JPH01500216A - 細胞分離用試薬 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞分離用試薬 技術分野 この発明は生物学的な細胞および副紙胞状（ｓｕｂｃｅ−１１ｕｌａｒ　）’成 分の分離および精製のための新しい組成物に関するものである。特に、この発明 は特定の細胞種や特定の副細胞状成分をそれらの浮遊密度に基づいて分離するた めの新しい組成物に関するものである。またもう一つ別の点から言えば、この発 明は回収した細胞や副細胞状成分の純度を高めることのできる特定の細胞種や特 定の副細胞状成分の分離のための新しい方法および手段に関するものである。

発明の背景 生物の体液や組織の成分分離は、臨床診断処置や科学調査、そして時には患者の 治療にしばしば必要である。たとえば、臨床診断分野においては組織を分類する 処置や免疫の機能検査または他の様にな処置のために精製されたリンパ球の急速 な分ｎを可能にする組成物や方法が必要とされている。基礎的研究においてもま た精製されたリンパ球ならびに血液からの他の細胞種を必要とする。さらに、エ ピゾームやＤＮＡ　１染色体、ミトコンドリアや他の副細胞状成分などのような 培養された細胞または副細胞状成分の研究においてもまた高度に精製された製剤 を必要とする。

分離精製には様々な方法で行い得る。しかし、分離した細胞はしばしば生育しう る細胞を必要とする処置において用いられるので、そのように分離された細胞の 機能が損なわれないでいることが大切である。細胞の生育力や細胞や副細胞状成 分の損なわれていない生物機能を確保するためには、分離処置の間に障害を起こ し得る物質を導入することを避けることが大切である。たとえば、組織適合性検 査に用いられる分離したリンパ球は様々なミトゲンによって刺激される。用いら れた媒体は、それ自体ではミトゲンであってはならない。なぜならば、これはＤ ＮＡ合成の測定の有効性に影響を及ぼすからである。

密度勾配遠心分離は生物細胞や副細胞状成分の分離に用いられる一つの技術であ る。勾配の形成に使われる物質が鋭敏な生物学的物質との相客性と与えるある種 の特徴をもっことが大いに望まれる。その技術に用いられてきた勾配物質はサッ カロース、デキストラン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｆｉｃｏｌｌ　（Ｐ ｈａｒｍａｃｉａの登録商標）　、Ｍｅｔｒｉｚａｍｉｄｅのようなヨウ素化さ れた低分子量化合物、塩化セシウムのような電塩を含んでいる。

しかし、これらの物質のほとんど社必要な分離された部分の生化学的機能をもし かすると損なうかもしれない望ましくない特徴をもっている。たとえば、いくつ かの一般に有効な血液分離手段は分離されたリンパ球製剤のミトゲン反応性を減 少させるかもしれない赤血球凝集ポリマーを含む（Ｊ、　Ｉｍｍｕｎｏｌ、　Ｍ ｅｔｈ、　５８：４３−５１．１９８０）。これらの物質はまた望ましくなく高 い浸透圧重量モル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ　）や粘度の溶液を作るであろう 。細胞凝集がしばしば生理学的ｐ）Ｉ　（７，４）でＢＳＡによってひき起こさ れ、’ｔ　ｆｃ　ＢＳＡ細胞膨潤（細胞密度を変えてしまう）のような他の問題 や細胞機能の起こりうる損失をもたらすので低めたｐＨ（５，１）で用いるのは 望ましくない。またＢＳＡは大規模な分離において用いるには費用がかがる。Ｆ ｉｃｏｌｌも同様に分散薬剤の使用、または、望ましくないが、−値を下げるこ とによってのみ直すことができる細胞凝集をひき起こすかもしれない。Ｆｉｃｏ ｌｌはまた大変粘性が高く、それが線状の等張勾配を作シ出すのを難しくしてい る。また、たとえ不連続な勾配を用いてでも、これらのいかなる物質によっても 、大変似かよった浮遊密度をもつ細胞を分離することは難しい。

細胞分離におけるいくつから成功をもって用いられてきた密度勾配物質はコロイ ドケイ酸（ｃｏｌｌｏｉｄａｌｓｉｌｉｃａ　）である。コロイドケイ酸は水中 で溶解した５１０２からケイ酸モノマーの重合によって作られるコロイド粒子の 水性懸濁液である。単一の粒子の大きさは平均すると１３０から１４ＯＡであシ 、一般に約３０から２２ＯＡの間にある。コロイド懸濁液はコロイド粒子が正味 の負電荷をもつｐＨ８〜１０において最も貯蔵安定性である。しかし、それは完 全に満足できるもので杜ない。コロイドケイ酸醇液は冷凍すると非可逆的に沈殿 し、またＰＨ５〜７で０．Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１以上のようなあるイオン状態の下で のタンパク質の存在にお＾でゲルを作る。変性していないケイ酸ゲル（ｓｉｌｉ ｃａｇｅｌ　）はまた大食球や赤血球を含むいくつかの細胞種に対して毒性を示 す。この毒性を減少させるために、また生理学的」ての塩溶液やタンパク質中で のコロイドの安定性を増加させるために、ポリマーでコロイドケイ酸？覆う幾多 の試みがなされてき次。デキストラｆａｃｅｓｃｉ、、５１　：　３８８−３９ ３（１９７４）’）、ボデキストラン硫酸塩、メチルセルロース、カルボキシメ チルセルロース（Ｅｘｐ、　Ｃｅ１ｌ　Ｒｅｓ、、　５０　：　３５５−３６８ 、（１９６８））、ポリビニルピロリドン４５７（１９７７）そしてＰＥＧ、Ｂ ＳＡおよびＦｉｃｏｌｌの混合物のようなポリマーが、Ｌｕｄｏｘ　（デュポン の登録商標）のようなケイ酸ゾルの被覆物として用いられてきた。

ただ単にケイ酸粒子をポリマーで覆うことにもまた問題がみられる。被覆処置に は溶液中の過剰な自由ポリマーの使用が必要とされる。過剰ポリマーは溶液の浸 透圧重量モル濃度や粘性を増加させる。精製された生物学的物質からポリマーを 取り除くこともまた雌しい。さらに、ポリマーで被覆されたコロイドケイ酸で精 製された細胞および器官の形態学上の特徴は一般に容認できるけれども、生化学 的特徴はしばしば損なわれている。たとえば、コロイドケイ酸とＰｖＰの混合物 で分離されたリンパ球は標準媒体の中の細胞と比較すコロイドケイ酸の毒性を減 少させるためのもう一つの試みはケイ酸粒子の表面を化学的に変性させることで あった。化学的に変性されたコロイドケイ酸の一つの例はアルミニウムをコロイ ドケイ酸に化学的に含有この製剤は報告によれば、広い…範囲において安定して いるが、しかし、まず最初に大規模に透析するかそして（または）木炭で処理し て、リンパ細胞に対して無毒にしリンパ球の細分分離に使えるようにしなけれＭ ｅｔ、ｈｏｄｓ、２８　：　２７７　（１９７９）。ＬｕｄＯＸ　ＡＭは報告に よれば浸透圧重量モル濃度（ｏｓｍｏｌａｌｉｔｙ　）に対する影響が小さく、 従ってこの混合物を使用して等張勾配を構成することができる。しかし、Ｌｕｄ ｏｘＡＭにはいくつかの欠点がある。勾配物質は様々な微生物の成長を支持する ので無菌状態で貯蔵されなければならない。様々なリンパ組織の中に見られる汚 染微生物の成長を抑制するために勾配物質には抗生物質や抗菌剤を加えなければ ならない。さらに、リンパ細胞の細区分を十分に分離させるためには不連続勾配 を用いる必要があるＯＪ、　Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ、　 ２８　：　２７７−２９２（１９７９）。不連続密度分離に固有の制限ｉ　９７ ５　；　”　Ａｕｔｏｍａｔｅｄ　Ｐｒｅｓｓ、　ｐｐ、　２１−９６　＋　１ ９７０）はリンパ球の回収を低め、従ってリンパ球比率に異な：５８４−５９７ ．１９７５）。さらに不連続勾配は密度の異なる個別の溶液から作られる。正確 な密度の様々な溶液を作るには相当な時間がかかる。遠心分離で密度勾配を作り 出すにも、２０，０００〜３０．００　Ｏｒｐｍの速度を必要とする。

別の重板されている化学変性コロイドケイ酸はＰｅｒ−ｃｏｌｌ　（Ｐｈａｒｍ ａｃｉａの登録商標）でちる。これはｐｖｐの層をケイ酸粒子に水素結合させた ものである。、タミしｃａｌｌは血液細胞成分および各種源からの副細胞状器官 を分離するために広く使われている。シ造者から供給された状態では、Ｐｅｒｃ ｏｌｌ　ｎ　’Ｍ度１．１５０±０．００５ｇ／ｃＩＩＬ３、Ｆ）１９．０±０ ．５および浸透圧重量モル濃度〈２５　ｍ　ＯｓＭ　／ゆをもつ。このＰｅｒｃ ｏｌｌに生理学的塩を加えて等張とし、酸または塩基を加えてｐＨ７，０〜７． ４に調節する。密度もまた注意深く調節する必要がある。

細胞が浮遊密度１．１１〜１．１２９　／　ｃｍ３より大であればＰｅｒｃｏｌ ｌを濃縮する必要がある。Ｐｅｒｃｏｌｌを使う通常の技術では、成層（ｌａｙ ｅｒｉｎｇ、）により、勾配形成剤の使用により、または遠心分離（一般に２０ ，０００〜３０．０００　ｒｐｍを要する）により、サンプル添加前に予め勾配 を形成する。これに代えて、遠心分離前に細胞製剤を希釈等張ＰｅｒＣＯ１ｌと 直接に混合することもできる。

