JPH02156154A

JPH02156154A - 線維芽細胞増殖因子の検出・測定法

Info

Publication number: JPH02156154A
Application number: JP63310856A
Authority: JP
Inventors: Yuji Sato; 雄二佐藤; Jii Furiizen Henrii; ヘンリー　ジー　フリーゼン
Original assignee: Takeda Chemical Industries Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1988-12-07
Filing date: 1988-12-07
Publication date: 1990-06-15
Also published as: US5187062A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】１１上旦皿里公ガ本発明は、サンドイッチ法による線維芽細胞増殖因子（
以下、ＦＧＦと略称することもある。）の検出・測定法
に関する。

甑米皇筺刀ＦＧＦは、ペプチド性因子で、等電点が塩基性の塩基性
ＦＧＦと酸性のＦＧＦがあり、共に全アミノ酸配列が明
らかにされているＣＦ、　Ｅｓｃｈら；Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａ１１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　８５　：　
６５０７（１９８５）およびに、　Ａ、　Ｔｈｏｍａｓ
ら；　Ｐｒｏｃ、　ＮａｔｌＡｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　
　ｔｌｓＡ　８２・６４０９（４９８５））。

ＦＧＦは、ｉｎ　ｖｉｔｒｏでは３Ｔ３細胞や血管内皮
細胞を含む中胚葉由来細胞に対して増殖促進作用を、ｉ
ｎ　　ｖｉｖｏ　　では血管新生作用を示すことが知ら
れている（Ｄ、　Ｇｏｓｐｏｄａｒｏｗｉｃｚら；Ｅｎ
ｄｏｃｒｉｎｅ　Ｒｅｖｉｅｗｓ旦：　９５（１９８７
））　、中でもＦＧＦの血管新生作用は細胞増殖作用と
相まって、損傷、火傷の治療薬、血栓症、動脈硬化症な
どの予防治療薬として用いられるものである。

発明が解決しようとする課題天然に存在するＦＧＦは極めて微１であり、特にこれを
ヒトの組織から得る試みは種々の制約によって極めて困
難であった。さらにこれ迄ＦＧＦの定量法として容易に
使える方法は確立されておらず、これらの理由からＦＧ
Ｆを医薬品として開発する上で欠かすことの出来ないＦ
ＧＦに関する性状などの基礎知見について不明の点が非
常に多い。

従って、ＦＧＦに関する多くの基礎知見、例えばＦＧＦ
の生体内における分布やその産生様式などを知ることが
できれば、該ＦＧＦの医薬品としての開発が容易となる
。

また、ＦＧＦの量を正確に知ることは、この蛋白質を遺
伝子組換え体から精製する際にも重要である。さらに、
ＦＧＦを段毎した動物の血中ＦＧＦ濃度を追跡すること
は非常に重要であるが、サンプル中に血清が混入するた
め従来の３７３細胞を用いた方法では測定出来ない。通
常、ＦＧＦの測定は血清濃度を下げて培養し、ＤＮＡ合
成を低下させた３Ｔ３細胞にＦＧＦを加え、ＤＮＡ合成
能がどの程度回復するかにより逆算される。しかしなが
ら、この方法は細胞を用いるため操作が微妙で測定誤差
が大きく、しかも結果を得るのに長時間を要するという
欠点を有する。従って、上記目的のために簡便かつ正確
なＦＧＦの測定手段の開発が望まれている。

課題を解決するための手段上記実情にかんがみ、本発明者らはＦＧＦの実用的な測
定手段を見い出すべく種々検討した結果、サンドイッチ
法における二つの結合体のうち、担体に保持する結合体
としてヘパリンを用いることにより、ＦＧＦを高感度で
測定することができることを見い出し、これに基づいて
さらに研究した結果、本発明を完成した。

本発明は、担体に保持されたヘパリン、被検試料および
標識剤を結合した抗体を用いるサンドイッチ法によって
ＦＧＦを検出・測定する方法である。

本発明の検出・測定法としては、ラジオイムノアッセイ
（以下、ＲＩＡと略称することもある。）でもよく、ま
た酵素免疫測定法（以下、Ｅ［Ａと略称することもある
。）でもよい。

ＦＧＦとしては、温血哺乳動物のＦＧＦであればいずれ
でもよい。また、そのムティン（＋ｏｕｔｅｉｎ）でも
よい。したがって、本明細書においては、ＦＧＦはとく
にことわりのない限り、そのムティンをも含むこともあ
る。

ＦＧＦとしては、酸性のもの（以下、ａ　ＦＧＦと略称
することもある。）、塩基性のものく以下、ｂＦＧＦと
略称することもある。）が挙げられる。

特に、塩基性ＦＧＦが好ましい。

ＦＧＦとしては、天然由来のものでもよく、また、遺伝
子工学的手法により製造されたものでもよい。

また、該補乳動物のａＦＧＦの例としては、たとえば、
ウシのａ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　［Ｋ、　Ａ、’　Ｔｈｏｍａｓ
ら；Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　
ＵＳＡ　８↓：３５７（１９８４）］、ヒトのａ　Ｆ　
Ｇ　Ｆ　（Ｇ、　Ｇｉｍｅｎｅｚ−Ｇａｌｌｅｇ。

ら　；　ｆ３ｉｏｃｈｅｍ、　　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　　
Ｉ？ｅｓ、　　Ｃｏ＋ａ＋ａｕｎ、　　ユ３８　　コロ
１１（１９８６））などがあげられる。

