JPH01501150A - インシユリンプリカーサー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インシュリンプリカーサ− 技術分野 本発明は新規なインシュリンプリカーサ−に関する。特に本発明は固有の遅延作 用を示すインシュリンの製造に使用でき、或いはそれ自体糖尿病の治療に使用し てもよい新規なプロインシュリン様インシュリンプリカーサ−に関する。更に本 発明はかかるプロインシュリン様インシュリンプリカーサ−に対し暗号づけする ＤＮＡ配列のみならず本発明のインシュリンプリカーサ−を含有する薬剤に関す る。

背景技術 重症又は慢性の場合、糖尿病ではインシュリン、例えばブタインシュリン、ウシ インシュリン又はヒトインシュリンを含有する注射製剤で通常処置される。

可溶性インシュリン製剤は通常速効性であるが、その代りに作用は数時間後にき かなくなる。従って注射をしばしば、通常１日に数回投与しなければならない。

この欠点を克服するため、作用を数時間又は２４時間まで又はそれ以上維持する よう、遅延作用を有するインシュリン製剤が配合された。かかる遅延製剤を用い ると成る糖尿病患者は少ない回数の注射、例えば２４時間に１回又は２回の注射 を受けなければならないだけである。

かかる遅延作用はインシュリンを僅かに可溶性の塩、例えば亜鉛インシュリン又 はプロタミンインシュリンに変えることによって達成できる。僅かに可溶性のイ ンシュリン塩は懸濁液の形で使用され、そこからインシュリンは例えば皮下注射 後徐々に放出される。

最近遅延作用を達成するための他の方法も提案された。

その例は重合された血清アルブミン中にインシュリン結晶を内包させることであ る。他の例は連続的に作用する注入装置、いわゆるインシュリンポンプである。

更にタンマーク特許出願第３５８２／８４号及び第３５８３／８４号には、Ｂ鎖 のＣ−末端をＡｒｇ　−ＯＨ又はＡｒｇ　−Ａｒｇ　−ＯＢの如き塩基性の有機 基で延長したインシュリン誘導体のみならず前記インシュリン誘導体を含有し、 遅延作用を示す懸濁液製剤が記載されている。

ブタ、ウシ、ヒツジ又はヒトインシュリンの如き糖尿病の治療に通常使用される インシュリンは、６個のカルボン酸基即ちＡ４．Ａ１７．Ａ２１．Ｂ１３．Ｂ２ １及び８３０位でカルボン酸基を含有する。この番号はＮ−末端から出発してイ ンシュリンのそれぞれ人類及びＢ鎖における位置を示す。

インシュリンの生物学的活性は通常誘導体化度が増大すると低下する。しかしな がら生物学的活性は驚いたことに遊離カルボン酸基の高度の誘導体化でさえも殆 んど影響を受けない。しかしながら６個全部の遊離カルボン酸が誘導体化された ときには生物学的活性は完全になくなる〔Ｂ１ｏｃｈａ暇Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃ ｔａ第３１０巻（１９７３年）第４０６頁〜第４１５頁のＷｉｄｅ　Ｄ、Ｌｅｖ ｙの論文参照〕。

発明の開示 インシュリン製剤、特に注射製剤において、位置Ａ４゜Ａ１７．Ｂ１３及びＢ２ １の４個のアミノ酸残基の一つ以上が帯電されていない側鎖を含有するようなイ ンシュリン誘導体の使用により、インシュリン活性を保持することができ、それ と同時に驚いたことに遅延作用が達成される。

この遅延効果は特別な誘導体の性質に依存する、例えば置換されたアミノ酸残基 の数及び前記残基の帯電されていない側鎖の化学組成によって決る。従って遅延 を変化させることができる。遅延作用がトリプシン活性の起源とは無関係に、ト リプシン活性に対して比較的非感性であることは、インシュリン誘導体の著しい 利点であり、新しい事実である。

位置Ａ４．Ａ１７．Ｂ１３及びＢ２１で一つ以上のアミノ酸残基が非帯電側鎖（ ｕｎｃｈａｒｇｅｄ　ｓｉｄ＠ｃｈａｉｎ　）を含有するようなかかるインシュ リン誘導体の製造は生物工学法を用いて行うことができる。前述した位置でのグ ルタミン酸残基の幾つか又は全部が非帯電側鎖を担持する天然に産するアミノ酸 例えばグルタミンで置換できる。

位置Ａ４．Ａ１７．８１３及びＢ２１におけるグルタミン酸残基の一つ以上が非 帯電側鎖を担持するアミノ酸残基に変換されたかかるインシュリン誘導体の製造 は、−末鎖ブリカーサーを介して生物工学的に最も容易に実施できる。

本発明は、下記アミノ酸配列を特徴とするかかるプロインシュリン様インシュリ ンプリカーサ−に関する：上記配列において、基ＲＢ１３　、　ＲＢ２１　、　 ＲＡ４及びＲＡ１７の少なくとも一つは中性アミノ酸残基であり、他はそれらが あるときにはＧｌｕであり、Ａ６とＡｌｌ、Ａ７とＢ７及びＡ２０とＢ１９の位 置はそれぞれ硫黄架橋で連結されており％Ｘｎは４０員子以下のペプチド鎖又は ペプチド結合であり、Ｇ、ＡＩに隣接する兜極員子はＬｙｓ＋又はＡｒｇである 。

それ自体知られている方法で、前記プリカーサ−はＷ＃素的に触媒作用させた半 合成によって前述したインシュリン誘導体に変換できる。Ｘｎがヒトプロインシ ュリンにおけるＢ２９−リジンとＡｌグリシンを連結するアミノ酸配列を有スる とき（この場合１位置”ａ　＋　ｘｓ　＊　ｘＦ＊　”ｓａ又はち。は中性アミ ノ酸に変換されていてもよい）、かかるインシュリンプリカーサ−はそれ自体が 、糖尿病の治療のための医薬製剤に用いることができるであろう。

最近ヒトプロインシュリンが、ヒトプロインシュリンの比較的低い生物学的強度 にも拘らず、糖尿病の治療におけるその使用によって増大しつつある関心を得て いる。これはより簡単な生物工学的生産によるばかりでなく、ヒトインシュリン よりも若干治療的な利点が出現したことにある：皮下注射後に観察された低血糖 症効果の時間は同じ効力の溶解したインシュリン製剤の注射後よりも明確に長い 、しかしインシュリン懸濁液製剤〔インスレイタート（ｒｎｓｌａｔａｒｄ　） 登録商標、モノタート（Ｍｏｎｏｔａｒｄ）登録商標〕の効果よりも短い［Ｄｉ ａｂｅｔｅｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ａｎｄ　Ｃ１１ｎｉｃａｌＰｒａｃｔｉｃｅ 、５ｕｐｐｌ、　ｌ　（１９ｆ３５年）　ｗｉｄｅ第３頁、Ｒ８Ｏ，Ｃ。

