JPH02156154A - 線維芽細胞増殖因子の検出・測定法 - Google Patents
線維芽細胞増殖因子の検出・測定法Info
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Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/475—Assays involving growth factors
- G01N2333/50—Fibroblast growth factors [FGF]
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
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- Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
11上旦皿里公ガ
本発明は、サンドイッチ法による線維芽細胞増殖因子(
以下、FGFと略称することもある。)の検出・測定法
に関する。
以下、FGFと略称することもある。)の検出・測定法
に関する。
甑米皇筺刀
FGFは、ペプチド性因子で、等電点が塩基性の塩基性
FGFと酸性のFGFがあり、共に全アミノ酸配列が明
らかにされているCF、 Eschら;Proc、 N
a11. Acad、 Sci、 USA 85 :
6507(1985)およびに、 A、 Thomas
ら; Proc、 NatlAcad、 Sci、
tlsA 82・6409(4985))。
FGFと酸性のFGFがあり、共に全アミノ酸配列が明
らかにされているCF、 Eschら;Proc、 N
a11. Acad、 Sci、 USA 85 :
6507(1985)およびに、 A、 Thomas
ら; Proc、 NatlAcad、 Sci、
tlsA 82・6409(4985))。
FGFは、in vitroでは3T3細胞や血管内皮
細胞を含む中胚葉由来細胞に対して増殖促進作用を、i
n vivo では血管新生作用を示すことが知ら
れている(D、 Gospodarowiczら;En
docrine Reviews旦: 95(1987
)) 、中でもFGFの血管新生作用は細胞増殖作用と
相まって、損傷、火傷の治療薬、血栓症、動脈硬化症な
どの予防治療薬として用いられるものである。
細胞を含む中胚葉由来細胞に対して増殖促進作用を、i
n vivo では血管新生作用を示すことが知ら
れている(D、 Gospodarowiczら;En
docrine Reviews旦: 95(1987
)) 、中でもFGFの血管新生作用は細胞増殖作用と
相まって、損傷、火傷の治療薬、血栓症、動脈硬化症な
どの予防治療薬として用いられるものである。
発明が解決しようとする課題
天然に存在するFGFは極めて微1であり、特にこれを
ヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極めて困
難であった。さらにこれ迄FGFの定量法として容易に
使える方法は確立されておらず、これらの理由からFG
Fを医薬品として開発する上で欠かすことの出来ないF
GFに関する性状などの基礎知見について不明の点が非
常に多い。
ヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極めて困
難であった。さらにこれ迄FGFの定量法として容易に
使える方法は確立されておらず、これらの理由からFG
Fを医薬品として開発する上で欠かすことの出来ないF
GFに関する性状などの基礎知見について不明の点が非
常に多い。
従って、FGFに関する多くの基礎知見、例えばFGF
の生体内における分布やその産生様式などを知ることが
できれば、該FGFの医薬品としての開発が容易となる
。
の生体内における分布やその産生様式などを知ることが
できれば、該FGFの医薬品としての開発が容易となる
。
また、FGFの量を正確に知ることは、この蛋白質を遺
伝子組換え体から精製する際にも重要である。さらに、
FGFを段毎した動物の血中FGF濃度を追跡すること
は非常に重要であるが、サンプル中に血清が混入するた
め従来の373細胞を用いた方法では測定出来ない。通
常、FGFの測定は血清濃度を下げて培養し、DNA合
成を低下させた3T3細胞にFGFを加え、DNA合成
能がどの程度回復するかにより逆算される。しかしなが
ら、この方法は細胞を用いるため操作が微妙で測定誤差
が大きく、しかも結果を得るのに長時間を要するという
欠点を有する。従って、上記目的のために簡便かつ正確
なFGFの測定手段の開発が望まれている。
伝子組換え体から精製する際にも重要である。さらに、
FGFを段毎した動物の血中FGF濃度を追跡すること
は非常に重要であるが、サンプル中に血清が混入するた
め従来の373細胞を用いた方法では測定出来ない。通
常、FGFの測定は血清濃度を下げて培養し、DNA合
成を低下させた3T3細胞にFGFを加え、DNA合成
能がどの程度回復するかにより逆算される。しかしなが
ら、この方法は細胞を用いるため操作が微妙で測定誤差
が大きく、しかも結果を得るのに長時間を要するという
欠点を有する。従って、上記目的のために簡便かつ正確
なFGFの測定手段の開発が望まれている。
課題を解決するための手段
上記実情にかんがみ、本発明者らはFGFの実用的な測
定手段を見い出すべく種々検討した結果、サンドイッチ
法における二つの結合体のうち、担体に保持する結合体
としてヘパリンを用いることにより、FGFを高感度で
測定することができることを見い出し、これに基づいて
さらに研究した結果、本発明を完成した。
定手段を見い出すべく種々検討した結果、サンドイッチ
法における二つの結合体のうち、担体に保持する結合体
としてヘパリンを用いることにより、FGFを高感度で
測定することができることを見い出し、これに基づいて
さらに研究した結果、本発明を完成した。
本発明は、担体に保持されたヘパリン、被検試料および
標識剤を結合した抗体を用いるサンドイッチ法によって
FGFを検出・測定する方法である。
標識剤を結合した抗体を用いるサンドイッチ法によって
FGFを検出・測定する方法である。
本発明の検出・測定法としては、ラジオイムノアッセイ
(以下、RIAと略称することもある。)でもよく、ま
た酵素免疫測定法(以下、E[Aと略称することもある
。)でもよい。
(以下、RIAと略称することもある。)でもよく、ま
た酵素免疫測定法(以下、E[Aと略称することもある
。)でもよい。
FGFとしては、温血哺乳動物のFGFであればいずれ
でもよい。また、そのムティン(+outein)でも
よい。したがって、本明細書においては、FGFはとく
にことわりのない限り、そのムティンをも含むこともあ
る。
でもよい。また、そのムティン(+outein)でも
よい。したがって、本明細書においては、FGFはとく
にことわりのない限り、そのムティンをも含むこともあ
る。
FGFとしては、酸性のもの(以下、a FGFと略称
することもある。)、塩基性のものく以下、bFGFと
略称することもある。)が挙げられる。
することもある。)、塩基性のものく以下、bFGFと
略称することもある。)が挙げられる。
特に、塩基性FGFが好ましい。
FGFとしては、天然由来のものでもよく、また、遺伝
子工学的手法により製造されたものでもよい。
子工学的手法により製造されたものでもよい。
また、該補乳動物のaFGFの例としては、たとえば、
ウシのa F G F [K、 A、’ Thomas
ら;Proc、 Natl、 Acad、 Sci、
USA 8↓:357(1984)]、ヒトのa F
G F (G、 Gimenez−Galleg。
ウシのa F G F [K、 A、’ Thomas
ら;Proc、 Natl、 Acad、 Sci、
USA 8↓:357(1984)]、ヒトのa F
G F (G、 Gimenez−Galleg。
ら ; f3iochem、 Biophys、
I?es、 Co+a+aun、 ユ38 コロ
11(1986))などがあげられる。
I?es、 Co+a+aun、 ユ38 コロ
11(1986))などがあげられる。
該補乳動物のbFGFの例としては、たとえば、ウシの
bFGF [プロ/−デインゲス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ(Proc、 N
atl、 Acad、 Sci、)USA、第82巻
第6507頁(1985年)]、ヒトのbFGF [ヨ
ー口。
bFGF [プロ/−デインゲス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ(Proc、 N
atl、 Acad、 Sci、)USA、第82巻
第6507頁(1985年)]、ヒトのbFGF [ヨ
ー口。
パ特許公開公報第237966号公報、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション”
ジャーナル(European Molecular
Biology Organization (EM
BO)Journal第5巻、第2523頁(1986
年)〕などがあげられる。
モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション”
ジャーナル(European Molecular
Biology Organization (EM
BO)Journal第5巻、第2523頁(1986
年)〕などがあげられる。
上記ムティンとしては、本来、元のペプチドあるいは蛋
白質のアミノ酸配列が変異したものであり、したがって
該変異としては、アミノ酸付加構成アミノ酸の欠損、他
のアミノ酸への置換が挙げられる。
白質のアミノ酸配列が変異したものであり、したがって