該補乳動物のｂＦＧＦの例としては、たとえば、ウシの
ｂＦＧＦ　［プロ／−デインゲス・オブ・ザ・ナショナ
ル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、）ＵＳＡ、第８２巻　
第６５０７頁（１９８５年）］、ヒトのｂＦＧＦ　［ヨ
ー口。

パ特許公開公報第２３７９６６号公報、ヨーロピアン・
モレキュラー・バイオロジー・オーガナイゼイション”
ジャーナル（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｂｉｏｌｏｇｙ　　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　（ＥＭ
ＢＯ）Ｊｏｕｒｎａｌ第５巻、第２５２３頁（１９８６
年）〕などがあげられる。

上記ムティンとしては、本来、元のペプチドあるいは蛋
白質のアミノ酸配列が変異したものであり、したがって
該変異としては、アミノ酸付加構成アミノ酸の欠損、他
のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ酸
が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のＦＧ
Ｆ構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該池のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個のＦ
ＧＦ構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。

ＦＧＦに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
ィンにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものである
。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１個
であるが、ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

さらに好ましくは、ＦＧＦと相同性（ホモロジー）が認
められており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配
列の一部あるいはすべてが挙げられる。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が欠損し
ているムティンにおける欠損している構成アミノ酸の数
としては、ＦＧＦの有する特徴を失わない限り何個でも
よい。

ＦＧＦの少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸が別のア
ミノ酸で置換されているムティンにおける置換される前
の少なくとも１個のＦＧＦ構成アミノ酸の数としては、
ＦＧＦの特徴を失わない限り何個でもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システィン
、システィン以外のものが挙げられる。

システィンが特に好ましい。置換される前の構成アミノ
酸としてシスティン以外のものとしては、アスパラギン
酸、アルギニン、グリシン、バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシスティンである場合に
は、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミノ
酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、たと
えば、グリシン、バリン。

アラニン、ロイシン、インロイシン、チロシン。

フェニルアラニン、ヒスチジン、トリプトファン。

セリン、スレオニン、メチオニンなどが挙げられる。特
に、セリン、スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシスティン以外のもので
ある場合には、置換された別のアミノ酸としては、たと
えば、アミノ酸の親水性、疎水性あるいは電荷の点で、
置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつものを選
ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラギン
酸の場合には、置換されたあとのアミノ酸としてアスパ
ラギン。

スレオニン、バリン、フェニルアラニン、アルギニンな
どが挙げられるが、特にアスパラギン、アルギニンが好
ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換さ
れたあとのアミノ酸としてグルタミン。

スレオニン、ロイシン、フェニルアラニン、アスパラギ
ン酸が挙げられるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合には
、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン、ロ
イシン、フェニルアラニン、セリン、グルタミン酸、ア
ルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン、アラ
ニン、ロイシン、システィン、グルタミン、アルギニン
、アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニンが好
ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合には、
置換されたあとのアミノ酸としては、セリン、ロイシン
、プロリン、グリシン、リジン。

アスパラギン酸などが挙げられ、特にセリンが好ましい
。

置換される前の元の構成アミノ酸としては、アスハラギ
ン酸、アルギニン、グリンン、セリンバリンが好ましい
。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン、グ
ルタミン、アルギニン、スレオニン、メチオニン、セリ
ン、ロイシンが好ましい。

置換されたムティンの最も好ましいものとしては、構成
アミノ酸であるシスティンがセリンに置換されたものが
最も好ましい。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なって
もよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換され
るのが好ましい。

本発明のムティンは、上記した付加、欠損、置換の２つ
または３つが組み合わさったものでもよい。

該ムティンを製造するためには、特定部位指向性変異誘
発技術（Ｓｉｔｅｄｉｒｅｃｔｅｄ　　＋ｓｕｔａｇｅ
ｎｅｓｉｓ）が採用される。該技術は周知であり、アー
ル・エフ・レイサー（Ｌａｔｈｅｒ、　Ｒ，Ｆ、）及び
ジェイ・ピー・レコノク（Ｌｅｃｏｑ、　Ｊ、　Ｐ、）
＋ジエネテイツク・エンジニアリング（Ｇｅｎｅｔｉｃ
　　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ）、アカデミツクブレス社
（１９８３年）第３１−５０頁、に示されている。オリ
ゴヌクレオチドに指示された変異誘発はエム・スミス（
Ｓ＋＋＋ｉｔｈ、　Ｍ、　）及びニス・キーｙム（Ｇｉ
ｌｌａ口、　Ｓ、）、ジェネティック・エンジニアリン
グ：原理と方法、プレナムプレス社（１９８１年）３巻
　１−３２頁に示されている。

該ムティンをコードする構造遺伝子を製造するためには
、たとえば、（ａ）ＦＧＦの構造遺伝子の１本鎖からなる１本鎖ＤＮ
Ａを突然変異株オリゴヌクレオチドブライマーと雑種形
成させる（この１本鎖で代替えすベキシスティン用コド
ン、又は場合によりこのコドンと対合をつくるアンチセ
ンス・トリブレットを包含する領域に対して上記ブライ
マーは相捕的なものである。但し、当該コドンの他のア
ミノ酸暗号化用コドン、又は場合によりアンチセンス・
トリブレットとの不一致はこの限りでない。）、（ｂ）
ＤＮＡポリメラーゼによりブライマーを伸長させ、突然
変異性へテロニ量体（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形
成させる、及び（ｃ）この突然変異性へテロニ領域体を複製する。