Ａｄｅｎｉｊｉ　−Ｊｏｎｅｓ等参照〕、シかしながらプロインシュリンは末梢 グルコース変換を刺激するよりもかなり肝グルコース生産を明らかに抑止するの で、より良好な血糖制釦を達成できることを教示している（　Ｄｉａｂｅｚｅｓ 第３３巻（１９８４年第７６２頁〜第７７０頁、　ＲｏＲ，Ｒｅｖｅｒｓ等参照 ）。

上述した治療上好適な本発明のインシュリンプリカーサ−はヒトインシュリンと 同じ治療活性を有する。更にそれらは、好適な誘導体化度を選択することによっ て遅延された低血糖活性を延引させうる利点を提供する。勿論不発明のインシュ リンプリカーサ−を製剤における通常のインシュリンとの混合物の形で使用し、 組合せた効果を達成することができる。

発明廚のインシュリンプリカーサ−の製造の好ましい方法は、生合成による方法 、例えばグルタミン酸に対する暗号づけをするＤＮＡ鎖中のコドンにおける単一 塩基のみを変えることによる方法であり、このコドンはグルタミンに対し暗号づ けすることかげできる。従ってプロインシュリンに対する暗号づけするＤＮＡ鎖 中の塩基を変えるか又は除くことによって、化学的に作ることは困難で時間のか かる方法を改変することができる。

ヒトインシュリンの生合成製造のための多くの難しい方法が知られている。それ らの全部に共通していることは、プロインシュリン全体、その変性された形に対 して又は別々にＡ鎖又はＢ鎖に対して暗号づけするＤＮＡ鎖を好適なプロモータ ーを含有する複製可能なプラスミド中に挿入することにある。一定の宿主微生物 中にこの系を変換することによって、それ自体知られている方法で真正のヒトイ ンシュリンに変えることができる生成物を作ることができる。

プロインシュリン又は類似インシュリンプリカーサ−の生合成及びそれらのイン シュリンへの変換のための幾つかの既知の方法を以下に説明する。

ヨーロッパ特許第５５９４５号明細書においては、切断部位によって分離された 別の蛋白との融合蛋白として生成物が作られる。これはプロテアーゼ切断部位で あってもよく、或いは化学的に例えばメチオニンで切断されうる部位であること ができる。プロインシュリンのための遺伝子は例えば組換えＤＮＡ法により別の 蛋白との遺伝子融合としてクローンされる。キメラ蛋白の分離後前記蛋白は好適 な酵素又はＣＮＢｒを用いて切断され、次いで変性されたプロインシュリンを亜 硫酸化した形で分離される。この生成物は米国特許第４４３０２６６号に記載さ れている如＜　ＰＨｌ　Ｏ，５で２−メルカプトエタノールを用いて還元条件下 に復元され、続イテＪ、　Ｂｌｏｌ、Ｃｈｓａ＋、第２４６巻、第６７８６頁（ １９７１年）にＫｅｍｍｌｓｒによって発表されている如くトリプシン／ＣｐＢ 切断をする。形成されるインシュリンはそれ自体知られている方法で分離する。

プロインシュリンはヨーロッパ特許第１１６２１１号に記載されている方法を用 いて生合成的に作ることができる。

この方法において、蛋白はサツカロミセス　セルビジアエ（５ａｃｃｈａｒｏａ ＋ｙｃｅｓ　ｃａｒｅｖｉｓｉａｅ　）からα−ファクター系を用いて培地中に 分泌される。この系中にプロインシュリンに対し暗ゼけする遺伝子を挿入するこ とによって、タンマーク特許出願第３０９１／８４号に記載された方法を用いて 培地から分離できる。その後プロインシュリンは前述した既知の方法でインシュ リンに変換できる。

タイプｎ１−ｚｃ＋）−（ｘｎ−ｙ）１．１−Ａｉ−ｔ）（Ｘｎはｎ個の天然に 産生ずるアミノ酸残基を有するペプチド鎖であり、ＹはＬｙｅ又はＡｒｇを表わ し、ｎはＯ〜３３の整数であり、虐は０又はｌであり、ｌ１ｌ−２９）はＢｌ− ｐｈｅ−Ｂ２９−”７”のヒトインシュリンの短縮されたＢ鎖を表わし、Ａ（１ −２１）はペプチド鎖−Ｘｎ−Ｙ−が二つの隣接塩基性アミノ酸残基を含有しな いならばヒトインシュリンのＡ鎖を表わす）のインシュリンプリカーサ−に対す る暗号づけをするＤＮＡ配列のみならず前記プリカーサ−の製造はデンマーク特 許出８８２３８５／８５号に記載されている。しかしながら全ての要件において 、インシュリンプリカーサ−の製造方法はヨーロッパ特許第１１６２０１号に記 載された方法に非常に類似している。

前述した方法において、生成物はプロインシュリン又はプロインシュリン様イン シュリンプリカーサ−である。更にこれらの生成物はシグナル配列と共に作られ るか（この目的は分割される細胞表面に生成物を担持させることにある）又は生 成物を安定化するため蛋白との融合として作られる。

更に生合成的に変性されたプロインシュリンを作ることができる。ヨーロッパ特 許出願第８２３０３０７１．３号にはＣ−鎖が組換えＤＮＡ法によって変性され たプロインシュリンが記載されている。

前述したインシュリン変性は、イーストサツカロミセスセルビジアユ中でヒトＳ ＯＤ　（５ｕｐａｒｏｘｉｄ＠ｄｉｉｍｕｔａｓ＋ｓ　）を暗号づけする遺伝子 との融合として変性ＤＮＡ配列を発現することによって作ることができる。ＳＯ Ｄはイースト中に高収率で発現され（Ｂｉｏｃｈａａ＋１ｓｔｒｙ第１９巻、第 ２３１Ｏ頁〜第２３１６頁、（”１９８０年）のＪａｂｕｇｃｂの論文参照〕更 に微生物で発現されたとき不安定であるプロインシュリン又はプロインシュリン の変体の発現を安定化することができる。

５ＯＤ−インシュリン遺伝子の転写のためのプロモーターとしてサツカロミセス 　セルビジアエからのＧＡＰＤＨ−プロモーター（グリセルアルデヒド−３−ホ スフェートデヒドロゲナーゼ）を使用する。遺伝子工学により、プロモーターは ＡＤＨ２−プロモーターから、またサツカロミセス　セルビジアエからも調節部 位をＧＡＰＤＨ−プロモーターに融合させることによって調節可能に作られる。