しかしながら、Ｐｅｒｃｏｌｌ　ｔ−血液細胞分離用媒体として使用するにはそ の簡便性、性能および実用性の上で制限がある。Ｐｅｒｃｏｌｌは紫外線領域に おいてｐｖｐによる強い吸収を示す。このことは分光測光法により核酸およびタ ンパク質の密度勾配を分析するときに重大な欠点となる。ＰＶＰはまたタンパク 質定量のためのＬｏｗｒｙＶｏｌｌ、１１５，１３４（１９８２）。Ｐｅｒｃｏ ｌｌは生理学的−およびイオン濃度において多少は安定であるが（塩、酸および 塩基の添加によ＃））等張にした後でオートクレイプにかけると安定でなく、ま た希釈溶液中で凝集する傾向がある。後者の問題はケイ酸表面からのｐｖｐの解 離によるので低濃度の遊離ｐｖｐの添加によシ防止できる。上記のように、遊離 ｐｖｐは少くともいくつかの細胞機能に対してマイナスの効果がある。

また、Ｐｅｒｃｏｌｌによって浮遊密度の僅かの差に基づいてのみ細胞を分離す るのは困難である。

本発明者は研究の結果、新しい化学変性技術を使うことによって、生物学的材料 の分離に有用な新しいコロイドケイ酸組成物を製造できることを見出した。この 組成物はオルガノシランを水性条件下で非多孔質コロイドケイ酸と高めた温度お よびアルカリ性−で反応させてケイ酸粒子とオルガノシランとの間に共有結合を 形成することによシ、製造する。この組成物は特定の細胞種または特定の副紙胞 状（５ｕｂｃｅｌｌｕｌａｒ　）成分をそれらの浮遊密度に基づいて単離するた めに使うことができる。この組成物は回収される細胞および副紙胞状成分の純度 を高めそしてサンプル処理時間を短縮する。異なる寸法の試薬変性ケイ酸粒子を 組合わせた組成物ｆ：製造することもできる。この組合わせ組成物によれば、倣 小な浮遊’ＥＩＫの相違によっても細胞および細胞状成分を分離できるという利 点がさらに得られる。この種の分離はこれまで不可能であったか、または実用化 されていなかった。精製した抗体をカップリングした試薬変性ケイ酸粒子から成 る組成物を作ることもできる。この抗体変性組成物は細胞および細胞成分を、そ れらの抗原決定基ならびにそれらの補体または抗体産生の可能な任意の他の細胞 成分たとえばペデチドホルモンリセプタに基づいて、分離することを可能とする 利点をもつ。

本組成物はいくつかの望ましい特性をもっている。

試薬変性はコロイドケイ酸の毒性を低めそして生理学的塩およびタンパク質の存 在下でのコロイドケイ酸粒子の凝集を防ぐ。本組成物は生物学的材料に対して相 容性をもち、細胞状および副線胞状生物学的粒子のいずれについても密度分離に 好適に使うことができる。

予め形成した密度勾配、その場で形成した密度勾配および比較的低速の遠心分離 を使う急速細胞分離のいずれも使用可能である。本組成物は生理学的なイオン濃 度および−をもち、等張であり、低粘度であり、そして密度範囲１．０〜１−４ １１　／　ｃｍ３ｔ−もつ。広い範囲の温度および一僅において安定である。安 定である証拠に、本組成物は生理学的条件下でのオートクレイプ操作に対して完 全に安定である。また本組成物は水溶液中に溶解または分散可能であシ、生物学 的標本から容易に除去することが可能であシ、そして低価格である。

本組成物の使用方法にもまたいくつかの利点がある。

従来の血液分離手段は注意深い血液成層（ｌａｙｅｒｉｎｇ）技術を必要とする 。本組成物によれば従来技術と比べて熟練を要さずに血液分離をすることができ る。たとえば、その場での操作については成層を必要としない。

分離すべき物質を試薬変性したコロイドケイ酸と混合し遠心分離するだけでよい 。全血から単核細胞を分離する場合は、単核細胞と周辺血液中に存在する他の細 胞状要素との間に存する、生来の密度差を利用する。

遠心分離をすると試薬変性コロイドケイ酸粒子の沈降によシ単核細胞の分離に適 当な連続した密度勾配が形成される。急勾配の形成はこの種の分離に使われる粒 子（直径２００Ａ以上）の高い沈降速度によるものである。細胞分離は周辺血液 細胞が遠心分離の間に連続密度勾配中の相当する浮遊密度部位に移動することに より完成する。この分離技術は高価でなく診断用遠心分離器以外には特別な装置 をほとんど必要としない。

発明の要約 本発明に従へば、シリカ粒子に無毒、非イオン性、親水性の表面を付与する試薬 ？用いて被覆された非多孔性のコロイドシリカ粒子を作シ、そして用いる方法が 発見された。得られる試薬で変性されたコロイドシリカは、凡ての型の体液例え ば血液と骨髄と髄液と胸膜液と精液並に分散された組織検体と培養された細胞と 他の源からの生物学的細胞およびそれらの構成要素から、細胞と単細胞構成要素 とを分離するのに用いることができる。

本発明の１つの実施態様によれば、有機シランがコロイドシリカにカップリング するように、水性媒質中、高められた温度とアルカリ性−とで、コロイドシリカ と有機シランとを混合する段階を含む、試薬変性されたコロイドシリカ製造のた めの新規の技術が提供される。得られる試薬変性のコロイドシリカは、活性炭吸 着によシ反応副生成物を除去され、それから脱イオンされる。それから、その試 薬変性されたコロイドシリカを、試薬と試薬変性されたコロイドシリカとの間に 更に共有結合での付着を形成させるため、再加熱する。

その滲透圧と−とを生物学的材料と適合させるため調節する。それから、その試 薬変性されたコロイドシリカを緩衝剤により、分離すべき生物学的材料に適当な 密度に希釈する。シリカの表面に共有結合で結合した有機シランはコロイドシリ カの毒性を減少させ、生理学的−と塩濃度とにおいて、蛋白質存在の下でのコロ イドシリカ粒子の凝析を防止する。

本発明の他の実施態様によれば、水性媒質において、チオール基が試薬変性され たコロイドシリカ表面上に結合するよう、チオール試薬と試薬変性されたコロイ ドシリカとの混合する段階を含む、チオール試薬を用いる抗体のカップリングし た試′＃変性コロイドシリカの製造の新規な技術を提供する。チオール基は更に スクシンイミドと反応させて、プロティンＡがカップリングする結合を提供する 。それから抗体をプロティンＡとカップリングして、抗体で変性されたコロイド ７リカを形成する。抗体変性コロイドシリカの使用は、抗体が結合できる抗原決 定因子をもつ構成要素細胞の、細胞混合物、例えば血液からの分離を可能にする 。

本発明の他の実施態様によれば、水性媒質中で試薬変性されたコロイドシリカと カルボシイミドとを反応させ、続いてプロティンＡがアミド結合を通じてカップ リングする結合手を形成させる段階を含む、カルざシイミドを用いる抗体変性さ れたコロイドシリカ製造の新規の技術を提供する。それから抗体をプロティンＡ とカップリングさせ、抗体変性されたコロイドシリカを形成させる。

本発明の他の実施態様によれば、希釈された細胞混合物と、分離すべきその細胞 混合物の構成要素細胞の浮遊密度の範囲内にある最終密度をもつ希釈された試薬 変性コロイドシリカ組成物とを、組成物の上に細胞混合物を層状に置くことによ シ接触させ、細胞分離を達成させるために細胞混合物と組成物とを懸垂筒型ロー ター中で遠心分離し、そして、バンドを形成する特定の型の細胞の特性浮遊密度 まで移動した構成要素細胞１＆：４める段階を含む、生物学的細胞混合物例えば 全血または他の生物学的流体から構成要素細胞を分離する新規の技術を提供する 。例えばリンパ球が血液試料中の他の型の細胞から分離できる。典型的にｆｌ　 ＩｊンｔＲ球は浮遊密度１．０６０〜１．０７４　ｇ　７ｃｍ３をもち、密度界 面に細胞バンドを形成する。他の型の細胞は勾配をつける材料中に侵入してしま う。その細胞バンドは取去ることができ、細胞は洗浄され、まるめられ、そして 増殖または代謝の研究あるいは他の実験に適した媒質中に再懸濁する。

本発明の他の実施態様に従えば、生物学的細胞混合物例えば全血または他の生物 学的流体から構成要素細胞を分離する新規の技術を提供し、それは細胞混合物試 料と希釈された試薬変性コロイドシリカ組成物とを混合し、定角度ローターまた は懸垂筒口−ター中で遠心分離することを含んでいる。遠心分離においては連続 した密度勾配が形成される。構成要素細胞はその勾配内の特性浮遊密度に移動し 、特定の型の細胞の特性密度のところに細胞バンドを形成する。例えば単核細胞 をこのその場での分離技術を用いて、血液試料中の他の細胞から分離してもよい 。単核細胞はメニスカスのすぐ下に細胞バンドを形成する。単核細胞バンドは他 の細胞のバンドと同様に互に集められ、洗浄され、まるめられ、増殖または代謝 の研究あるいは他の実験に適した媒質中に再懸濁できる。