次に、突然変異化された遺伝子を運搬するファージＤＮ
Ａを単離し、プラスミドへ組み込む。

このようにして得られたプラスミドで適当な宿主を形質
転換し、得られた形質転換体を培地に培養することによ
り、ムティンを製造することができる。

本発明方法は、非競合法による免疫化学的測定法である
サンドイッチ法の原理に基づいて行なわれるものである
。

本発明方法に用いられる担体としては、例えば、ゲル粒
子（例、アガロースゲルし例、セファロース４Ｂ１セフ
アロース６Ｂ（ファルマンア・ファインケミカル社（ス
エーデン）製）〕、デ牛ストランゲル〔例、セファデッ
クスＧ−７５、セファデックスＧ−１００、セファデッ
クス（、−２００（ファルマシア・ファインケミカル社
（スエーデン）製）〕、ポリアクリルアミドゲル〔例、
バイオゲルＰ３０、バイオゲルＰ−６０．バイオゲルＰ
−１００（バイオラッド・ラボラトリーズ社（米国）製
）〕、セルロース粒子〔例、アビセル（脂化成製）、イ
オン交換セルロース（例、ジエチルアミノエチルセルロ
ース、カルボキシメチルセルロース）〕、物理的吸着剤
〔例、ガラス（例、ガラス球、ガラスロッド、アミノア
ルキルガラス球、アミノアル牛ルガラスロツド）、シリ
コン片、スチレン系樹脂（例、ポリスチレン球、ポリス
チレン粒子）、イムノアッセイ用プレート（例、ヌンク
社（デンマーク）製月、イオン交換樹脂（例、弱酸性陽
イオン交換樹脂〔例、アンバーライトＩＲＣ−５０（ロ
ーム・アンド・ハース社（米国）製）、ゼオカーブ２２
６（バームチｙト社（西ドイツ）製））　、弱酸性陽イ
オン交換樹脂〔例、アンバーライトＩ　Ｒ−４Ｂ、ダウ
エックス３（ダウケミカル社（米国＞Ｍ）〕）などが挙
げられる。

本発明方法において用いられるヘパリンとしては、Ｄ−
グルコサミン、Ｄ−グルクロンｆｉｊ１２．Ｌ−イズロ
ン酸からなる多糖のＮ−硫酸、Ｎ−アセチルおよび〇−
硫酸置換体が挙げられる。

担体にヘパリンを保持させるには、公知の常套手段を応
用し得るが、例えばヘパリンに高親和性を持つ物質とし
て［Ｓ、　５ｕｚｕｋｉ　ら；アナリティカル・バイオ
ケミストリー（Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ）１旦ユニ
ｔｏ　ｌ（１９８４）］　に記載のあるＰｏ１ｙ−Ｌ−
１、ｙｓｉｎｅを用いる方法が挙げられる。

例えば、Ｐｏ１ｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ（Ｐ　Ｌ　Ｌ　）
をｌＯμｇ〜１００μｇ／ウェル・９６穴プラスチ、ク
プレート（例えばＤｉｎａｔｅｃｈｉｆ　（ＩＪＳＡ）
製）、ガラスピーズ。

プラスチックビーズなどの担体に固定する。固定は約４
〜１５°Ｃ９−夜または室温で約１〜６時間反応させる
ことにより行なわれる。

次いでヘパリンを約ｌＯＯμｇ〜１　ｍｇ／ウェル−Ｐ
ＬＬ固定９６穴プラスチツクプレートになるように前述
のＰＬＬ固定プレートに固定する。固定は約４〜１５℃
、−夜または室温で約１〜６時間反応させることにより
行なわれる。

その他抗体固定のための各種プレートの市販されている
ものを使うことができる。

本発明方法の結合体として用いられるＦＧＦに対する抗
体は、ポリクローナル抗体でも、モノクローナル抗体で
もよい。

該ＦＧＦに対するポリクローナル抗体は、抗原としての
ＦＧＦを温血動物に接種しＦＧＦに対する抗体を産生さ
せ、採取することにより製造される。

該抗原としてのＦＧＦは、天然のＦＧＦと同様の生物学
的もしくは免疫学的活性を有するものであればいずれで
もよく、例えば遺伝子工学技術により製造されるＦＧＦ
や、その生物学的もしくは免疫学的活性に必要な一部分
のアミノ酸配列からなるフラグメントでもよい。これら
の遺伝子工学技術で製造されるＦＧＦはポリペプチドの
アミノ末端にざらにＭｅｔを有していてもよく、またＦ
ＧＦとそのアミノ末端にさらにＭｅｔを有するＦＧＦと
の混合物でもよい。

上記フラグメントは、ペプチド合成の公知の常套手段で
製造し得る。そしてそれは、固相法、液相法のいずれに
よっても良い。名のようなペプチド合成の方法としては
、例えば、”Ｔｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ第１巻（１９６
６）、５ｃｈｒ’６ｄｅｒ　　ａｎｄ　　Ｌｕｂｋｅ著
、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ
、　Ｕ、Ｓ、Ａ、、′ペプチド合成”、泉屋ら著、九薔
株式会社（１９７５）あるいは“ペプチド合成の基礎と
実験”、泉屋ら著、丸善株式会社（１９８５）に記載の
方法が挙げられる。