グルコースを含有する培地で生長したとき、プロモーターは不活性である、しか しそれはグルコースの不存在下には活性である。

ＤＮＡ配列における変性はインビトロでインシュリン遺伝子に突然変異誘発を用 いて作ることができる。この方法は米国のＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　 Ｓｃｉ、第８２巻第４４８頁〜第４９２頁（１９８５年）にＴ、　Ａ、　Ｋｕｎ ｋｓｌによッテ発表すしている。この方法によれば、インシュリン遺伝子を含有 する配列は一重鎖ＤＮＡバクテリオファージＭｌａ中にクローンされる。このハ イブリッドファージからのＤＮＡ　（鋳型）が精製され、突然変異の各側での所 望の突然変異及び相同部域を含有するプライマー代表的には１５〜２５７−が鋳 型にアニーリングされる。次の工程はＤＮＡポリメラーゼＩを用いて全ファージ ゲノムに沿ってプライマーを延長させることである、この方法で二本鎖分子が作 られ、一つの鎖が突然変異を含有し、他の鎖が野生型インシュリン遺伝子である 。ファージの中で、ファージ子孫（ｏｆｆｓｐｒｉｎｇ　）の一本領ＤＮＡに突 然変異形成プライマーの雑種形成させることにより、所望の種類に対してスクリ ーニングすることができる。プライマーは突然変異鎖に対する完全相同を示すが 、野生型とは一つの単−又クレオシドによって異なる。

スクリーニング後、二本鎖ＤＮＡはファージが増殖されたＥ。

ｃｏｌｉ細胞から分離でき、このＤＮＡから変性されたインシュリン遺伝子が回 収される。そして遺伝子は元の発現系中に再挿入される。

本発明を実施するための形態 本発明を下記実施例で更に説明する。

イースト、サツカロミセス　セルビジアユ中に存在スルときＳＯＤ　−ｋＬｓｔ 　−ＰＩ　（スーパーオキシドジスムターゼ−メチオニン−プロインシュリン） の融合蛋白を生成する発現プラスミドを第１図に示す。このプラスミドはインビ トロで突然変異誘発が変異を暗号づける発現プラスミドを作るために使用できる ため、変性インシュリン分子の発現のための塩基性プラスミドである。

第１図において下記略記号を使用している：２μ＝２ミクロン。サツカロミセス 　セルビジアエから分離されたＤＮＡ配列。サツカロミセス　セルビジアユ中の プラスミドの複製に寄与する。

ＬＥＵ２ｄ：選択しうる標識。ロイシンの生合成における酵素を暗号づけする。

ＡＤＨ２ｒ：ＡＤＩｌ！２プロモーターの調節部分（アルコールデヒドロゲナー ゼ）　（Ｍｏｌ、　Ｃｅ１ｌ、　Ｂｉｏｌ、第６巻、（１９８６年）第１８９４ 頁〜第１９０２頁、　Ｓｕｇｔｅｒ等の論文）。

ＧＡＰＤＨｐ　ニゲリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼプロ モーター（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈ＊ｓｉ、第２５８巻（１９８５年）第４３８ ４頁〜第４３８９頁、丁ｒａｖｉ！１等の論文〕。

ＧＡＰＤＢｔ　ニゲリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼター ミネータ−（上記論文照）。

ｐｓＲ３２２：バクテリア配列。Ｆｉ、Ｃｏ１１中でプラスミドを増殖したとき 複製に寄与する。

Ｂ＝制限エンドヌクレアーゼ認識部位。Ｂａａ＋旧。

Ｒ−：制限エンドヌクレア°−ゼ認識部位。ＮｃｏＩ　。

Ｓ：制限エンドヌクレアーゼ認識部位。５ａｌｌ　。

ＳＯＤ　ニス−パーオキシドジスムターゼ遺伝子。

ＰＸニブロインシュリン遺伝子 最終発現プラスミドｐＹＡＳＩ　ｌへの中間体プラスミドｐＹＳＩ　１がＳＯＤ 　−Ｍａｔ　−ＰＩ融合を暗号づけする。ＳＯＤ遺伝子断片をｐｓＯＤＮｃｏ　 ５　カラビッグパーシャルＳａｕ　３　Ａ制限断片として分離した（　Ｎｕｃｌ ｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒａｍ、第１３巻（１９８５年）第２０１７頁〜第２０３ ４頁、Ｈａｌｌｓｗｓｌｌ等の論文）。プラスミドＰｉｎｓ　５をＨｌｎｄ　ｌ ｌＩ　−５ａｌｌ制限断片の分離のため使用した。これは１３のアミノ末端アミ ノ酸の外は好ましいイーストコドンを有する合成プロインシュリン遺伝子を含有 する。プロインシュリンの１３Ｎ末端アミノ酸、メチオニン及びＳＯＤの３Ｃ末 端アミノ散を暗号づけする合成５１塩基対Ｓａｕ　３　Ａ　−Ｈｉｎｄ　ｌｌ　 リンカ−は二つの精製された断片及びＮｃｏＩ　−５ｉｌＩ−カットｐＰＧＡＰ 　ヘクターで連結された（前記Ｔｒａマｌの論文参照）。

プラスミドｐＹＡＳＩ　ｌの別の中間体、プラスミドｐＪｓ１０４がＡＤＩＩ！ 　２及び０ＡＰＤＥから連結組合されたプロモーターを暗号づけする。ＡＤＨ２ の調節配列を含有する断片がプラスミドｐＡＤＲ’ｌから分離された（　Ｎａｔ ｕｒ＠　第３００巻（１９８２年）第７２４頁〜第７２８頁、　Ｂｅ１ｅｒ及び Ｙｏｕｎｇの論文〕、これはＡＤＢ　２及びその上流ｉ＊ｉａ領域を暗号づけす る９ａａ＋ｌ１ｌＩ　−９ｐｈｌ断片を含有する。プラスミドＰＡＤＲ２がＥｃ ｏＲＶで切りとられ、これはＡＴＧ開始コドンから位置＋６６で切断する。

ＤＮＡを更にＢａｌ　３１ヌクレアーゼで処理し、合成ＸｈｏＩ−リンカ−を末 端に連結した。ｚｈｏｘで消化し再連結した後、形成されたプラスミドをに、Ｃ ｏ１１に形質変換した。ＡＤＨ２ＡＴＧ開始コドンからの位置−２３２でＸｈｏ ）−リンカ−を含有するプラスミドをｘｂｏｒで消化し、Ｓｌヌクレアーゼで処 理し、ＥｅｏＲＩで消化し、ｐＢＲ３２２から生ずるＥｅｏＲＩ部及びＡＤＨ２ 調節領域でのＸｈｏＩ部位でプラント末端を有する線分子を作った。

