させ、ｐＨＲＨｉｎｃを構築した（第４
図参照）。

実施例６（組換え体プラスミドｐＲＨＨｆｎｃの製法）実施例１
で得られたｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５を５ａｆＩで切断後
、旧ｎｃＩＩで切断して、ヒＩ−ＴＮＦのＣ末端側をコ
ードする約９５０　ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。また
、同じ＜　　ｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５をＢａｍ　ＨＩと
ＳａＩ！、■で切断し、約２９００　ｂｐのＤＮＡ断片
を分離した。一方、実施例２で得られたｐＲＮ　ｔｒｐ
　＠　Ｂａｍ　ＨＩと旧ｎｃＩＩで切断し、ウサギＴＮ
ＦのＮ末端側をコードしている約２７０　ｂｐのＤＮＡ
断片を分離した。これら３つのＤＮＡ断片を混合しＴ４
ＯＮＡリガーゼを用いて結合させ、ｐＨＲＨｉｎｃを構
築した。

実施例７（組換え体プラスミドｐＨＲＢｓｔの製法）実施例１で
得られたプラスミドｐＨＮ　ｔｒｐ５３５を制限酵素Ｂ
ｓｔＥ］ｌとＰｓｔＩを用いて切断して、約２７００　
ｂｐのＤＮＡ断片を分離した。一方、実施例２で作製し
たプラスミドｐＲＮｔｒｐをＢｓｔＥＩＩとＰｓｔｌを
用いて切断し、約１４１０　ｂｐ　０）ＤＮＡ断片を分
離した。両ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＤＮＡ　リガーゼ
を加えて結合させ、ｐＨＲＢｓｔを構・築した（第５図
参照）。

実施例８（組換え体プラスミドｐＲＨＢｓｔの製法）実施例１で
得られたプラスミドｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５をＢｓｔＥ
Ｉ［とＰｓｔ　Ｉを用いて切断して、約１４１０　ｂｐ
のＤＮＡ断片を分離した。一方、実施例２で作製したプ
ラスミドｐ　ＲＮ　ｔｒｐをＢｓｔＥＩ［とＰｓｔＩを
用いて切断し、約２７００　ｂｐのＤＮＡ断片を分離し
た。

両ＤＮＡ断片を混合し、Ｔ４ＯＮＡ　リガーゼを加えて
結合させ、ｐＲＨＢｓｔを構築した。

実施例９（新規ポリペプチドの大腸菌による生産）実施例３〜８
で得られた組換えプラスミドをそれぞれ大腸菌ＬＥ３９
２株に導入し、それぞれのキメラＴＮＦを以下のように
して同様に生産させた。

実施例３〜８で得られたプラスミドを持つ大腸菌ＬＥ３
９２株を５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと５Ｏｎｇ／
ｄアンピシリンを含むＬＢ培地（１％トリプトン、０．
５％酵母エキス、０．５％ＮａＣｊ２．　ｐＨ７，０）
に植菌し、対数増殖後期まで３７°Ｃで培養した。培養
液の２０ｍｆｔを１０００ｄの５８ｇ／ｍｆｌのテトラ
サイクリンを含むＭ９ＣＡ培地（０，６％Ｎａ、ＨＰＯ
，，０，３％ＫｌｈＰＯ，，０，５％ＮａＣＲ１０，１
％Ｎ１１．ｉ、０．２％グルコース、２　ｍＭ　Ｍｇ５
Ｏｎ、０．１　ｍＭ　ＣａＣ１ｚ　、０．２％カザミノ
酸、ｐＨ７，４）に加え、５０００ｄ容量の三角フラス
コを用いて、３７℃、１５０ｒｐｍで振盪培養、２０時
間墳培養た。各々の培養液を６００Ｏｒｐｍ　、１０分
間遠心して集菌し、１５ｄの２０ｏ＋Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ
ｃ　１２　（ｐＨ８，０）に懸濁し、０°Ｃで超音波破
砕（大苗製作所製Ｓｏｎ　ｔｅａ　ｔｏｒ）した。得ら
れた破砕液を１５００Ｏｒｐｍ　、３０分間遠心してそ
の上清を得た。

