JP2628509B2 - 細胞分離用試薬 - Google Patents

細胞分離用試薬

Info

Publication number
JP2628509B2
JP2628509B2 JP62502184A JP50218487A JP2628509B2 JP 2628509 B2 JP2628509 B2 JP 2628509B2 JP 62502184 A JP62502184 A JP 62502184A JP 50218487 A JP50218487 A JP 50218487A JP 2628509 B2 JP2628509 B2 JP 2628509B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cell
colloidal silica
reagent
cells
density
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP62502184A
Other languages
English (en)
Other versions
JPH01500216A (ja
Inventor
ドーン，アラン、アー
Original Assignee
アクティベイテッド セル セラピー，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by アクティベイテッド セル セラピー，インコーポレイテッド filed Critical アクティベイテッド セル セラピー，インコーポレイテッド
Publication of JPH01500216A publication Critical patent/JPH01500216A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2628509B2 publication Critical patent/JP2628509B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3202—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the carrier, support or substrate used for impregnation or coating
    • B01J20/3204—Inorganic carriers, supports or substrates
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3214—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the method for obtaining this coating or impregnating
    • B01J20/3217—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond
    • B01J20/3219—Resulting in a chemical bond between the coating or impregnating layer and the carrier, support or substrate, e.g. a covalent bond involving a particular spacer or linking group, e.g. for attaching an active group
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3257—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur together with at least one silicon atom, these atoms not being part of the carrier as such
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3257—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur together with at least one silicon atom, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3259—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur together with at least one silicon atom, these atoms not being part of the carrier as such comprising at least two different types of heteroatoms selected from nitrogen, oxygen or sulfur with at least one silicon atom
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B01J20/3246—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure
    • B01J20/3257—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur together with at least one silicon atom, these atoms not being part of the carrier as such
    • B01J20/3263—Non-macromolecular compounds having a well defined chemical structure the functional group or the linking, spacer or anchoring group as a whole comprising at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur together with at least one silicon atom, these atoms not being part of the carrier as such comprising a cyclic structure containing at least one of the heteroatoms nitrogen, oxygen or sulfur, e.g. an heterocyclic or heteroaromatic structure
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3268—Macromolecular compounds
    • B01J20/3272—Polymers obtained by reactions otherwise than involving only carbon to carbon unsaturated bonds
    • B01J20/3274—Proteins, nucleic acids, polysaccharides, antibodies or antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2982—Particulate matter [e.g., sphere, flake, etc.]
    • Y10T428/2991—Coated
    • Y10T428/2993—Silicic or refractory material containing [e.g., tungsten oxide, glass, cement, etc.]
    • Y10T428/2995—Silane, siloxane or silicone coating

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は生物学的な細胞および副細胞状（subcellu
lar）成分の分離および精製のための新しい組成物に関
するものである。特に、この発明は特定の細胞種や特定
の副細胞状成分をそれらの浮遊密度に基づいて分離する
ための新しい組成物に関するものである。またもう一つ
別の点から言えば、この発明は回収した細胞や副細胞状
成分の純度を高めることのできる特定の細胞種や特定の
副細胞状成分の分離のための新しい方法および手段に関
するものである。
発明の背景 生物の体液や組織の成分分離は、臨床診断処置や科学
調査、そして時には患者の治療にしばしば必要である。
たとえば、臨床診断分野においては組織を分類する処置
や免疫の機能検査または他の様々な処置のために精製さ
れたリンパ球の急速な分離を可能にする組成物や方法が
必要とされている。基礎的研究においてもまた精製され
たリンパ球ならびに血液からの他の細胞種を必要とす
る。さらに、エピゾームやDNA、染色体、ミトコンドリ
アや他の副細胞状成分などのような培養された細胞また
は副細胞状成分の研究においてもまた高度に精製された
製剤を必要とする。
分離精製には様々な方法で行い得る。しかし、分離し
た細胞はしばしば生育しうる細胞を必要とする処置にお
いて用いられるので、そのように分離された細胞の機能
が損なわれないでいることが大切である。細胞の生育力
や細胞や副細胞状成分の損なわれていない生物機能を確
保するためには、分離処置の間に障害を起こし得る物質
を導入することを避けることが大切である。たとえば、
組織適合性検査に用いられる分離したリンパ球は様々な
ミトゲンによつて刺激される。用いられた媒体は、それ
自体ではミトゲンであつてはならない。なぜならば、こ
れはDNA合成の測定の有効性に影響を及ぼすからであ
る。
密度勾配遠心分離は生物細胞や副細胞状成分の分離に
用いられる一つの技術である。勾配の形成に使われる物
質が鋭敏な生物学的物質との相容性を与えるある種の特
徴をもつことが大いに望まれる。その技術に用いられて
きた勾配物質はサツカロース、デキストラン、ウシ血清
アルブミン（BSA）、Ficoll（Pharmaciaの登録商標）、
Metrizamideのようなヨウ素化された低分子量化合物、
塩化セシウムのような重塩を含んでいる。しかし、これ
らの物質のほとんどは必要な分離された部分の生化学的
機能をもしかすると損なうかもしれない望ましくない特
徴をもつている。たとえば、いくつかの一般に有効な血
液分離手段は分離されたリンパ球製剤のミトゲン反応性
を減少させるかもしれない赤血球凝集ポリマーを含む
（J.Immunol.Meth.38:43−51,1980）。これらの物質は
また望ましくない高い浸透圧重量モル濃度（osmolalit
y）や粘度の溶液を作るであろう。細胞凝集がしばしば
生理学的pH（7.4）でBSAによつてひき起こされ、またBS
A細胞膨潤（細胞密度を変えてしまう）のような他の問
題や細胞機能の起こりうる損失をもたらすので低めたpH
（5.1）で用いるのは望ましくない。またBSAは大規模な
分離において用いるには費用がかかる。Ficollも同様に
分散薬剤の使用、または、望ましくないが、pH値を下げ
ることによつてのみ直すことができる細胞凝集をひき起
こすかもしれない。Ficollはまた大変粘性が高く、それ
が線状の等張勾配を作り出すのを難しくしている。ま
た、たとえ不連続な勾配を用いてでも、これらのいかな
る物質によつても、大変似かよつた浮遊密度をもつ細胞
を分離することは難しい。
細胞分離におけるいくつから成功をもつて用いられて
きた密度勾配物質はコロイドケイ酸（colloidal silic
a）である。コロイドケイ酸は水中で溶解したSiO2から
ケイ酸セノマーの重合によつて作られるコロイド粒子の
水性懸濁液である。単一の粒子の大きさは平均すると13
0から140Åであり、一般に約30から220Åの間にある。
コロイド懸濁液はコロイド粒子が正味の負電荷をもつpH
8〜10において最も貯蔵安定性である。しかし、それは
完全に満足できるものではない。コロイドゲイ酸溶液は
冷凍すると非可逆的に沈殿し、またpH5〜７で0.1M NaCl
以上のようなあるイオン状態の下でのタンパク質の存在
においてゲルを作る。変性していないケイ酸ゲル（sili
cagel）はまた大食球や赤血球を含むいくつかの細胞種
に対して毒性を示す。この毒性を減少させるために、ま
た生理学的pHでの塩溶液やタンパク質中でのコロイドの
安定性を増加させるために、ポリマーでコロイドケイ酸
を覆う幾多の試みがなされてきた。デキストラン（Exp.