ＧＡＰＤＨプロモーター領域を含有する断片を、制限酵素Ａｌｕｌ及びｐＰＧＡ ＰのＩｃｏＲＩで消化しくテｒａｖｉ＊等の論文参照）、４００塩基対断片の分 離によって分離した。ハイブリッドプロモーターはここでＡＤＨ２配列を含有す る線状化されたプラスミドでＧＡＰＤＥプロモーター断片を連結することによっ て構成された。二つの断片間の融合は配列分析で立証された。

プラスミドｐＹＳＡＩ　ｌの構成： 最終発現プラスミドは、ｐＪｓ　１０４から分離されたＢａｍＨＩ　／　Ｎｃｏ Ｉ断片及びｐＳＴ　ｌから分離されたＮｃｏＩ　／　Ｂａ＋ｎＨＩ断片を連結し 、連結生成物をＢａωＨ１で消化し、子牛腸ホスファターゼで処理したベクター ｐｃ１／１を複製するイーストに断片を連結することによって（Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

第８１巻（１９８４年）第４６４２頁〜第４６４６頁、Ｂｒａｋｅ等の論文参照 ）。

Ｍ１３ファージ中でのインシュリン遺伝子のクローニング二発現プラスミドｐＹ ＡＳＩ　ｌから分離された３０３４塩基対ＢａｍＨＩ−フラグメントを、Ｂａｅ ｏＨＩで消化したＭ１３１３フアージｌ　３　ｃａｐ　１８の複製形にクローン した。Ｅ、　ｃｏｌｔ株ＪＭ１０１の形質転換後、挿入体の存在及び指向性はＧ ｏｎｅ第１９巻（’１９８２年）第２６９頁〜第２７６頁にＭａｓｓｉｎｇ及び ｖｌ・ｉｒａによって発表されている如く分離されたＤＮＡで配列分析によって 証明された。

オリゴデオキシリボヌクレオチド合成：使用した突然変異化プライマーをＤＮＡ 第３巻（１９８２年）第３３９頁〜第３４３頁に５ａｎｃｈｅｚ−Ｐｅｓｃａｄ ｅｒ及びＡＣＡＡＣＡＴＴＧＴＴσＡＡＣＡＡＴＡＣＣ）。

７　Ｑ　ｍＭ　Ｈｏｐｅｓ、ｐＨ７，Ｑ、ｌ　Ｑ　ｍＭ　ＭｇＣｌ、、　５　ｍ ＭＤＤ’！’、ｌ　ｍＭ　ＡＴＰ、５　Ｑ　ｒｎｐｏｌオリゴヌクレオチド及び アメルシャムからの３６単位丁４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する１０μｅ 容量中で５′末端で２１マーをキナーゼ化した。培養は、３０分ずつ２回行い、 ２回の培養の間にｌμｅのｌ　Ｑ　ｍＭ　ＡＴＰを添加した。

７　Ｑ　ｍＭ　Ｈｏｐ＠ｓ、ｐＨ７，Ｑ、１０Ｉ！ＩＭＭｇＣ／！、５　ｍＭＤ ＤＴ　、４　Ｑ　ｐｍｏｌオリゴヌクレオチド、２．５１ＩＭ　（Ｔ　−３２” ）−１Ｐ及び７単位の〒４ポリヌクレオチドキナーゼを含有する５０μｌ容量中 で５′−末端で２１７−を標識づけした。培養は３７℃で３０分であった。培養 後、取り込まれなかったヌクレオチドを、ＴＥバッファー（１０１ＩＭ　トリス ＨＣＩ、ＰＨ７，５，１１１Ｍ　ＩＥＤＴＡ、ｐＨ７，５）で３！／セファデッ クスＧ−１０カラムで標識づけオリゴヌクレオチドから分離した。

ウラシルとり込み鋳型−ＤＮＡの分離：多数のチミジン分子をウラシルで置換し た鋳ｆｆ１−ＤＮＡを株！！、ｃｏｌｉ　ＲＺ　Ｉ　Ｑ　３２から分離できる（ 前述したテ、Ａ。

Ｋｕｎｋ・１の論文参照）。株は次の方法でインシュリン配列を含有するＭ１３ ファージで感染させた：１０　Ｍ１３ファージを、ミドロガリズミツク相中の０ ．２５μ９／−のウリジン及びｌＯｄのＥ、　ｃｏｌｉ　ＲＺＩ　Ｏ３２細胞で 補った１００ＴＩＬｔ２ＸＹテ培地（イースト抽出物５９／／、トリプトン８９ ／１％　Ｎａｃｅ　５９　／　／）と混合する。３７℃で１６時間振とうしつつ 培養した。この培地から、大容量に規模拡大して−に従って精製した。

ウラシルとり込み株ＲＺＩ　Ｏ３２から分離し、インシュリン配列を含有する一 本鎖Ｍ　１３　ｍｐ　１８　（０，１３ｐＩｌｌｏｌ　）を２Ｑ　ｍＭ　Ｈｉｐ ・＊、ｐＨ７，３，１０ＩｅＭＭｇ、Ｃｅ＊、　５　Ｑ　ｍＭＮ＆（：／及びｌ 　ａｏＭ　ＤＤＴ中の５′−キナーゼ化突然変異化プライマー（５ｐｗ＋ｏりで 感染させた。混合物を８５℃に加熱し、次いで室温に冷却した。この混合物に、 ２Ｑ　ｍＭ　Ｈｏｐｅｓ。

ＰＨ７，３、ｌｏ　ａ＋Ｍ　ＭｇＣ４、ｌ　ｍＭ　ＤＤＴ　、　Ｑ、　２　ＷＭ 　ｄＡＴＰ。

０．２　＋ａＭ　ｄＣＴＰ、０，２１ＣＭ　ｄＧＴＰ、　Ｑ、２　ｍＭ　ｄＴＴ Ｐ　。

ｌａ＋Ｍ　ＡＴＰ、　３単位Ｔ　４　ＤＮＡリガーゼ及び２単位ＤＮＡポリメラ ーゼＩ　（Ｋｌｅｎｏｗ断片）を含有する溶液のｌＯμｌに加えた。最終容量の ２０μｌを１６℃で１６時間培養した。