該変異としては、アミノ酸付加構成アミノ酸の欠損、他
のアミノ酸への置換が挙げられる。
該アミノ酸の付加としては、少なくとも1個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。
が付加しているものが挙げられる。
該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも1個のFG
F構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。
F構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。
該池のアミノ酸への置換としては、少なくとも1個のF
GF構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。
GF構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。
FGFに少なくとも1個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも1個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものである
。
ィンにおける少なくとも1個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものである
。
付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも1個
であるが、FGFの特徴を失わない限り何個でもよい。
であるが、FGFの特徴を失わない限り何個でもよい。
さらに好ましくは、FGFと相同性(ホモロジー)が認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。
FGFの少なくとも1個のFGF構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、FGFの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、FGFの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。
FGFの少なくとも1個のFGF構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているムティンにおける置換される前
の少なくとも1個のFGF構成アミノ酸の数としては、
FGFの特徴を失わない限り何個でもよい。
ミノ酸で置換されているムティンにおける置換される前
の少なくとも1個のFGF構成アミノ酸の数としては、
FGFの特徴を失わない限り何個でもよい。
置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のものが挙げられる。
、システィン以外のものが挙げられる。
システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。
置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン。
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン。
アラニン、ロイシン、インロイシン、チロシン。
フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン。
セリン、スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特
に、セリン、スレオニンが好ましい。
に、セリン、スレオニンが好ましい。
置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。
スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。
置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。
スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。
置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、ア
ルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、ア
ルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。
置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。
置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン。
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン。
アスパラギン酸などが挙げられ、特にセリンが好ましい
。
。
置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスハラギ
ン酸、アルギニン、グリンン、セリンバリンが好ましい
。
ン酸、アルギニン、グリンン、セリンバリンが好ましい
。
置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。
置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。
上記の置換においては、2以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、2または3個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。
もよい。特に、2または3個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。
本発明のムティンは、上記した付加、欠損、置換の2つ
または3つが組み合わさったものでもよい。
または3つが組み合わさったものでもよい。
該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術(Sitedirected +sutage
nesis)が採用される。該技術は周知であり、アー
ル・エフ・レイサー(Lather、 R,F、)及び
ジェイ・ピー・レコノク(Lecoq、 J、 P、)
+ジエネテイツク・エンジニアリング(Genetic
Engineering)、アカデミツクブレス社
(1983年)第31−50頁、に示されている。オリ
ゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス(
S+++ith、 M、 )及びニス・キーyム(Gi
lla口、 S、)、ジェネティック・エンジニアリン
グ:原理と方法、プレナムプレス社(1981年)3巻
1−32頁に示されている。
発技術(Sitedirected +sutage
nesis)が採用される。該技術は周知であり、アー
ル・エフ・レイサー(Lather、 R,F、)及び
ジェイ・ピー・レコノク(Lecoq、 J、 P、)
+ジエネテイツク・エンジニアリング(Genetic
Engineering)、アカデミツクブレス社
(1983年)第31−50頁、に示されている。オリ
ゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス(
S+++ith、 M、 )及びニス・キーyム(Gi
lla口、 S、)、ジェネティック・エンジニアリン
グ:原理と方法、プレナムプレス社(1981年)3巻
1−32頁に示されている。
該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、 (a)FGFの構造遺伝子の1本鎖からなる1本鎖DN
Aを突然変異株オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形
成させる(この1本鎖で代替えすベキシスティン用コド
ン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセ
ンス・トリブレットを包含する領域に対して上記ブライ
マーは相捕的なものである。但し、当該コドンの他のア
ミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・
トリブレットとの不一致はこの限りでない。)、(b)
DNAポリメラーゼによりブライマーを伸長させ、突然
変異性へテロニ量体(heteroduplex)を形
成させる、及び (c)この突然変異性へテロニ領域体を複製する。
、たとえば、 (a)FGFの構造遺伝子の1本鎖からなる1本鎖DN
Aを突然変異株オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形
成させる(この1本鎖で代替えすベキシスティン用コド
ン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセ
ンス・トリブレットを包含する領域に対して上記ブライ
マーは相捕的なものである。但し、当該コドンの他のア
ミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・
トリブレットとの不一致はこの限りでない。)、(b)
DNAポリメラーゼによりブライマーを伸長させ、突然
変異性へテロニ量体(heteroduplex)を形
成させる、及び (c)この突然変異性へテロニ領域体を複製する。
次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージDN
Aを単離し、プラスミドへ組み込む。
Aを単離し、プラスミドへ組み込む。
このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。
本発明方法は、非競合法による免疫化学的測定法である
サンドイッチ法の原理に基づいて行なわれるものである
。
サンドイッチ法の原理に基づいて行なわれるものである
。
本発明方法に用いられる担体としては、例えば、ゲル粒
子(例、アガロースゲルし例、セファロース4B1セフ
アロース6B(ファルマンア・ファインケミカル社(ス
エーデン)製)〕、デ牛ストランゲル〔例、セファデッ
クスG−75、セファデックスG−100、セファデッ
クス(、−200(ファルマシア・ファインケミカル社
(スエーデン)製)〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、
バイオゲルP30、バイオゲルP−60.バイオゲルP
−100(バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製
)〕、セルロース粒子〔例、アビセル(脂化成製)、イ
オン交換セルロース(例、ジエチルアミノエチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース)〕、物理的吸着剤
〔例、ガラス(例、ガラス球、ガラスロッド、アミノア
ルキルガラス球、アミノアル牛ルガラスロツド)、シリ
コン片、スチレン系樹脂(例、ポリスチレン球、ポリス
チレン粒子)、イムノアッセイ用プレート(例、ヌンク
社(デンマーク)製月、イオン交換樹脂(例、弱酸性陽
イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIRC−50(ロ
ーム・アンド・ハース社(米国)製)、ゼオカーブ22
6(バームチyト社(西ドイツ)製)) 、弱酸性陽イ
オン交換樹脂〔例、アンバーライトI R−4B、ダウ
エックス3(ダウケミカル社(米国>M)〕)などが挙
げられる。
子(例、アガロースゲルし例、セファロース4B1セフ
アロース6B(ファルマンア・ファインケミカル社(ス
エーデン)製)〕、デ牛ストランゲル〔例、セファデッ
クスG−75、セファデックスG−100、セファデッ
クス(、−200(ファルマシア・ファインケミカル社
(スエーデン)製)〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、
バイオゲルP30、バイオゲルP−60.バイオゲルP
−100(バイオラッド・ラボラトリーズ社(米国)製
)〕、セルロース粒子〔例、アビセル(脂化成製)、イ
オン交換セルロース(例、ジエチルアミノエチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース)〕、物理的吸着剤
〔例、ガラス(例、ガラス球、ガラスロッド、アミノア
ルキルガラス球、アミノアル牛ルガラスロツド)、シリ
コン片、スチレン系樹脂(例、ポリスチレン球、ポリス
チレン粒子)、イムノアッセイ用プレート(例、ヌンク
社(デンマーク)製月、イオン交換樹脂(例、弱酸性陽
イオン交換樹脂〔例、アンバーライトIRC−50(ロ
ーム・アンド・ハース社(米国)製)、ゼオカーブ22
6(バームチyト社(西ドイツ)製)) 、弱酸性陽イ
オン交換樹脂〔例、アンバーライトI R−4B、ダウ
エックス3(ダウケミカル社(米国>M)〕)などが挙
げられる。
本発明方法において用いられるヘパリンとしては、D−
グルコサミン、D−グルクロンfij12.L−イズロ
ン酸からなる多糖のN−硫酸、N−アセチルおよび〇−
硫酸置換体が挙げられる。
グルコサミン、D−グルクロンfij12.L−イズロ
ン酸からなる多糖のN−硫酸、N−アセチルおよび〇−
硫酸置換体が挙げられる。
担体にヘパリンを保持させるには、公知の常套手段を応
用し得るが、例えばヘパリンに高親和性を持つ物質とし
て[S、 5uzuki ら;アナリティカル・バイオ
ケミストリー(Anal、 Biochet)1旦ユニ
to l(1984)] に記載のあるPo1y−L−
1、ysineを用いる方法が挙げられる。
用し得るが、例えばヘパリンに高親和性を持つ物質とし
て[S、 5uzuki ら;アナリティカル・バイオ
ケミストリー(Anal、 Biochet)1旦ユニ
to l(1984)] に記載のあるPo1y−L−
1、ysineを用いる方法が挙げられる。
例えば、Po1y−L−Lysine(P L L )
をlOμg〜100μg/ウェル・96穴プラスチ、ク
プレート(例えばDinatechif (IJSA)
製)、ガラスピーズ。
をlOμg〜100μg/ウェル・96穴プラスチ、ク
プレート(例えばDinatechif (IJSA)
製)、ガラスピーズ。
プラスチックビーズなどの担体に固定する。固定は約4
〜15°C9−夜または室温で約1〜6時間反応させる
ことにより行なわれる。
〜15°C9−夜または室温で約1〜6時間反応させる
ことにより行なわれる。
次いでヘパリンを約lOOμg〜1 mg/ウェル−P
LL固定96穴プラスチツクプレートになるように前述
のPLL固定プレートに固定する。固定は約4〜15℃
、−夜または室温で約1〜6時間反応させることにより
行なわれる。
LL固定96穴プラスチツクプレートになるように前述
のPLL固定プレートに固定する。固定は約4〜15℃
、−夜または室温で約1〜6時間反応させることにより
行なわれる。
その他抗体固定のための各種プレートの市販されている
ものを使うことができる。
ものを使うことができる。
本発明方法の結合体として用いられるFGFに対する抗
体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体で
もよい。
体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体で
もよい。
該FGFに対するポリクローナル抗体は、抗原としての
FGFを温血動物に接種しFGFに対する抗体を産生さ
せ、採取することにより製造される。
FGFを温血動物に接種しFGFに対する抗体を産生さ
せ、採取することにより製造される。
該抗原としてのFGFは、天然のFGFと同様の生物学
的もしくは免疫学的活性を有するものであればいずれで
もよく、例えば遺伝子工学技術により製造されるFGF
や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分
のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよい。これら
の遺伝子工学技術で製造されるFGFはポリペプチドの
アミノ末端にざらにMetを有していてもよく、またF
GFとそのアミノ末端にさらにMetを有するFGFと
の混合物でもよい。
的もしくは免疫学的活性を有するものであればいずれで
もよく、例えば遺伝子工学技術により製造されるFGF
や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分
のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよい。これら
の遺伝子工学技術で製造されるFGFはポリペプチドの
アミノ末端にざらにMetを有していてもよく、またF
GFとそのアミノ末端にさらにMetを有するFGFと
の混合物でもよい。
上記フラグメントは、ペプチド合成の公知の常套手段で
製造し得る。そしてそれは、固相法、液相法のいずれに
よっても良い。名のようなペプチド合成の方法としては
、例えば、”The Peptides第1巻(196
6)、5chr’6der and Lubke著
、Academic Press、 New York
、 U、S、A、、′ペプチド合成”、泉屋ら著、九薔
株式会社(1975)あるいは“ペプチド合成の基礎と
実験”、泉屋ら著、丸善株式会社(1985)に記載の
方法が挙げられる。
製造し得る。そしてそれは、固相法、液相法のいずれに
よっても良い。名のようなペプチド合成の方法としては
、例えば、”The Peptides第1巻(196
6)、5chr’6der and Lubke著
、Academic Press、 New York
、 U、S、A、、′ペプチド合成”、泉屋ら著、九薔
株式会社(1975)あるいは“ペプチド合成の基礎と
実験”、泉屋ら著、丸善株式会社(1985)に記載の
方法が挙げられる。
また、該フラグメントは、適当な酵素によりFGFを切
断することにより製造してもよい。該方法としては、た
とえば、“生化学実験講座1 タンパク質の化学■“、
日本生化学全編、東京化学同人(1976)の255ペ
ージから332ページに記載の方法が挙げられる。
断することにより製造してもよい。該方法としては、た
とえば、“生化学実験講座1 タンパク質の化学■“、
日本生化学全編、東京化学同人(1976)の255ペ
ージから332ページに記載の方法が挙げられる。
上記抗原としてのFGFは、キャリア用蛋白と結合され
る。該キャリアー用蛋白としては、例えば、牛チログロ
ブリン、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、ヘモ
シアニン、フロイントの完全アジュバント(デイフッ社
製)などがあげられる。
る。該キャリアー用蛋白としては、例えば、牛チログロ
ブリン、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、ヘモ
シアニン、フロイントの完全アジュバント(デイフッ社
製)などがあげられる。
該抗原としてのFGFとキャリアー用蛋白との結合には
、公知の常套手段、を用いて実施し得る。
、公知の常套手段、を用いて実施し得る。
結合に用いる試薬としては、例えば、ゲルタールアルデ