Cell Res.,50:355−368（1968））、ポリビニルアルコ
ール（PVA）（J.Coll.and Interface Sci.,51:388−393
（1974））、ポリエチレングリコール（PEG）（Exp.Cel
l Res.,57:338−350（1969）、Arch.Biochem．Biophy
s.,168:289−301（1975））、デキストラン硫酸塩、メ
チルセルロース、カルボキシメチルセルロース（Exp.Ce
ll Res.,50:355−368,（1968））、ポリビニルピロリド
ン（PVP）（Exp.Cell Res.,46:621−623（1966）；Exp.
Cell Res.,50:355−368（1968）；J.Cell Biol.,55−57
9−585（1972）；Exp.Cell Res.,110:449−457（1977）
そしてPEG、BSAおよびFicollの混合物のようなポリマー
が、Ludox（デユポンの登録商標）のようなケイ酸ゾル
の被覆物として用いられてきた。
ただ単にケイ酸粒子をポリマーで覆うことにもまた問
題がみられる。被覆処置には溶液中の過剰な自由ポリマ
ーの使用が必要とされる。過剰ポリマーは溶液の浸透圧
重量モル濃度や粘性を増加させる。精製された生物学的
物質からポリマーを取り除くこともまた難しい。さら
に、ポリマーで被覆されたコロイドケイ酸で精製された
細胞および器官の形態学上の特徴は一般に容認できるけ
れども、生化学的特徴はしばしば損なわれている。たと
えば、コロイドケイ酸とPVPの混合物で分離されたリン
パ球は標準媒体の中の細胞と比較すると放射性チミジン
の含有が減少している（Exp.Cell Res.,50:353（196
8）。
コロイドケイ酸の毒性を減少させるためのもう一つの
試みはケイ酸粒子の表面を化学的に変性させることであ
つた。化学的に変性されたコロイドケイ酸の一つの例は
アルミニウムをコロイドケイ酸に化学的に含有させたLu
dox AM（デユポンの登録商標）である。J.Colloid and
Interface Science,55:25（1975）。この製剤は報告に
よれば、広いpH範囲において安定しているが、しかし、
まず最初に大規模に透析するかそして（または）木炭で
処理して、リンパ細胞に対して無毒にしリンパ球の細分
分離に使えるようにしなければ、細胞分離用には使えな
い。J.Immunological Methods,28:277（1979）。Ludox
AMは報告によれば浸透圧重量モル濃度（osmolality）に
対する影響が小さく、従つてこの混合物を使用して等張
勾配を構成することができる。しかし、Ludox AMにはい
くつかの欠点がある。勾配物質は様々な微生物の成長を
支持するので無菌状態で貯蔵されなければならない。様
々なリンパ組織の中に見られる汚染微生物の成長を抑制
するために勾配物質には勾生物質や抗菌剤を加えなけれ
ばならない。さらに、リンパ細胞の細区分を十分に分離
させるためには不連続勾配を用いる必要がある。J.Immu
nological Methods,28:277−292（1979）。不連続密度
分離に固有の制限（Ann.Rev.Biophys.Bioeng.1:93−13
0,1972;Int.Rev.Exp.Path14:91−204,1975;“Automated
Press,pp.21−96,1970）はリンパ球の回収を低め、従
つてリンパ球比率に異なる結果を与えることがある（Sc
and.J.Immunol.3:61,1974;Clin.Immunol.Immunopath.3:
584−597,1975）。さらに不連続勾配は密度の異なる個
別の溶液から作られる。正確な密度の様々な溶液を作る
には相当な時間がかかる。遠心分離で密度勾配を作り出
すにも、20,000〜30,000rpmの速度を必要とする。
別の市販されている化学変性コロイドケイ酸はPercol
l（Pharmaciaの登録商標）である。これはPVPの層をケ
イ酸粒子に水素結合させたものである。Anal.Biochem.,
88:271−282（1978）。Percollは血液細胞成分および各
種源からの副細胞状器官を分離するために広く使われて
いる。製造者から供給された状態では、Percollは密度
1.130±0.005g/cm3、pH9.0±0.5および浸透圧重量モル
濃度＜25m OsM/kgをもつ。このPercollに生理学的塩を
加えて等張とし、酸または塩基を加えてpH7.0〜7.4に調
節する。密度もまた注意深く調節する必要がある。細胞
が浮遊密度1.11〜1.12g/cm3より大であればPercollを濃
縮する必要がある。Percollを使う通常の技術では、成
層（layering）により、勾配形成剤の使用により、また
は遠心分離（一般に20,000〜30,000rpmを要する）によ
り、サンプル添加前に予め勾配を形成する。これに代え
て、遠心分離前に細胞製剤を希釈等張Percollと直接に
混合することもできる。
しかしながら、Percollを血液細胞分離用媒体として
使用するにはその簡便性、性能および実用性の上で制限
がある。Percollは紫外線領域においてPVPにより強い吸
収を示す。このことは分光測光法により核酸およびタン
パク質の密度勾配を分析するときに重大な欠点となる。
PVPはまたタンパク質定量のためのLowry法において高い
バツクグラウンドを与える。Cell Separation:Method a
