JPH02179475A - 酵素標識法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は酵素標識法、更に詳しくは糖蛋白質を抗体又は
抗原と酵素との間の架橋剤として使用する酵素標識法に
関するものである。

〔従来の技術〕

抗体（又は抗原）に酵素を標識する方法としてゲルター
ル・アルデヒド法（Ｉｍｍｕｎｏ−ｃｈｅｍｉ　ｓＬ　
ｒｙ、８：４３．１９６９）、マレイミド法（Ｊ　、Ｂ
ｉ　ｏｃｈｅｍ、７８　：２３５．１９７５）、　　ピ
リジル・ジスルフィド法（Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１７３
ニア２３゜１９７８）、カルボジイミド誘導体法、混合
酸無水物（ｍｉｘｅｄ　　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）法等の
化学的結合剤を利用する方法が知られている。或は、標
識用酵素が糖蛋白質（特にパーオキシダーゼ：　ＰＯＤ
）の場合、その標識用酵素の糖部分のジオール基をアル
デヒ・ド基に変え。

抗体（又は抗原）の７ミノ基とシャツの塩基を形成させ
て結合ならしめる過ヨウ素酸酸化法（Ｊ　、Ｈｉ　ｓｔ
　ｏｃｈｅｍ、Ｃｙｔｏｃｅｍ。

２２：ＬＯ３４，１９７４）が知られている。

特に、過ヨウ素酸酸化法の場合は、直接結合に関与する
特別な架橋剤を必要とせず、標識用酵素自身が所有して
いる官能基を利用して抗体（又は抗原）との結合を簡易
に実施させるものである。然して、酵素ＰＯＤを抗体（
又は抗原）に標識させた後は、あくまでも本酵素の活性
を測定することにより分析を行う。

〔発明が解決しようとする課題〕

しかしながら、過ヨウ素酸酸化法で使用される酵素ＰＯ
Ｄは、安価であり、その標識反応操作は簡便であるが本
酵素による発色反応は血清の痕跡、或は、使用する器具
等の僅かの汚れでも鋭敏に反応し非特異発色を起こす可
能性が極めて高い、そのため本酵素反応の扱いには細心
の注意を要する。故に、他酵素を標識酵素とする方が、
特に例えばβ−Ｄ−ガラクトシダーゼのような人体に存
在しない酵素を利用することが臨床診断化学上好ましい
、ところがこのβ−Ｄ−ガラクトシダーゼを標識するた
めに上記の化学結合剤を使用する種々の方法が試みられ
ているが目的とする酵素標識物を得るまでの操作が極め
て煩雑である。又、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ以外の他
の酵素を標識するときもまったく同様の問題がある。

なお、特公昭６３−７６２１号公報には甲状腺ホルモン
又はコルチゾンの遊離部分の濃度を測定する方法におい
て使用するアミノ酸側鎖のアミノ位のｔＳＥ飾が例示さ
れているが、酵素の標識に一般的に使用できる方法では
ない。

本発明は上記従来技術における問題点を解決するための
ものであり、抗体（又は抗ｒＸ）との結合反応に於て、
直接結合に関与する特別な架橋剤を不必要として、即ち
、特別な化学的架橋剤を使う必要性のない糖蛋白質（特
に、従来より標識酵素として利用されているＰＯＤ）を
架橋剤として利用する酵素標識法を提供することを目的
とするものである。

〔課題を解決するための手段〕

即ち本発明の酵素標識法は、抗体又は抗原に糖蛋白質を
介して酵素（ただし、前記糖蛋白質と同一種類の糖蛋白
質は除く）を結合させることを特徴とする。

つまり、糖蛋白質例えばＰＯＤを分析に際してそれ自身
の酵素活性を測定するために使用するのではなく、抗体
又は抗原の−ＮＨ基及び他の酵素（標識用酵素の−ＮＨ
基）との間にシー２フの塩基形成を行ない、ＰＯＤを介
して抗体又は抗原と酵素とを結合させるために使用する
ものである。

本発明の方法によって得られる酵素標識抗体又は抗原は
下記式で表わされる。

抗体（又は抗原）−Ｎ＝ＣＨ−糖蛋白質−ＣＨ＝Ｎ−標
識酵素 糖蛋白質としてはパーオキシダーゼ（ＰＯＤ）を使用す
るのが好ましい、糖蛋白質が酵素の場合、その糖蛋白質
（酵素）を介して抗体又は抗原に結合させる標識酵素と
しては、架橋剤として使用した糖蛋白質（酵素）以外の
種類の糖蛋白質（標識酵素）であれば使用してもよい。

糖蛋白質及び酵素の種類は、抗体又は抗原の種類や分析
目的などに応じて適宜選択する。

〔実施例〕

以下の実施例において本発明を更に詳細に説明する。な
お本発明は下記実施例に限定されるものではない。

■、糖蛋白質（ＰＯＤ）架橋酵素標識抗体の作製（イ）
抗ＡＦＰ抗体（ウサギγ−グロブリン）５ｍｇを含有す
る０、０℃Ｍ　　Ｎａ　　ＣｏＪＮａＨＣＯ１ｍｍ液液
ｐＨ１０、２７）０．５ｍ文及び標識用酵素β−Ｄ−ガ
ラクトシダーゼ　４　、　Ｏｍ　ｇを含有する同緩衝液
０．３ｍ文を同緩衝液５００ｍ文で２回透析（４℃で各
々１７．８時間）後遠心分子ａ（室温で３００Ｏｒｐｍ
、１０分間）した。