ヒド、水溶性カルボジイミドなどがあげられる。抗原と
してのFGFとキャリアー用蛋白との使用比は、約1対
工ないし約1対10が適当であり、反応のpHは、中性
付近、特に約6〜8前後が良好な結果を与える場合が多
い。また、反応に要する時間は、約1〜12時間が良い
場合が多いが、特に、約2〜6時間が適当である。この
ようにして作成された複合物は、常套手段で約O〜18
°C前後で水に対して透析し、凍結して保存しても良い
し、凍結乾燥して保存しても良い。
ヒド、水溶性カルボジイミドなどがあげられる。抗原と
してのFGFとキャリアー用蛋白との使用比は、約1対
工ないし約1対10が適当であり、反応のpHは、中性
付近、特に約6〜8前後が良好な結果を与える場合が多
い。また、反応に要する時間は、約1〜12時間が良い
場合が多いが、特に、約2〜6時間が適当である。この
ようにして作成された複合物は、常套手段で約O〜18
°C前後で水に対して透析し、凍結して保存しても良い
し、凍結乾燥して保存しても良い。
ポリクローナル抗体を製造するためには、上記のように
して製造した免疫原を混血動物に接種される。上記抗体
の製造に用いられる混血動物としては、例えば、捕乳諷
血動物(例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、
モルモット、ウシ、ウマ、ブタ)、鳥類(例、ニワトリ
、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ)などが挙げられる
。免疫原を、1晶血動物に接種する方法としては、動物
に接種する免疫原は、抗体産生をする有効な量でよく、
例えば、ウサギに1回1mgをldの生理食塩水および
フロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならび
に後肢掌皮下に4週問おきに5回接種すると抗体を産生
させる場合が多い。このようにして、温血動物中に形成
された抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは
、通常最終接種後7日から12日の間に耳静脈から採取
し、遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清
は、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるア
フィニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収す
ることによりポリクローナル抗体を精製することが出来
る。
して製造した免疫原を混血動物に接種される。上記抗体
の製造に用いられる混血動物としては、例えば、捕乳諷
血動物(例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、
モルモット、ウシ、ウマ、ブタ)、鳥類(例、ニワトリ
、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ)などが挙げられる
。免疫原を、1晶血動物に接種する方法としては、動物
に接種する免疫原は、抗体産生をする有効な量でよく、
例えば、ウサギに1回1mgをldの生理食塩水および
フロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならび
に後肢掌皮下に4週問おきに5回接種すると抗体を産生
させる場合が多い。このようにして、温血動物中に形成
された抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは
、通常最終接種後7日から12日の間に耳静脈から採取
し、遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清
は、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるア
フィニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収す
ることによりポリクローナル抗体を精製することが出来
る。
また、ミルスティン(Milstein)らの方法〔ネ
イチュア(Nature)、第256巻(1975)、
竿495頁〕に記載の方法と同様の方法により得られる
モノクローナル抗体も利用できる。すなわち、該モノク
ローナル抗体は、免疫原のポリペプチドまたは蛋白複合
体で哺乳動物を免疫し、取り出した肺臓細胞と同種また
は異種のリンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリド
ーマとし、これをクローン化し、ここで得られたハイブ
リドーマを哺乳動物に接種し、モノクローナル抗体を生
成蓄積せしめ、これを採取して製造される。
イチュア(Nature)、第256巻(1975)、
竿495頁〕に記載の方法と同様の方法により得られる
モノクローナル抗体も利用できる。すなわち、該モノク
ローナル抗体は、免疫原のポリペプチドまたは蛋白複合
体で哺乳動物を免疫し、取り出した肺臓細胞と同種また
は異種のリンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリド
ーマとし、これをクローン化し、ここで得られたハイブ
リドーマを哺乳動物に接種し、モノクローナル抗体を生
成蓄積せしめ、これを採取して製造される。
免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔
内、静脈内、筋肉内、陵内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主としては皮下、腹腔内、静脈内に(と
りわけ皮下)注入するのが好ましい。また、免疫間隔、
免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、
例えば2週間隔で約2〜6回免疫し、最終免疫後、約1
〜5回、好ましくは約2〜4日後に摘出した肺臓細胞を
用いる方法がよく用いられる。免疫量は1回にペプチド
量として、マウス当り約0.1μg以上、好ましくは約
10μg〜300μg用いることが望ましい。また、肺
臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上
昇を一確認した上で、肺臓細胞を用いる融合実験を行う
ことが望ましい。
内、静脈内、筋肉内、陵内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主としては皮下、腹腔内、静脈内に(と
りわけ皮下)注入するのが好ましい。また、免疫間隔、
免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、
例えば2週間隔で約2〜6回免疫し、最終免疫後、約1
〜5回、好ましくは約2〜4日後に摘出した肺臓細胞を
用いる方法がよく用いられる。免疫量は1回にペプチド
量として、マウス当り約0.1μg以上、好ましくは約
10μg〜300μg用いることが望ましい。また、肺
臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上
昇を一確認した上で、肺臓細胞を用いる融合実験を行う
ことが望ましい。
上記肺臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘
出したマウスの肺臓細胞を、ヒポキサンチン〜グアニン
ーホスホリボシルトランスフェラーセ欠損(HGPRT
→や、チミジンキナーゼ欠損(TK→の様なマーカーを
持った適切な同種または異種(好ましくは同種)のミエ
ローマ〔例、P3−X63−Ag・8UI(市森 他
ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド 且55
(1985)))等の、リンパ球様細胞株との間で軸合
させる。例えばケラ−およびミルスタインらの方法〔ネ
イチ+−(Nature)256 : 495(197
5))に準じて融合させることにより製造される。たと
えばミエローマ細胞と肺細胞とを約l:5の割合で、た
とえばイスコツ培地とハムF12培地を1:lに混合し
た培地(以下IH培地と称する。)に懸濁させ、センダ
イウィルス、ポリエチレングリコール(PEG)等の融
合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキシド(D
MSO)その池の融合促進剤を加えることも可能である
。PEGの重合度は、ふつう約1000〜6000、
[l’li;を約0.5〜30分、 aIJEハ約10
%〜80%等が用いられるが、好ましい条件の一例とし
て、PEG 6000を約35〜55%で約4〜10
分処理することにより、効率よく融合させることが出来
る。融合細胞は、ヒポキサンチンアミノプテリン−チミ
ジン培地(HAT培地;ネイチャー、λ旦旦、495(
1975))等を用いて、選択的に増殖させることが出
来る。
出したマウスの肺臓細胞を、ヒポキサンチン〜グアニン
ーホスホリボシルトランスフェラーセ欠損(HGPRT
→や、チミジンキナーゼ欠損(TK→の様なマーカーを
持った適切な同種または異種(好ましくは同種)のミエ
ローマ〔例、P3−X63−Ag・8UI(市森 他
ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド 且55
(1985)))等の、リンパ球様細胞株との間で軸合
させる。例えばケラ−およびミルスタインらの方法〔ネ
イチ+−(Nature)256 : 495(197
5))に準じて融合させることにより製造される。たと
えばミエローマ細胞と肺細胞とを約l:5の割合で、た
とえばイスコツ培地とハムF12培地を1:lに混合し