また、該フラグメントは、適当な酵素によりＦＧＦを切
断することにより製造してもよい。該方法としては、た
とえば、“生化学実験講座１　タンパク質の化学■“、
日本生化学全編、東京化学同人（１９７６）の２５５ペ
ージから３３２ページに記載の方法が挙げられる。

上記抗原としてのＦＧＦは、キャリア用蛋白と結合され
る。該キャリアー用蛋白としては、例えば、牛チログロ
ブリン、牛血清アルブミン、牛ガンマグロブリン、ヘモ
シアニン、フロイントの完全アジュバント（デイフッ社
製）などがあげられる。

該抗原としてのＦＧＦとキャリアー用蛋白との結合には
、公知の常套手段、を用いて実施し得る。

結合に用いる試薬としては、例えば、ゲルタールアルデ
ヒド、水溶性カルボジイミドなどがあげられる。抗原と
してのＦＧＦとキャリアー用蛋白との使用比は、約１対
工ないし約１対１０が適当であり、反応のｐＨは、中性
付近、特に約６〜８前後が良好な結果を与える場合が多
い。また、反応に要する時間は、約１〜１２時間が良い
場合が多いが、特に、約２〜６時間が適当である。この
ようにして作成された複合物は、常套手段で約Ｏ〜１８
°Ｃ前後で水に対して透析し、凍結して保存しても良い
し、凍結乾燥して保存しても良い。

ポリクローナル抗体を製造するためには、上記のように
して製造した免疫原を混血動物に接種される。上記抗体
の製造に用いられる混血動物としては、例えば、捕乳諷
血動物（例、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、ラット、マウス、
モルモット、ウシ、ウマ、ブタ）、鳥類（例、ニワトリ
、ハト、アヒル、ガチョウ、ウズラ）などが挙げられる
。免疫原を、１晶血動物に接種する方法としては、動物
に接種する免疫原は、抗体産生をする有効な量でよく、
例えば、ウサギに１回１ｍｇをｌｄの生理食塩水および
フロイントの完全アジュバントで乳化して、背部ならび
に後肢掌皮下に４週問おきに５回接種すると抗体を産生
させる場合が多い。このようにして、温血動物中に形成
された抗体を採取する方法としては、例えばウサギでは
、通常最終接種後７日から１２日の間に耳静脈から採取
し、遠心分離して血清として得られる。得られた抗血清
は、通常、各抗原ペプチドを保持させた担体を用いるア
フィニティクロマトグラフィーで吸着した画分を回収す
ることによりポリクローナル抗体を精製することが出来
る。

また、ミルスティン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法〔ネ
イチュア（Ｎａｔｕｒｅ）、第２５６巻（１９７５）、
竿４９５頁〕に記載の方法と同様の方法により得られる
モノクローナル抗体も利用できる。すなわち、該モノク
ローナル抗体は、免疫原のポリペプチドまたは蛋白複合
体で哺乳動物を免疫し、取り出した肺臓細胞と同種また
は異種のリンパ球様細胞とを細胞融合によりハイブリド
ーマとし、これをクローン化し、ここで得られたハイブ
リドーマを哺乳動物に接種し、モノクローナル抗体を生
成蓄積せしめ、これを採取して製造される。

免疫方法は、例えばマウスを免疫する場合、皮下、腹腔
内、静脈内、筋肉内、陵内等のいずれのルートからでも
可能であるが、主としては皮下、腹腔内、静脈内に（と
りわけ皮下）注入するのが好ましい。また、免疫間隔、
免疫量等も可変度は高く、種々の方法が可能であるが、
例えば２週間隔で約２〜６回免疫し、最終免疫後、約１
〜５回、好ましくは約２〜４日後に摘出した肺臓細胞を
用いる方法がよく用いられる。免疫量は１回にペプチド
量として、マウス当り約０．１μｇ以上、好ましくは約
１０μｇ〜３００μｇ用いることが望ましい。また、肺
臓を摘出する前に、部分採血を行い、血中の抗体価の上
昇を一確認した上で、肺臓細胞を用いる融合実験を行う
ことが望ましい。

上記肺臓細胞とリンパ球様細胞との細胞融合は例えば摘
出したマウスの肺臓細胞を、ヒポキサンチン〜グアニン
ーホスホリボシルトランスフェラーセ欠損（ＨＧＰＲＴ
→や、チミジンキナーゼ欠損（ＴＫ→の様なマーカーを
持った適切な同種または異種（好ましくは同種）のミエ
ローマ〔例、Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ・８ＵＩ（市森　他　
ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッド　且５５
（１９８５）））等の、リンパ球様細胞株との間で軸合
させる。例えばケラ−およびミルスタインらの方法〔ネ
イチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）２５６　：　４９５（１９７
５））に準じて融合させることにより製造される。たと
えばミエローマ細胞と肺細胞とを約ｌ：５の割合で、た
とえばイスコツ培地とハムＦ１２培地を１：ｌに混合し
た培地（以下ＩＨ培地と称する。）に懸濁させ、センダ
イウィルス、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の融
合剤が用いられる。もちろんジメチルスルホキシド（Ｄ
ＭＳＯ）その池の融合促進剤を加えることも可能である
。ＰＥＧの重合度は、ふつう約１０００〜６０００、　
［ｌ’ｌｉ；を約０．５〜３０分、　ａＩＪＥハ約１０
％〜８０％等が用いられるが、好ましい条件の一例とし
て、ＰＥＧ　　６０００を約３５〜５５％で約４〜１０
分処理することにより、効率よく融合させることが出来
る。融合細胞は、ヒポキサンチンアミノプテリン−チミ
ジン培地（ＨＡＴ培地；ネイチャー、λ旦旦、４９５（
１９７５））等を用いて、選択的に増殖させることが出
来る。