nd Selected Applications,Vol I.115,134（1982）。Pe
rcollは生理学的pHおよびイオン濃度において多少は安
定であるが（塩、酸および塩基の添加により）等張にし
た後でオートクレイブにかけると安定でなく、また希釈
溶液中で凝集する傾向がある。後者の問題はケイ酸表面
からのPVPの解離によるので低濃度の遊離PVPの添加によ
り防止できる。上記のように、遊離PVPは少くともいく
つかの細胞機能に対してマイナスの効果がある。また、
Percollによつて浮遊密度の僅かの差に基づいてのみ細
胞を分離するのは困難である。
本発明者は研究の結果、新しい化学変性技術を使うこ
とによつて、生物学的材料の分離に有用な新しいコロイ
ドケイ酸組成物を製造できることを見出した。この組成
物はオルガノシランを水性条件下で非多孔質コロイドケ
イ酸と高めた温度およびアルカリ性pHで反応させてケイ
酸粒子とオルガノシランとの間に共有結合を形成するこ
とにより、製造する。この組成物は特定の細胞種または
特定の副細胞状（subcellular）成分をそれらの浮遊密
度に基づいて単離するために使うことができる。この組
成物は回収される細胞および副細胞状成分の純度を高め
そしてサンプル処理時間を短縮する。異なる寸法の試薬
変性ケイ酸粒子を組合わせた組成物を製造することもで
きる。この組合わせ組成物によれば、微小な浮遊密度の
相違によつても細胞および細胞状成分を分離できるとい
う利点がさらに得られる。この種の分離はこれまで不可
能であつたか、または実用化されていなかつた。精製し
た抗体をカツプリングした試薬変性ケイ酸粒子から成る
組成物を作ることもできる。この抗体変性組成物は細胞
および細胞成分を、それらの抗原決定基ならびにそれら
の補体または抗体産生の可能な任意の他の細胞成分たと
えばペプチドホルモンリセプタに基づいて、分離するこ
とを可能とする利点をもつ。
本組成物はいくつかの望ましい特性をもつている。試
薬変性はコロイドケイ酸の毒性を低めそして生理学的塩
およびタンパク質の存在下でのコロイドケイ酸粒子の凝
集を防ぐ。本組成物は生物学的材料に対して相容性をも
ち、細胞状および副細胞状生物学的粒子のいずれについ
ても密度分離に好適に使うことができる。予め形成した
密度勾配、その場で形成した密度勾配および比較的低速
の遠心分離を使う急速細胞分離のいずれも使用可能であ
る。本組成物は生理学的なイオン濃度およびpHをもち、
等張であり、低粘度であり、そして密度範囲1.0〜1.4g/
cm3をもつ。広い範囲の温度およびpH値において安定で
ある。安定である証拠に、本組成物は生理学的条件下で
のオートクレイブ操作に対して完全に安定である。また
本組成物は水溶液中に溶解または分散可能であり、生物
学的標本から容易に除去することが可能であり、そして
低価格である。
本組成物の使用方法にもまたいくつかの利点がある。
従来の血液分離手段は注意深い血液成層（layering）技
術を必要とする。本組成物によれば従来技術と比べて熟
練を要さずに血液分離をすることができる。たとえば、
その場での操作については成層を必要としない。分離す
べき物質を試薬変性したコロイドケイ酸と混合し遠心分
離するだけでよい。全血から単核細胞を分離する場合
は、単核細胞と周辺血液中に存在する他の細胞状要素と
の間に存する、生来の密度差を利用する。遠心分離をす
ると試薬変性コロイドケイ酸粒子の沈降により単核細胞
の分離に適当な連続した密度勾配が形成される。急勾配
の形成はこの種の分離に使われる粒子（直径200Å以
上）の高い沈降速度によるものである。細胞分離は周辺
血液細胞が遠心分離の間に連続密度勾配中の相当する生
遊密度部位に移動することにより完成する。この分離技
術は高価でなく診断用遠心分離器以外には特別な装置を
ほとんど必要としない。
発明の要約 本発明に従えば、シリカ粒子に無毒、非イオン性、親
水性の表面を付与する試薬を用いて被覆された非多孔性
のコロイドシリカ粒子を作り、そして用いる方法が発見
された。得られる試薬で変性されたコロイドシリカは、
凡ての型の体液例えば血液と骨髄と髄液と胸膜液と精液
並に分散された組織検体と培養された細胞と他の源から
の生物学的細胞およびそれらの構成要素から、細胞と準
細胞構成要素とを分離するのに用いることができる。
本発明の１つの実施態様によれば、有機シランがコロ
イドシリカにカツプリングするように、水性媒質中、高
められた温度とアルカリ性pHとで、コロイドシリカと有
機シランとを混合する段階を含む、試薬変性されたコロ
イドシリカ製造のための新規の技術が提供される。得ら
れる試薬変性のコロイドシリカは、活性炭吸着により反
応副生成物を除去され、それから脱イオンされる。それ
から、その試薬変性されたコロイドシリカを、試薬と試
薬変性されたコロイドシリカとの間に更に共有結合での
付着を形成させるため、再加熱する。その滲透圧とpHと
を生物学的材料と適合させるため調節する。それから、
その試薬変性されたコロイドシリカを緩衝剤により、分
離すべき生物学的材料に適当な密度に希釈する。シリカ
の表面に共有結合で結合した有機シランはコロイドシリ
カの毒性を減少させ、生理学的pHと塩濃度とにおいて、
蛋白質存在の下でのコロイドシリカ粒子の凝析を防止す
る。
本発明の他の実施態様によれば、水性媒質において、
チオール基が試薬変性されたコロイドシリカ表面上に結
合するよう、チオール試薬と試薬変性されたコロイドシ
リカとの混合する段階を含む、チオール試薬を用いる抗