た培地(以下IH培地と称する。)に懸濁させ、センダ
イウィルス、ポリエチレングリコール(PEG)等の融
合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキシド(D
MSO)その池の融合促進剤を加えることも可能である
。PEGの重合度は、ふつう約1000〜6000、
[l’li;を約0.5〜30分、 aIJEハ約10
%〜80%等が用いられるが、好ましい条件の一例とし
て、PEG 6000を約35〜55%で約4〜10
分処理することにより、効率よく融合させることが出来
る。融合細胞は、ヒポキサンチンアミノプテリン−チミ
ジン培地(HAT培地;ネイチャー、λ旦旦、495(
1975))等を用いて、選択的に増殖させることが出
来る。
増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生が
あるか否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には、まず第1段階として免疫した
ペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッ
セイ(tA)法またはエンザイムイムノアッセイ(EI
A)法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法
についても種々の変法が可能である。好ましい測定法の
一例として、EJAを用いるーっの方法について述べる
。セルロースピーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウス
イムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせて
おき、これに測定しだい培養上清や、マウスの血清を加
え、一定時間、定7!!(約4〜40°Cを示す。以下
においても同様。)で反応させる。この後、反応物をよ
(洗った後、酵素で標識したペプチド(酵素とペプチド
を常法に従いカプリングさせた後精製)を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。
あるか否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には、まず第1段階として免疫した
ペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッ
セイ(tA)法またはエンザイムイムノアッセイ(EI
A)法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法
についても種々の変法が可能である。好ましい測定法の
一例として、EJAを用いるーっの方法について述べる
。セルロースピーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウス
イムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせて
おき、これに測定しだい培養上清や、マウスの血清を加
え、一定時間、定7!!(約4〜40°Cを示す。以下
においても同様。)で反応させる。この後、反応物をよ
(洗った後、酵素で標識したペプチド(酵素とペプチド
を常法に従いカプリングさせた後精製)を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。
選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに対
する抗体活性のみられたウェルの細胞は、限界稀釈法等
によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化
された細胞の上清について同様にスクリーニングを行い
抗体価の高いウェルの細胞を増やすことにより、免疫し
たペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマクローンが得られる。
する抗体活性のみられたウェルの細胞は、限界稀釈法等
によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化
された細胞の上清について同様にスクリーニングを行い
抗体価の高いウェルの細胞を増やすことにより、免疫し
たペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマクローンが得られる。
このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばRPMI 1640(MooreG、 E、、
eL、 al、 ジャーナル・オブ・アメリカン・
メディカル・アソシエーンヨン(J、八m、 Med。
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばRPMI 1640(MooreG、 E、、
eL、 al、 ジャーナル・オブ・アメリカン・
メディカル・アソシエーンヨン(J、八m、 Med。
As5oc、)199,549(1967))に約01
〜40%の牛血清を加えた培地等で約2〜10日間、好
ましくは約3〜5日間培養することにより、培養液から
該モノクローナル抗体を得ることができる。また、哺乳
動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取す
ることにより抗体を取得することが出来る。このために
は、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前もって
接種したBA L B / c等のマウスに約1×10
′〜lXlO7個、好ましくは約5X105〜2X10
6個の71イブリドーマを腹腔内に接種し、約7〜20
日後、好ましくは約10〜14日後に腹水液を採取する
。
〜40%の牛血清を加えた培地等で約2〜10日間、好
ましくは約3〜5日間培養することにより、培養液から
該モノクローナル抗体を得ることができる。また、哺乳
動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取す
ることにより抗体を取得することが出来る。このために
は、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前もって
接種したBA L B / c等のマウスに約1×10
′〜lXlO7個、好ましくは約5X105〜2X10
6個の71イブリドーマを腹腔内に接種し、約7〜20
日後、好ましくは約10〜14日後に腹水液を採取する
。
腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、DEAE
−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単
離することが出来る。
−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単
離することが出来る。
であっても良い。なかでも、標識剤を直接結合させる抗
体分子はF ab’であることが好ましい。
体分子はF ab’であることが好ましい。
標識剤としては、RIAの場合は、たとえば放射性同位
元素 34 +tJなどが挙げられる。
元素 34 +tJなどが挙げられる。
該放射性同位元素としては、たとえば、sH1+151
などが挙げられる。
などが挙げられる。
EIAの場合の標識剤としては、たとえば酵素。
蛍光物質1発光物質などが挙げられるが、酵素を用いる
のが好ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなも
のが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキンダ
ーゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好
ましい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のもの
を用いることができるが、その例としてはたとえば西洋
わさび、パイナツプル、イチジク、甘苦、ソラマメ、ト
ウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げら
れ、特に西洋わさびから抽出されたホースラデイツシュ
ペルオキシダーゼ(horserad 1shpero
xidase)(HRP )が好ましい。
のが好ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなも
のが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−D−ガラクトシダーゼ、グルコースオキンダ
ーゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好
ましい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のもの
を用いることができるが、その例としてはたとえば西洋
わさび、パイナツプル、イチジク、甘苦、ソラマメ、ト
ウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げら
れ、特に西洋わさびから抽出されたホースラデイツシュ
ペルオキシダーゼ(horserad 1shpero
xidase)(HRP )が好ましい。
蛍光物質としては、たとえばFITC(Fluores
cein l5othiocyanate)、 ロ
ーダミン、ランクナイドキレートなどが挙げられる。
cein l5othiocyanate)、 ロ
ーダミン、ランクナイドキレートなどが挙げられる。