本発明の他の実施態様によれば、浮遊密度がほんの少ししか違はない生物学的細 胞または準細胞構成要素を分離する新規の技術を提供する。その技術は、異った 寸法をもつ試薬変性コロイドシリカ粒子と細胞混合物例えば血液試料、軟部また は骨髄とを混合し、その細胞混合物と試薬変性コロイドシリカ組成物とを混合し 、その混合物を遠心して密度勾配を生じさせ、後、特定の特性浮遊密度に形成さ れる細胞の個別のバンドを集めると云う段階を含む。そうして集めた細胞は洗浄 し、まるめられ、そして増殖または代謝の研究または他の実験に適した媒質中に 再懸濁する。例えばＢおよび１９２２球を血液試料中の他の細胞から分離しても よい。Ｂ細胞はＴ細胞より低密度領域をもっている。

ＴおよびＢ細胞は、Ｂ細胞が勾配中の鋭い変化点でバンドを作や、Ｔ細胞がそれ よシ高い密度のところに分離してバンドを形成するよう勾配の形を選択すること によ）分離することができる。勾配中への、小さい試コロイドシリカ粒子より作 られたもの）の混在はよシ低い密度領域を拡げまたはせはめるに反し、より大き い試薬変性コロイドシリカ粒子（約２０ＯＡ以上のコロイドシリカ粒子より作ら れたもの）は勾配のよシ高い密度領域を圧縮する。従って、適当な初期密度を選 択し、適当な粒子寸法から作った試薬変性コロイドシリカ粒子を用いて密度勾配 の選択領域を拡げることによ５、Ｂ細胞とＴ細胞とを分離することが出来る。こ の方法はまたＢお工びＴ細胞からＮＫ細胞を分離するにも使用できる。Ｂ細胞と Ｔ細胞とＮＫ細胞との分離後、Ｂ細胞とＴ細胞とＮＫ細胞との螢光単り−ロン体 抗体による細胞の染色を行うことができる。

本発明の他の実施態様に従えば、異る抗原決定因子をもつ生物学的細胞または細 胞構成要素の分離のための新規の技術を提供する。抗体変性されたコロイドシリ カ粒子調製には大きい粒子寸法（約６０　ＯＡ）のコロイドシリカを用いる。抗 体変性コロイドシリカ細胞混合物に混合する。その混合物を、抗体変性コロイド シリカが構成要素細胞上の抗原部位に結合するに光分な時間培讐する。それから その混合物を細胞分離組成物を通して遠心分離する。付着した細胞を持った抗体 変性コロイドシリカは勾配の底部から回収できる。付着した細胞蝶スルフヒドリ ル減少剤の処理によシ、チオール試薬を用いて調製した抗体変性コロイドシリカ から取除かれる。若し抗体変性コロイドシリカがアミド結合を通してプロティン Ａを直接試薬変性コロイドシリカの表面上にカップリングさせて調製したならば 、付着した細胞はエタノールアミン処理によって取除いてもよい。抗体変性され たコロイドシリカからの除去につづいて、細胞を洗浄し、増殖または代謝の研究 あるいは他の実験に適した媒体中に再懸濁する。

図面の簡単な説明 第１ａ、ｂ、ｃ、ｄ図は希釈されている試薬変性されたコロイドシリカの独特な 個体群を混合して得られた勾配の形状を示す線図である。

第２図は付着している有機７ラン試薬残基金５Ｒ＠で表はしである試薬変性され ているコロイドシリカの概略図である。

好ましい実地態様の詳細な記述 生物学的細胞と細胞構成要素との分離に適当な、試薬で変性したコロイドシリカ 組成物が公開された。その組成物の１独特の個体群１（以下で定義される）は単 離された細胞と細胞構成要素とを得るに要する時間を減少させると共に、得られ る単離物の純度を増加させる。試薬で変性したコロイドシリカ組成物の独特な個 体群の混合物の使用は非常に似た浮遊密度をもつ細胞の型の分離を可能にする。

更に、精製したモノクロナール抗体とカップリングさせることによシ変性された 、試薬で変性されたコロイドシリカの独特の個体群の使用は、抗原決定因子の補 体に基く、細胞の分離を可能にする。

そのカップリング反応に用いる非多孔性コロイドシリカ粒子の寸法は約３０Ａ〜 約６０ＯＡで変動する。

各個別の組成物のための出発材料は大多数が殆んど同じ直径であるコロイドシリ カ粒子を包含している。しかし、コロイドシリカ粒子のこの１個体群“は、技術 で公知の粒子の寸法分類法によって誘導することが出来るような分布曲線で表わ すことが出来る寸法範囲を持っている。この個体群中の大部分の粒子は、その分 布曲線の頂点の寸法を持つが、全体の曲線がその個体群１に表現している。その 個体群に特定される寸法は製造業者の規格に示されている寸法である。製造業者 から受取る個体群の実際の寸法はロット毎に変るかもしれない。その寸法変動を 調和するために、各個体群は１約ｘＡ”として示めされる。ここに、ｘｈ製造業 者のカタログと製造規格とに示されている粒子寸法呼称である。本発明に従って 使用できるコロイドシリカ粒子は、Ｎｙａｃｏｌ　Ｐｒｏｃｉｕｃｔｓ、　Ｉｎ ｃ、　（Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒ、　Ｍａｓｓ、）により’　Ｎｙａｃｏｌ　”の 名称の下に阪売されている材料を含み、その材料は、水に溶解している５１０２ からモノ珪酸の重合によシ形成されたコロイド状粒子の水性懸濁液である。１度 変性試薬と共有結合で結合すると、その粒子は、おのおのが定められた範囲内の 浮遊密度をもつ、試薬で変性されたコロイドシリカ粒子集団となる。得られた、 変性試薬とカップリングした粒子個体群の浮遊密度範囲と最も好ましい浮遊密度 とを第１表に示す。

第１表 試薬変性されたコロイド 未変性シリカ　好ましい浮　最も好まし３０　１．０６−１．１６　１．１１ ４０　１．０４６−１．１４６　１．０９６７０　１．０６７４−１．１６７４ 　１．１１７４８０　１．１１５−１．２１５　１．１６５１２０　１．１１９ −１．２１９　１．１６９１３０　１．１１２−１．２１２　１．１６２１４０ 　１．１７２−１．２７２　１．２２２１５０　１．２１９−１．３１９　１． ２＜５９２００　１．１３９−１．２３９　１．１８９２２０　１．１２　−１ ．２２　１．１７６００　１．３３−１．４３　１．６８力ツプリング反応に用 いられる粒子の直径と、変性試薬とのカップリングの後の浮遊密度とによシ他の 個体群と区別出来る、試薬で変性されたコロイドシリカ粒子の個体群を、２つの 独特の個体群中のある粒子の特性は同じかもしれないが、′独特の個体群”とす る。

特別な分離性質をもつ細胞分離組成物混合物を作るため独特な個体群の１つまた はそれ以上を混合してもよ前記のコロイドシリカ粒子と共有結合で結合する試薬 はどんな有機７ラン試薬であってもよい。有機シランはコロイドシリカの表面上 のシラノール（ｓｌ−〇−８ｉ）基と安定な共有シロキサン結合を形成出来る唯 一の化合物である。有機シラン中の官能基は非イオン的であって親水性でなけれ ばならない。イオン性官能基は、イオンの荷電が出および塩の変化に対し敏感で 、その結果デル化する故に、希ましくない。疎水性官能基は中性の−と生理学的 塩濃度におけるゲル化に対し、コロイドシリカを実際に敏感にする。親水性官能 基はＨ２Ｏ１コロイド表面に結合させる。結合Ｈ２０は−とイオン強度と蛋白質 との変化に対して独立である保護殻として働き、その故にそのコロイドをゲル化 から保護する。

有機シランはシリカ粒子に１無毒“、非イオン性、親水性の表面を与える。無毒 の意味はその組成物が分離すべき生物学的材料の保全または機能に影響を与えな いと云うことである。使用することが出来る有機シランの例を第２表に掲げる。

好ｌしい有機シランはγ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシランである。

第　２　表 試薬変性されたコロイドシリ （ａ）　（ｘ）３−８ｉ（ＣＨ２）３−ＯＣＨ２５（３−グリシドオキシゾロピ ル）トリクロロシラン　ｃｌ（６−グリシドオキシゾロピル）トリエトキシシラ ン　Ｈ５Ｏ２０（３−グリシドオキシプロビル）トリアセトキシシラン　Ｈ３Ｃ ’Ｃ○２（３−グリシドオキシプロビル）　メチル　ジ１ＸシランＨ３ｃ（３− グリ７ドオキシグロビル）　ジメチル＋Ｘシラン　（Ｈ２Ｏ）２（ｂ）　（Ｘ） ３−８ｉ（ＣＨｓ＋）ｚ−○ＣＨ２Ｃ！（ＣＨ２０（２−グリシドオキシエチル ）トリメトキシシラン　Ｈ２ＣＯ（２−グリシドオキシエチル）トリクロロシラ ン　Ｃ１（２−グリシドオキシエチル）トリエトキシシラン　Ｈ５Ｃ’２０（２ −グリシドオキシエチル）トリアセトキシシラン　Ｈ３ＣＣＯ２（２−グリシド オキシエチル）　メチルシ“Ｘシラン　Ｈ２Ｏ（２−グリシドオキシエチル）　 ジメチル“Ｘシラン　（Ｈ２Ｏ）２（ｃ）　（Ｘ）３−８ｉ（ＣＨ２）３−０２ ＣＣＨ３３−アセトキシプロピル　トリメトキシシラン　Ｈ３Ｃ０６−ア七トキ シプロビル　トリクロロシラン　Ｃ１３−アセトキシプロピル　トリエトキシシ ラン　Ｈ５Ｏ２０６−アセトキシプロピル　トリアセトキシシラン　Ｈ３ＣＣＯ ２３−アセトキシプロピル　メチルゾ歌シラン　Ｈ２Ｏ２−アセトキシプロピル 　ゾメチルヘシラン　（Ｈ２Ｏ）　２（ｄ）　（Ｘ）３−８１（ＣＨ２）２−０ ２ＣＣＨ３２−アセトキシエチル　トリメトキシシラン　Ｈ３ＣＯ２−アセトキ シエチル　トリクロロシラン　Ｃ１２−アセトキシエチル　トリエトキシ７ラン 　Ｈ２Ｏ２゜２−アセトキシエチル　トリアセトキシシラン　Ｈ３ＣＣ○２２− アセトキシエチル　メチルジ　Ｘシラン　Ｈ２Ｏ２−アセトキシエチル　ジメチ ル　Ｘシラン　（Ｈ２Ｏ）２（ｅ）　（Ｘ）３−３１（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ２ ０Ｈ２０Ｈ）２ビス　（２−ヒドロキシエチル）−３７ミノプロビルトリメトキ シシラン　Ｈ２Ｏ。