体のカツプリングした試薬変性コロイドシリカの製造の
新規な技術を提供する。チオール基は更にスクシンイミ
ドと反応させて、プロテインＡがカツプリングする結合
を提供する。それら抗体をプロテインＡとカツプリング
して、抗体で変性されたコロイドシリカを形成する。抗
体変性コロイドシリカの使用は、抗体が結合できる抗原
決定因子をもつ構成要素細胞の、細胞混合物、例えば血
液からの分離を可能にする。
本発明の他の実施態様によれば、水性媒質中で試薬変
性されたコロイドシリカとカルボジイミドとを反応さ
せ、続いてプロテインＡがアミド結合を通じてカツプリ
ングする結合手を形成させる段階を含む、カルボジイミ
ドを用いる抗体変性されたコロイドシリカ製造の新規の
技術を提供する。それから抗体をプロテインＡとカツプ
リングさせ、抗体変性されたコロイドシリカを形成させ
る。
本発明の他の実施態様によれば、希釈された細胞混合
物と、分離すべきその細胞混合物の構成要素細胞の浮遊
密度の範囲内にある最終密度をもつ希釈された試薬変性
コロイドシリカ組成物とを、組成物の上に細胞混合物を
層状に置くことにより接触させ、細胞分離を達成させる
ために細胞混合物と組成物とを懸垂筒型ローター中で遠
心分離し、そして、バンドを形成する特定の型の細胞の
特性浮遊密度まで移動した構成要素細胞を集める段階を
含む、生物学的細胞混合物例えば全血または他の生物学
的流体から構成要素細胞を分離する新規の技術を提供す
る。例えばリンパ球が血液試料中の他の型の細胞から分
離できる。典型的にはリンパ球は浮遊密度1.060〜1.074
g/cm3をもち、密度界面に細胞バンドを形成する。他の
型の細胞は勾配をつける材料中に進入してしまう。その
細胞バンドは取去ることができ、細胞は洗浄され、まる
められ、そして増殖または代謝の研究あるいは他の実験
に適した媒質中に再懸濁する。
本発明の他の実施態様に従えば、生物学的細胞混合物
例えば全血または他の生物学的流体から構成要素細胞を
分離する新規の技術を提供し、それは細胞混合物試料と
希釈された試薬変性コロイドシリカ組成物とを混合し、
定角度ローターまたは懸垂筒ローター中で遠心分離する
ことを含んでいる。遠心分離においては連続した密度勾
配が形成される。構成要素細胞はその勾配内の特性浮遊
密度に移動し、特定の型の細胞の特性密度のところに細
胞バンドを形成する。例えば単核細胞をこのその場での
分離技術を用いて、血液試料中の他の細胞から分離して
もよい。単核細胞はメニスカスのすぐ下に細胞バンドを
形成する。単核細胞バンドは他の細胞のバンドと同様に
互に集められ、洗浄され、まるめられ、増殖または代謝
の研究あるいは他の実験に適した媒質中に再懸濁でき
る。
本発明の他の実施態様によれば、浮遊密度がほんの少
ししか違はない生物学的細胞または準細胞構成要素を分
離する新規の技術を提供する。その技術は、異つた寸法
をもつ試薬変性コロイドシリカ粒子と細胞混合物例えば
血液試料、軟層または骨髄とを混合し、その細胞混合物
と試薬変性コロイドシリカ組成物とを混合し、その混合
物を遠心して密度勾配を生じさせ、後、特定の特性浮遊
密度に形成される細胞の個別のバンドを集めると云う段
階を含む。そうして集めた細胞は洗浄し、まるめられ、
そして増殖または代謝の研究または他の実験に適した媒
質中に再懸濁する。例えばＢおよびＴリンパ球を血液試
料中の他の細胞から分離してもよい。Ｂ細胞はＴ細胞よ
り低密度領域をもつている。ＴおよびＢ細胞は、Ｂ細胞
が勾配中の鋭い変化点でバンドを作り、Ｔ細胞がそれよ
り高い密度のところに分離してバンドを形成するよう勾
配の形を選択することにより分離することができる。勾
配中への、小さい試薬変性コロイドシリカ粒子（それら
は約80Å以下のコロイドシリカ粒子より作られたもの）
の混在はより低い密度領域を広げまたはせばめるに反
し、より大きい試薬変性コロイドシリカ粒子（約200Å
以上のコロイドシリカ粒子より作られたもの）の勾配の
より高い密度領域を圧縮する。従つて、適当な初期密度
を選択し、適当な粒子寸法から作つた試薬変性コロイド
シリカ粒子を用いて密度勾配の選択領域を拡げることに
より、Ｂ細胞とＴ細胞とを分離することが出来る。この
方法はまたＢおよびＴ細胞からNK細胞を分離するにも使
用できる。Ｂ細胞とＴ細胞とNK細胞との分離後、Ｂ細胞
とＴ細胞とNK細胞との螢光単クーロン体抗体による細胞
の染色を行うことができる。
本発明の他の実施態様に従えば、異る抗原決定因子を
もつ生物学的細胞または細胞構成要素の分離のための新
規の技術を提供する。抗体変性されたコロイドシリカ粒
子調製には大きい粒子寸法（約600Å）のコロイドシリ
カを用いる。抗体変性コロイドシリカ細胞混合物に混合
する。その混合物を、抗体変性コロイドシリカが構成要
素細胞上の抗原部位に結合するに充分な時間培養する。
それからその混合物を細胞分離組成物を通して遠心分離
する。付着した細胞を持つた抗体変性コロイドシリカは
勾配の底部から回収できる。付着した細胞はスルフヒド
リル減少剤の処理により、チオール試薬を用いて調製し
た抗体変性コロイドシリカから取除かれる。若し抗体変
性コロイドシリカがアミド結合を通してプロテインＡを
直接試薬変性コロイドシリカの表面上にカツプリングさ
せて調製したならば、付着した細胞はエタノールアミン
処理によつて取除いてもよい。抗体変性されたコロイド
シリカからの除去につづいて、細胞を洗浄し、増殖また
は代謝の研究あるいは他の実験に適した媒体中に再懸濁
する。
