JPH02131577A - ノイラミニダーゼの製造法 - Google Patents

ノイラミニダーゼの製造法

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JPH02131577A
JPH02131577A JP1081199A JP8119989A JPH02131577A JP H02131577 A JPH02131577 A JP H02131577A JP 1081199 A JP1081199 A JP 1081199A JP 8119989 A JP8119989 A JP 8119989A JP H02131577 A JPH02131577 A JP H02131577A
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護 長谷川
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01018—Exo-alpha-sialidase (3.2.1.18), i.e. trans-sialidase
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ノイラミニダーゼの製造法に関する。ノイラ
ミニダーゼ（Ｅ　Ｃ　３．　２．　１　１８）は生体の
重要な構成成分である塘蛋白質や糖脂質などの末端に位
置するシアル酸（ノイラミン酸のアシル誘導体の総称）
のα配位のケトシドを基質とし、このシアール酸残基を
遊離させる加水分解酵素である。
ノイラミニダーゼは、血清などの生体中のンアル酸含有
物質の定量に用いられ、各種炎症疾．＠、ＩＩＫ原病、
癌などの臨床診断の分野に利用される。
従来の技術 ノイラミニダーゼは、ウイルス、細菌、放線菌などの微
生物、鳥類、噛乳動物の種々の組織に広く分布している
ことが知られている。
従来、微生物を用いてノイラミニダーゼを生産する方法
としては、ノイラミニダーゼ生産能を有する微生物をノ
イラミニダーゼ誘導物質としてコロミン酸や各種動物組
織の浸出・抽出液を加えた培養液中で培養して、生成し
たノイラミニダーゼを採取する方法が知られている〔代
謝１６（５），　　７　６　１　　（１９７９）　．バ
イオキミ力・エバイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉ
ｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ＾ｃｔａ）　．　　３５０　，　
　４　２　５−４　３　１　（１９７４），　　ジャー
ナル・オブ・バイ才ケミストリイ　（Ｊ．　Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．）８２．　１４２５−１４３３　（１９７７）　
．　ジャーナル・オブ・バタテリオロジイ（Ｊ　　Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ　）　１１９（２）３９４−４００　　
（１９７４）　，カナディアン・ジャーナル・オブ・マ
イクロバイオロジイ（ＣａｎａｄｉａｎＪ．Ｍｉｃｒｏ
ｂｉｏｌｏｇｙＨ８，　　１　０　０　７．　　（＋９
７２）．特公昭５０−１１９９１，特開昭６０−３４１
８１］。
発明が解決しようとする課題 ノイラミニダーゼを製造する際、ノイラミニダーゼ誘導
物質を大量に使用することは、経済的に極めて不利であ
る。ノイラミニダーゼを工業的に安価に製造するには、
ノイラミニダーゼ誘導物質の添加が不要でかつノイラミ
ニダーゼ生産能の優れた微生物を用いる必要がある。
課題を解決するだめの手段 本発明者は、工業的に安価にノイラミニダーゼを製造す
る方法につし）で種々検討した。その結果、遺伝子組換
え技術を用いて、ノイラミニダーゼをコードしている遺
伝子を含むＤＮＡ断片をクローニングし、該ＤＮＡ断片
を含む組換え体ＤＮＡを導入することにより、ノイラミ
ニダーゼ生産能を向上させ、ノイラミニダーゼ誘導物質
を加えることなしにノイラミニダーゼを製造することが
できることを見出し、本発關を完成した。
以下に本発明を詳細に説明する。
本発明は、ストレプトマイセス属に属し、ミクロモノス
ポラ属に属する微生物由来のノイラミニダーゼの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体Ｄ　
Ｎ　Ａを保有する微生物を培地に培養し、培養物中にノ
イラミニダーゼを生成蓄積させ、該培養物からノイラミ
ニダーゼを採取することを特徴とするノイラミニダーゼ
の製造法を提供する。
ノイラミニダーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａ断片の供与源としては、ミクロモノスポラ属に属し、
ノイラミニダーゼ生産能を有する微生物の染色体ＤＮＡ
があげみれる。具体的には下記の菌株があげられる。
ミクロ千ノスボラ０チャルセア（！Ｊｉｃｒｏｍｏｎｏ
ｓｐｏｒａ　　ｃｈａｌｃｅａ）八ＴＣＣ　　　１２４
５２ 〃　　　　　　　　　＾Ｔ［’Ｃ　　２７０８４ミクロ
｛ノスホラ・シトし７（Ｍ　　　ｃｉｔｒｅａ）　　Ｎ
ＲＲＬ　　Ｂ−１６６０１ミクａｔノスボラ−ｘチノス
ボラ（Ｍ，ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）ＡＴＣＣ　　１５
８３７ミクロ量ノスボラ・バーブしオクロモゲネス（Ｍ
．ｐｕｒｐｕｒｅｏｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ）ＮＲＲＬ
　　Ｂ−９４３ ミクｏｔノスボラ・グロボーサ（Ｍ，ｇｌｏｂｏｓａ）
　　ＮＲＲＬ　　Ｂ−２６７３ミクａｔノスボラ・メラ
ノスボラ（Ｍ，ｍｅｌａｎｏｓｐｏｒａ）　　ＩＦＯ　
　１２５１５ミクａｔノスボラ・ナラシバＭ，ｎａｒａ
ｓｈｉｎｏ）　　　ＡＴＣ：Ｃ　　２７３３１ミクロそ
ノスボラ・ビリディフ７シエンス（１，１．ｖｉｒｉｄ
ｉｆａｃｉｅｎｓ）＾ＴＣＣ　　３１１４６ 上記の菌株の染色体Ｄ　Ｎ　Ａを、後述の実施例１に示
した方法に従って抽出し、ノイラミニダーゼの合成に関
与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片の供与源として用いる
。
ノイラミニダーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａ断片を組み込むためのベクターとしては、ストレプト
マイセス属菌種中で自律複製可能なベクターであればい
ずれも使用できる。
好適には、ｐＩＪ４１［：ジーン（Ｇｅｎｅ）　２０．
　５１６２（１９８２）］　、ｐ　Ｉ　Ｊ　７　０　２
　Ｃジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロ
ジイ　（Ｊ．　Ｇｅｎ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）　１２
９　．　２７０３−２７１４　（１９８３）　〕などが
あげられる。
ノイラミニダーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮ
Ａ断片を含む組換え体ＤＮＡは、供与体ＤＮＡとベクタ
ーＤＮＡとを適当な制限酵素、例えばＢｇｌＩＩやＢｃ
ｌｌで切断し、同の切断末端を利用して結合させること
により種々の組換え体混成物と共に得ることができる。
得られた組換え体混成物を用いて、ノイラミニダーゼ生
産能を有さない微生物を形質転換し、得られた形質転換
株のノイラミニダーゼ生産能を調べることにより、ノイ
ラミニダーゼ生産能を獲得した形質転換株を選択し、該
菌株より組換え体ＤＮＡを分取することにより、ノイラ
ミニダーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片
を含む組換え体ＤＮＡが得られる。
宿主微生物としては、ストレプトマイセス属に属する微
生物で、本発明の組換え体ＤＮＡを導入することにより
ノイラミニダーゼ生産能を得ることができる微生物なら
ばいずれも用いることができる。具体的には下記の菌株
が用いられる。
ストしブトマイセス・リピダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙ
ｃｅｓ　　ｌｉｖｉｄａｎｓ）ＴＫ２３〃　　　　　　
　　　　　＾ＴＣ［：　　１９８４４ストしブトマイセ
ス・アンボフ７シエンス（Ｓ，ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ
）ＡＴＣＣ　　１５１５４〃　　　　　　　　　　　　
　　　　　　ＡＴＣＣ　　２３８７７〃　　　　　　　
　　　　　　　　　　　ＩＦＯ　　　１２６５１ストし
ブトマイセス・フラディアエ（Ｓ．ｆｒａｄｉａｅ）　
　　ＡＴＣＣ　　１０７４５”　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　ＮＲＲＬ　　Ｂ−２７０２ストしブト
マイセス・グラウセセンス（Ｓ．ｇｌａｕｃｅｓｃｅｎ
ｓ）ＡＴＣＣ　　２３６２２ノイラミニダーゼの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮ
Ａを用いて、上記の宿主微生物をＫ，Ｆ，　（：ｈａｔ
ｅｒらの方法〔カレント・トピックス・イン・マイクロ
バイオロジイ・アンド・イムノロジイ（Ｃｕｒｒｅｎｔ
　Ｔｏｐｉｃｓｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　ａｎｄ
　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）　９６．　６９−９５（１９
８２）　］に従って形質転換することにより、ノイラミ
ニダーゼ生産能を有する菌株を得ることができる。
本発明で使用する微生物の具体的な例としてよ、ミクロ
モノスポラ・ビリディファシェンス由来のノイラミニダ
ーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片をＩｌ
ｌ　Ｉ　Ｊ　７　０．２に組み込んで得ろれた組換え体
ＤＮＡ　　ｐＮＥＤ−ＢＧ６を保有するストレプトマイ
セス・リビダンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　ｌ　ｉ
ｖｉｄａｎｓ）　Ｎ　Ｅ　Ｄ　−　Ｂ　Ｇ　６、または
同様にして得られた組倹え体ＤＮＡ　　ｐＮＥＤ−ＢＣ
４を保有するストレプトマイセス・リビダンスＮＥＤ−
ＢＣ４があげられる。本菌株は、昭和６３年２月２７日
および平成元年３月１７日付で、工業技術院微生物工業
技術研究所（微工研）にＦＥＲＭ　　ＢＰ−１７６８お
よびＦＥＲＭ　　ＢＰ−２３４０として寄託されている
。
本発明で得みれるノイラミニダーゼ生産能を付与された
形質転換株は、ノイラミニダーゼ誘導物質を加えること