上＆ｊｉ合物ノ１０　ａｔをＣａ　Ｃｌｘ処理Ｅ、　ｃｏｌｉ　ＪＭ　Ｉ　Ｑ　 ｌを形質変換するために使用した。細胞は、１ゴについて１０’細胞を含有する 最少培地寒天中で平板培養した。形質変換法はウラシル含有鋳Ｗｌｐｍｏ／につ いて約１０′プラークを生ぜ冷却した（４℃）形質変換プレートを乾燥した１枚 のニトロセルロース紙と重ねた。約４分間湿潤させた後、フィルターを１分間Ｑ 、５　Ｍ　ＮａＯＨ，１，５Ｍ　ＮａＣｌ中に、１分間０．５Ｍ　トリスＨＣｌ 、　ＰＨ８，０，１，５Ｍ　ＮａＣ／中に、そして最後にＱ、３　Ｍ　ＭｇＣｌ 、０．０３　Ｍクエン酸ナトリウム中に５分間（２ｘ　ｓｓｃ　）浸漬した。次 いでフィルターを２時間８０℃でＪ空オーブン中で加熱し、０．９　Ｍ　ＮａＧ ／、ｏ、ｏ　９Ｍクエン酸ナトリウム、０．２に血清アルブミン、０．２％フィ コール、０．２にポリビニルピロリドン、０．１％ＳＤＳ及び５０μｇ／ｙｄの さけ精子ＤＮＡを含有する２０ゴ中で２時間６５℃でプレハイブリッド化した。

最後にＩ　０ｆＣＰ、　３２ｐ標識づけ突然変異化プライマーを加え、このハイ ブリッド化を３１℃で１６時間生起させた。ハイブリッド化後、フィルターを２ ＸＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳで５５℃で１５分間３回洗った。

フィルターのオートラジオグラフは正のプラークを明らかに示した。突然変異種 の頻度は２５〜４０にであった。

正７アージをＥ、ｃｏｌｉ株ＸＭ　Ｉ　Ｏ１に感染するために使用した。３７℃ で６時間で５ｄＺＸＹＴ中に約１０”ファージ及びＪＭ　１０１の５コロニーが 生長し、二本鎖環状ＤＮＡを、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｓｓ＋、第７巻第 １５１３頁（１９７９年）にＢｉｒｎｂｏｉａ＋及びＤｏｌｙによって発表され た方法により精製した。

ＤＮＡ製剤（約５μｇ）を、ｌ　ＱＱａ＋Ｍ　ＮａＣ４，５ＱｍＭ　トリｘ　Ｈ Ｃｌ、　ｐＨ７，５、ｌ　Ｑ　ｔｓｈＭ　ＭｇＣ１ｔ及びｌ　ｍＭ　ＤＤＴの６ ０ｐｌ中で３７℃で２時間制限酵素ＢａｍＨＩのｌＯ単位で消化した。

Ｄ）ＩＡ断片をアガロースゲルで分離し、３０３４塩基対の断片を精製した。

イースト複製ベクターＰＣＩ／１への連結：上述した如く単離したＢａｍＨＩ断 片を下記反応混合物中でベクターＰＣＩ／１に連結した： ０．６μ９断片％　ＢａｍＥＩとホスファターゼで処理した０、１μ９のベクタ ー、５０ＩｏＭ　トリスＨＣ／　％ｐＥ　７．４、ｌ　Ｑ　ｔａＭＭ　ｇ　Ｃｌ 、、ｌＱｍＭＤＴＴ及びｌ　ｔｎＭ　ＡＴＰ、最終容量２０ｐｅ。

連結混合物の５μｌをＲ，ｃｏｌｉ株ＭＣ１０６１中に形質変換した、この中で 変性発現プラスミドが増殖し、同定された。

イースト株Ｐ０１７の形質変換： Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（米国）第７５巻（１９７８年 ）ｌ＠ｕ２）を形質変換した。

実施例　２ 形質変換されたイースト中でのＳＯＤ　−Ｍｅｔ−プリカーサ−の発現： ＹＰＤ培地に接種するため形質変換法を使用した（　ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈ ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｌ　９８１年発行Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎｙ ＠ａｓｔ　ｇｅｎｖｔｉｅｓ　５ｈａｒｓａｎ等による）。定常期まで３０℃で 生長させて、培地を１％のエタノールを含有するＭＰ培地中に２０倍に稀釈し、 再び３０℃で飽和まで生長させた。

サツカロミセス　セルビジアエベレットからスーパーオキシドジスムターゼ−メ ト−プリカーサ−のｆｆｆＪｆｆ側１及び２に記載した如く均質化（Ｍａｎｔｏ ｎ　Ｇａｕｌユｎホモジナイザーによる）し、形質変換し、生長させた１００９ のペレットを、４００ｍ１の水で磨砕し、６０００　ｒｐｏで遠心分離した。ペ レットに２６７９のグアニジニウムハイドロクロライド及び０，６ｇのグリシン を加え、容量を水で徐々に４００Ｍ１に調整した。次にｐＨを５Ｍの塩酸で２， ６に調整し、懸濁液を２０℃で４８時間ゆるやかに撹拌した。

遠心分離し、傾瀉した後ペレットを捨て、上澄液を沖過した。炉液に１．４２９ のリン酸水素二ナトリウム２水塩を溶解し、５Ｍの水酸化す）　ＩＪウムでｐＨ を８．０に調整した。

４２２μｌの２−メルカプトエタノールを加え、溶液を２０℃で３０分間ゆるや かに撹拌した。

トリスアクリル（Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ、登録商標）ＣＦ−０５のカラムでゲル濾 過することによって蛋白を、０．０５Ｍの酢酸、０．００５Ｍの２−メルカプト エタノール、７Ｍの尿素を含有し、水酸化ナトリウムでｐＨを５，５に調整した バッファーに移し、溶液を、前記バッファーで４℃で平衡化したｓｐ−トリスア クリル（登録商標）Ｍの５Ｘ１５ｃｎＩカラムに適用した。次いで蛋白を、流速 １００ｉｄ／ｈｒで２０時間にわたってＱＭから０．５Ｍへ増大する同じバッフ ァ中の線上塩化ナトリウム勾配で溶離した。

各画分（ＳＤＳ　−ＰＡＯＩ＋で検出）を含有するハイブリッド蛋白を３容量の 水で稀釈し、硫酸アンモニウムを３９０９／ｌで加えて蛋白を沈澱させた。沈澱 を遠心分離し、水中に再懸濁させた後、水に対して透析し、凍結乾燥した。