実施例１０（新規ポリペプチドの精製）実施例９で得られた上滑に２ｇのストレプトマイシンを
添加し、０°Ｃで３０分間放置する。１２．００Ｏｒｐ
ｍ１５分、遠心して上清をとり、これを２０　ｍＭＴｒ
ｉｓ−ｔｌｃｆ　（ｐｔ１８　）に透析した後、ＩＩＰ
ＬＣ（高速液体フロマドグラフィー）で精製する。ＤＥ
ＡＲ−５ＰＷ（東ソー社製）で２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−１
１ｃｎ　（ｐＨ８）の溶液下、Ｎａｃ　Ｉ！、をＯＭか
ら０．３Ｍへ１時間でグラジェントをかけ、得られたピ
ークをＬ細胞障害活性で固定し、障害活性を示すピーク
をセントリコン１０（アミコン社）で濃縮する。次ニ５
ＨＯＤＥＸ　Ｈ５−８０３Ｆカラム（昭和電工針！りを
用い２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｆ（ｐＨ８，０）、１５
０ｍＭ　　ＮａＣｌでゲル濾過を行ない、Ｌ細胞に障害
活性を示す部分を濃縮し、精製品とする。こうして得ら
れたキメラＴＮＦの純度は、ＳＤＳポリアクリルアミド
ゲル電気泳動から、５０〜９０％程度である。

実施例１１（抗ＩＩＩ瘍活性の評価法）Ｊａｐａｎ、　Ｊ、　Ｍｅｄ、　Ｓｃｉ、Ｂｉｏｆ、　
２９　１０５−１１８　（１９８６）に記載の方法に従
ってマウス由来細胞Ｌ−Ｍ細胞（ＡＴＣＣＣＣＬｌ、２
）に対する抗腫瘍活性を測定し、これをもとにしてヒト
由来筋肉細胞ＸＹＭに対する活性を測定した。検体を１
％のウシ胎児血清を含むイーグルのミニマムエツセンシ
ャル培地（？ＩＢＭ）で希釈した試料１００μ２とＬ−
台細胞１０’個／ｄの懸濁液１００μｌを９６穴のマイ
クロプレート（フロー・ラボラトリ−社）に加えた。こ
れを３７°Ｃ１５％ＣＯ２下、１００％の濃度で４８時
間培養する。

その後２０μ２の２５％グルタルアルデヒド液を加え生
細胞を固定した。洗浄後、固定化細胞を１００μ２の０
．０５％メチレンブルー液で染色し、洗浄後２００ｕｆ
ｆｉの０．３３Ｎ塩酸で抽出し、その６６５ｎｍにおけ
る吸光度を測定した。

Ｌ−Ｍ細胞の５０％を殺す為に必要な活性を１単位／ｄ
と定義し、対照の吸光度の５０％の値に相当する試料の
希釈率を力価とした。

ヒト由来筋肉腫細胞ＫＹＭに対する障害性をほぼＬ−Ｍ
細胞と同様の方法で測定した。即ち、希釈した試料を５
Ｘ１０３個／ウェルのＫＹＭ細胞と共にＤＭ−１６０（
田水製薬）、２０％ウシ胎児血清で４〜５日培養後、グ
ルタルアルデヒド存在下、遠心することにより、生細胞
を固定した。洗浄後メチレンブルーで染色し、塩酸抽出
後６６５ｎｍにおける吸光度を測定した。ＫＹＭ細胞の
５０％を殺す為に必要な活性を１単位／　ｍｌと定義し
、対照の吸光度の５０％の値に相当する試料の希釈率を
力価とした。

実施例１０で得られたポリペプチドについて行った評価
結果を表１に示す。

以下　余白表ヒ　　ト　ＴＮＦ　　　　　　　１００　　　　　　　
　　　３７０ウサギＴＮＦ　　　　１００　　　　　　
１４２ｐＨＲＢｓｔ　　　　　　　１００　　　　　　
　　　　６２ｐＲＨＢｓｔ　　　　　　１００　　　　
　　　　　５５３ｐＨＲＢａｌ　　　　　　１００　　
　　　　　　　１０８ｐＲＨＢａｉ、１００　　　　　
　　３．０６４ｐ　ＨＲＨｉｎｃ　　　　１００　　　
　　　２５７ＲＨＨｉｎｃ　　　　１００　　　　　　
２３５（発明の効果）本発明によれば、医薬用途に有用な新規な抗腫瘍性ポリ
ペプチドが提供される。また、ヒトＴＮＦとはヒト腫瘍
細胞障害活性の異なるポリペプチドが提供される。さら
に本発明のポリペプチドは当該技術分野における構造−
活性相関の研究にも使用できる。