ビス　（２−ヒドロキシエチル）−３７ミノプロビルトリクロロシラン　Ｃ１ ビス　（２−ヒドロキシエチル）−３７ミノプロビルトリエトキシシラン　Ｈ５ Ｃ２０ビス　（２−ヒドロキシエチル）−３７ミノプロビルトリアセトキシシラ ン　Ｈ５ＣＣ０２ビス　（２−ヒドロキシエチル）−３アミンプロビルメチルジ 　Ｘ　シラン　Ｈ３Ｃビス　（２−ヒドロキシエチル）−３７ミノプロビルジメ チル　Ｘ　シラン　（Ｈ２Ｏ）２（ｆ）　（Ｘ）３−８ｉ（ＣＨ２）２−Ｎ（Ｃ Ｈ２ＣＨ２０Ｈ）２ビス　（２−ヒドロキシエチル）−２アミンエチルトリクロ ロシラン　Ｃ１ ビス　（２−ヒドロキシエチル）−２アミノエチルトリエトキシ７ラン　Ｈ５Ｃ ２０ビス　（２−ヒドロキシエチル）−２７ミノエテルトリアセトキシ７ラン　 Ｈ３ＣＣＯ２ビス　（２−ヒドロキシエチル）−２７ミノエチルメチルゾ　Ｘ　 シラン　Ｈ３Ｃ ビス　（２−ヒドロキシエチル）−２アミンエチルジメチル　Ｘ　シラン　（Ｈ ２Ｏ）２（励　（ｘ）３−ｓｉ（ＣＨ２）３−ＣＯ２ＣＨ３３−（カルボメトキ シ）プロピルトリメトキシシラン　Ｈ３ＣＯ３−（カルボメトキシ）プロピルト リクロロシラン　Ｃ１３−（カルざメトキシ）プロピルトリエトキシシラン　Ｈ ５Ｃ２０３−（カルボメトキシ）プロピルトリアセトキシシラン　Ｈ３ＣＣＯ２ ３−（カルボメトキシ）プロピル　メチルジ４Ｉｘシラン　Ｈ２Ｏ２−（カルボ メトキシ）プロピル　ジメチル４ｋＸシラン　（Ｈ２Ｏ）　２（ｈ）　（Ｘ）３ −８ｉ（ＣＨ２）２−ＣＯ２ＣＨ３２−（カルボメトキシ）エチルトリメトキシ ７ラン　Ｈ２ＣＯ２−（カルボメトキシ）エチルトリクロロシラン　Ｃｌ２−（ カルボメトキシ）エチルトリエトキシシラン　Ｈ５Ｃ’２０２−（カルボメトキ シ）エチルトリアセトキシシラン　Ｈ３ＣＣＯ２２−（カルがメトキシ）エチル 　メチルジ歌シラン　Ｈ２Ｏ２−（カルボメトキシ）エチル　ジメチルなシラン 　（Ｈ２Ｏ）２（ｉ）　（Ｘ）３−３ｉ（ＣＨ２）３−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ ２）２Ｃ○２ＣＨ３メチル（２−（３−トリメトキシ　シリルプロピルアミン） エチルアミン）−３−プロピオネート　Ｈ２Ｏ。

メチル（２−（３−トリクロロ　シリルプロピルアミノエチルアミノ）−３−プ ロピオネート　Ｃ１メチル（２−（３−トリエトキシ　シリルプロピルアミノ） エチルアミノ）−３−プロピオネ−）　Ｈ５Ｃ２０メチル（２−（３−トリアセ トキシ　シリルゾロピルアミノエチルアミノ）−３−プロピオネート　Ｈ３ＣＣ Ｏ。

メチル（２−（３−ジ　”Ｘメチルシリルプロピルアミノエチルアミノ）−３− プロピオネート　Ｈ３Ｃメチル＜２−Ｃ５−ゝＸＸジメチルシリルデミピルアミ ノエチルアミノ−３−プロピオネート　（Ｈ２Ｏ）２（ｊ）（Ｘ）３−３ｉ（Ｃ Ｈｚ）２−ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯ２ＣＨ３メチル（２−（２− トリメトキシ　シリルエチルアミノ）エチルアミノ）−３−プロピオネ−トド３ ＣＯメチル（２−（２−）リクロロ　シリルエチルアミノエチルアミノ）−３− ７’ロピオネート　Ｃ１メチル（２−（２−トリエトキシ　シリルエチルアミノ ）エチルアミノ）−３−プロピオネート　Ｈ５Ｃ２０メチル（２−（２−トリア セトキシ　シリルエチルアミノエチルアミノ）−３−プロピオネート　Ｈ３ＣＣ ○２メチル（２−（２−ジ３ｘメチルシリルエチルアミンエチルアミノ）−３− プロピオネート　Ｈ３Ｃメチル（２−（２−“Ｘジメチルシリルエチルアミノエ チルアミノ）−３−プロピオネート（Ｈ２Ｏ）２（（至）　（Ｘ）　３−８ｉ（ ＣＨ２）　３−ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨＣ（ＣＨ３）ＯＮ−（）リメトキシシリルゾ ロビル）アセチルグリシンアミド　Ｈ３ＣＯ Ｎ−（トリクロロシリルプロピル）アセチルグリシンアミド　ＣＩ Ｎ−（）リエトキシシリルプロビル）アセチルグリシンアミド　Ｈ５Ｃ２Ｏ Ｎ−（トリアセトキシシリルゾロビル）アセチルグリシンアミド　Ｈ３ＣＣＯ２ Ｎ−（ゾなメチルシリルプロピル）アセチルグリシンアミド　Ｈ３Ｃ Ｎ−（“Ｘジメチルシリルゾロピル）アセチルグリシンアミド　（Ｈ２Ｏ）２ （１）　（Ｘ）３−８ｉ（ＣＨ２）２−ＮＨＣＯＣＨ２ＮＨＣ（ＣＨ３）ＯＮ− （トリメトキシシリルエチル）アセチルグリシンアミド　Ｈ３ＣＯ Ｎ−（）！Ｊジクロロリルエチル）アセチルグリシンアミド　ＣＩ Ｎ−（）リエトキシシリルエチル）アセチルグリシンアミド　Ｈ５Ｃ２Ｏ Ｎ−（）リアセトキシシリルエチル）アセチルグリシンアミド　Ｈ３ＣＣＯ２ Ｎ−（ジ３Ｘメチルシリルアセチル）アセチルグリシンアミド　Ｈ３Ｃ Ｎ　−（”Ｘジメチルシリルエチ）アセチルグリシンアミド　（Ｈ２Ｏ）　２ （（ロ）（Ｘ）３−８ｉ（ＣＨ２）　３−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２ＯＮ−（３−ト リメトキシシリルプロピル）モルホリン　Ｈ３Ｃ０Ｎ−（３−トリクロロシリル プロピル）モルホリン　ＣＩＮ−（３−トリエトキシシリルゾロピル）モルホリ ン　Ｈ５Ｃ２ＯＮ−（３−トリアセトキシシリルプロピル）モルホリン　Ｈ３Ｃ ＣＯ２Ｎ−（３−シ“Ｘメチルシリルゾロビル）モルホリン　Ｈ３ＣＮ−（３− “Ｘジメチルシリルゾロピル）モルホリン　（Ｈ２Ｏ）　２（向　（Ｘ）３−８ ｉ（ＣＨ２）＋−Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２ＯＮ−（２−）リメトキシシリルエチル ）モルホリン　Ｈ３Ｃ○Ｎ−（２−トＩＪ／ロロシリルエチル）モルホリン　Ｃ ＩＮ−（２−）リエトキシシリルエチル）モルホリン　Ｈ５Ｃ２ＯＮ−（２−ト リアセトキシシリルエチル）モルホリン　Ｈ３ＣＣ０２Ｎ−（２−シ′ｋＸメチ ルシリルエチル）モルホリン　Ｈ３ＣＮ−（２−”Ｘジメチルシリルエチル）モ ルホリン　（Ｈ２Ｏ）　２（ｏｌ　（Ｘ）３−３ｉ（ＣＨ２）３−Ｎ（ＣＨ＝Ｃ Ｈ２）２Ｎ−（３−）リメトキシシリルデロビル）ピロール　Ｈ３Ｃ０Ｎ−（３ −トリクロロシリルゾロピル）ピロール　ＣＩＮ−（３−トリエトキシシリルプ ロピル）ピロール　Ｈ５Ｃ２ＯＮ−（３−）リアセトキシシリルプロビル）ピロ ール　Ｈ３ＣＣＯ２Ｎ−（３−ジ“Ｘメチルシリルゾロピル）ピロール　Ｈ３Ｃ Ｎ−（３−”Ｘジメチルシリルゾロピル）ピロール　（Ｈ２Ｏ）２（ｐｌ　（Ｘ ）３−３ｉ（ＣＨ２）２−Ｎ（ＣＨ＝ＣＨ２）２Ｎ−（２−４１Ｊメトキシシリ ルエチル）ピロール　Ｈ３Ｃ０Ｎ−（２−トリクロロシリルエチル）ピロール　 ＣＩＮ−（２−）リエトキシシリルエチル）ピロール　Ｈ５Ｃ２ＯＮ−（２−） リアセトキシシリルエチル〕ピロール　Ｈ３ＣＣＯ８Ｎ−（２−ジ“Ｘメチルシ リルエチル）ピロール　Ｈ３ＣＮ　−（２−”Ｘジメチルシリルエチル）ピロー ル　（Ｈ２Ｏ）２試薬で変性されたコロイドシリカは抗体、好ましくは単クーロ ン抗体、最も好ましくは精製された単クーロン抗体とカップリングさせることに よシ更に変性できる。第１に、プロティンＡを試薬で変性きれたコロイドシリカ の表面に、或はアミド結合も通じてカップリングさせる。それから抗体がそのゾ ロティンＡと結合して抗体で変性されたコロイドシリカを形成する。