図面の簡単な説明 第1a,b,c,dは希釈されている試薬変性されたコロイド
シリカの独特な固体群を混合して得られた勾配の形状を
示す線図である。
第２図は付着している有機シラン試薬残基を“R"で表
はしてある試薬変性されているコロイドシリカの概略図
である。
好ましい実施態様の詳細な記述 生物学的細胞と細胞構成要素との分離に適当な、試薬
で変性したコロイドシリカ組成物が公開された。その組
成物の“独特の固体群”（以下で定義される）は単離さ
れた細胞と細胞構成要素とを得るに要する時間を減少さ
せると共に、得られる単離物の純度を増加させる。試薬
で変性したコロイドシリカ組成物の独特な固体群の混合
物の使用は非常に似た浮遊密度をもつ細胞の型の分離を
可能にする。更に、精製したモノクロナール抗体とカツ
プリングさせることにより変性された、試薬で変性され
たコロイドシリカの独特の固体群の使用は、抗原決定因
子の補体に基く、細胞の分離を可能にする。
そのカツプリング反応に用いる非多孔性コロイドシリ
カ粒子の寸法は約30Å〜約600Åで変動する。各個別の
組成物のための出発材料は大多数が殆んど同じ直径であ
るコロイドシリカ粒子を包含している。しかし、コロイ
ドシリカ粒子のこの“固体群”は、技術で公知の粒子の
寸法分類法によつて誘導することが出来るような分布曲
線で表わすことが出来る寸法範囲を持つている。この固
体群中の大部分の粒子は、その分布曲線の頂点の寸法を
持つが、全体の曲線がその固体群を表現している。その
固体群に特定される寸法は製造業者の規格に示されてい
る寸法である。製造業者から受取る固体群の実際の寸法
はロツト毎に変るかもしれない。その寸法変動を調和す
るために、各固体群は“約ｘÅ”として示めされる。こ
こに、ｘは製造業者のカタログと製造規格とに示されて
いる粒子寸法呼称である。本発明に従つて使用できるコ
ロイドシリカ粒子は、Nyacol Products,Inc.（Worchest
er,Mass.）により“Nyacol"の名称の下に販売されてい
る材料を含み、その材料は、水に溶解しているSiO2から
モノ珪酸の重合により形成されたコロイド状粒子の水性
懸濁液である。１度変性試薬と共有結合で結合すると、
その粒子は、おのおのが定められた範囲内の浮遊密度を
もつ、試薬で変性されたコロイドシリカ粒子集団とな
る。得られた、変性試薬とカツプリングした粒子固体群
の浮遊密度範囲と最も好ましい浮遊密度とを第１表に示
す。
カツプリング反応に用いられる粒子の直径と、変性試
薬とのカツプリングの後の浮遊密度とにより他の固体群
と区別出来る、試薬で変性されたコロイドシリカ粒子の
固体群を、２つの独特の固体群中のある粒子の特性は同
じかもしれないが、“独特の固体群”とする。特別な分
離性質をもつ細胞分離組成物混合物を作るため独特な固
体群の１つまたはそれ以上を混合してもよい。
前記のコロイドシリカ粒子と共有結合で結合する試薬
はどんな有機シラン試薬であつてもよい。有機シランは
コロイドシリカの表面上のシラノール（Si−Ｏ−Si）基
と安定な共有シロキサン結合を形成出来る唯一の化合物
である。有機シラン中の官能基は非イオン的であつて親
水性でなければならない。イオン性官能基は、イオンの
荷電がpHおよび塩の変化に対し敏感で、その結果ゲル化
する故に、希ましくない。疎水性官能基は中性のpHと生
理学的塩濃度におけるゲル化に対し、コロイドシリカを
実際に敏感にする。親水性官能基はH2Oをコロイド表面
に結合させる。結合H2OはpHとイオン強度と蛋白質との
変化に対して独立である保護殻として働き、その故にそ
のコロイドをゲル化から保護する。
有機シランはシリカ粒子に“無毒”、非イオン性、親
水性の表面を与える。無毒の意味はその組成物が分離す
べき生物学的材料の保全または機能に影響を与えないと
云うことである。使用することが出来る有機シランの例
を第２表に掲げる。好ましい有機シランはγ−グリシド
オキシプロピルトリメトキシシランである。
試薬で変性されたコロイドシリカは抗体、好ましくは
単クーロン抗体、最も好ましくは精製された単クーロン
抗体とカツプリングさせることにより更に変性できる。
第１に、プロテインＡを試薬で変性されたコロイドシリ
カの表面に、或はアミド結合も通じてカツプリングさせ
る。それから抗体がそのプロテインＡと結合して抗体で
変性されたコロイドシリカを形成する。如何なる寸法の
コロイドシリカを用いてもよい。しかし、好ましい寸法
は約600Åのコロイドシリカである。若しプロテインＡ
がアミド結合を通じ試薬で変性されているコロイドシリ
カに直接カツプリングしているならば、第３表に掲げら
れている有機シランを用いて調製された試薬で変性され
たコロイドシリカだけを用いてもよい。
第 ３ 表 アミド結合を通じカツプリングされている抗体で変性さ
れたコロイドシリカ調製に適当な有機シラン親有機シラン ここでＸは （ａ） (X)３Si(CH２)３NH(CH２)２NH(CH２)２NH２ （トリメトキシシリルプロピルジエチレン トリアミン H3CO Cl H5C2O H3CCO2 H3C (H３C)２ 本発明の組成物は一般的には次の如くして作ることが
できる。コロイドシリカを、コロイド状態を安定化する
有機シラン試薬と混合する。好ましくは、試薬添加に先
立ち、そして添加の間コロイドシリカを約75℃に加熱す
る。その水性コロイドシリカ溶液は、希望量の試薬がコ
ロイドシリカに混合された場合、シリカが試薬に対して
常に過剰であるように、どんな便宜的濃度であることが