増殖して来た細胞の培養上清は、目的とする抗体産生が
あるか否かについてスクリーニングを行うことができる
が、抗体価のスクリーニングは次の様に行うことが出来
る。即ち、この場合には、まず第１段階として免疫した
ペプチドに対する抗体産生の有無を、ラジオイムノアッ
セイ（ｔＡ）法またはエンザイムイムノアッセイ（ＥＩ
Ａ）法等の方法で調べることが出来るが、これらの方法
についても種々の変法が可能である。好ましい測定法の
一例として、ＥＪＡを用いるーっの方法について述べる
。セルロースピーズ等の担体に、例えばウサギ抗マウス
イムノグロブリン抗体を常法に従ってカプリングさせて
おき、これに測定しだい培養上清や、マウスの血清を加
え、一定時間、定７！！（約４〜４０°Ｃを示す。以下
においても同様。）で反応させる。この後、反応物をよ
（洗った後、酵素で標識したペプチド（酵素とペプチド
を常法に従いカプリングさせた後精製）を加え、一定時
間、定温で反応させる。反応物をよく洗った後、酵素基
質を加え、一定時間、定温で反応させ、その後、生成発
色物を吸光度または蛍光度等で測定することが出来る。

選択培地で増殖を示し、かつ免疫に用いたペプチドに対
する抗体活性のみられたウェルの細胞は、限界稀釈法等
によりクローニングを行うことが望ましい。クローン化
された細胞の上清について同様にスクリーニングを行い
抗体価の高いウェルの細胞を増やすことにより、免疫し
たペプチドと反応性を示すモノクローナル抗体産生ハイ
ブリドーマクローンが得られる。

このようにしてクローン化されたハイブリドーマを、液
体培地中で増殖させる。具体的には例えば、液体培地た
とえばＲＰＭＩ　　１６４０（ＭｏｏｒｅＧ、　Ｅ、、
　ｅＬ、　ａｌ、　　ジャーナル・オブ・アメリカン・
メディカル・アソシエーンヨン（Ｊ、八ｍ、　Ｍｅｄ。

Ａｓ５ｏｃ、）１９９，５４９（１９６７））に約０１
〜４０％の牛血清を加えた培地等で約２〜１０日間、好
ましくは約３〜５日間培養することにより、培養液から
該モノクローナル抗体を得ることができる。また、哺乳
動物の腹腔内に接種し、細胞を増殖させ、腹水を採取す
ることにより抗体を取得することが出来る。このために
は、例えばマウスの場合、ミネラルオイル等を前もって
接種したＢＡ　Ｌ　Ｂ　／　ｃ等のマウスに約１×１０
′〜ｌＸｌＯ７個、好ましくは約５Ｘ１０５〜２Ｘ１０
６個の７１イブリドーマを腹腔内に接種し、約７〜２０
日後、好ましくは約１０〜１４日後に腹水液を採取する
。

腹水に生成蓄積した抗体は、例えば硫安分画、ＤＥＡＥ
−セルロースカラムクロマトグラフィー等により、容易
にモノクローナル抗体を純粋な免疫グロブリンとして単
離することが出来る。

であっても良い。なかでも、標識剤を直接結合させる抗
体分子はＦ　ａｂ’であることが好ましい。

標識剤としては、ＲＩＡの場合は、たとえば放射性同位
元素　３４　＋ｔＪなどが挙げられる。

該放射性同位元素としては、たとえば、ｓＨ１＋１５１
などが挙げられる。

ＥＩＡの場合の標識剤としては、たとえば酵素。

蛍光物質１発光物質などが挙げられるが、酵素を用いる
のが好ましい。酵素としては、安定で比活性の大きなも
のが好ましく、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファタ
ーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、グルコースオキンダ
ーゼ等を用いることができるが、ペルオキシダーゼが好
ましい。ペルオキシダーゼとしては、種々の起源のもの
を用いることができるが、その例としてはたとえば西洋
わさび、パイナツプル、イチジク、甘苦、ソラマメ、ト
ウモロコシなどから得られるペルオキシダーゼが挙げら
れ、特に西洋わさびから抽出されたホースラデイツシュ
ペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄ　１ｓｈｐｅｒｏ
ｘｉｄａｓｅ）（ＨＲＰ　）が好ましい。

蛍光物質としては、たとえばＦＩＴＣ（Ｆｌｕｏｒｅｓ
ｃｅｉｎ　　ｌ５ｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）、　　ロ
ーダミン、ランクナイドキレートなどが挙げられる。

発光物質としては、たとえば、アクリジニウムエステル
などが挙げられる。

抗体に標識剤を結合させるには、公知の常套手段を応用
し得るが、例えば＋２５１を抗体に結合させることがで
きる。この方法には公知の常套手段を応用し得るが、例
えば、［Ｋ、　Ｍ、　Ｆｕｒｇｕｓｏｎら；　＾ｃｔａ
　　Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、　５ｕｐｐｌｅ、　　２２
５　：　ｌ　３０　（１９７９））に記載のＩｏｄｏｇ
ｅｎを用いる方法もある。