如何なる寸法のコロイドシリカを用いてもよい。しかし、好ましい寸法は約６０ ＯＡのコロイドシリカである。若しプロティンＡがアミド結合を通じ試薬で変性 されているコロイドシリカに直接カッシリングしているならば、第３表に掲げら れている有機シランを用いて調製された試薬で変性されたコロイドシリカだけを 用いてもよい。

第　６　表 アミド結合を通じカップリングされている抗体で（ａ）　（Ｘ）３Ｓｉ（ＣＨｓ ＋）３ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ２（トリメトキシシリルグロビル ゾエチレントリアミン　Ｈ３Ｃ’Ｏ ３Ｃ （Ｈ２Ｏ）２ 本発明の組成物は一般的には次の如くして作ることができる。コロイドシリカを 、コロイド状態を安定化する有機シラン試薬と混合する。好ましくは、試薬添加 に先立ち、そして添加の間コロイドシリカを約７５００に加熱する。その水性コ ロイドシリカ溶液は、希望量の試薬がコロイドシリカに混合された場合、シリカ が試薬に対して常に過剰であるように、どんな便宜的濃度であることができる。

このことは試薬のコロイドシリカへの時宜を得た添加によって達成し得る。試薬 の添加速度は好ましくはコロイドシリカ１を当）毎分試薬約０．５〜約２．０ｒ ｎｌ、最も好ましくはコロイドシリカ１を当り毎分試薬約Ｑ、７ｒｎｌである。

用いられる試薬量は、化学的に変性される特定のコロイドシリカ中に存在する表 面シラノールの全個数による。特定のコロイドシリカ中の表面シラノール基の全 個数は次の如くして計算できる。

全表面シラノール数一体積（ｄ）×密度Ｃｊｊ／Ｔｉ１ｌ）Ｘシリカ固形物（％ ）（製造業者データ）×表面積（ｎｍ２／ｇ）（Ｍ遺業者データ）Ｘ　４．５シ ラノール数／　ｎｍ２（Ｔｈｅ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　ｏｆ　５ｉｌｉｃａ　： 　５ｏｌｕｂｉｌｉｔｙ　。

Ｐｏ１ｙｔｎｅｒｉｚａｔｉｏｎ、　Ｃｏ１１ｏｉｄ　ａｎｄ　５ｕｒｆａｃｅ 　Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ。

ａｎｄ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　６３３−６３６頁、１９７９年からの値 ）。試薬１分子が表面シラノール分子１，２または３個と反応し、それと共有結 合を形成し得る。コロイドシリカ？化学的に変性するのに用いられる試薬の概算 体積は次のようにして計算出来る。

試薬体＆−（（全表面シラノール数／アざがドロ数）／Ｚ　）　Ｘ　（試薬分子 量）×（試薬密度）（この式で、Ｚは好ましくは１，２または３、最も好ましく はＺ−３である）。コロイドシリカはｚ−３の時１完全に変性”される。チオー ル試＃を用いて調製される、抗体で変性されたコロイドシリカを作るに用いる１ 部分的に変性′されたコロイドシリカを形成するためには、完全に変性されたコ ロイドシリカ形成のために計算された試薬量の約５０〜７５％？使用する。

試薬を完全に添加した後、その反応混合物ｆ：１〜３時間攪拌しながら約り０℃ 〜約８０’Ｃで加熱する。反応副生成物は好ましくは、その反応混合物を活性炭 を通過させ、そして反応混合物を脱イオンして除去する。

試薬で変性されたコロイドシリカの脱イオンは好ましくはその反応混合物を陽イ オン交換樹脂（水素型）と陰イオン交換樹脂（水酸基型）とを通過させて達成さ せる。活性炭カラムおよび樹脂カラム何れの中に残存する試薬変性されたコロイ ドシリカも好ましくは、それぞれのカラムに水を通過させて回収する。試薬とシ リカ表面との間のそれ以上の共有結合的付着は、試薬変性されたコロイドシリカ をはげしく攪拌し乍ら更に加熱して促進できる。この段階は好ましくは３〜６時 間、約９０°Ｃ〜約１００℃で行う。更に好ましくは約９５℃で３時間行う。

それから、試薬変性されたコロイドシリカ調製物は、生理学的浸透圧と−とに調 節される。浸透圧は好ましくは固形の塩化ナトリウムと塩化カリウムとを用いて 調節する。ｐＨｉ好１しくに水素型とナトリウム型とのＨＥＰＥＳ緩衝剤を用い て調節する。得られた溶液の密度はそれから使用前に緩衝剤（２３ｍＭ、４７． ４）を用いて調節され、分離されるべき材料の密度範囲にある最終密度をもつ希 釈された試薬変性コロイドシリカを形成する。

試薬変性されているコロイドシリカを希釈する緩衝剤は、分離され、精製される べき生物学的材料と”相客れる１ものならばどんな緩衝剤でも可能である。′相 客れる゛ためには、担体液体は生理学的イオン強度と−とであシ、分離される材 料の構造または機能に影響を与えてはならない。用いることが出来る緩衝剤の例 には、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパン　スルホン酸（ ＨＥＰＥＳ　）、Ｎ　−Ｎ−ビス−２−ヒドロキシエチル−２−アミノエタン　 スルホン酸（ＢＥＳ）、ビス−２−ヒドロキシエチルイミノ−トリス−ヒドロキ シメチルメタン−２−ビス−２−ヒドロキシエチルアミノ−２−ヒドロキシメチ ル−１゜３−プロパンジオール（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ　）、１，３−ビス−トリス −ヒドロキシメチルメチルアミノプロパン（ＢＩＳ−ＴＲＩＳ−ＰＲＯＰＡＮＥ 　）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルビベラゾンーＮ−３−７’ロパンスルホン酸（ ＥＰＰＳ　）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−２−ヒドロキシプロ パン　スルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、５−Ｎ−モルホリノプロパン　スルホン酸 （ＭＯＰＳ）、ヒペラゾンーＮ−Ｎ−ビスー２−エタン　スルホン酸（ＰＩＰＥ Ｓ）、ピペラジン−Ｎ−Ｎ−ビス−２−ヒドロキシプロパンスルホン＠　（ｐｏ ｐｓｏ　）、５−Ｎ−）リス−ヒドロキシメチルメチルアミノ−２−ヒドロキシ プロパン　スルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−）リス−ヒドロキシメチルメチル− ２−アミノエタン　スルホン酸（ＴＥＳ　）　ｋ包含する。

試薬変性されているコロイドシリカまたは希釈されている試薬変性されたコロイ ドシリカは技術で公知の滅菌法で滅菌できる。その組成物は圧力釜処理には安定 ではあるが、滅菌の好ましい方法は０．２ミクロンのフィルターを通過させるこ とである。滅菌された生成物は、細胞分離例えば引続く培養での増殖のための細 胞の分離のため、あるいは出発材料の滅菌状態を要求する試験での使用のための 無菌条件での使用ができる。

連続密度勾配遠心分離法によシ細胞から構成要素細胞をその場で分離することの 効果は、得られる、細胞と希釈された試薬変性コロイドシリカとの混合物の密度 で左右される。例えば、全血から単核細胞を分離する場合、混合物の密度は次の 式を用いて計算できる。

〔この式で、１．０６７　ｇ／ｃｍ３は全血と希釈された試薬変性コロイドシリ カとの最適混合物で得られた密度であり、１．０２４ｇ／α３は全血の有効密度 （血液の密度から血液中の赤血球による密度への寄与を引いたもの）であシ、Ｘ は分離される血液の体積であシ、Ｙｌは希釈された試薬変性されているコロイド シリカの密度であり、Ｙは希釈された試薬変性されたコロイドシリカの体積であ る〕。