できる。このことは試薬のコロイドシリカへの時宜を得
た添加によつて達成し得る。試薬の添加速度は好ましく
はコロイドシリカ１当り毎分試薬約0.5〜約2.0ml、最
も好ましくはコロイドシリカ１当り毎分試薬約0.7ml
である。
用いられる試薬量は、化学的に変性される特定のコロ
イドシリカ中に存在する表面シラノールの全個数によ
る。特定のコロイドシリカ中の表面シラノール基の全個
数は次の如くして計算できる。
全表面シラノール数＝体積（ml）×密度（g/ml）×シ
リカ固形物（％）（製造業者データ）×表面積（nm2/
g）（製造業者データ）×4.5シリノール数/nm2（The Ch
emistry of Silica:Solubility,Polymerization,Colloi
d and Surface Properties,and Biochemistry,633−636
頁、1979年からの値）。試薬１分子が表面シラノール分
子1,2または３個と反応し、それと共有結合を形成し得
る。コロイドシリカを化学的に変性するのに用いられる
試薬の概算体積は次のようにして計算出来る。
試薬体積＝〔（全表面シラノール数／アボガドロ数）
/Z〕×（試薬分子量）×（試薬密度）（この式で、Ｚは
好ましくは1,2または３、最も好ましくはＺ＝３であ
る）。コロイドシリカはＺ＝３の時“完全に変性”され
る。チオール試薬を用いて調製される、抗体で変性され
たコロイドシリカを作るに用いる“部分的に変性”され
たコロイドシリカを形成するためには、完全に変性され
たコロイドシリカ形成のために計算された試薬量の約50
〜75％を使用する。
試薬を完全に添加した後、その反応混合物を１〜３時
間撹拌しながら約70℃〜約80℃で加熱する。反応副生成
物は好ましくは、その反応混合物を活性炭を通過させ、
そして反応混合物を脱イオンして除去する。試薬で変性
されたコロイドシリカの脱イオンは好ましくはその反応
混合物を陽イオン交換樹脂（水素型）と陰イオン交換樹
脂（水酸基型）とを通過させて達成させる。活性炭カラ
ムおよび樹脂カラム何れの中に残存する試薬変性された
コロイドシリカも好ましくは、それぞれのカラムに水を
通過させて回収する。試薬とシリカ表面との間のそれ以
上の共有結合的付着は、試薬変性されたコロイドシリカ
をはげしく撹拌し乍ら更に加熱して促進できる。この段
階は好ましくは３〜６時間、約90℃〜約100℃で行う。
更に好ましくは約95℃で３時間行う。
それから、試薬変性されたコロイドシリカ調製物は、
生理学的浸透圧とpHとに調節される。浸透圧は好ましく
は固形の塩化ナトリウムとを用いて調節する。pHは好ま
しくは水素型とナトリウム型とのHEPES緩衝剤を用いて
調節する。得られた溶液の密度はそれから使用前に緩衝
剤（20mM、pH7.4）を用いて調節され、分離されるべき
材料の密度範囲にある最終密度をもつ希釈された試薬変
性コロイドシリカを形成する。
試薬変性されているコロイドシリカを希釈する緩衝剤
は、分離され、精製されるべき生物学的材料と“相容れ
る”ものならばどんな緩衝剤でも可能である。“相容れ
る”ためには、担体液体は生理学的イオン強度とpHとで
あり、分離される材料の構造または機能に影響を与えて
はならない。用いることが出来る緩衝剤の例には、４−
（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパン
スルホン酸（HEPES）、Ｎ−Ｎ−ビス−２−ヒドロキシ
エチル−２−アミノエタン スルホン酸（BES）、ビス
−２−ヒドロキシエチルイミノ−トリス−ヒドロキシメ
チルメタン−２−ビス−２−ヒドロキシエチルアミノ−
２−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール（BIS−
TRIS）、1,3−ビス−トリス−ヒドロキシメチルメチル
アミノプロパン（BIS−TRIS−PROPANE）、Ｎ−２−ヒド
ロキシエチルピペラジン−Ｎ−３−プロパンスルホン酸
（EPPS）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ−
２−ヒドロキシプロパン スルホン酸（HEPPOS）、３−
Ｎ−モルホリノプロパン スルホン酸（MOPS）、ピペラ
ジン−Ｎ−Ｎ−ビス−２−エタン スルホン酸（PIPE
S）、ピペラジン−Ｎ−Ｎ−ビス−２−ヒドロキシプロ
パン スルホン酸（POPSO）、３−Ｎ−トリス−ヒドロ
キシメチルメチルアミノ−２−ヒドロキシプロパン ス
ルホン酸（TAPSO）、Ｎ−トリス−ヒドロキシメチルメ
チル−２−アミノエタン スルホン酸（TES）を包含す
る。
試薬変性されているコロイドシリカまたは希釈されて
いる試薬変性されたコロイドシリカは技術で公知の滅菌
法で滅菌できる。その組成物は圧力釜処理には安定では
あるが、滅菌の好ましい方法は0.2ミクロンのフイルタ
ーを通過させることである。滅菌された生成物は、細胞
分離例えば引続く培養での増殖のための細胞の分離のた
め、あるいは出発材料の滅菌状態を要求する試験での使
用のための無菌条件での使用ができる。
連続密度勾配遠心分離法により細胞から構成要素細胞
をその場で分離することの効果は、得られる、細胞と希
釈された試薬変性コロイドシリカとの混合物の密度で左
右される。例えば、全血から単核細胞を分離する場合、
混合物の密度は次の式を用いて計算できる。
〔この式で、1.067g/cm3は全血と希釈された試薬変性コ
ロイドシリカとの最適混合物で得られた密度であり、1.