本発明の測定系における被検試料としては、尿、面清、
面漿、髄液等の体液、あるいは、細胞や菌体の抽出液ま
たはその培養上清が挙げられる。

本発明の測定方法のＥＩＡの例として、標識剤がベルオ
キ／ダーゼの場合について以下に具体的に説明するが、
ベルオキ／ダーゼに限定されるものではない。

まず、■担体に保持されたヘパリンに、測定すべきＦＧ
Ｆを含む被検試料を加えてＦＧＦを結合させ、これに、
ペルオキシダーゼを結合した抗体を加え反応させる。

■・　■で得られた反応生成物にペルオキシダーゼの基
質を加え、生じた物質の吸光度らしくは蛍光強度を測定
することにより上記の反応生成物の酵素活性を知る。

■：　上記■〜■の操作を既知量のＦＧＦの標準溶液に
対してあらかじめ行い、ＦＧＦと吸光度もしくは蛍光強
度との関係を標準曲線として作成しておく。

■：　未知量のＦＧＦを含む分析対象物（被検試料）に
ついて得られた吸光度もしくは蛍光強度を標準曲線にあ
てはめ、分析対象物中のＦＧＦの量を測定する。

本発明の測定方法のＲＩＡの例として、標識剤が１２５
１の場合について以下に具体的に説明するが、１１５１
に限定されるものではない。

まず■担体に保持されたヘパリンに測定すべきＦＧＦを
含む被検試薬を加えてＦＧＦと結合させ、これに１″５
Ｉを結合した抗体（直接に抗ＦＧＦ抗体に１１５１を結
合させた場合と、非標識抗ＦＧＦ抗体とｌｆｆ１５１を
結合させた２次抗体とを組み合わせた場合がある。）を
加え反応させる。

■　■で得られた反応生成物のγ−放射活性を測定する
。

■　上記■−■の操作を既知量のＦＧＦの標準液に対し
てあらかじめ行いＦＧＦとγ−放射活性の関係を標準曲
線として作成しておく。

■　未知量のＦＧＦを含む分析対象物（被検試料）につ
いて得られたγ−放射活性を標準曲線にあてはめ分析対
象物中のＦＧＦの量を測定する。

不法は今後、臨床検体（血液、血清、血漿、尿。

胸水２Ｍ液など）中のＦＧＦの検出・測定や、ＦＧＦの
組織内、臓器内分布の検討に有力な手段を提供するもの
である。

本発明方法においては、担体に保持された結合体トシて
、ヘパリンを用いるため、測定感度が高く、血中のＦＧ
ＦＩが測定できる。これを利用して癌の診断薬にも応用
可能である。

本明細書において、アミノ酸などを略号で表示する場合
、ｒＵＰＡｃ−ＩＬＩＢ　　Ｃｏａｓｉｓｉｏｎ　　ｏ
ｎＢｉｏｃｈｅ＋５ｉｃａｌ　　Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕ
ｒｅによる略号あるいは当該分野における慣用略号に基
づくものであり、その例を下記する。また、アミノ酸に
関し光学異性体がありうる場合は、特に明示しなければ
Ｌ−体を示すものとする。

Ｔｙｒ：　　チロシンＮｌｅ：　　ノルロイシン以下に実施例を挙げて本発明をさらに具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるべきものではない。

実施例１（１）抗ＣＴｙｒ目）　　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１
１）Ｎ　ｌｅ”ウサギ抗体の調整ペプチド（Ｔｙｒ”）ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１１）
Ｎ　ｌｅ”ＣＭ、　Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、　Ｙ、　Ｓ、
　Ｋｌａｕｓｎｅｒ、　Ｍ、　Ａ、　０ｎｄｅｔｔｉ″
Ｐｅｐｔｉｄｅ　　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ″Ｊｏｈｎ　Ｗ
ｅｉｌｙ　　ａｎｄ　　５ｏｎｓ。

Ｎ、Ｙ、（１９７６）に記載の方法と同様の方法で製造
される。なお、水晶は、Ａｌｂｅｒｔａ　　Ｐｅｐｔｉ
ｄｅＩｎｓｔｉｔｕｔｅ、　　Ｅｄｍｏｎｔｏｎ　　＾
Ｉｂｅｒｔａ、　　Ｃａｎａｄａから購入した。〕をＫ
　Ｌ　Ｈ（Ｋｅｙｈｏｌｅ　　ＬｉａｐｅｔＨｅｍｏｃ
ｙａｎｉｎ）とゲルタールアルデヒドを用いて結合した
ものを、該ペプチドが１００μｇ／ｒｎｌとなるように
リン酸緩衝液（ＰＢＳ）（ＮａＣＱ８０００ｍｇ／Ｑ　
、ＫＣｌ２２００ｍｇ＃！、ＮａＨＰＯ，・７Ｈ，０２
１６０ａ＋ｇ／１２．　ＫＨｔＰＯ４２００ｍｇ／１２
．ＭｇＣＱｔ。