１ｇのスーパーオキシドジスムターゼ−メト−プリカーサ−を真空フラスコ中の ７０容量にのギ酸８０ゴに溶解し、８４．５μｌの２−メルカプトエタノールを 加えた。溶液を窒素雰囲気下２時間放置し、次いで１．２５９の臭化シアンを加 えた。反応混合物を暗所で１８時間放置した。ギ酸を高減圧下蒸発させ、８０ｄ の水を加えた後残渣を凍結乾燥した。

亜硫酸化プリカーサ−の製造： ＣＮＢｒ切断からの凍結乾燥残渣を、０．２Ｍのリン酸水素二ナトリウム、８Ｍ の尿素を含有し、５Ｍの酢酸でＰＨ７，４に調整した５０ｄ中に３７℃で溶解し ％０．５Ｍの亜硫酸ナトリウム、０．２ＭのＫＤｉＡ、８Ｍの尿素、を含有し、 氷酢酸でＰＨ７，４に調整した１２．５＋ｗ／の液を加え、溶液を３７℃で放置 した。１０分後に０．５Ｍの四チオン酸ナトリウム、８Ｍの尿素を含有し、氷酢 酸でｐＨ７，４に調整した液６ゴを加えた。３０分後に前記亜硫酸塩溶液１２． ５ｍ／を、４０分後に前記四チオン酸塩溶液７ｍｌを加え、反応混合物を３７℃ で更に６０分放置した。

トリスアクリル（登録商標）ＣＦ−Ｑ５のカラムでゲル沖過し、蛋白を、０．０ ５Ｍの酢酸、０．ＯＩＭの塩化ナトリウム、７Ｍの尿素を含有し、水酸化ナトリ ウムでｐＨ４，７に調整したバッファーに移し、この溶液を、前記バッファーで ４℃で平衡化した５Ｐ−）ＩＪスアクリル（登録商標）Ｍの５Ｘ１５ａｍカラム に適用した。次いで蛋白を１００ｄ／ｈｒの流速で同じバッファーで溶離し１画 分を含有するプリカーサ−を集め、０．０５Ｍの重炭酸アンモニウムでトリスア クリル（登録商標）ＣＦ−Ｑ５のカラムで脱塩し、凍結乾燥した。

プリカーサ−の復元及びｎ製： ５０吋の亜硫酸化プリカーサ−を、酸素不含０．０５Ｍグリシンの４００ｄに溶 解し、ｐＨを水酸化ナトリウムで１０に調整した。次に同じバッファー中の０． ５に２−メルカプトエタノール２ｄを加え、反応混合物を窒素雰囲気下４℃で２ ４時間放置した。次いで５Ｍ塩酸でｐＨを３に調整することによって反応を停止 させ、８０９の塩化ナトリウムを加えて蛋白を沈澱させた。遠心分離後、残渣を １０ｄの水を加えることによって再溶解し、次いで水に対して透析し、凍結乾燥 した。次いで蛋白を、ｐＨを８．２５に調整することによって６０％エタノール 、０．０２Ｍ）リスＥＣｅ中に再溶解し、前記バッファーで平衡化した１、６Ｘ ２０ｃＩＩＩＱ−スフ７ｏ−ス（登録商標）ＣＬ−５Ｂフアスト・フロー・カラ ムに適用し％ｓｏｙ／ｈｒの流速で１５時間にわたりＱＭからｏ、ｉｎへ増大す る同じバッファー中の塩化ナトリウムの線状勾配で溶離した。プリカーサ−を含 有する画分からエタノールを減圧除去し、蛋白を水に対して透析して分離し、凍 結乾燥した。

前述した方法によって下記インシュリンプリカーサ−を製造した： （Ａ　４−　ｇｉｎ　）−ヒトプロインシュリン（Ａ　４　、　Ｂ　２１−　Ｂ ｉｎ　）　−ヒ）プロインシュリン（Ａ４−ｇｅｎ）−インシュリンプリカーサ −、ｎ＝ｏ（ｘｏ＝ペプチド結合）プリカーサ−の同定はアミノ酸分析及び多段 エドマン分解によってｍ認した。

実施例　４ （Ａ　４−　ｇ、ｅｎ　）−ヒトインシュリンの製造：実施例１．２及び３に記 載した方法で作った（Ａ４−ｇｌｎ　）　−ヒトプロインシュリン１５０ｔｎｇ を、４ｘｌ（セットリングした容量）のマトリックス結合トリプシン〔トリプシ ン−セファロース（登録商標）ファスト・フロー、０．８呵酵素／ｄゲル）の０ ．０５Ｍ）すｙ、　Ｔ３Ｃｅ　（ｐＨ７，５）　中（ＩｃＬ！！濁液３０濁液３ 舶 拌した。樹脂を沖過によって除去し、形成された（Ａ４−ｇｅｎ　）−デス−（ Ｂ３０）−インシュリンの溶液をｐＨ６．３で沈澱させて分離し％凍結乾燥した 。

蛋白粉末を２００■のスレオニンメチルエステル、１．０１のエタノール及び０ ．　４　ｄの蒸溜水を含有する混合物に溶解した。酢酸でｐＨを６．３に調整し 、２ｄのトリプシン−セファロース（登録商標）を加えた。ゆるやかに撹拌しつ つ２０℃で２時間放置した後，トリプシン−マトリックスを沖過によって除去し 、１０容量の２−プロパツールを加えて蛋白を沈澱させた。空気乾燥した沈澱を 、ｐＨ８．２５の６０に（容量）エタノール、０．０２Ｍ）リスＨＣ１！中に溶 解し、前記バッファーで平衡化した１．６Ｘ２０百のＱ−セファロース（登録商 標）　ＣＬ　−５　Ｂファスト・フロー・カラムに適用し、流速５　０　ｒ．ｔ ／　ｂｒで１５時間にわたって、同じバッファー中のＱＭからＯ．１Ｍへ増大す る線状塩化ナトリウム勾配で溶離した。（　Ａ　４　−　ｇｅｎ　）−ヒトイン シュリン、Ｂ５０−メチルエステルを含有する画分からエタノールを減圧で除去 し、蛋白をｐＨを６．８に調整することによって沈澱させた。

遠心分離し、凍結乾燥後、１　０　ｎｉ　／　ａｔの蛋白濃度で冷０．　１Ｍ水 酸化ナトリウム中で１０分間Ｂ５０−メチルエステルを加水分解し、続いてｐＨ を８．５に調整した。

溶液を２容の０．０２Ｍ）リスＥＣＭ　（　ｐＨ　８．５）で稀釈し、次いで前 述した如＜１．６Ｘ２０ｃｆｎのＱ−セファロース（登録商標）ＣＬ−５８７ア スト・フロー・カラムに適用し、溶離した。エタノールを除去した後蛋白をｐＨ ６．３で沈澱させた。３０■の（　Ａ　４　−　ｇｅｎ　）−ヒトインシュリン を凍結乾燥後に得た。