024g/cm3は全血の有効密度（血液の密度から血液中の赤
血球による密度への寄与を引いたもの）であり、Ｘは分
離される血液の体積であり、Y1は希釈された試薬変性さ
れているコロイドシリカの密度であり、Ｙは希釈された
試薬変性されたコロイドシリカの体積である〕。
全血と希釈された試薬変性のコロイドシリカのどんな
組合せも使用できる。唯一つの制限は混合物で得られた
密度が約1.067±0.001g/cm3であるべきことである。赤
血球密度はpHに依存する。赤血球密度は希釈された試薬
変性コロイドシリカの中、pH7.40＋0.03で最大である。
その結果、単核細胞から赤血球の最も効果的な分離はこ
のpHのところで達成される。
試薬で変性されたコロイドシリカの構造は次のようで
ある。
（この式で、 はコロイドシリカ粒子を表わし、Ｒはコロイドシリカに
結合する試薬である）。試薬がγ−グリシドオキシプロ
ピル トリメトキシシランである場合、反応生成物の構
造は次の如くである。
（この式で、２つのＸ基は何れも−OH基、または好ま
しくは１つが−OH基で１つがシリカ表面との追加の結
合、あるいはさらに好ましくは２つのシリル表面との追
加の結合である）。Ｒ基間の橋かけ結合または重合は起
らない。最終的なコロイドシリカ粒子の概略の表現を第
２図に示す。ここでは付加されている試薬の残基はＲで
表はされている。
使用に際しては、希釈された試薬変性されているコロ
イドシリカを、適当な方法で、分離すべき細胞または細
胞構成要素を含有する試料に接触させる。どの粒子寸法
を用いるかの選択は、分離すべき細胞または細胞構成要
素の浮遊密度の範囲と分離に採用される遠心力と分離持
続時間とに基く。より大きい粒子寸法を用いることはよ
り小さい粒子寸法を用いることに比較して、密度勾配を
生じさせるのに要する時間とｇ−力を減少させるので好
ましい。沈降速度は粒子直径の２乗に比例する故に、大
きい粒子寸法のものはより小さい粒子寸法のものより大
きい沈降速度をもつ。より短い遠心分離時間とより低い
ｇ−力とは、遠心分離で得られる細胞または細胞構成要
素に対する損傷を減少させる。
試薬変性されているコロイドシリカ中での細胞分離
は、細胞または細胞構成要素が遠心分離中に浮遊密度勾
配内でのそれらの浮遊密度に移動することにより達成さ
れる。それからそれぞれの浮遊密度で形成される細胞バ
ンドを、ピペツトまたは好ましくは細胞除去管により、
別別に遠心管に移すことができる。前記の細胞除去管の
製造法および使用法は1986年４月９日出願の私の同時係
属米国出願番号第849,698号に述べられていて、その開
示は参考資料によりここで与えられている。細胞分離試
薬は洗浄により除去できる。そしてその細胞はまるめら
れ、緩衝剤または培養媒質中に再懸濁することができ
る。
本発明は次の例を考慮することにより更に理解され
る。しかし、これらの例は説明として与えられるもので
あつて制限として与えられるものではないこと、そし
て、例えば材料の量または選択において、本発明の請求
範囲に引用されている本発明の範囲から逸脱することな
く、多くの変化または変更があつてもよいことを理解す
べきである。
実施例１ 試薬変性されたコロイドシリカの調製 約70Åのコロイドシリカ（シリカ50wt％）（Nyacol P
roducts,Inc.Worchester,Massより購入）３を75℃に
加熱する。γ−グリシドオキシプロピルトリメトキシシ
ラン（Petrarch Systems,Inc.より購入）210mlを、絶え
ず撹拌しながら毎分2.0mlで添加する。その反応混合物
を撹拌しながら75℃に加熱し、試薬を添加し終つてから
さらに60分間加熱する。それから、如何なる反応副生成
物も除去するため、その反応混合物を活性炭カラム（直
径8cm、高さ40cm）を通過させる。それから、その試薬
変性されたコロイドシリカを、１時間に3.8の割合
で、初めに陽イオン交換樹脂カラム（水素型）（8cm×4
0cm）、それから陰イオン交換樹脂カラム（水酸基型）
（8cm×40cm）を通すことはより脱イオンする。それか
ら水３を活性炭とイオン交換樹脂とを通過させ、残存
している試薬変性されたコロイドシリカを除去する。
試薬とシリカ表面との間の共有結合の形成を更に促進
するため、その試料変性されたコロイドシリカを、はげ
しく撹拌しながら３時間95℃に加熱する。それから固形
塩化ナトリウム８〜9g/と固形塩化カリウム0.3〜0.4g
/と、水素型（2.51g/）とナトリウム型（2.47g/
とのHEPES緩衝剤20mMとを前記試薬変性されたコリドシ
リカ調製物に加え、その滲透圧とpHとをそれぞれ生理学
的水準に調節する。それから、得られた溶液を、同一の
滲透圧とpHとを持つHEPES緩衝剤溶液と混合することに
より、最終密度1.074〜1.099g/cm3に希釈する。〔第４
表を見よ。それに上記の如くして調製した２つの希釈さ
れた試薬変性されているコロイドシリカ組成物の性質