全血と希釈された試薬変性のコロイドシリカのどんな組合せも使用できる。唯一 っの制限は混合物で得られた密度が約１．０６７±０．００１１１　／　ｃｒｔ ｔ３であるべきことである。赤血球密度は−に依存する。赤血球密度は希釈され た試薬変性コロイドシリカの中１．８７．４０±０．０３で最大である。その結 果、単核細胞から赤血球の最も効果的な分＠はこの−のところで達成される。

試薬で変性されたコロイドシリカの構造は次のよう■ し、Ｒはコロイドシリカに結合する試薬である）。試薬がγ−グリシドオキシプ ロピル　トリメトキシシランである場合、反応生成物の構造は次の如くである。

（この式で、２つのＸ基は何れも一〇Ｈ基、または好ましくけ１つが一〇Ｈ基で １つがシリカ表面との追加の結合、あるいはさらに好ましくは２つのシリル表面 との追加の結合である）。Ｒ基間の橋かけ結合または重合は起らない。最終的な コロイドシリカ粒子の概略の表現を第２図に示す。ここでは付加されている試薬 の残基はＲで表はされている。

使用に際しては、希釈された試薬変性されているコロイドシリカを、適当な方法 で、分離すべき細胞または細胞構成要素を含有する試料に接触させる。どの粒子 寸法を用いるかの選択は、分離すべき細胞または細胞構成要素の浮遊密度の範囲 と分離に採用される遠心力と分離持続時間とに基く。よシ大きい粒子寸法を用い ることはより小さい粒子寸法を用いることに比較して、密度勾配を生じさせるの に要する時間とｇ−力を減少させるので好ましい。沈降速度は粒子直径の２乗に 比例する故に、大きい粒子寸法のものはよシ小さい粒子寸法のものより大きい沈 降速度をもつ。よシ短い遠心分離時間とより低いｇ−力とは、遠心分離で得られ る細胞または細胞構成要素に対する損傷を減少させる。

試薬変性されているコロイドシリカ中での細胞分離は、細胞または細胞構成要素 が遠心分離中に浮遊密度勾配内でのそれらの浮遊密度に移動することにより達成 される。それからそれぞれの浮遊密度で形成される細胞バンドを、ピペットまた は好ましくは細胞除去管により、態別に遠心管に移すことができる。前記の細胞 除去管の製造法および使用法は１９８６年４月９日出願の私の同時係属米国出願 番号第８４９．６９８号に述べられていて、その開示は参考資料によりここで与 えられている。細胞分離試薬は洗浄により除去できる。

そしてその細胞はまるめられ、緩衝剤または培養媒質中に再懸濁することができ る。

本発明は次の例を考直することにより更に理解される。しかし、これらの例は説 明として与えられるものであって制限として与えられるものではないこと、そし て、例えば材料の量または選択において、本発明の請求範囲に引用されている本 発明の範囲から逸脱することなく、多くの変化または変更があってもよいことを 理解すべきである。

実施例１ 試薬変性されたコロイドシリカの調製 約７ＯＡのコロイドシリカ（シリカ５　Ｑ　ｗｔ％）（Ｎｙａｃｏｌ　Ｐｒｏｄ ｕｃｔｓ、　Ｉｎｃ、　Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒ、Ｍａｓｓより購入）５ｔｋ７５ ℃に加熱する。γ−グリシドオキシプロビルトリメトキシシラ：ｙ　（Ｐｅｔｒ ａｒｃｈ　Ｓｙｓｔｅｍｓ、　Ｉｎｃ、より購入）２１３ｍ／を、絶えず攪拌し ながら毎分’１．Ｑｍｌで添加する。その反応混合物を攪拌しながら７５℃に加 熱し、試薬を添加し終ってからさらに６０分間加熱する。それから、如何なる反 応副生成物も除去するため、その反応混合物を活性炭カラム（直径８ｃＴＬｓ高 さ４０ｃｍ）を通過させる。それから、その試薬変性されたコロイドシリカと、 １時間に３．８６の割合で、初めに陽イオン交換樹脂カラム（水素型）　（８Ｃ １ｒＬＸ　４０ｃｒｎ）、それから陰イオン交換樹脂カラム（水酸基型）（８ｃ ｍｘ４０ｃＭＬ）を通すことはより脱イオンする。それから水３ｔを活性炭とイ オン交換樹脂とを通過させ、残存している試薬変性されたコロイドシリカを除去 する。

試薬とシリカ表面との間の共有結合の形成を更に促進するため、その試料変性さ れたコロイドシリカを、はげしく撹拌しながら６時間９５℃に加熱する。それか ら固形塩化ナトリウム８〜９１１／ｌと固形塩化カリウム０．３〜０．４　ｇ／ 　ｔと、水素型（２，５１９／ｌ）とナトリウム型（２，４７１／ｚ）とのＨＥ ＰＥＳ緩衝剤２０ｍＭとを前記試薬変性されたコロイドシリカ調製物に加え、そ の滲透圧と…とをそれぞれ生理学的水準に調節する。それから、得られた溶液を 、同一の滲透圧と−とを持つＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液と混合することにより、最終 密度１．０７４〜１．０９９ｇ／ｃｒＩＬ３に希釈する。〔第４表を見よ。それ に上記の如くして調製した２つの希釈された試薬変性されているコロイドシリカ 組成物の性質が、２つの市販されていて入手可能な細胞分離試薬、Ｐｅｒｃｏｌ ｌ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａの登録商標）とＬｕｄｏｘ　Ｈ３−５０（Ｄｕ　Ｐｏ ｎｔの登録商標）とが比較しである〕実施例２ 血液からの単核細胞の分離 粒子直径約７０Ａで、希釈後の密度的１−０７４ｇ／ｃＩｎ３ｆｔもつコロイド シリカから作った希釈された試薬変性コロイドシリカ５　ｍｌを１５ｍｇの円錐 形遠心分離管に入れる。燐酸塩で緩衝されている塩水（塩化ナトリウムＢｇ／ｌ 、塩化カリウム０．２９／　ｔ、リン酸水素−ナトリウム１．１５ｇ／ｌ、リン 設＝水素カリウム０．２９／ｌ、　ｐ）１７．４　＞で１：１に希釈された血液 ３　ｍｌ？前記の試薬変性されているコロイドシリカの上に層をなす様に入れる 。その遠心管を懸垂筒型ローター中で、室温、９００　ｘｇで２０分間遠心分離 する。メニスカスに集った単核細胞バンドを細胞除去管またはピペットで取り去 る。その単核細胞ｆ　Ｈａｎｃｋｓ液（塩化カリウム０．４１１／ｌ、リン酸− 水素カリウム６０８９／１１塩化ナトリウム８．０９／ｌ、重炭酸ナトリウム０ ．５５ｇ／ｌ、リン酸水素＝ナトリウム４８ｍ９／ｌ。

グルコース１９／ｌ、フェノールレッド１０す／１゜＋ｌＪ″１７．４　）　１ ０ｍ１ｆ：加え、室温、３００　ｘｇで１０分間遠心分離して洗浄する。リンパ 球り平均回収百分率は６２．３であシ、その細胞の平均生育率は９５％より大き く、リンパ球の平均百分率は７７．６％である。（選択された市販され入手出来 る細胞分離試薬で得られた回収物との比較に就いては第５表を見よ）。

実施例３ 多量の抗凝固性にされている全血から単核細胞の無菌的分離 ＥＤＴＡで抗凝固体にされている全血４〜１５ＩＩＩｌを、希釈後の浮遊密度的 １．０８９〜約１．０９９９　／　ｃｍ”をもち、フィルターで滅菌され、希釈 されている試薬変性コロイドシリカ６．７１＋Ｉｌを含む管中に無菌的に加える 。

その血液とコロイドシリカとを数回管を反転させて静かに混合する。単核細胞は 定角度ローター中、室温で２０００ｘｇ、１０分間遠心分離して分離する。メニ スカスのすぐ下に形成される単核細胞バンドを滅菌した細胞除去管で取シ去る。

回収された細胞は無菌）ｈｎｋｓ溶液１Ｑｒｎｌを加え、管を反転させて洗浄す る。その管を室温、３００　ｘｇで１０分間遠心分離する。リンパ球の最高回収 のためには、０看％ＢＳＡを洗浄緩衝液中に含ませる。リンパ球の平均回収率は ８４．８％であシ、平均生育率は９８．０％であり、リンパ球個体群の平均純度 は７６．４％であった。（選択された布板されていて入手可能な細胞分離試薬で 得られた回収との比較には第５表を見よ。また、この実施例で用いた生成物で回 収した血液細胞構成要素の型の分析百分率については第６表も見よ）。

第　６　表 赤血球　９．２１ リンパ球　７６．４゜ 単核細胞　１８．８”畳 好塩基性球　３．２゜ 好中球　０．３゜ 好酸級　０蒼薔 未熟細胞　１．１゜ 畳白血球と赤血球とに、即ち全細胞に対する百分率として表す 平均リンパ球回収率　８４．８ 平均生育率　９８．０ ４４赤血球を除き、白血琢のみに対しての百分率で表す実施例４ 少量の抗凝固化されている全血からの、単核細胞の分離 ＥＤＴＡで抗凝固化されている全血１〜３　ｍｌ　ｆ　、希釈された後の密度的 １．０８９〜約１．０９９　ｇ／α３を持つ希釈された試薬変性されているコロ イドシリカ６．７ｙｒｔｌｚ含む管に加える。Ｈａｎｋｓ溶液、ｐｉ−１７，４ ，１１＋Ｉｔを加える。その血液とコロイドシリカとを、管を数回反転させて靜 かに混合する。単核細胞を定角度ローター中、室温、２０００ｘｇで１０分間遠 心分離して分離する。