６　Ｈ＊　ＯＩ　ＯＯＩＩｇ／（りに溶かしたものを等
量のフロイントコンブリートアジコバント（Ｄｉｆｃｏ
社）と混合した。これをウサギの筋肉内へ１１Ｉｄｌ投
与し、以後２週間毎に上記合成ペプチド１００μｇ／１
ｎｌｌを等量のインコンプリートアジュバント（Ｄｉｒ
ｅ□社）と混合したものを投与した。計５回投与して得
られた血液を室温に５時間静置後、４°Ｃに１６時間放
置したのち３０００　ｒｐｍ、　　１０分間遠心し、そ
の上清を抗（Ｔｙｒ目）　　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−
１１）Ｎ　ｌｅ”ウサギ血清とした。また、臭化シアン
活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア？ｆ）０．５ｇ
をグラスフィルターに移し、２Ｃ７の０．００１Ｎ塩酸
を加えて充分に膨潤させたのち、４００滅の同塩酸溶液
でよく洗浄した。一方、１００μＱの（Ｔｙｒ”］ヒト
ｂ　Ｆ　Ｇ　Ｆ　（１−１１）Ｎ　ｌｅ”ペプチド溶液
（蛋白■４０　ｍｇ／ｄ）へ２蔵の０．１Ｍ重炭酸ナト
リウム０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液を加えたのち、０．
１Ｍ水酸化ナトリウム溶液でｐＨを８．４に調整した。

この溶液へ上記臭化／アン活性化セファロース４Ｂを加
え、室温で２時間反応した。反応後、ゲルをグラスフィ
ルターに移し、１００ｄの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム０
．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で洗浄した。ついで、ｌＯｄ
のＱ、１Ｍ　Ｔｒｉｓ塩酸ｐＨ８，０溶液中へゲルを加
え、ゆっくり撹拌しながら４°Ｃで２００時間反応せて
、残存活性基をマスクした。ゲルはＯ，１Ｍ１！！炭酸
ナトリウム溶液、１Ｍ食塩含有０．１Ｍ酢酸（ｐＨ４，
０）、ＩＭ食塩含有Ｏ１ＩＭホウ酸緩衝液（ｐＨ８，０
）各ｔｏｏｙで順次洗浄した。水晶をＰＢＳに懸濁して
カラムにつめ、４°Ｃに保存した。

前３己血を青をこのカラム（こか（ナカラムハ２８０ｎ
Ｉ１１の吸収がなくなるまでＰＢＳで十分にδＬ浄した
。

ついで０．２Ｍグリシン塩酸緩衝液（ｐＨ２，３）１０
％Ｄｉｏｘａｎｅで溶出を行い、溶出画分に、すぐ１７
３量のＬＭ　Ｔｒｉｓ　　ＨＣＱ　（ｐＨ７，４）を添
加し中和した。この溶液をＰＢＳに対して４°Ｃて１６
時間透析した。透析後１０．Ｏ’ＯＯｒｐｍ、１０分間
遠心し、その上清液を抗［Ｔｙｒ”］　ヒトｂＦＧＦ　
（１−１１）Ｎ　ｌｅ”ウサギ抗体として用いた。

本抗体の特異性をみるために、ウシ角膜内皮細胞（ＢＣ
Ｅ　ｃｅｌｌ）の培養上清中のヘパリン結合タンパクと
組換体ｂＦＧＦ’ＥｓＤｓ−ＰＡＧＥにかけ、た（第【
図参照）。

（２）ヘパリンをコートしたマイクロタイタープレート
による２−サイトのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）９６ウエルマイクロタイタープレート（［）ｉｎａｔｅ
ｃｈ）　（９６−ｗｅｌｌ　　Ｈａｔ　　ｂｏｔｔｏｍ
ｅｄｐｏｌｙｖｉｎｙｃｈｌｏｒｉｄｅ　　ｍ１ｃｒｏ
ｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ、　ＤｙｎａＬｅｃｈＬｏｂｏ
ｒａｔｏｒｉｅｓ、＾１ｅｘａｎｄｒｉａ、　Ｖｉｒｇ
ｉｎｉａ、　Ｕ、Ｓ、Ａ、）のウェル間の差をなくすた
めに、生理食塩水１０川％Ｔｖｅｅｎ２０で洗浄した後
、蒸留水ですすいで、エタノールで処理してよ（乾燥し
たものを以下の過程で用いた。

ポリーＬ−リジン（シグマ社製）を蒸留水に１００μｇ
／ａＪとなるように溶かし、１００μｅ／ウエルで上記
°のプレートに入れた。これを４°Ｃで−装置き、溶液
を捨てた後、各ウェルを蒸留水で洗浄して、ポリーＬ−
リジンをコートしたプレートとした。

次にヘパリン（シグマ社製）をｌ　ｍｇ／ｍｆｌとなる
ように蒸留水に溶かし、１００μρ／ウエルで上記のポ
リ−し一リジンをコートしたプレートに入れた。

これを４°Ｃで一装置き、溶液を捨てた後。各ウェルを
蒸留水で洗浄して、ヘパリンをコートしたプレートとし
た。

このプレートの各ウェルに１％牛血清アルブミン（Ｂ　
Ｓ　Ａ）／Ｐ　Ｂ　Ｓを２００μσ入れ、４°Ｃで一装
置き、溶液を捨てた後、０．５Ｍ　ＮａＣＱ／ＰＢＳで
洗浄して非特異的にヘパリンを結合しているタンパクを
除去した。このようにしてブロッキングを行ったプレー
トを用いて以下のＲＩＡを行った。