なしに、通常の放線菌の培養方法で培養することによっ
て、ノイラミニダーゼを培養物中に生成蓄積する。
本発胡に使用される培地としては、炭素源、窒素源、無
機物その他の栄養素を程よく含有するものであれば、天
然培地、合成培地のいずれも用いることができる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、シュクロ
ース、マルトース、マンノース、澱粉、澱粉加水分解液
、糖蜜などの種々の炭水化物、あるいはグリセロール、
ソルビトール、マンニトールなどの種々の糖アルコール
、酢酸、乳酸、ピルビン酸、フマール酸、クエン酸など
の各種有機酸、エタノールなどの各種アルコール、エチ
レングリコール、プロピレングリコールなどの各種グリ
コール、各種アミノ酸、牛心臓や牛脳の浸出液、牛血液
粉末などが使用可能である。
窒素，原としてはアンモニア、あるいは塩化アンモニウ
ｌ−、炭Ｍアンモニウム、リン酸アンモニウｌ−、’ｈ
ｔ’ｉＨアンモニウム、酢酸アンモニウムなど各種無機
および有機アンモニウム塩、硝酸ナ｝　ｉＪウム、硝酸
カリウムなどの硝酸塩、尿素、アミノ酸およびその他の
窒素化合物、ならびにベブトン、ＮＺ一アミン、肉エキ
ス、コーンスチープリカー、カゼイン加水分解物、蝿加
水分靜物、フィッシュミールあるいはその消化物、脱脂
大豆あるし）はその消化物などの窒素含有有機物質など
が用いられる。
無機物としてはリン酸第一カリウム、リン酸第二カリウ
ム、塩化カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マンガン、
硫酸第一鉄、塩化ナ｝　ＩＪウム、炭酸カルシウムなど
が用いられる。
培養はｐ｝１６．０〜７５、温度２５〜３５℃で４〜６
日間、通気攪拌しながら行う。
このようにして培養することにより、培養物中、主に培
養液中にノイラミニダーゼが生成蓄積する。培養物中か
らのノイラミニダーゼの採取は次のように行う。
培養終了後、培養液を戸過あるいは遠心分離し、閑体を
除きρ液あるいは上清を得る。この枦液あるいは上浦液
を通常酵素精製に用いられる方法、例えば、塩析、有機
溶媒沈殿、透析、イオン交換力ラムクロマト、ゲル戸過
、凍結乾怪などの方法にて処理することによりｖ４製ノ
イラミニダーゼを採取することができる。
たとえば、培養ｐ液を、硫酸アンモニウム０．５飽和に
よる塩析を行い、生じる沈殿を緩衝液に溶解、透析後、
ＤＥＡＥ−セファデソクスやＤＥＡＥ−セルロースのよ
うな陰イオン交接樹脂を充填したカラムに吸着させ、吸
着した酵素を塩化ナ｝　ＩＪウムまたは硫酸アンモニウ
ムの濃度勾配により溶出させる。溶出された酵素をさら
にセファテ゜ツクスＧ−７５やバイオ・ゲルＰ−１００
によるゲルｐ過法により精製する。
以下に実施例を示す。
実舟例１ （ｌ）ミクτコモノスポラ・ごリディファンエンス△Ｔ
ＣＣ３＋１４６の染色体ＤＮＡを下記のようにして抽出
した。ミクロモノスポラ・ビリディフ；ｐ　／工：／ス
Ａ’ＦＣＣ　３　１　１　４　６を４ｍｌのＳＫＮｏ２
の培地ＣスタビロースＫ（松谷化学工業社製）２０ｇ、
グルコース５ｇ、酵母エキス（大五栄養化学社Ｍ）５ｇ
、ベプトン（極東製薬工業社製）３ｇ、′勺エキス（極
東製薬工業社製）３ｇ、Ｋ＋−＋２ＰＯ１　　０．　　
２　　ｇ　Ｘ　Ｍｇ　　Ｓ　　○，　・　７　ト１２０
０　６ｇおよびＣａＣＯ３　１ｇを脱イオン水で１！と
し、ｐ　Ｈ　７．　６に調整したもの、１２０℃で２０
分間高圧滅菌する〕に接種して３０℃で３日間振盪培養
し、その全量を３０ｍｌのＳ　Ｋ　Ｎｏ．　２培地（土
記ＳＫＮｏ．　２　ｃ培地からＣ　ａ　Ｃｏ．を除いた
もの）に接種して、さちに３０℃で２口間振盪培養した
。４℃、１０分間、１２．０００ｒｐｍ′７：″遠心し
て菌体を集め、２０ｍｌの１０．３％ンヨ糖溶液で２回
［々体を洗浄した。
菌体を６ｍｌのＴＳ緩衝液［　１　０．　３％のンヨ糖
および２５ｍ！，Ｉエチレンジアミン四酢酸２ナトリウ
ｌ、（ＥＤＴＡ）を含む５０ｍ！Ｊ｝リスー塩酸榎｛（
液（ｐＨ８．０）：ｌにセ濁し、さらに５０ｍｇの卵白
リゾチムを加えて３７℃で１時間インキユベートした。
これに０．６ｍｌのブロティナーセＫ（’／グマ社製、
ＴＳ緩衡液で２ｍｇ／ｌ７ｌ１の１度に調整したもの）
を加え、次いで３．６ｍｌの３．３％ドデシル硫酸ナ｝
　ＩＪウム溶液を加えて、３７℃で１時間インキユベー
トして溶菌した。さらに５０℃で３０分間加温後、水嗜
に浸して冷却した。
１０ｍｌのフェノール・クロロホルムｉｎ　Ｃ５００ｇ
のフェノールと５００ｍｌのクロロホルムおよび８００
ｍｇの８−ハイドロキシキノリン（東京化成工業社製）
をよく混合後、２００ｍｌの脱イオン水を加えてよく振
って得た下層を用し）る〕を加えて５分間静かに攪拌し
た後、４℃、１５分間、１２，　０００ｒｐｍで遠心し
た。上層を取り、ＲＮＡ分解酵素を最終濃度２０μｇ／
ｍｌになるように添加し、３７℃で４５分間インキユベ
ートした。１０分の１容の５Ｍ塩化ナ｝　ＩＪウム溶液
を加え、続いて４分の１容のポリエチレングリコール６
．０００　（半井化学社製）を加えて静かに混合した。
水冷下一晩静置した後、４℃、５分間、５，０００ｒρ
ｍで遠心して得られるペレットを５〜１０ｍｌのＴＥ緩
衡液に溶解した。ｌＯ分の１容の３Ｍ酢酸ナ｝　ＩＪウ
ムおよび３０分の１容の６６ｍＭＭｇＣβ２溶液を加え
た後、２，２容の９９％冷エタノールを加えてゆっくり
と攪拌し、４℃、５分間、５．　０００ｒｐｍで遠心し