（ロ）糖蛋白質として酵素パーオキシダーゼ（ＰＯＤ）
５ｍｇを蒸留水１ｍＭに溶解し、０．１ＭＮａＩＯ４水
溶液０．２ｍ文を緩かに攪拌しながら加え室温にて２０
分間反応後５００ｍａｌの１ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４，
４）にて２０時間透析（４℃で３００Ｏｒｐｍ、１０分
間）後遠心分離した。

（ハ）（イ）と（ロ）の上清混和液の０．２ＭＮａ、Ｃ
ｏ３−ＮａＨＣＯ３緩衝液（ｐＨ１０，０８）：５０終
文を少量づつ添加後室部にて２時間極めて緩かに攪拌し
、更に水冷下にて新たに調整したＯ、１ｒｎｌの水素化
ホウ素ナトリウム（４ｍ　ｇ　／　ｍ　ｌ　）水溶液を
加え１時間反応後、この反応液を、３５０ｍＪｌのＰＢ
Ｓ溶液（リン酸緩衝生理食塩水）にて３回（４℃で各々
８．１６．１４時間）透析後遠心分離した。この上清混
和液を用時１重量％ＢＳＡ　Ｃウシ血清アルブミン）−
ＰＢＳ液にて５０００倍に稀釈して供した。

ＩＩ　、抗体結合ビーズの作製 径１／４インチのポリスチレンポール１００個をＩＮ塩
酸−エタノール溶液３０ｍｊＬ中にて一夜放置後、蒸留
水５０ｍＪｌにて３回、生理食塩水（生食）５０ｍｌに
て３回洗節した。この洗浄後のボールを抗ＡＦＰ抗体（
ウサギγ−グロブリン）のＰＢＳ溶液（０，０１５ｇ／
　ｍ　Ｊｌ　）　３０ｒｎｌ中に入れ３７℃で３時間加
温後生食１００ｍ文にて５回洗浄し２重量％　Ｂ５Ａ３
０ｍ愛を入れて、更に３７℃で３時間加温後このＢＳＡ
液を除去し０．１重量％ＢＳＡ３０ｍｊＬを新たに入れ
て４℃で保存し使用時供給した。

■、検量線の作製 遠心分離後の上清（本発明によって得られた酵素標識抗
体：　ＰＯＤ架橋酵素標識抗体）を使用してワンーステ
ップサンドイッチＥＩＡ法にて検量線を作成した。即ち
、試験管内の５０００倍稀釈のＰＯＤ架橋酵素標識抗体
３ｏｏｇ文に標準ＡＦＰ（１０，４０，１６０又は８４
０ｍｇ／ｍＪＬ）　５０　ｕｎ　（又はｌ　００　ａｎ
＞を添加混和後、抗ＡＦＰ抗体結合ポリスチレン・ボー
ル１個を、それぞれの試験管に入れ３７℃にて３０分間
反応後、生食２ｍｕで３回洗詐した。

洗浄後のビーズを新らしい試験管に移し変えた後、２０
　ｍ　Ｍ　Ｏ−二トロフェニルーβ−Ｄ−ガラクトシド
（２０重量％エチレングリコール含有の０．０１ＭＮａ
Ｈ２Ｉ’ＯＮａ　２Ｈ１’０．緩衝液：ｐＨ７，０）０
．５ｍｊＬを注入し３７℃で１０分間振湯（９０回／分
）した０反応停止液として１ＭＮａ２ＣＯ３２、ＯｍＪ
ｌを使用し、４２０ｎｍに於て各標準液濃度の呈色度を
測定した。得られた検量線を図に示す。

〔発明の効果〕

上述の如く本発明の酵素標識法は、抗体又は抗原に糖蛋
白質を介して酵素（ただし、前記糖蛋白質と同一種類の
糖蛋白質は除く）を結合させるため以下に例示する如く
種々の効果を奏する。

（ｉ）架橋反応操作は極めて簡便である。即ち、ＰＯＤ
をＩ標識酵素とする簡易な操作と同様のためである。又
、同様の操作によって他の酵素を標識することが可能で
あるため一つの酵素ＰＯＤの標識技術をマスターするこ
とにより、すべての酵素標識技術をマスターすることに
なる。

（１１）あらゆる酵素を同一原理の反応で標識すること
が（又はさせることが）可能である。

（ＩＩ＋）あらゆる抗体（又は、蛋白抗原）は遊離の−
ＮＨを有するため同一反応原理で糖蛋白質架橋による酵
素標識が可能である。

（１ｖ）糖蛋白質として特に、酵素ＰＯＤを架橋剤とし
て利用する場合、極めて安価な標識法である。

【図面の簡単な説明】

図は本発明の酵素標識法においてＰＯＤ架橋酵素標識抗
体を使用してワン・ステップ・サンドイッチＥＩＡ法に
よって作成した抗ＡＦＰ抗体についての検量線を表わす
図である。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）抗体又は抗原に糖蛋白質を介して酵素（ただし、
   前記糖蛋白質と同一種類の糖蛋白質は除く）を結合させ
   ることを特徴とする酵素標識法。
2. （２）糖蛋白質がパーオキシダーゼであることを特徴と
   する請求項１記載の酵素標識法。