メニスカスのすぐ下に形成される単核細胞バンドを細胞分離管で取り去る。回収 された細胞はＨａｎｋｓ溶液１ｆ３ｍｌを加え、管を反転させて洗浄する。それ から管を室温、３００　ｘｇで１０分間遠心する。最高のリンパ球回収には、０ ．１％ＢＳＡを洗浄緩衝液中に含ませる。

実施例５ 多量の抗凝固化された全血からのリンパ球の無菌的分離 ＥＤＴＡで抗凝固化されている全血４〜ｉ５ｍ／を、希釈後の密度的１．０７９ 〜約１．０８９　ｇ／ｃｍ３をもつ、フィルターで滅菌された、希釈されている 試薬変性のコロイドシリカ６．７ｒｎｌを含む管に無菌的に加える。その血液と 希釈された試薬変性されているコロイドシリカとを数回管を反転させて靜に混合 する。単核細胞を定角度ローター中、室温、２０００ｘｇで１５分間遠心して分 離する。メニスカスのすぐ下に形成される単核細胞と小板とのバンドを無菌ピペ ットと無菌細胞除去管とで取り去る。前のバンドの下に形成されているリンパ球 バンドを細胞除去管で取シ去る。回収された細胞バンドは無菌Ｈａｎｋｓ溶液１ ０ｍ１を加え、管を反転させることにより洗浄する。それから管を室温、３０　 Ｄ　ｘｇで１０分間遠心する。リンパ球の最高回収には、０．１％ＢＳＡを洗浄 緩衝液に含ｌせる。

実施例６ 少量の抗凝固化された全血からのリンパ球の分離ＥＤＴＡで抗凝固化された全血 １〜５　ｍｌ　ｆ　、希釈された後の浮遊密度が約１．０７９〜約１−０８９　 ｇ／ｃｍ２である希釈された試薬変性コロイドシリカ（５，７ｍＡの入った管に 加える。その血液と希釈された試薬変性されているコロイドシリカとを、数回管 を反転させて靜に混合する。単核細胞を、定角度ローター中、室温、２０００ｘ ｇで１５分間遠心することにより分離する。メニスカスのすぐ下に形成される単 核細胞と小板とを含む細胞バンドをピペットと細胞除去管を用いて取シ去る。

先のバンドの下に形成されるリンパ涼バンドは細胞除去管で取り去る。回収され た細胞のバンドは何れも、Ｈａｎｋｓ溶液ＩＱｍ７！を加え、管を反転させて洗 浄する。

それからその管を室温、３００　ｘｇで１０分間遠心する。リンパ球の最高回収 のためには、０．１％ＢＳＡを洗浄緩衝液中に含１せる。

実施例７ 臨床研究用キッドを用いる、全血からのＢおよび１９７８球細胞の分離 約７ＯＡのコロイドシリカから作った試薬変性されたコロイドシリカ１．７ｍＱ 約１６０〜２００Ａのコロイドシリカから作った試薬変性されたコロイドシリカ ４．０ｍｌト約６０　ＯＡのコロイドシリカから作った試薬変性されたコロイド シリカ１．Ｑｒｎｌとを包含する希釈された試薬変性コロイドシリ力計６．７１ ！Ｌｉｆｔ全血１〜５．０財と混合し、定角度ローター中、２０００　ｘｇで１ ５分間遠心分離する。Ｂ　１７７２球は勾配中の鋭い変り目でバンド？形成する 。Ｂりンパ球はＴ細胞バンドの上に分離してバンドを形成する。Ｂｉｔ胞バンド をピペットと細胞除去管とで取シ去る。それからＴ細胞バンドを細胞除去管を用 いて取り去る。集められた細胞バンドは何れもＨａｎｋｓ溶液、ＰＨ７，４，１ ０ＩＩＩｔで洗浄し、室温、３００　ｘｇで１０分間遠心分離して回収する。

実施例８ 骨髄腫細胞を用いる融合に先立つ、８９７８球の分離Ｈａｎｋｓ　溶液、ＰＨ７ ，４、中細胞Ｉ　Ｘ　１０７〜５　Ｘ　１０７個／　ｒｎｌをもつ、マウス胛細 胞懸濁液１〜６　ｍｌを、希釈された試薬変性コロイドシリカ６．７１１ＩＪと 混合し、定角度ローター中、２０００ｘｇで１０〜１５分間遠心分離する。Ｂ　 １７７２球は胛の中の大部分の他の細胞より密でなく、メニスカスより数ｎ下に バンドを形成する。

その細胞バンドを細胞除去管を用いて集める。その細胞を、Ｈａｎｋｓ溶液、出 ７．４．１０１１１／！加え、室温、３００ｘｇで１０分間遠心して洗浄する。

分離した細胞は骨髄腫細胞を用いる融合に直接用いることができる。

実施例９ 単クーロン抗体で変性されたシリカ粒子を用いる細胞の分離 部分的に試薬変性されたコロイドシリカ粒子（約６００Ａのコロイドシリカから 作った）１００ｍｌ’Ｆｔ：水性条件の下で３−メルカゾトゾロビルトリメトキ シシラン０．５〜１．Ｑｍｌと反応させ、試薬変性されたコロイドシリカ表面に チオール基を含有するチオール変性コロイドシリカを形成させる。そのチオール 変性コロイドシリカを、水性条件の下、チルールと反応して５ＰＤＰ変性コロイ ドシリカを形成するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチオ）プロピオ ネート（ＳＰＤＰ）０．２６〜１．５０　ｇと反応させる。それから、プロティ ンＡ２０〜２０００　ｇ　ｋ　５ＰＤＰ変性コロイドシリカに加える。５ＰＤＰ はプロティンＡとアミド結合を形成し、それを粒子にカップリングさせ、プロテ ィンＡ変性されたコロイドシリカを形成する。それから、単クーロン抗体（Ｍａ ｂ）５〜２００μｇをプロティンＡ変性コロイドシリカ０．１〜１．Ｑｍｌと混 合する。プロティンＡはＭａｂと結合し、抗体変性されたコロイド７リカを形成 する。抗体変性コロイドシリカを全血１〜５．Ｑｍｌと混合し、１５分間培養し 、抗体を細胞の抗原と結合させる。それから、その混合物を、希釈された試薬変 性コロイドシリカについての密度勾配遠心分離によって分離する。抗体変性コロ イドシリカが結合した細胞は密度が変シ、容易に分離される。抗体変性コロイド シリカは結合した細胞と共に細胞除去管を用いて集められる。細胞はジチオトレ イトールまたは他のスルフヒトリール基減少剤例えばグルタチオンまたはβ−メ ルカプトエタノールによる処理によシ抗体変性コロイドシリカから取り除かれる 。それから細胞をＨａｎｋｓ　＠液、市７．４．１０ゴで洗浄し、３００ｘｇで １０分間遠心分離することにより集める。

実施例１０ 単クーロン抗体で変性されたシリカ粒子を用いた細胞の分離 完全に試薬変性されているコロイドシリカはエポキシ有機シランまたは第３表に 硲げたどの有機シランを用いても調製される。完全に試薬変性されたコロイドシ リカ（約６０ＯＡのコロイドシリカ粒子から作っ渇１００１ｎ／ｌ″１，１−カ ルボニル−ジイミダゾール０．５〜５．０９またはスクシンイミド０．３〜３． ０ｇと水性条件の下で反応させ、カルボジイミド変性のコロイドシリカを形成さ せる。それからそのカルゼジイミド変性コロイドシリカを直接水中でプロティン Ａ１３〜１３００■と反応させ、プロティンＡ変性コロイドシリカを形成させる 。それから、消衰した単クーロン抗体（Ｍａｂ　）５〜２００μｇｔ−プロティ ンＡ変性コロイドシリカ０．１〜１．Ｑｍｌと混合する。プロティンＡはＭａｂ と結合し、抗体で変性されたコロイドシリカを形成する。その抗体変性されたコ ロイドシリカを全血１〜６．０ＩＩＩｔと混合し、１５分間培養して抗体変性コ ロイドシリカを細胞上の抗原と結合させるようにする。それから、その混合物を 、布釈された試薬変性されたコロイドシリカを通しての密度勾配遠心分離によっ て分離する。抗体変性コロイドシリカが結合した細胞は密度が変り、それ故容易 に分離される。結合した細胞と共に、抗体変性したコロイドシリカ？細胞除去管 を用いて集める。

細胞はエタノールアミンで処理することにより抗体変性されたコロイドシリカか ら除去される。それから、細胞ｆ　Ｈａｎｋｓ溶液、出７．４、ｊＱｍｌで洗浄 し、６００ｘｇで１０分間遠心分離して集める。

実施例１１ 精液標本からのＸおよびＸ精子の分離 精子Ｉ　Ｘ　１０’〜２　Ｘ　１０７個／　ａｔを含有する精液試料１〜６ｒｎ ｌを、希釈後の密度がＸ精子とｙｍ子との密度の中間の１．１８５９／　ｃｙｎ ３である希釈された試薬変性コロイドシリカ６．７１１１１と混合する。その勾 配をつける材料は約７ＯＡのコロイドシリカから作った試薬変性コロイドシリカ １．７コと約２０ＯＡのコロイドシリカから作った試薬変性コロイドシリカ５． ３ｍＪからなる。