【図面の簡単な説明】

第１図はヒト及びウサギＴＮＦのアミノ酸配列、第２図
はｐ　ＨＮ　ｔｒｐ５３５の構築のスキーム、第３図は
ｐＲＮｔｒｐの構築のスキーム、第４図はｐＨＲＢａｆ
ｆｉ及びｐＲＨＢａｆの構築スキーム、第５図はｐＨＲ
Ｈｉｎｃ及びｐＲＨＨｉｎｃの構築スチーム、第６図は
ｐＨＲＢｓｔ及びｐＲＨ［１ｓｔ構築のスキームを示し
ている。ｐＨＮ咋５３５０祷榮第２図特許出願人　　　旭化成工業株式会社第 ■ ＊本本＊ネネ　ネ１ｔＥＩＩ木本本ネ本イＬＮＲＲＡＮＡＬＬＡＮＧＶＥ　ＬＦ？ＤＮＱＬＷＰ
Ｓ　　ＥＧＬＹＬＩＹＳＱＶ’Ｉｌｊ；ｓＱＲＡＮＡＬ
ＬＡＮＧＭＫ　　Ｌ丁ＤＮＱＬＷＰＡ　　ＤＧＬＹＬＩ
ＹＳＱＶ＊本　　　　　ｋ本　水　　　木本ａｌ　ＩＴＫＶＮ　　ＬＬ５ＡＩＫＳＰＣＱ　　ＲＥＴＰＥＧＡ
ＥＡＫ　ＰＷＹＥＰＩＹＬＧＧ）ＮＫＶＮ　　ＬＬＳＡ
ＩＫＳＰＣＨＦ？ＥＴＰＥＥＡＥＰＭ　　ＡＷＹＥＰＩ
ＹＬＧＧ京水　　　　　　　　　　　　　　木　　　　
　　＊　　本本　本ＨＩｎｃＩ［３ＱＶＹＦ　　ＧＩＩＡＬ　　ｌ！５！５３ＱＶＹＦ　
　ＧＩＩＡＬ　　１５４第３図ｐＲＮ咋の槙莱ＲＮｔｒｐ第５図ｐＨＲ＋＋ｎｃｐＲＨ＋ｌ口Ｃ第４図ｐＨＲ日ａｌ　、ｐＲＨＢａｌ　の１８Ｍ３．０ｋｂ１．１ｋｂ３．０ｋｂｋｂＨＲＢａｌｐＲＨＢａｌ第６図ｐＨＲＢｓｔ　、　ｐＲＨｅｓｔ　ｎ［ｐＨＮ　ｔｒｐ
　５３５ＲＮｔｒｐ２．７ｋｂ１．４ｋｂ２．７ｋｂ、４ｋｂ頼合し耗ふ［ｐ）４ＲＢｓｔＲＨＢｓｔ

Claims

【特許請求の範囲】

（１）下記の一般式（ I ）で表わされるアミノ酸配列
を有するポリペプチド【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】（但し、Ｘ０１は水素原子又は１個〜８個のアミノ酸残
基、Ｘ０２、Ｘ０３、Ｘ０６、Ｘ０８、Ｘ０９、Ｘ１１
、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、
Ｘ２０、Ｘ２１は１個のアミノ酸残基、Ｘ０４、Ｘ０５
、Ｘ０７、Ｘ１３は２個のアミノ酸残基、Ｘ１６は３個
のアミノ酸残基、Ｘ１０は１個又は２個のアミノ酸残基
を表わす。）
（２）下記の一般式（ I ）で表わされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドを有効成分として含有する医薬組
成物【遺伝子配列があります】【遺伝子配列があります】（但し、Ｘ０１は水素原子又は１個〜８個のアミノ酸残
基、Ｘ０２、Ｘ０３、Ｘ０６、Ｘ０８、Ｘ０９、Ｘ１１
、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、
Ｘ２０、Ｘ２１は１個のアミノ酸残基、Ｘ０４、Ｘ０５
、Ｘ０７、Ｘ１３は２個のアミノ酸残基、Ｘ１６は３個
のアミノ酸残基、Ｘ１０は１個又は２個のアミノ酸残基
を表わす。）
（３）下記の一般式（ I ）で表わされるアミノ酸配列
を有するポリペプチドをコードするＤＮＡ【遺伝子配列
があります】【遺伝子配列があります】（但し、Ｘ０１は水素原子又は１個〜８個のアミノ酸残
基、Ｘ０２、Ｘ０３、Ｘ０６、Ｘ０８、Ｘ０９、Ｘ１１
、Ｘ１２、Ｘ１４、Ｘ１５、Ｘ１７、Ｘ１８、Ｘ１９、
Ｘ２０、Ｘ２１は１個のアミノ酸残基、Ｘ０４、Ｘ０５
、Ｘ０７、Ｘ１３は２個のアミノ酸残基、Ｘ１６は３個
のアミノ酸残基、Ｘ１０は１個又は２個のアミノ酸残基
を表わす。）