０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳにより適当に希釈した試料を１
００μσずつプレートの各ウェルに入れて、４°Ｃで一
装置いた。このとき、バックグラウンドをとるために０
．１％ＢＳＡ／ＤＭＥＭ／２５ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣσ
（ｐＨ７，４）あるいは０，１％Ｂ　Ｓ　Ａ／ｌ　Ｏｒ
ａＭ　ＭｇＣＬ／２５ｍＭ　　Ｔｒｉｓ−ＨＣ（１（ｐ
Ｈ７，４）を入れたウェルを同時に用意しておいた。Ｄ
ＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ　　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　　
Ｅａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ。

試料のプレートへの吸着を行った後、０．１％Ｂ　Ｓ　
Ａ／　Ｐ　Ｂ　Ｓ／　ｌ　ＯＩＩＩＭ　　ＭｇＣＱｔ　
テ各ウェルを洗浄し、実施例１（１）に記した抗〔Ｔｙ
ｒｌ′〕　ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１１）Ｎ　ｌｅ”
ウサギ抗体を０．１％ＢＳＡ／　Ｐ　Ｂ　Ｓ　／　１０
　ｍＭ　ＭｇＣ（ｈで１０−’−２Ｘｔｏ−’に希釈し
て各ウェルに１００μＱ加えて、４°Ｃで一装置いた。

さらに、０．１％Ｂ　Ｓ　Ａ／　Ｐ　Ｂ　Ｓ／　ｌ　Ｏ
ｍＭ　ＭｇＣＱ、でプレートを洗浄した後、１１６１−
抗つサギＩｇＧヤギ抗体Ｆａｂ″（マイズル社製）を０
．１％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ１００Ｏ〜５０００倍に希釈し
、プレートの各ウェルに１００μＱずつ加えて、４０Ｃ
で一装置いた。プレートをＯ１１％ＢＳＡ／ＰＢ　Ｓ　
／　１０　ｍＭ　ＭｇＣＱ−で十分洗浄した後、各ウェ
ルをハサミで切り取り、ガンマ−カウンターで各ウェル
のカウントを測定した。組み操体由来ウシｂＦＧＦを用
いてこのＲＩＡを行って得られた標準曲線は第２図に示
すようになった（ｎ＝４．ｍ±Ｓ　Ｄ、　”ｐ＜０．０
５．　”ｐ＜０．０１）。この曲線は１〜１０ｐｇのｂ
ＦＧＦを検出できることを示している。なお、該組み操
体由来ウシｂＦＧＦは、アムジエン社（Ｕ、　Ｓ、　Ａ
、　）より購入した。

また、上記と同様の方法でウシ角膜内皮細胞（ＢＣＥ　
ｃｅｌｌ）を無血清培地で培養した場合、培養液中に放
出されるｂＦＧＦｆｆｉを経時的に測定すると第３図に
示すようになった（ｎ＝３．ｍ＋ｓＥ）。

さらに、上記と同様の方法でＢＣＥ細胞を上皮細胞増殖
因子（ＥＧＦ）で刺激して放出されるｂＦＧＦ量も検出
された（第４図）。

また、上記と同様の方法で、ヒト癌細胞Ｕ８７ＭＧが無
血清培地で培養されたときに放出されるｂＦＧＪｌも本
方法で検出することができた（第５図、ｎ−３，ｍ＋ｓ
Ｅ）。

次に、上記と同様の方法で血清が本ＲＩＡに与える影響
を調べた結果を第６図に示す。なお、このときＰ　Ｌ　
Ｌ　（Ｐｏｌｙ−Ｌ−Ｌｙｓｉｎｅ）は３００μｇ／ｈ
ｕヘパリン１０３　ｍｇ／ｄを用いた。第６図において
、ローは５％ＦＣ３の、−〇−は１０％ＦＣ３の、Ｘ−
は２０％ＦＣ３の場合の結果をそれぞれ示す。

発明の効果本発明のＦＧＦの検出・測定法によると、ＦＧＦを高感
度に測定することができるので、体液や細胞中のＦＧＦ
を有利に検出、測定することができる。

【図面の簡単な説明】

第１図は、実施例１（１）で得られた、抗〔Ｔｙｒｌ′
〕ヒトｂＦ　Ｇ　Ｆ　（１−１１）Ｎ　ｌｅ”ウサギ抗
体のウェスターンブロッティングの結果を示す。第２図は、実施例１（２）で得られた、組み操体由来つ
／ｂＦ　Ｇ　Ｆを用いたＲＩＡの標準曲線を示す。第３図は、実施例１（２）で得られた、ウシ角膜内皮細
胞培養液中のｂＦＧＦ量を示す。第４図は、実施例１（２）で得られた、ＢＣＥ細胞培養
液中のｂＦＧＦの量を示す。第５図は、実施例１（２）で得られた、胞培養液中のｂ
ＦＧＦの■を示す。第６図は、実施例１（２）で得られた、下でのｂＦＧＦ
測定への影響を示す。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）担体に保持されたヘパリン、被検試料および標識
剤を結合した抗体を用いるサンドイッチ法によって線維
芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）を検出・測定することを特徴
とするＦＧＦの検出・測定法。
（２）ＦＧＦが塩基性ＦＧＦである請求項１記載の検出
・測定法。