てペレットを得た。このペレットを７０％冷エタノール
で２回洗浄することにより、ミクロモノスポラ・ビリデ
ィファシエンスの染色体ＤＮＡを得た。得られた染色体
ＤＮＡ　　５μｇを、制限酵素ＢｇβＨ　（ベーリンガ
ー社製）１５単位を含むＭ媛衝液〔組成は１マニュアル
・フォー・ジ工不ティックエンジニアリング（ゴールド
スプリング　ハーバー　ラボラトリー）ρ２２８（１９
８０）　＠照〕　１００μＱに加え、３７℃で３時間反
応させた。
これに１００μｅのフェノール・クロロホルム混液を加
えて激しく１０秒間攪拌して反応を停止させた後、４℃
で５分間、１２．　０００ｒρｍで遠心して上清を採取
した。
放線菌用ベクターｐｌＪ７０２　　５μｇを、ホ１］限
酵素Ｂｇｌ！Ｕ　　５単位を含むＭ緩衝液４０μＱに加
え、３７℃で２時間反応させた。これに５０μρの脱イ
オン水と１０μａのＩＭＦリス〔トリス　（ヒドロキシ
メチル）アミノメタン〕一塩酸緩１１８１　（ｐｔｌ８
５）を加えてよく混合した。さらに２．５単位のウシ小
腸アルカリ性フォスファターゼ（分子生物学用、ベーリ
ンガー社製）を添加レヘ３７℃で４５分間インキユベー
トした。これにフ一ノール・クロロホルム混液１（１０
μｅを加えて激し＜１０秒間攪拌した後、４℃、１２．
　０００ｒｐｍで５分間遠心して上清を採取した。
得みれたミクロモノスポラ・ビリディファンエンス＾Ｔ
Ｃ（：　３１１４６の染色体［０＼Ａ　５μｇｔ含む上
清２５μｇとρＩＪ　７０２　５μｇを含む上清２５μ
ｇを混合し、１０分の１容量の３Ｍ酢酸ナトリウｌ・溶
液と等容量のインブロパノールき共によく混合して水冷
下３０分間放置した。次いて４℃、１４．　０００ｒｐ
ｍで５分間遠心してペレットを得、これを４００ｕＱの
冷７０％エタノールで洗浄して真空下乾怪した。これに
０．８ｍＭＡＴＰ（アデノシン　トリフォスフエート、
シグマ社製）、１０ｍＭジチオスライトール（半井化学
社製）および６．　６　ｍ！，Ｉ塩化マグ不ンウムを含
有ずる６６ｍＭ｝’Ｊスー塩酸緩衝液からなるライゲー
ション緩衝液＜ｐｌ｛７．　６　）　　２　５μｅを加
えて溶解し、さらに１単位のＴ４ライゲース（ベーリン
ガ−社製）を加えて１５℃で１５時間インキユベートシ
た。
この反応液に７５μＱのＰ一溶液｛シヨ糖１０３ｇ、Ｋ
ｚＳＯ＋　２５ｍｇ，ＭｇＣｆ２’　６Ｈ２０　２０３
ｍｇ、および微量金属元素液ＣＺｎＣβｚ４０ｍｇ、Ｆ
ｅＣｌ３・６Ｈ２０　２　０　０ｍｇ，　ＣｕＣｆ２・
２｝｛２０　　　　１　　０ｍｇＳ　ＭｎＣＲ　　２・
４　　Ｆ｛　２０　　１　　０　ｍｇ，Ｎ　ａ　２Ｂ　
１０　７・ｌＯＨ　２０　１０ｍｇ、（ＮＨ．）ｓＭｏ
．・４Ｈ２０　　１０ｍｇを脱イオン水１１に含んだ溶
液＝０２ｍｌを脱イオン水と混合して９０ｍｌとする。
これに１０ｍ１の０．２５Ｍ　　ＴＥＳ　ＣＮ−トリス
（ヒドロキンメチル）−メチル−２＝アミノエタンスル
ホン酸、半井化学社１）緩衡液（ｐｆｌ７．　２　）　
、０．　５ｍｌの５Ｍ塩化カルシウム溶液、ｌｍｌの０
．５％ＫＨ，ＰＯ．を加えた溶液、いずれの溶液も高圧
滅菌したものを用Ｉ１る）と、Ｋ．　Ｆ，　ＣｈａＬｅ
ｒらの方法に従って調製したストレプトマイセス・リビ
ダンスＴＫ？３［カレント・トピックス・イン・マイク
ロバイオロジイ・アンｋ′・イムノロジイ（Ｃｕｒｒｅ
（４ξＴｏｐｉｃｓ　　ｉｎ　　Ｍ＋ｃｒｏｂ＋ｏｌｏ
ｇｙ　　ａｎｄ　　ｌｍｍｕｎｏｌｏ）＋ｙ）　　　９
６６９　−　９５　（１９８５）　］のブロトブラスト
菌液２５μＱを順次加えて静かに混合し、１分間室温に
放置した。
次いテＤ　Ｏ　Ｏ　ｕＱのＴ−溶液〔２５％容量のポリ
エチレングリコール１０００　（半井化学社製）と７５
％容量のＰ−溶液を混合したものΣ・を加えて攪拌した
。これをＰ−溶液で適当ｊこ希釈したもの１０υ頭ずつ
を再生プレートＲ５・＝ン：ｌｌ糖１０３ｇ，Ｋ　２　
Ｓ　Ｏ　．　０．　　２　　５　　ｇ　、　＼１ｇ　Ｃ
　　Ｒ　　２　・　６　Ｈ２０１　０．　１　２　ｇ、
グルコース１０ｇ１カザミノ酸（ディフコ社製）１ｇ、
酵母エキス（ディフコ社製）５ｇ，微ｆｆｌ金属元素液
２　ｍｌ、Ｔ　Ｅ　Ｓ　５．　７　３　ｇ、＼ａＯ８　
　２．５ｇを脱イオン水て１ｌとし、ＩｉＨ７．２に調
整する。これを５等分し、４．４ｇのバクトアガー（デ
ィフコ社製）を加えて２０分間高圧或菌ずる。これらの
１つに３ｍｌの２０％グルタミン酸ナトリウノ、溶液、
３ｍｌの２％ＮａＮ○３溶液、２ｍｌの０３％Ｋ　Ｈ　
，　Ｐ　Ｏ　．溶液および０．ｌｌｌｎｌの５ＭＣａＣ
β２を加えてよく混ぜ、その２０ｍｌずつをプレートに
まいて１５時間乾燥させて使用する〕に塗布した。３０
℃で１５時間培養後、チ才ペブチン（羨沢薬品社製）を
０．　５　ｍｇ／ｍｌの濃度で含有する２５ｍｌの軟寒
天培地Ｃ８ｇのニュートリエントブロス（ディ７コ社製
）と５ｇのバタトアガーを１βの脱イオン水と共に高圧
滅菌したもの］を重層し、さらに３０℃で３日間培養を
続けた。形質転換再生株が生育したプレートに、２ｍｇ
の４＝メチルウンベリフェリルーＮ−アセチルノイラミ
ン酸・アンモニウｌ、塩（半井化学社製）を含有する軟
寒天培地２５ｍｌを重層し、３７℃で５分間インキユベ
ートした。紫外線ランプを照射してその周囲に蛍光を発
する形質転換株を検索し、１２１株のノイラミニダーゼ
生産閑を得た。得られた形質転換株それぞれについて、
後述の実施例２と同様の条件でノイラミニダーゼ生産試
験を行った。
ノイラミニダーゼ生産能の優れた菌株を数株選び、その