発光物質としては、たとえば、アクリジニウムエステル
などが挙げられる。
などが挙げられる。
抗体に標識剤を結合させるには、公知の常套手段を応用
し得るが、例えば+251を抗体に結合させることがで
きる。この方法には公知の常套手段を応用し得るが、例
えば、[K、 M、 Furgusonら; ^cta
Endocrinol、 5upple、 22
5 : l 30 (1979))に記載のIodog
enを用いる方法もある。
し得るが、例えば+251を抗体に結合させることがで
きる。この方法には公知の常套手段を応用し得るが、例
えば、[K、 M、 Furgusonら; ^cta
Endocrinol、 5upple、 22
5 : l 30 (1979))に記載のIodog
enを用いる方法もある。
本発明の測定系における被検試料としては、尿、面清、
面漿、髄液等の体液、あるいは、細胞や菌体の抽出液ま
たはその培養上清が挙げられる。
面漿、髄液等の体液、あるいは、細胞や菌体の抽出液ま
たはその培養上清が挙げられる。
本発明の測定方法のEIAの例として、標識剤がベルオ
キ/ダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ベルオキ/ダーゼに限定されるものではない。
キ/ダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ベルオキ/ダーゼに限定されるものではない。
まず、■担体に保持されたヘパリンに、測定すべきFG
Fを含む被検試料を加えてFGFを結合させ、これに、
ペルオキシダーゼを結合した抗体を加え反応させる。
Fを含む被検試料を加えてFGFを結合させ、これに、
ペルオキシダーゼを結合した抗体を加え反応させる。
■・ ■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基
質を加え、生じた物質の吸光度らしくは蛍光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
質を加え、生じた物質の吸光度らしくは蛍光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。
■: 上記■〜■の操作を既知量のFGFの標準溶液に
対してあらかじめ行い、FGFと吸光度もしくは蛍光強
度との関係を標準曲線として作成しておく。
対してあらかじめ行い、FGFと吸光度もしくは蛍光強
度との関係を標準曲線として作成しておく。
■: 未知量のFGFを含む分析対象物(被検試料)に
ついて得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあ
てはめ、分析対象物中のFGFの量を測定する。
ついて得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあ
てはめ、分析対象物中のFGFの量を測定する。
本発明の測定方法のRIAの例として、標識剤が125
1の場合について以下に具体的に説明するが、1151
に限定されるものではない。
1の場合について以下に具体的に説明するが、1151
に限定されるものではない。
まず■担体に保持されたヘパリンに測定すべきFGFを
含む被検試薬を加えてFGFと結合させ、これに1″5
Iを結合した抗体(直接に抗FGF抗体に1151を結
合させた場合と、非標識抗FGF抗体とlff151を
結合させた2次抗体とを組み合わせた場合がある。)を
加え反応させる。
含む被検試薬を加えてFGFと結合させ、これに1″5
Iを結合した抗体(直接に抗FGF抗体に1151を結
合させた場合と、非標識抗FGF抗体とlff151を
結合させた2次抗体とを組み合わせた場合がある。)を
加え反応させる。
■ ■で得られた反応生成物のγ−放射活性を測定する
。
。
■ 上記■−■の操作を既知量のFGFの標準液に対し
てあらかじめ行いFGFとγ−放射活性の関係を標準曲
線として作成しておく。
てあらかじめ行いFGFとγ−放射活性の関係を標準曲
線として作成しておく。
■ 未知量のFGFを含む分析対象物(被検試料)につ
いて得られたγ−放射活性を標準曲線にあてはめ分析対
象物中のFGFの量を測定する。
いて得られたγ−放射活性を標準曲線にあてはめ分析対
象物中のFGFの量を測定する。
不法は今後、臨床検体(血液、血清、血漿、尿。
胸水2M液など)中のFGFの検出・測定や、FGFの
組織内、臓器内分布の検討に有力な手段を提供するもの
である。
組織内、臓器内分布の検討に有力な手段を提供するもの
である。
本発明方法においては、担体に保持された結合体トシて
、ヘパリンを用いるため、測定感度が高く、血中のFG
FIが測定できる。これを利用して癌の診断薬にも応用
可能である。
、ヘパリンを用いるため、測定感度が高く、血中のFG
FIが測定できる。これを利用して癌の診断薬にも応用
可能である。
本明細書において、アミノ酸などを略号で表示する場合
、rUPAc−ILIB Coasision o
nBioche+5ical Nomenclatu
reによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を下記する。また、アミノ酸に
関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
L−体を示すものとする。
、rUPAc−ILIB Coasision o
nBioche+5ical Nomenclatu
reによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を下記する。また、アミノ酸に
関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
L−体を示すものとする。
Tyr: チロシン
Nle: ノルロイシン
以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるべきものではない。
が、本発明はこれらに限定されるべきものではない。
実施例1
(1)抗CTyr目) ヒトbF G F (1−1
1)N le”ウサギ抗体の調整 ペプチド(Tyr”)ヒトbF G F (1−11)
N le”CM、 Bodanszky、 Y、 S、
Klausner、 M、 A、 0ndetti″
Peptide 5ynthesis″John W
eily and 5ons。
1)N le”ウサギ抗体の調整 ペプチド(Tyr”)ヒトbF G F (1−11)
N le”CM、 Bodanszky、 Y、 S、
Klausner、 M、 A、 0ndetti″
Peptide 5ynthesis″John W
eily and 5ons。
N、Y、(1976)に記載の方法と同様の方法で製造
される。なお、水晶は、Alberta Pepti
deInstitute、 Edmonton ^
Iberta、 Canadaから購入した。〕をK
L H(Keyhole LiapetHemoc
yanin)とゲルタールアルデヒドを用いて結合した
ものを、該ペプチドが100μg/rnlとなるように
リン酸緩衝液(PBS)(NaCQ8000mg/Q
、KCl2200mg#!、NaHPO,・7H,02
160a+g/12. KHtPO4200mg/12
.MgCQt。
される。なお、水晶は、Alberta Pepti
deInstitute、 Edmonton ^
Iberta、 Canadaから購入した。〕をK
L H(Keyhole LiapetHemoc
yanin)とゲルタールアルデヒドを用いて結合した
ものを、該ペプチドが100μg/rnlとなるように
リン酸緩衝液(PBS)(NaCQ8000mg/Q
、KCl2200mg#!、NaHPO,・7H,02
160a+g/12. KHtPO4200mg/12
.MgCQt。
6 H* OI OOIIg/(りに溶かしたものを等
量のフロイントコンブリートアジコバント(Difco
社)と混合した。これをウサギの筋肉内へ11Idl投
与し、以後2週間毎に上記合成ペプチド100μg/1
nllを等量のインコンプリートアジュバント(Dir
e□社)と混合したものを投与した。計5回投与して得
られた血液を室温に5時間静置後、4°Cに16時間放
置したのち3000 rpm、 10分間遠心し、そ
の上清を抗(Tyr目) ヒトbF G F (1−
11)N le”ウサギ血清とした。また、臭化シアン
活性化セファロース4B(ファルマシア?f)0.5g
をグラスフィルターに移し、2C7の0.001N塩酸
を加えて充分に膨潤させたのち、400滅の同塩酸溶液
でよく洗浄した。一方、100μQの(Tyr”]ヒト
b F G F (1−11)N le”ペプチド溶液
(蛋白■40 mg/d)へ2蔵の0.1M重炭酸ナト
リウム0.5M塩化ナトリウム溶液を加えたのち、0.
1M水酸化ナトリウム溶液でpHを8.4に調整した。
量のフロイントコンブリートアジコバント(Difco
社)と混合した。これをウサギの筋肉内へ11Idl投
与し、以後2週間毎に上記合成ペプチド100μg/1
nllを等量のインコンプリートアジュバント(Dir
e□社)と混合したものを投与した。計5回投与して得
られた血液を室温に5時間静置後、4°Cに16時間放
置したのち3000 rpm、 10分間遠心し、そ
の上清を抗(Tyr目) ヒトbF G F (1−
11)N le”ウサギ血清とした。また、臭化シアン
活性化セファロース4B(ファルマシア?f)0.5g
をグラスフィルターに移し、2C7の0.001N塩酸
を加えて充分に膨潤させたのち、400滅の同塩酸溶液
でよく洗浄した。一方、100μQの(Tyr”]ヒト
b F G F (1−11)N le”ペプチド溶液
(蛋白■40 mg/d)へ2蔵の0.1M重炭酸ナト
リウム0.5M塩化ナトリウム溶液を加えたのち、0.