その混合物を定角度ローター中、２０００　ｘｇで１０〜１５分間遠心分離する 。Ｘ精子の密度は、精子当シのＤＮＡ含有量が低いため、Ｘ精子の密度より小さ い。

Ｘ精子をピペットと細胞除去管を用いて取り去る。Ｘ精子を細胞除去管を用いて 取り去る。その分離は、アクリジンオレンジを用いる分離精子の螢光染色法によ シ管理し、螢光活性化細胞分別（ＦＡＣ８）レーデ−システムの使用によシ定鉦 する。ＤＮＡ含有量の大きいＸ精子はＸ精子に比較してより大きい螢光像を作る 。

Ｂｉｏｌ、　Ｐ、ｅｐｒｏｄ、　２８　：　３１２−５２１　（１９８５）。

実施例１２ 粒子寸法の組合せを用いる勾配の形の作成希釈後側れも密度１．０８９　ｇ／α ３を持つ希釈された試薬変性のコロイドシリカの独特の個体群の混合物針６．０ コを全血３．ＱｍＡ！と混合し、定角度ローター中、室温、２０００ｘｇで１０ 分間遠心分離する。試薬変性されたコロイドシリカの独特の個体群を第７表に示 す如く混合する。

第　７　表 試料変性されたコロイドシリカ コロイドシリカ Ａ２．Ｏｍｔｌ、Ｏａｔ　３−Ｏｍｌ Ｂ　２．Ｏｍｌ　２．Ｏｄ　２．０１１ＬｔＣ１，Ｏｍｌ　４．０　ｍｌ　１． ０　ｍｌＤ　２．０　ｍｌ　３．０　ｍｌ　１．３　ｍｌＥ　１．Ｏｍｌ　３． ０　ＩＩＩｔ　２．□　ｍｔＦ　１−ＯＩｌｌ　２−Ｏｒｔｔｌ　３．ＯａｔＧ 　Ｑ　６．Ｑｒｎｌ　Ｑ Ｈ０５，ＯｍＪ　１．０ｍ１ ｒ　０　４．０ｒｎｌ　２．０ｍｌ 血液試料中の細胞がバンドを形成する密度の測定には密夏試標ビーズ（ｐｈａｒ ｍａｃｉａ　）を用いた。第７表に掲げた組合せについての結果を第１図に示す 。

７巨僑良 補正書の写（翻訳文）提出基 昭和６２年１２月　９日

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）コロイドケイ酸粒子複数個と、（ｂ）該コロイドケイ酸粒子に共有結 合して非イオン性親水性表面をもつ変性コロイドケイ酸粒子を形成している変性 試薬有効量と、 を含んで成る細胞分離用組成物。 ２．変性試薬として、水溶性官能基をもつオルガノシランを含んで成る、前項１ に記載の組成物。 ３．オルガノシランとして、式 （Ｘ）３−Ｓｉ−（ＣＨ２）３−Ｙ で表わされるものを含んで成る、前項２に記載の組成物。 ４．式中のＹがＯＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｏ、Ｏ２ＣＣＨ３、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ） ２、ＣＯ２ＣＨ３、ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯ２ＣＨ３、ＮＨＣＯ ＣＨ２ＮＨＣ（ＣＨ３）Ｏ、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２ＯおよびＮ（ＣＨ＝ＣＨ２） ２から成る群から選んだものである、前項３に記載の組成物。 ５．式中のＸがＨ３ＣＯ、Ｃｌ、Ｈ５Ｃ２Ｏ、Ｈ３ＣＣＯ２、Ｈ３Ｃおよび（Ｈ ３Ｃ）２から成る群から選んだものである、前項３に記載の組成物。 ６．オルガノシランとして、式 （Ｘ）３−Ｓｉ−（ＣＨ２）２−Ｙ で表わされるものを含んで成る、前項２に記載の組成物。 ７．式中のＹがＯＣＨ２ＣＨＣＨ２Ｏ、Ｏ２ＣＣＨ３、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ） ２、ＣＯ２ＣＨ３、ＮＨ（ＣＨ２）２ＮＨ（ＣＨ２）２ＣＯ２ＣＨ３、ＮＨＣＯ ＣＨ２ＮＨＣ（ＣＨ３）Ｏ、Ｎ（ＣＨ２ＣＨ２）２ＯおよびＮ（ＣＨ＝ＣＨ２） ２から成る群から選んだものである、前項６に記載の組成物。 ８．式中のＸがＨ３ＣＯ、Ｃｌ、Ｈ５Ｃ２Ｏ、Ｈ３ＣＣＯ２、Ｈ３Ｃおよび（Ｈ ３Ｃ）２から成る群から選んだものである、前項６に記載の組成物。 ９．オルガノシランとしてγ−グリシドキシプロピルートリメトキシシランを含 んで成る、前項２に記載の組成物。 １０．コロイドケイ酸粒子として寸法がほぼ同じものを含み、そして試薬変性し たコロイドケイ酸粒子が個別の集団を形成している、前項１に記載の組成物。 １１コロイドケイ酸粒子の寸法が直径約３０Å〜約６００Åのものである、前項 １０に記載の組成物。 １２．試薬変性したコロイドケイ酸粒子の個別の集団１個１たはそれ以上が緩衝 液中に懸濁し混合して所望の最終濃度の細胞分離用組成物を形成している、前項 １０に記載の組成物。 １３．（ａ）コロイドケイ酸粒子複数個に変性試薬を共有結合させて非イオン性 親水性表面をもつ試薬変性コロイドケイ酸粒子を形成し緩衝剤中に態濁させて成 る細胞分離用組成物の上に細胞混合物をのせ、そして （ｂ）該細胞分離用組成物を通して細胞サンプルを遠心分離して特徴的な浮遊密 度をもつ成分細胞帯少くとも１個を形成する、 工程を含んで成る、細胞混合物から成分細胞種を分離する方法。 １４．変性試薬として、水溶性官能基をもつオルガノシランを含むものを使う、 前項１３に記載の方法。 １５．（ａ）コロイドケィ酸粒子複数個に変性試薬を共有結合させて非イオン性 親水性表面をもつ試薬変性コロイドケイ酸粒子を形成し緩衝剤中に懸濁させて成 る細胞分離用組成物を含む試験管に細胞混合物を加え、 （ｂ）該細胞混合物と該細胞分離用組成物とを転倒により混合し、そして （ｃ）該細胞混合物と該細胞分離用組成物とを遠心分離して、細胞混合物の成分 細胞が特徴的な浮遊密度をもつ細胞帯少くとも１個を形成している密度勾配を生 成させる、 工程を含んで成る、細胞混合物から成分細胞種を分離する方法。 １６変性試薬として、オルガノシランを使う、前項１５に記載の方法。 １７．高い浮遊密度をもつ細胞帯と低い浮遊密度をもつ細胞帯とを含む少くとも ２個の細胞帯を生成させる、前項１５に記載の方法。 １８．ほぼ均一な寸法のコロイドケイ酸粒子複数個に変性試薬を共有結合させて 非イオン性親水性表面をもたせた試薬変性コロイドケイ酸粒子から成る個別の集 団少くとも２個を混合して使う、前項１５に記載の方法。 １９（ａ）水溶性官能基をもつオルガノシランに共有結合させたコロイドケイ酸 粒子を、この粒子の表面上にチオール基を形成することのできるメルカプトシラ ンと混合して、チオール変性コロイドケイ酸を形成し、 （ｂ）このチオール変性コロイドケイ酸を、そのチオール基と反応するコハク酸 イミドと反応させて、コハク酸イミド変性コロイドケイ酸を形成し、（ｃ）この コハク酸イミド変性コロイドケイ酸をプロテインＡと反応させてプロテインＡ変 性コロイドケイ酸を形成し、そして （ｄ）このプロテインＡ変性コロイドケイ酸を精製抗体と反応させて抗体変性コ ロイドケイ酸を形成する、 工程を含んで成る方法により製造した、細胞分離用組成物。 ２０．（ａ）水溶性官能基をもつオルガノシランに共有結合させたコロイドケイ 酸粒子複数個を、このコロイドケイ酸粒子と反応するカツプリング試薬と混合し て、活性化された粒子を形成し、 （ｂ）この活性化された粒子をプロテインＡと反応させてプロテインＡ変性コロ イドケイ酸を形成し、そして （ｃ）このプロテインＡ変性コロイドケイ酸を抗体と反応させて抗体変性コロイ ドケイ酸を形成する、工程を含んで成る方法により製造した、細胞分離用組成物 。 ２１．カップリング試薬として、１，１−カルボニルジイミダゾールおよびスク シンイミドから成る群から選んだものを使つた、前項２０に記載の組成物。 ２２．（ａ）抗体変性コロイドケイ酸と細胞混合物とを混合して粒子・細胞混合 物を形成し、 （ｂ）この粒子・細胞混合物を、成分細胞種が抗体変性粒子と結合するのに充分 な時間インキュベートして、粒子・細胞混合物および粒子に結合した細胞を形成 し、 （ｃ）このインキユベートした粒子・細胞混合物および粒子結合細胞を、コロイ ドケイ酸粒子複数個をオルガノシランに共有結合させて形成した非イオン性親水 性表面をもつ試薬変性コロイドケイ酸粒子から成る細胞分離用組成物と、混合し 、そして（ｄ）該粒子結合細胞およびインキュベートした粒子・細胞混合物を、 該細胞分離用組成物を通して、遠心分離して、特徴的な浮遊密度をもつ少くとも １個の成分細胞帯および少くとも１個の粒子結合細胞帯を形成する、 工程を含んで成る、細胞混合物から特定の細胞種を分離する方法。