中の１株の保有するブラスミドを単離し、各種制限酵素
による消化とアガロースゲル電気泳動により構造を解析
した結果、第１図に示すような構造を有していることが
判明した。このブラスミドをｐＮＥＤ−ＢＧ６と命名し
た。
（２）上記（１）で調製したミクロモノスポラ・ビリデ
ィファシエンスの染色体ＤＮＡから、制限酵素Ｂｃｌｌ
を用いて（１）と同様の方法でノイラミニダーゼの合成
に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体Ｄ
ＮＡを作成した。
すなわち該染色体ＤＮＡ　５μｇを制限酵素Ｂｃｌ（ベ
ーリンガー社製）１５単位を含むＭ緩衝液１００μｇに
加え、５０℃で２時間反応させた。これに１００４のフ
ェノール・クロロホルム混液を加えて激しく攪拌した後
、４℃で５分間、１２．　００Ｏｒｐｍで遠心して上清
を採取した。これに放線菌用ベクターｐｌＪ７０２を上
記（１）と同様に制限酵素ＢｇｌＵで切断後ウシ小腸ア
ルカリ性フォスファターゼ処理、およびフェノール・ク
ロロホルム処理して加え、その混合物の１０分の１容量
の３Ｍ酢酸ナ｝　ＩＪウム溶液と、等容かのイソプロパ
ノールをさらに７乙１１えてよく混合し水冷下３０分間
赦置した。次″，）で４℃、１４．　０００ｒｐｍで５
分間遠心してペレノトをｉ七、これを４００μｇの冷７
０％エタノールで洗浄後真空下乾遅した。これにライゲ
ーション暖衝液２５μｇを加えて溶解し、１単位のＴ４
ライゲースを加えて１５℃で１５時間インキユベトした
。
この反応液にＰ一溶液７５μｇおよび上記（１）で調製
したストレプトマイセス・リビダンスＴＫ２３のブロト
プラスト閑液２５μｇを加えて静かに混合した。上記（
１）と同様の方法でブロトプラストを形質転換Ｌ，Ｐ−
溶液で適当に希釈した後再生プレトＲ５に塗布した。３
０℃で１５時間培養後チ才ペプチンを含有する軟寒天培
地２．５ｍｌを重層し、さらに３０℃で３日間培養を続
けた。上記（１）と同様に４−メチルウンベリフエリル
ーＮ−アセチルノイラミン酸を用い、コロニーの周囲に
蛍光を発する形質転換株を検索し、２７株のノイラミダ
ーゼ生産菌を得た。得られた形質転換株それぞれについ
て、後述の実施例２と同様の条件でノイラミニダーゼ生
産試験を行い、ノイラミニダーゼ生産能の（憂れた菌株
１株を選んだ。その株の保有するプラスミドを単離し、
各種制限酵素による消化とアガロースゲル電気泳動によ
り構造を解析した結果、第２図に示すような構造を有し
ていることが判明した。このブラスミドをｐＮＥＤ−Ｂ
Ｃ４と命名した。
実施例２， 組換え体ＤＮＡを保有する微生物によるノイラミニダー
ゼの生産 実施例１で得られたｐＮＥＤ−ＢＧ６を保有するストレ
プトマイセス・リビダンスＮＥＤ−ＢＧ６　（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−１７６８）およびｐＮＥＤＢＣ４を保有する
ストレプトマイセス・リビダンスＮＥＤ−ＢＣ４　　（
ＦＥＲＭ　　ＢＰ’−２３４０）を、それぞれｌμｇの
チオベブチンを含有する４ｍのＹＥＭＥ培地口酵母エキ
ス（ディフフ社製）３．０ｇ，バタトペプトン（ディフ
−ａ．ＪＪ！）　５．　０　ｇ，麦芽エキス（ディフコ
社製）３．０ｇ，およびグルコースｌ　０．　Ｏ　ｇを
脱イオン水１βに含み、ｐＨ７．２に調整して１２０℃
で２０分間高圧滅菌した培地〕に接種して、３０℃で２
日間振盪培養した。得られた種培養液０．５ｍｌを２．
５μｇのチオペブチンを含む１０ｍｌのＳＫ〜ｏ２培地
に接種して、３０℃で５日間振盪培養した。培養期間中
、１日毎に培１！液を０．２ｍｌずつサンプリングした
。
培養液サンプルを４℃、１４，　０００ｒｐｍで５分間
遠心して上浦を採取し、これを脱イオン水で４０倍に希
釈してノイラミニダーゼ活性を測定した。
ノイラミニダーゼ活性の測定は、「蛋白質・核酸・酵素
」別冊［１ｌ！質実験法Ｊ　ｐ２２　（１９６８）共立
出版のＮ−アセチルへキソサミンの定量法に従った。
得られた希釈培養上清１０μｇに０１ｍｌのコロミン酸
ナトリウム溶液（４０ｍｇ／ｍｌ）　、０．　１　ｍｌ
（７）０．　２Ｍのクエン酸−リン酸ニナ｝　１１ウム
緩衝液（ｐＨ５．０）および０．３ｍｌの脱イオン水を
加えて３７℃で１０分間インキユベートした。１００℃
で３分間加熱処理して反応を停止した。次参で５０μＱ
のＮアセチルノイラミン酸アルドラーセ（１屯位／ｍ１
、協和発酵工業社製）を加えて７０℃で１５分間インキ
ユベートした。生じたＮ−アセチルマンノサミンをモル
ガンーエルソン法（’．ｌｏｒｇａｎ　−　Ｅｌｓｏｎ
法）で定量した。即ち上記反応液にＩＯＯｇＱのホウ酸
塩溶液＜４．９５ｇのホウ酸を５Ｑｍｌｏ脱イ才ン水に
溶解し、ＩＮ水酸化カリウムでｐｆｌ９．　ｌに調整し
た後、脱イオン水で］ＯＯｍｌとしたもの）を加え、ｌ
　Ｏ　Ｏ　ｔで正確に３分間加払後、直ちに水ｊこ浸し
て冷却した。これに３ｍｌのｐ−ノメチルγミノベンズ
アルデヒド試薬（Ｈｌｇのｐ−ジメチルアミノベンズア
ルデヒド（半井化学社製）をＩＯＮ塩酸を１２，５％含
む氷酢酸１００ｍｉに溶解して作製したもの〕を添加し
てよく攪拌し３７℃で３０分インキユベートした後、こ
の溶液の５　８　５　ｎｍ：こおける吸光度を測定した
。既知濃度のＮ−ｒセチルマンノサミンの５８５ｎｍに
おける吸光度を』１ｊ定することにより作製した検量線
を用いて、生じたＮ−アセチルマンノサミン量を算出し
、培養土清中のノイラミニダーゼ活性を測定した。この