1M水酸化ナトリウム溶液でpHを8.4に調整した。
この溶液へ上記臭化/アン活性化セファロース4Bを加
え、室温で2時間反応した。反応後、ゲルをグラスフィ
ルターに移し、100dの0.1M重炭酸ナトリウム0
.5M塩化ナトリウム溶液で洗浄した。ついで、lOd
のQ、1M Tris塩酸pH8,0溶液中へゲルを加
え、ゆっくり撹拌しながら4°Cで200時間反応せて
、残存活性基をマスクした。ゲルはO,1M1!!炭酸
ナトリウム溶液、1M食塩含有0.1M酢酸(pH4,
0)、IM食塩含有O1IMホウ酸緩衝液(pH8,0
)各tooyで順次洗浄した。水晶をPBSに懸濁して
カラムにつめ、4°Cに保存した。
え、室温で2時間反応した。反応後、ゲルをグラスフィ
ルターに移し、100dの0.1M重炭酸ナトリウム0
.5M塩化ナトリウム溶液で洗浄した。ついで、lOd
のQ、1M Tris塩酸pH8,0溶液中へゲルを加
え、ゆっくり撹拌しながら4°Cで200時間反応せて
、残存活性基をマスクした。ゲルはO,1M1!!炭酸
ナトリウム溶液、1M食塩含有0.1M酢酸(pH4,
0)、IM食塩含有O1IMホウ酸緩衝液(pH8,0
)各tooyで順次洗浄した。水晶をPBSに懸濁して
カラムにつめ、4°Cに保存した。
前3己血を青をこのカラム(こか(ナカラムハ280n
I11の吸収がなくなるまでPBSで十分にδL浄した
。
I11の吸収がなくなるまでPBSで十分にδL浄した
。
ついで0.2Mグリシン塩酸緩衝液(pH2,3)10
%Dioxaneで溶出を行い、溶出画分に、すぐ17
3量のLM Tris HCQ (pH7,4)を添
加し中和した。この溶液をPBSに対して4°Cて16
時間透析した。透析後10.O’OOrpm、10分間
遠心し、その上清液を抗[Tyr”] ヒトbFGF
(1−11)N le”ウサギ抗体として用いた。
%Dioxaneで溶出を行い、溶出画分に、すぐ17
3量のLM Tris HCQ (pH7,4)を添
加し中和した。この溶液をPBSに対して4°Cて16
時間透析した。透析後10.O’OOrpm、10分間
遠心し、その上清液を抗[Tyr”] ヒトbFGF
(1−11)N le”ウサギ抗体として用いた。
本抗体の特異性をみるために、ウシ角膜内皮細胞(BC
E cell)の培養上清中のヘパリン結合タンパクと
組換体bFGF’EsDs−PAGEにかけ、た(第【
図参照)。
E cell)の培養上清中のヘパリン結合タンパクと
組換体bFGF’EsDs−PAGEにかけ、た(第【
図参照)。
(2)ヘパリンをコートしたマイクロタイタープレート
による2−サイトのラジオイムノアッセイ(RIA) 96ウエルマイクロタイタープレート([)inate
ch) (96−well Hat bottom
edpolyvinychloride m1cro
titer plate、 DynaLechLobo
ratories、^1exandria、 Virg
inia、 U、S、A、)のウェル間の差をなくすた
めに、生理食塩水10川%Tveen20で洗浄した後
、蒸留水ですすいで、エタノールで処理してよ(乾燥し
たものを以下の過程で用いた。
による2−サイトのラジオイムノアッセイ(RIA) 96ウエルマイクロタイタープレート([)inate
ch) (96−well Hat bottom
edpolyvinychloride m1cro
titer plate、 DynaLechLobo
ratories、^1exandria、 Virg
inia、 U、S、A、)のウェル間の差をなくすた
めに、生理食塩水10川%Tveen20で洗浄した後
、蒸留水ですすいで、エタノールで処理してよ(乾燥し
たものを以下の過程で用いた。
ポリーL−リジン(シグマ社製)を蒸留水に100μg
/aJとなるように溶かし、100μe/ウエルで上記
°のプレートに入れた。これを4°Cで−装置き、溶液
を捨てた後、各ウェルを蒸留水で洗浄して、ポリーL−
リジンをコートしたプレートとした。
/aJとなるように溶かし、100μe/ウエルで上記
°のプレートに入れた。これを4°Cで−装置き、溶液
を捨てた後、各ウェルを蒸留水で洗浄して、ポリーL−
リジンをコートしたプレートとした。
次にヘパリン(シグマ社製)をl mg/mflとなる
ように蒸留水に溶かし、100μρ/ウエルで上記のポ
リ−し一リジンをコートしたプレートに入れた。
ように蒸留水に溶かし、100μρ/ウエルで上記のポ
リ−し一リジンをコートしたプレートに入れた。
これを4°Cで一装置き、溶液を捨てた後。各ウェルを
蒸留水で洗浄して、ヘパリンをコートしたプレートとし
た。
蒸留水で洗浄して、ヘパリンをコートしたプレートとし
た。
このプレートの各ウェルに1%牛血清アルブミン(B
S A)/P B Sを200μσ入れ、4°Cで一装
置き、溶液を捨てた後、0.5M NaCQ/PBSで
洗浄して非特異的にヘパリンを結合しているタンパクを
除去した。このようにしてブロッキングを行ったプレー
トを用いて以下のRIAを行った。
S A)/P B Sを200μσ入れ、4°Cで一装
置き、溶液を捨てた後、0.5M NaCQ/PBSで
洗浄して非特異的にヘパリンを結合しているタンパクを
除去した。このようにしてブロッキングを行ったプレー
トを用いて以下のRIAを行った。
0.1%BSA/PBSにより適当に希釈した試料を1
00μσずつプレートの各ウェルに入れて、4°Cで一
装置いた。このとき、バックグラウンドをとるために0
.1%BSA/DMEM/25mM Tris−HCσ
(pH7,4)あるいは0,1%B S A/l Or
aM MgCL/25mM Tris−HC(1(p
H7,4)を入れたウェルを同時に用意しておいた。D
MEM:Dulbeccos Modified
Eagle’sMedium。
00μσずつプレートの各ウェルに入れて、4°Cで一
装置いた。このとき、バックグラウンドをとるために0
.1%BSA/DMEM/25mM Tris−HCσ
(pH7,4)あるいは0,1%B S A/l Or
aM MgCL/25mM Tris−HC(1(p
H7,4)を入れたウェルを同時に用意しておいた。D
MEM:Dulbeccos Modified
Eagle’sMedium。
試料のプレートへの吸着を行った後、0.1%B S
A/ P B S/ l OIIIM MgCQt
テ各ウェルを洗浄し、実施例1(1)に記した抗〔Ty
rl′〕 ヒトbF G F (1−11)N le”
ウサギ抗体を0.1%BSA/ P B S / 10
mM MgC(hで10−’−2Xto−’に希釈し
て各ウェルに100μQ加えて、4°Cで一装置いた。
A/ P B S/ l OIIIM MgCQt
テ各ウェルを洗浄し、実施例1(1)に記した抗〔Ty
rl′〕 ヒトbF G F (1−11)N le”
ウサギ抗体を0.1%BSA/ P B S / 10
mM MgC(hで10−’−2Xto−’に希釈し
て各ウェルに100μQ加えて、4°Cで一装置いた。
さらに、0.1%B S A/ P B S/ l O
mM MgCQ、でプレートを洗浄した後、1161−
抗つサギIgGヤギ抗体Fab″(マイズル社製)を0
.1%BSA/PBST100O〜5000倍に希釈し
、プレートの各ウェルに100μQずつ加えて、40C
で一装置いた。プレートをO11%BSA/PB S
/ 10 mM MgCQ−で十分洗浄した後、各ウェ
ルをハサミで切り取り、ガンマ−カウンターで各ウェル
のカウントを測定した。組み操体由来ウシbFGFを用
いてこのRIAを行って得られた標準曲線は第2図に示
すようになった(n=4.m±S D、 ”p<0.0
5. ”p<0.01)。この曲線は1〜10pgのb
FGFを検出できることを示している。なお、該組み操
体由来ウシbFGFは、アムジエン社(U、 S、 A
、 )より購入した。
mM MgCQ、でプレートを洗浄した後、1161−
抗つサギIgGヤギ抗体Fab″(マイズル社製)を0
.1%BSA/PBST100O〜5000倍に希釈し