生成物の純度は逆相高圧液体クロマトグラフィで確認し、生成物の同定はアミノ 酸分析及び多段エドマン分解によって確認した。

実施例　５ 実施例１．２及び３に記載した方法で作った１８０■の（　Ａ　４　−　ｇｅｎ 　）−インシュリンプリカーサ−（Ｘ＝ペプチド結合）を、塩酸でＰＨ７．７に 調整した２０容量にエタノール、０．０５Ｍ）リス中のマトリックス結合トリプ シン〔トリプシン−セファロース（登録商標）ファスト・フロー、０、　８　１ １９酵素／ｄゲル〕７ｄ（セットリング容量）を含有する懸濁液３５ｄに加え、 混合物を２０℃で２時間ゆるやかに撹拌した。次いで樹脂を炉別し、主として（ 　Ａ　４　−　ｇｔ’ｎ）−デス−８３０−インシュリンを含有する形成された 溶液をｐＨ６．３に調整した。これによって沈澱した蛋白を遠心分離によって分 離し凍結乾燥した。蛋白質粉末を４　０　０　１ｎ９のスレオニンメチルエステ ル、２．０ｍのエタノール及ヒｏ．８０ｄの蒸溜水の混合物に再溶解した。ｐＨ を酢酸で６．３に調整し、３、２ｄのトリプシン−セファロース（登録商標）を 加えた。ゆるやかに撹拌しつつ２０℃で２時間放置した後、トリプシン−マトリ ックスを炉別し、１０容量の２−プロパツールを加えて蛋白質を沈澱させた。空 気乾燥した沈澱を０．０２Ｍ）リスＦｉＣ１、６０％（容量）エタノール、ｐＨ ８、２５に再溶解し、前記バッファーで平衡化した１．６Ｘ２０Ｉ：ｌｌ１ｑ− セファロース（登録商標）　ＣＬ　−　５　８フアスト・フロー・カラムに適用 し、５　０　ｖ／　ｈｒの流速で１５時間、同じバッファー中のＱＭから０．１ Ｍへ増大する線状塩化ナトリウム勾配で溶離した。

（Ａ４−ｇｌｎ）−ヒトインシュリン、Ｂ５０−メチルエステルを含有する画分 から減圧下エタノールを除去し、ｐＥを６．８に調整して蛋白質を沈澱させた。

遠心分離し、凍結乾燥後、Ｂ５０−メチルエステルを、１ｏｑｙｌｔの蛋白濃度 で冷０．１Ｍ水酸化ナトリウム中で１０分間加水分解し。

続いてｐＨを８，５に調整した。溶液を２容量の０．０２Ｍ）！１スＨＣｅ％ｐ Ｈ８．５で稀釈し、次いで１．６Ｘ２０ｃＩＲのＱ−セファロース（登録商標） ＣＬ−５Ｂフアスト・フロー・カラムに適用し，前述した如く溶離した。エタノ ールを除去後、ＰＨ６．３で蛋白を沈澱させた。凍結乾燥後３４哩の（Ａ４−ｇ ｌｎ　）ヒトインシュリンが得られた。

生成物の純度は逆相高圧液体クロマトグラフィで確認し、生成物の同定はアミノ 酸分析及び多段エドマン分解で確認実施例１．２及び３に記載した方法で作った ２００巧のＣ　（　Ａ　４　、　Ｂ　２１　）　−　ｇｌｎ　、　Ｘ　ｌ　−　 ｔｈｒ　％Ｘ　２−　ｌｙｅ、Ｘ　３　−　ａｒｇ　）−インシュリンプリカー サ−を、塩酸でｐＨ１０に調整した０．０５Ｍ）！Ｊエチルアミン、２０に（容 量）エタノール中の８ゴ（セットリング容量）のマトリックス結合トリプシン〔 トリプシン−セフロース（登録商標）ファスト・フロー、４．　Ｏ　ｌｒ４酵素 ／ｄゲル〕を含有する懸濁液４０ｍ／に加え、混合物を４℃で３時間ゆるやかに 撹拌した。

次いで樹脂を炉別し、主として［（Ａ４，Ｂ２１）−ｇｅｎ）−デス−８３０− インシュリンを含有する形成された溶液をｐＨ６．５に調整した。沈澱した蛋白 を遠心分離によって単離し、凍結乾燥した。

蛋白粉末を、４００ｑのスレオニメチルエステル、２，Ｏｄのエタノール及び０ ．８０ｄの蒸溜水の混合物に再溶解した。ｐＨを酢酸で６．３に調整し、３．２ ｄのトリプシン−セファロース（登録商標）を加えた。ゆるやかに撹拌しつつ２ ０℃で２時間放置した後、トリプシン−マトリックスを炉別し、蛋白を２−プロ パツール１０容量を加えて沈澱させた。

空気乾燥した沈澱を０．０２Ｍ）リスＨＣＩ％６０％（容量）エタノール、ＰＨ ８，５に再溶解し、前記バッファーで平衡化した１、６Ｘ２０ｆｆｌＱ−セファ ロース（登録商標）ＣＬ−５Ｂフアスト・フロー・力２ムに適用し、５０　ｗｅ ／　ｈｒの流速で、１５時間、ＯＭから０．ＩＭへ増大する線塩化ナトリウム勾 配で溶離した。エタノールを〔（Ａ４．Ｂ２１）−ｇ／ｎ〕ヒトインシュリン、 Ｂ５０−メチルエステルを含有する画分から減圧除去し、蛋白をｐＨ７に調整す ることによって沈澱させた。遠心分離し、凍結乾燥した後、Ｂ５０−メチルエス テルを１０分間、冷０．１Ｍ水酸化ナトリウム中で、蛋白濃度ｌＯ岬／Ｍｌで加 水分解し、続いてｐＨを９に調整した。

溶液を２容量の０．０２ＭトリスＩＣ／、ｐＨ９で稀釈し、次いで１，６Ｘ２０ ｃｆｎのＱ−−１＝７７０−ｘ（登録商標）ＣＬ−６Ｂフアスト・フロー・カラ ムに適用し、前述した如く溶離した。エタノールを除去した後蛋白をｐＨ６，５ で沈澱させた。凍結乾燥後Ｃ（Ａ　４　、　Ｂ　２１　）　−ｇｅｎ　）　ヒト インシュリンが得られた。