際、１分間に１μモルのＮ−アヤチルマンノサミンを生
成する酵素量を１単位とした。培養土清のノイラミニダ
ーゼ活性を第１表に示した。
第　　　　　１　　　　　表 一方、原株であるミクロモノスポラ・ビリディファシエ
ンスは最高１．２単位／ｍｌであった。
次に、上記と同様にして得られたＮＥＤ−ＢＧＧ株の培
養液５００ｍｌを４℃、８．０００ｒｐｍで１０分間遠
心して上清を取り、これに０．５飽和に”Ａるよう硫酸
アンモニウム（半井化学社製）を徐々ｊご添加して４℃
で一晩放置した。これを４℃，１０，　ＯＯＯｒｐｍで
１０分間遠心し、得られたペレットを３０ｍｌの１０１
′ｎＮｌリン酸（ＮａＨｚＰＯａ　　ＮａＪＰＯ−）緩
衝液（ｐＨ７．０）に溶解した後、２１の１０ｍＭリン
酸緩衝液に対して一晩透析した。この全量を５００ｍｌ
のＤＥ＾巳−セフ７０−ス−ＣＬ−６８　（フ７）レマ
／ア社製）を充填したカラム（内径４．　２　ｃｍ、高
さ１３７５ｃｎ１）に静かにのせて吸着させ、１１のリ
ン酸緩｛ｔ液を通塔して非吸着成分を除ｔ１だ。
次いて５０ｍＭのＮａＣｆを含Ｌ゛リン酸１１　！ｌ液
１ｌを通塔後、ｌ　Ｏ　Ｏ　ｍ！．１の＼ａＣｔを含む
リン酸緩衝液を通塔し、波長２８０ｎｍの吸光度がｏ２
以上の溶出液を採集した。これを５βのリン酸緩衝液に
対して一晩透析し、凍結乾坏した。このようにして得た
成分は４２Ｘ］０’単位の酵素活性を有する２８２ｍｇ
のタンパク箕を含んでいた。活性の培養上清からの回収
１ｂは７１２％であった。
実施例３ ミクロモノスポラ・ビリテ゛イファンエンス由来のノイ
ラミニダーゼ遣伝了の塩基配列を以下のようにして決定
した。実惟例】で作製したノイラミニダーゼをコードし
てし）る遣伝子を含む組換え体ブラ７．ミ｝’ｐＮＥＤ
−ＢＧ６とｐＮＥＤ−Ｂｃ４の挿入Ｄ　Ｎ　Ａの共通邪
分（第１図の８．９１０１１．　１２および１３位と第
２図の１５．　１６．　１？，　１８．　１９および２
０（）γ）にＪＪ伝子が存在すると予測されたので、そ
の前後をも含む領域を解析した。
まずｐＮＥＤ−ＢＧ６由来の２．　５　ｋｂのＢｇｌｌ
ｌ切断Ｄ　Ｎ　Ａ断片（第１図８〜１６位）およびｐＮ
ＥＤ−ＢＣ４由来の０．　５　ｋｂのＢｇｌｌｌ切断Ｄ
ＮＡ断片（第２図１３〜１５位）を、大腸閑用クローニ
ンクヘクターｐＵｃ１１８１：メソソズ・イン・エンザ
イモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏ
ｇｙ）　　１５３３〜ＩＩ　（＋９８７）　〕を用いて
それぞれクローニングした。転写、駐訳は一方方向にし
か行われないので、両側かみ挿入ＤＮＡ断片の塩基配列
が決定できろように、それぞれのＤＮＡ断片を逆向きに
挿入したもの、例えばｐＮＥＤ−ＢＧ６由来の２５ｋｂ
のＢｇｌＩｌ切断ＤＮＡ断片は、転写、駐訳の方向に第
１図の８位から１６位の方向にＤＮＡ断片を挿入したも
のと１６位から８位の方向にＤＮＡ断片を挿入したもの
をそれぞれ作製した。クローニングは、ジャーナル・オ
ブ・モレキュラー・バイオロジイ（Ｊ　Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ，）　５３　　，１５９（１９７０）に記載の方法で
行い、ＢｇＩｎとＢａｍｌ｛　Ｉの同一切断末端を利用
して、ｐｕｃ　Ｉ　１　８のＢａｍＨ　Ｉ切断部位にＢ
ｇｌＵ切断ＤＮＡ断片を挿入した。
得られたブラスミドから、制限酵素Ｐｓｔ　Ｉ、Ｘｂａ
ｌ　　（いずれもベーリンガ−社製）を用いて、挿入Ｄ
ＮＡ断片を切り出し、キローシークエンス（Ｋｉｌｏ−
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ）用デレーションキット（Ｄｅｌｅｔ
ｉｏｎＫｉｔ）　（宝酒造社製）を用いて各種のデレー
ションミュータント（Ｄｅｌｅｔｉｏｎ　ｍｕｔａｎｔ
）を作製した。得みれたデレーションミュータントから
ヘルパーファージＭ１３ＫＯ７により単ｉｌｌ　Ｄ　Ｎ
　Ａとして回収された種々のＤＮＡ断片について、グイ
デオキシ法〔ブロンイディング・オブ・ザ・ナショナル
・アヵデミイ’オブ・サイエンス（Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ
．＾ｃａｄ．　Ｓｃｉ．　）ＵＳＡ．．　７４　．５４
６３〜５４６７　（１９７７）　〕により塩基配列を決
定した。放線菌のＤＮＡはグアニンとシトンンの含量が
他の生物由来のＤＮＡに比べて高く、塩基配列決定の際
、ゲル電気泳動上でバンドの圧縮という障害が生じ易い
が、これを回避するため反応に際してはデオキングγノ
シントリフォスフェ｝　　　（ｄｃｏｘｙｇｕａｎｏｓ
ｉｎｅ　　Ｌｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｄＧＴＰ）　　
とデ才キ／イノ／ントリフォスフェート（ｄｅｏｘｙｉ
ｎｏｓｉｎｅＬｒ＋ｐｈｏｓｐｈａｔｅ，　ｄｌＴＰ）
を併用した。上記のようにして決定されたミクロモノス
ポラ・ビリディファンエンス由来のノイラミニダーゼ遺
伝子の塩基配列およびアミノ酸配列を第２表に示す。
箪 表 ＳｅｒＡｒｇＰｒｏＧｌｙＴｈｒＡｓｐＰｒｏＡｌａＡ
ｓｐＰｒｏＡｓｎＶａｌＬｅｕＨｉｓＡ１ａＡｓｒ＋ｌ
／ａＩＡｌａＴｈｒＳｅｒＴｈｒＡｓｐＧ１ｙＧｌｙＬ
ｅｕＴｈｒＴｒｐｓｅｒＨｉｓＡｒｇＧＡＴＧＧＣＣＡ
ＧＡＣＣＴＧＧＣＣＧＧＴＴＴＣＧＡＡＧＧＴＣＴＴＣ
ＣＡＧＣＣＣＧＧＣＴＣＧＡｓｐＧｌｙＧｌｎＴｈｒＴ