、プレートの各ウェルに100μQずつ加えて、40C
で一装置いた。プレートをO11%BSA/PB S
/ 10 mM MgCQ−で十分洗浄した後、各ウェ
ルをハサミで切り取り、ガンマ−カウンターで各ウェル
のカウントを測定した。組み操体由来ウシbFGFを用
いてこのRIAを行って得られた標準曲線は第2図に示
すようになった(n=4.m±S D、 ”p<0.0
5. ”p<0.01)。この曲線は1〜10pgのb
FGFを検出できることを示している。なお、該組み操
体由来ウシbFGFは、アムジエン社(U、 S、 A
、 )より購入した。
また、上記と同様の方法でウシ角膜内皮細胞(BCE
cell)を無血清培地で培養した場合、培養液中に放
出されるbFGFffiを経時的に測定すると第3図に
示すようになった(n=3.m+sE)。
cell)を無血清培地で培養した場合、培養液中に放
出されるbFGFffiを経時的に測定すると第3図に
示すようになった(n=3.m+sE)。
さらに、上記と同様の方法でBCE細胞を上皮細胞増殖
因子(EGF)で刺激して放出されるbFGF量も検出
された(第4図)。
因子(EGF)で刺激して放出されるbFGF量も検出
された(第4図)。
また、上記と同様の方法で、ヒト癌細胞U87MGが無
血清培地で培養されたときに放出されるbFGJlも本
方法で検出することができた(第5図、n−3,m+s
E)。
血清培地で培養されたときに放出されるbFGJlも本
方法で検出することができた(第5図、n−3,m+s
E)。
次に、上記と同様の方法で血清が本RIAに与える影響
を調べた結果を第6図に示す。なお、このときP L
L (Poly−L−Lysine)は300μg/h
uヘパリン103 mg/dを用いた。第6図において
、ローは5%FC3の、−〇−は10%FC3の、X−
は20%FC3の場合の結果をそれぞれ示す。
を調べた結果を第6図に示す。なお、このときP L
L (Poly−L−Lysine)は300μg/h
uヘパリン103 mg/dを用いた。第6図において
、ローは5%FC3の、−〇−は10%FC3の、X−
は20%FC3の場合の結果をそれぞれ示す。
発明の効果
本発明のFGFの検出・測定法によると、FGFを高感
度に測定することができるので、体液や細胞中のFGF
を有利に検出、測定することができる。
度に測定することができるので、体液や細胞中のFGF
を有利に検出、測定することができる。
第1図は、実施例1(1)で得られた、抗〔Tyrl′
〕ヒトbF G F (1−11)N le”ウサギ抗
体のウェスターンブロッティングの結果を示す。 第2図は、実施例1(2)で得られた、組み操体由来つ
/bF G Fを用いたRIAの標準曲線を示す。 第3図は、実施例1(2)で得られた、ウシ角膜内皮細
胞培養液中のbFGF量を示す。 第4図は、実施例1(2)で得られた、BCE細胞培養
液中のbFGFの量を示す。 第5図は、実施例1(2)で得られた、胞培養液中のb
FGFの■を示す。 第6図は、実施例1(2)で得られた、下でのbFGF
測定への影響を示す。
〕ヒトbF G F (1−11)N le”ウサギ抗
体のウェスターンブロッティングの結果を示す。 第2図は、実施例1(2)で得られた、組み操体由来つ
/bF G Fを用いたRIAの標準曲線を示す。 第3図は、実施例1(2)で得られた、ウシ角膜内皮細
胞培養液中のbFGF量を示す。 第4図は、実施例1(2)で得られた、BCE細胞培養
液中のbFGFの量を示す。 第5図は、実施例1(2)で得られた、胞培養液中のb
FGFの■を示す。 第6図は、実施例1(2)で得られた、下でのbFGF
測定への影響を示す。
Claims (2)
- (1)担体に保持されたヘパリン、被検試料および標識
剤を結合した抗体を用いるサンドイッチ法によって線維
芽細胞増殖因子(FGF)を検出・測定することを特徴
とするFGFの検出・測定法。 - (2)FGFが塩基性FGFである請求項1記載の検出
・測定法。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63310856A JPH02156154A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | 線維芽細胞増殖因子の検出・測定法 |
US07/345,220 US5187062A (en) | 1988-12-07 | 1989-04-28 | Method for detecting and measuring FGF |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63310856A JPH02156154A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | 線維芽細胞増殖因子の検出・測定法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH02156154A true JPH02156154A (ja) | 1990-06-15 |
Family
ID=18010214
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63310856A Pending JPH02156154A (ja) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | 線維芽細胞増殖因子の検出・測定法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5187062A (ja) |
JP (1) | JPH02156154A (ja) |
Families Citing this family (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0420081A1 (en) * | 1989-09-26 | 1991-04-03 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Monoclonal antibody against an acidic FGF protein, its production and use |
US6346510B1 (en) * | 1995-10-23 | 2002-02-12 | The Children's Medical Center Corporation | Therapeutic antiangiogenic endostatin compositions |
AU2002224558A1 (en) * | 2000-07-11 | 2002-02-05 | The Regents Of The University Of California | Method of diagnosing breast cancer using nipple fluid |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4652532A (en) * | 1984-12-24 | 1987-03-24 | Bain James D | Free radical based biochemical method for detecting substances in fluids |
-
1988
- 1988-12-07 JP JP63310856A patent/JPH02156154A/ja active Pending
-
1989
- 1989-04-28 US US07/345,220 patent/US5187062A/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
US5187062A (en) | 1993-02-16 |
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