生成物の純度は逆相高圧液体クロマトグラフィで確認した、生成物の同定はアミ ノ酸分析及び多段エドマン分解によって確認した。

実施例　７ ［（Ａ４．Ｂ２１）−ｇｌ！ｎ〕ｔニドインシュリンのＳ造：実施例１．２及び ３に記載した方法で作ったＣ（Ａ４゜Ｂ２１　）　−ｇｅｎ　）　ヒトプロイン シュリン１７０Ｆ、５を、０．０５Ｍ炭酸水素アンモニウム中、ｐＨ８の８ゴ（ セットリング容量）のマトリックス結合トリプシン〔トリプシン−セファロース （登録商標）ファスト・フロー、０８呵酵素／鹸ゲル〕の二；濁液３４ａ（に加 え、混合物を２０℃で３０分ゆるやかに撹拌した。次いで樹脂を炉別し、形成さ れた（　（Ａ４゜Ｂ　２１　）　−ｇｅｎ　］−デス（Ｂ３０）−インシュリン の溶液を凍結乾燥した。

蛋白質粉末を２５０■のスレオニンメチルエステル、１、２５　ｍｌのエタノー ル及び０．５１Ｌｔの蒸溜水を含有する混合物に溶解した。酢酸でｐＨを６．３ に調整し％　２　ｍｌのトリプシン−セファロース（登録商標）を加えた。ゆる やかに撹拌しつつ２０℃で２時間放置後、トリプシン−マトリックスを炉別し、 ｌＯ容景の２−プロパツールを加えて蛋白を沈澱させた。空気乾燥した沈澱を、 ０．０２ＭトリスＨＣ１，６０％（容量）エタノール、ｐＨ８，２５に再溶解し 、前記バッファーで平衡化した１、５Ｘ２（１＋＋＋Ｑ−セファロース（登録商 標）ＣＬ−５Ｂフアスト・フロー・カラムに適用し、５０ｄ／　ｈｒの流速で１ ５時間、ＱＭから０．１Ｍへ増大する同じバッファー中の線状塩化ナトリウム勾 配で溶離した。

エタノールを、（（Ａ　４　、　Ｂ　２１　）　−ｇｉｎ　）　ｌニドインシュ リン、Ｂ５０−メチルエステルを含有する画分から減圧下除去し、ｐＨを７に調 整して蛋白を沈澱芒せた。遠心分離し、凍結乾燥後、Ｂ５０−メチルエステルを 、ｔｏｗ／ｍの蛋白濃度で、冷０．１Ｍ水酸化ナトリウム中で１０分間加水分解 し、続いてｐＨを９に調整した。溶液を２容量の０．０２ＭトリスＨＣ１！、Ｐ Ｈ９で稀釈し、次いで１．６Ｘ２０＋１１のＱ−セファｏ−ス（登録商標）ＣＬ −５Ｂフアスト・フロー・カラムに適用し、前述した如く溶離した。エタノール を除去した後蛋白をｐＨ６，５で沈澱させた。凍結乾燥後、２５１ｎｇの（（Ａ 　４　、　Ｂ　２１　＞　−ｇｅｎ　）ヒトインシュリンを得た。

生成物の純度は逆相高圧液体クロマトグラフィで確認した、生成物の同定はアミ ノ酸分析及び多段エドマン分解で確認した。

（Ａ　４−　ｇｅｎ　）−ヒトプロインシュリンを含有する注射薬の製造＝２５ 岬の（Ａ　４−　ｇｉｎ　）　−ヒトプロインシュリンを、０．５にのｌ−クレ ゾール及び２．６％のグリセロールを含有する０、０２２５Ｍ！ｊン酸３ｄに溶 解し、ｐＨを水酸化ナトリウム溶液で７．４に調整した。水で容量を５．０ゴに 調整し、溶液をｔ過によって滅菌した。

ギアナプタに皮下注射して（０，１２５ｆｎｇ／Ｋｆ）、最大低血糖効果の時間 は、通常のインシュリン製剤〔ベロスリン（Ｖｓｌｏｓｕｌｉｎ　）、登録商標 〕及びＮＰＥ懸濁液製剤〔インスラタード（Ｉｎ５ｕｌａｔａｒｄ　）、登録商 標〕に対して比較したとき中間であることが判った。

鬼 ８Ｒ３２２ 手続補正書（■） ｉノ年Ｑ月タ日

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. １．アミノ酸配列が： 【配列があります】 （式中基ＲＢ１３，ＲＢ２１，ＲＡ４及びＲＡ１７の少なくとも一つは中性アミ ノ酸残基であり、その他は存在するときＧｅｕであり、Ａ６とＡ１１，Ａ７とＢ ７及びＡ２０とＢ１９の位置はそれぞれ硫黄架橋で連結されており、Ｘｎは４０ 員子以下のペプチド鎖又はペプチド結合であり、ＧｅｙＡ１に隣接する究極表子 はＬｙｓ又はＡｒｇである）を特徴とするインシユリンプリカーサー。
2. ２．基ＲＢ１３，ＲＢ２１，ＲＡ４及びＲ１７の少なくとも一つがＧｅｎである 請求の範囲第１項記載のインシユリンプリカーサー。
3. ３．基ＲＢ１３，ＲＢ２１及びＲＡ１７がＧｅｕであり、ＲＡ４がＧｅｎである 請求の範囲第１項又は第２項記載のインシユリンプリカーサー。
4. ４．基ＲＢ１３及びＲＡ１７カＧｅｕであり、ＡＡ４及びＲＢ２１がＧｅｎであ る請求の範囲第１項又は第２項記載のインシユリンプリカーサー。
5. ５．ｘｎがヒトプロインシユリンにおけるＬｙｓＢ２９及びＧｅｙＡ１を連結す るアミノ酸配列を有する請求の範囲第１項〜第４項の何れかに記載のインシユリ ンプリカーサー。
6. ６．Ｘｎ中の位置Ｘ４，Ｘ６，Ｘ７，Ｘ１４又はＸ３０での酸性アミノ酸残基の 一つ以上が中性アミノ酸残基に変換された請求の範囲第５項記載のインシユリン プリカーサー。
7. ７．請求の範囲第１項〜第６項の何れかに記載のインシユリンプリカーサーに対 し暗号づけしたことを特徴とするＤＮＡ配列。
8. ８．請求の範囲第７項記載のＤＮＡ配列を含有することを特徴とする複製発現剤 。
9. ９．医薬的に許容じうるキヤリヤーとの混合物の形で請求の範囲第５項又は第６ 項記載のインシユリンプリカーサーを含有し、所望によつて速効性インシユリン も含有することを特徴とする医薬製剤。