ｒｐＰｒｏＶａｌＳｅｒＬｙｓＶａｌＰｈｅＧｌｎＰｒ
ｏＧｌｙＳｅｒＡＴＧＴＣＧＴＡＣＴＣＣＡＣＣＣＴＧ
ＡＣＣＧＣＡＣＴＧＣＣＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＴＡＣＧ
ＧＧＭｅｔｓｅｒ丁ｙｒＳｅｒＴｈｒＬｅｕＴｈｒＡｌ
ａＬｅｕＰｒｏＡｓｐＧｌｙＴｈｒＴｙｒＧｌｙＡｌａ
ＧｌｙＡｒｇＬｅｕｌｌｅＧ１ｎＧｌｎＴｙｒＴｈｒｌ
ｌｅＩｌｅＡｓｎＡ１ａＡ１ａＧｌｙＣＴＧＣＴＧＴＡ
ＣＧＡＧＣＣＧＧＧＣＡＣＣＧＧＣＡＴＣＡＧＡＴＡＣ
ＧＣＣＡＡＣＴ１’ＣＡＡＣＬｅｕＬｅｕＴｙｒＧｌｕ
ＰｒｏＧ１ｙＴｈｒＧｌｙｌ　ｌｅＡｒｇＴｙｒＡｌａ
ＡｓｎＰｈｅＡｓｎＧＣＣＴＴＣＣＡＧＧＣＧＧＴＧＡ
ＧＣＧＴＧＴＡＣＡＧＣＧＡＣＧＡＣＣＡＣＧＧＡＡＧ
ＧＡＣＣＡｌａＰｈｅＧ１ｎＡ１ａＶａｌＳｅｒＶａｌ
ＴｙｒＳｅｒＡｓｐＡｓｐＨｉｓＧｌｙＡｒｇＴｈｒＣ
ＴＣＧＣＣＴＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＣＡＴＣＴＧＣＧＣ
ＧＣＣＣＴＴＣＡＣＧＡＴＴＣＣＧＧＡＴＬｅｕＡｌａ
ＴｒｐＬｅｕＧＩｙＧｌｙＩｌｅＣｙｓＡｌａＰｒｏＰ
ｈｅＴｈｒＩｌｅＰｒｏＡｓｐＴＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧ
ＣＧＡＡＧＣＣＧＴＣＧＧＧＧＴＣＧＧＣＡＴＧＯＡＣ
ＧＡＧＡＡＣＡＡＧＴｒｐＡｒｇＡｌａＧ１ｙＧｌｕＡ
１ａＶａｌＧ１ｙＶａＩＧｌｙＭｅｔＡｓｐＧｌｕＡｓ
ｎＬｙｓＧＴＧＧＣＧＣＴＣＧＡＧＣＣＧＧＧＣＣＡＧ
ＣＡＧＧＴＣＡＣＴＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＣＣＧＴＣＶ
ａｌＡｌａＬｅｕＧｌｕＰｒｏＧ１ｙＧｌｎＧｌｎＶａ
ｌＴｈｒＶａｌＰｒｏＶａＩＡｌａＶａＡＣＣＧＴＧＧ
ＡＡＣＴＣＴＣＣＧＡＴＧＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＧＣＴ
ＣＡＡＣＡＧＣＣＧＣＧＡＣＴｈｒＶａｌＧｌｕＬｅｕ
ＳｅｒＡｓｐＧ１ｙＡｒｇＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｓｎＳ
ｅｒＡｒｇＡｓｐＡＣＧＡＡＣＣＡＧＴＣＣＧＧＴＡＴ
ＣＧＣＧＧＴＡＣＣＧＡＡＧＣＣＧＡＧＣＣＴＴＣＡＧ
ＣＴＣＴｈｒＡｓｎＧｌｎＳｅｒＧｌｙ［１ｅＡ１ａＶ
ａｌＰｒｏＬｙｓＰｒｏｓｅｒＬｅｕＧｌｎＬｅｕＴＣ
ＧＧＣＣＣＧＣＡＧＣＧＧＡＴＡＣＣＧＴＡＡＧＧＴＧ
ＧＣＣＧＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＧＣＳｅｒＡ１ａＡ
ｒｇＳｅｒＧ１ｙＴｙｒＡｒｇＬｙｓＶａＩＡ１ａＶａ
ｌＳｅｒＴｈｒＡｓｐＧｌｙＧＡＣＧＣＡＴＣＧＣＣＧ
ＧＡＣＴＧＧＣＡＧＧＴＴＣＡＧＧＧＴＴＣＣＧＴＣＧ
ＡＧＣＣＣＣＴＣＡｓｐＡｌａｓｅｒＰｒｏＡｓｐＴｒ
ｐＧｌｎＶａＩＧｌｎＧｌｙＳｅｒＶａｌＧｌｕＰｒｏ
ＬｅｕＧＧＣＣＡＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＣＣＧＧＴＧＡ
ＣＣＡＴＣＧＡＣＣＧＣＧＡＣＣＴＣＣＣＣＧＡＣＧ１
ｙＨｉｓＳｅｒＴｙｒＧ１ｙＰｒｏＶａｌＴｈｒＩ１ｅ
ＡｓｐＡｒｇＡｓｐＬｅｕＰｒｏＡｓｐＣＣＧＡＣＧＡ
ＡＣＡＡＣＧＣＡＴＣＧＡＴＣＡＴＣＣＧＧＧＣＣＴＴ
ＣＣＣＴＧＡＣＧＣＣＣＣＧＰｒｏＴｈｒＡｓｎＡｓｎ
ＡｌａＳｅｒＩｌｅＩｌｅＡｒｇＡｌａＰｈｅＰｒｏＡ
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ＡｒｇＧＣＣＧＧＣＴＣＣＧＣＧＣＧＧＧＣＣＡΔＧＧ
ＴＣＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣＡｌ
ａＧ１ｙｓｅｒＡ１ａＡｒｇＡ１ａＬｙｓＶａｌＬｅｕ
ＬｅｕＰｈｅＳｅｒＡｓｎＡｌａＡｌａＡＣＣＴＣＣＧ
ＣＧＧＧＴＡＡＣＧＣＧＴＣＧＡＣＧＡＣＣＴＴＣＡＣ
ＧＧＴＣＡＣＧＧＴＴＧＧＡＴｈｒＳｅｒＡｌａＧｌｙ
ＡｓｎＡｌａＳｅｒＴｈｒＴｈｒＰｈｅＴｈｒＶａｌＴ
ｈｒＶａｌＧｌｙ９１０　　　　　　’９２０　　　　
　　　　９３０　　　　　　　　９４０ＡＧＣＣＡＧＡ
ＣＣＴＣＧＣＧＣＡＧＴＣＡＧＧＧＣＡＣＣＡＴＣＣＧ
ＧＡＴＧＴＣＣＴＧＣＧＡＣＳｅｒＧ１ｎＴｈｒＳｅｒ
ＡｒｇＳｅｒＧｌｎＧｌｙＴｈｒＩｌｅＡｒｇＭｅｔＳ
ｅｒＣｙｓＡｓｐＣＴＧＣＴＣＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＧ
ＧＡＴＧＡＧＣＡＴＣＧＣＧＧＡＣＧＴＣＧＡＣＡＧＣ
ＧＡＧＬｅｕＬｅｕＡｓｐＧｌｎＡｌ　ａＡｒｇＭｅ　
ｔｓｅｒＩ　ｌ　ｅＡｌ　ａＡｓｐｖａＩＡｓｐｓｅｒ
Ｇｌ　ｕＧＡＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＧＡＡＧＡＣＧＧＧ
ＣＧＧＧＣＧＡＧＣＡＡＣＧＴＧＡＴＣＧＡＣＧＧＣＧ
ｌｕＴｈｒＡｌａＡｒｇＧｌｕＡｓｐＧｌｙＡｒｇＡｌ
ａＳｅｒＡｓｎＶａｌＩｌｅＡｓｐＧｌｙ発明の効果 ノイラミニダ ゼの合成に関与する潰｛ム情報４ ＡＡＣＣＣＣＴＣＧＡＣＧＴＴＣＴＧＧＣＡＣＡＣＣＧ
ＡＡＴＧＧＴＣＧＣＧＴＧＣＣＧＡＴＧＣ丁ＡｓｎＰｒ
ｏＳｅｒＴｈｒＰｈｅＴｒｐＨｉｓＴｈｒＧｌｕＴｒｐ
ｓｅｒＡｒｇＡｌａＡｓｐＡｌａ担うＤＮＡ断片を含む
組換え体Ｄ入７へ４保有する微生物を用いることにより
、ノイラミニダ七誘 ＣＣＴＧＧＣＴＡＣＣＣＧＣＡＣＣＧＣＡＴＣＡＧＣＣ
ＴＣＧＡＣＣＴＣＧＧＴＧＧＣＡＣＧＣＡＣＰｒｏＧ１
ｙＴｙｒＰｒｏＨｉｓＡｒｇＩ１ｅｓｅｒＬｅｕＡｓｐ
ＬｅｕＧｌｙＧｌｙＴｈｒＨｉｓ導物質を培地に添加す
ることなしに、 ダ ゼを効率よく｛１ることができる。
ノ・イラミ ＡＣＧＡＴＣＡＧＣＧＧＣＣＴＣＣＡＧＴＡＣＡＣＣＣ
ＧＡＣＧＧＣＡＧＡＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＴｈｒＩ１
ｅｓｅｒＧ１ｙＬｅｕＧ１ｎＴｙｒＴｈｒＡｒｇＡｒｇ
Ｇ１ｎＡｓｎＳｅｒＡｌａＡｓｎ
【図面の簡単な説明】
第１図および第２図は、 それぞれブラスミ ド ＧＡＧＣＡＧＧＴＣＧＣＧＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＴＣＴ
ＴＣＧＣＧＧＴＧＧＡＣＣＴＣＡＧＣＧＣＣＧｌｕＧｌ
ｎＶａｌＡｌａＡｓｐＴｙｒＧ１ｕｌｌｅＰｈｅＡｌａ
ＶａｌＡｓｐＬｅｕｓｅｒＡｌａｐＮＥＤ ＢＧ６およびｐＮＥＤ Ｆ３Ｃ４（Ｊ）．１，ＩｆｉＴ！ ＧＣＣＡＣＣＧＧＧＣＧＡＴＧＴＧＣＧＴＣＣＴＧＣＧ
ＧＴＧＣＧＧＣＴＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＣＣＡｌａＴｈ
ｒＧｌｙＡｒｇＣｙｓＡｌａＳｅｒＣｙｓＧｌｙＡｌａ
ＡｌａＧｌｙＰｒｏＭｅＬＡｌａ酵素切断地図を示す。 図中、 犬線品分（よノイラミ ニダーゼをコ ドする遺伝子を含む碩域を−１；−４−っＧＧＧＣＴＧ
ＣＡＣＧＴＣＴＴＣＴＣＣＣＡＣＧＣＣＣＣＣＧＧＣＣ
ＴＧＧＴＣＧＧＣＣＧＣＴＧＴＧｌｙＬｅｕＨｉｓｅａ
ｌＰｈｅＳｅｒＨｉｓＡ１ａＰｒｏＧｌｙＬｅｕＶａＩ
ＧｌｙＡｒｇＣｙｓまた、図中の各数字はそれぞれ１τ
５己の｛直（ｋｂ｝を表す。 ＣＣＣＧＣＣＴＧＴＧＡＡＣＡＧＧＴＧＡＴＧＣＴＧＣ
ＧＧＣＴＧＧＴＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＧノ〜ＣＰｒｏＡ
ｌａＣｙｓＧｌｕＧｌｎＶａＩＭｅｔＬｅｕＡｒｇＬｅ
ｕＶａｌＡｒｇＡｌａＰｒｏＡｓｐ第１図 ０．　００／　８．　３０ ２，４０ １ａ Ｑ ・１ ４．８０ １０， ４．８５ ５，２０ ＴＴＧＧＣＧＴＴＣＧＡＣＣＡＧＣＣＧＣＡＣＣＣＣＧ
ＧＣＣＣＧＣＴＧＴＧＡＬｅｕＡ１ａＰｈｅＡｓｐＧ１
ｎＰｒｏＨｉｓＰｒｏＧｌｙＰｒｏＬｅｕ＊＊＊ｌ３ ６．３０ １４， ６．４４ １５． ｌ６ １７， ７．２５ ７．９０ 第２図 １．　　０．００／＋３　　７ ５．２．４０　　　　６ ９．６．００　　　　１０ １３．９．４３　　　　１４ １７．　　１０．６５　　　１８ ２＋．Ｉ２．７０　　　２２， ３　２ｌ　　　　７ ７．０８　　　　ＩＩ ９，７７　　　　＋５ １０．８８　　１９ １２．７７　　　２３ ３．　　０　　ｇ５ ４，１５ ７．８２ １０．　００ ２．１０ ＋２．　０５ 特１作出願人 （１０２）協和醗酵下業株式会社

Claims (6)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）ストレプトマイセス属に属し、ミクロモノスポラ
    属に属する微生物由来のノイラミニダーゼの合成に関与
    する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを
    保有する微生物を培地に培養し、培養物中にノイラミニ
    ダーゼを生成蓄積させ、該培養物からノイラミニダーゼ
    を採取することを特徴とするノイラミニダーゼの製造法
    。
  2. （２）ストレプトマイセス属に属し、ミクロモノスポラ
    属に属する微生物由来のノイラミニダーゼの合成に関与
    する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組換え体ＤＮＡを
    保有する微生物。
  3. （３）ミクロモノスポラ属に属する微生物由来のノイラ
    ミニダーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片
    を含む組換え体ＤＮＡ。
  4. （４）大きさが８．３キロベースで、制限酵素に対する
    感受性部位数が、ＢａｍＨ I ２、Ｘｈｏ I ３、Ｂｃｌ
    I ５、Ｃｌａ I ３、Ｓａｃ I １、ＢｇｌII２、Ｋｐ
    ｎ I ２、Ｐｓｔ I １で特徴づけられるノイラミニダー
    ゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む組
    換え体ＤＮＡｐＮＥＤ−ＢＧ６。
  5. （５）大きさが１３．７キロベースで、制限酵素に対す
    る感受性部位数が、ＢａｍＨ I ３、Ｘｈｏ I ３、Ｂｃ
    ｌ I ５、Ｃｌａ I ３、Ｓａｃ I １、ＢｇｌII２、Ｋ
    ｐｎ I ２、Ｐｓｔ I ３で特徴づけられるノイラミニダ
    ーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ断片を含む
    組換え体ＤＮＡｐＮＥＤ−ＢＣ４。
  6. （６）下記の塩基配列およびアミノ酸配列で表されるミ
    クロモノスポラ属に属する微生物由来のノイラミニダー
    ゼをコードする遺伝子。 【遺伝子配列があります】
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