が、２つの市販されていて入手可能な細胞分離試薬、Pe
rcoll（Pharmaciaの登録商標）とLUDOX HS−30（Du Pon
tの登録商標）とが比較してある〕 実施例２ 血液からの単核細胞の分離 粒子直径約70Åで、希釈後の密度約1.074g/cm3をもつ
コロイドシリカから作つた希釈された試薬変性コロイド
シリカ3mlを15mlの円錐形遠心分離管に入れる。燐酸塩
で緩衝されている塩水（塩化ナトリウム8g/、塩化カ
リウム0.2g/、リン酸水素＝ナトリウム1.15g/、リ
ン酸＝水素カリウム0.2g/、pH7.4）で1:1に希釈され
た血液3mlを前記の試薬変性されているコロイドシリカ
の上に層をなす様に入れる。その遠心管を懸垂筒型ロー
ター中で、室温、900xgで20分間遠心分離する。メニス
カスに集つた単核細胞バンドを細胞除去管またはピペツ
トで取り去る。その単核細胞をHancks液（塩化カリウム
0.4g/、リン酸＝水素カリウム60mg/、塩化ナトリウ
ム8.0g/、重炭酸ナトリウム0.35g/、リン酸水素＝
ナトリウム48mg/、グルコース1g/、フエノールレツ
ド10mg/、pH7.4）10mlを加え、室温、300xgで10分間
遠心分離して洗浄する。リンパ球の平均回収百分率は6
2.3であり、その細胞の平均生育率は95％より大きく、
リンパ球の平均百分率は77.6％である。（選択された市
販され入手出来る細胞分離試薬で得られた回収物との比
較に就いては第５表を見よ）。
実施例３ 多量の抗凝固性にされている全血から単核細胞の無菌的
分離 EDTAで抗凝固体にされている全血４〜15mlを、希釈後
の浮遊密度約1.089〜約1.099g/cm3をもち、フイルター
で滅菌され、希釈されている試薬変性コロイドシリカ6.
7mlを含む管中に無菌的に加える。その血液とコロイド
シリカとを数回管を反転させて静かに混合する。単核細
胞は定角度ローター中、室温で2000xg、10分間遠心分離
して分離する。メニスカスのすぐ下に形成される単核細
胞バンドを滅菌した細胞除去管で取り去る。回収された
細胞は無菌Hanks溶液10mlを加え、管を反転させて洗浄
する。その管を室温、300xgで10分間遠心分離する。リ
ンパ球の最高回収のためには、0.1％BSAを洗浄緩衝液中
に含ませる。リンパ球の平均回収率は84.8％であり、平
均生育率は98.0％であり、リンパ球固体群の平均純度は
76.4％であつた。（選択された市販されていて入手可能
な細胞分離試薬で得られた回収との比較には第５表を見
よ。また、この実施例で用いた生成物で回収した血液細
胞構成要素の分析百分率については第６表も見よ）。
第 ６ 表 血液の構成要素細胞への分離 細胞型 対全細胞（％） 赤血球 9.2＊ リンパ球 76.4＊＊ 単核細胞 18.8＊＊ 好塩基性球 3.2＊＊ 好中球 0.3＊＊ 好酸級 0＊＊ 未熟細胞 1.1＊＊ ＊白血球と赤血球とに、即ち全細胞に対する百分率とし
て表す 平均リンパ球回収率 84.8 平均生育率 98.0 ＊＊赤血球を除き、白血球のみに対しての百分率で表す 実施例４ 少量の抗凝固化されている全血からの、単核細胞の分離 EDTAで抗凝固化されている全血１〜3mlを、希釈され
た後の密度約1.089〜約1.099g/cm3を持つ希釈された試
薬変性されているコロイドシリカ6.7mlを含む管に加え
る。Hanks溶液、pH7.4、1mlを加える。その血液とコロ
イドシリカとを、管を数回反転させて静かに混合する。
単核細胞を定角度ローター中、室温、2000xgで10分間遠
心分離して分離する。メニスカスのすぐ下に形成される
単核細胞バンドを細胞分離管で取り去る。回収された細
胞はHanks溶液10mlを加え、管を反転させて洗浄する。
それから管を室温、300xgで10分間遠心する。最高のリ
ンパ球回収には、0.1％BSAを洗浄緩衝液中に含ませる。
実施例５ 多量の抗凝固化された全血からのリンパ球の無菌的分離 EDTAで抗凝固化されている全血４〜15mlを、希釈後の
密度約1.079〜約1.089g/cm3をもつ、フイルターで滅菌
された、希釈されている試薬変性のコロイドシリカ6.7m
lを含む管に無菌的に加える。その血液と希釈された試
薬変性されているコロイドシリカとを数回管を反転させ
て静に混合する。単核細胞を定角度ローター中、室温、
2000xgで15分間遠心して分離する。メニスカスのすぐ下
に形成される単核細胞と小板とのバンドを無菌ピペツト
と無菌細胞除去管とで取り去る。前のバンドの下に形成
されているリンパ球バンドを細胞除去管で取り去る。回
収された細胞バンドは無菌Hanks溶液10mlを加え、管を
反転させることにより洗浄する。それから管を室温、30
0xgで10分間遠心する。リンパ球の最高回収には、0.1％
BSAを洗浄緩衝液に含ませる。
実施例６ 少量の抗凝固化された全血からのリンパ球の分離 EDTAで抗凝固化された全血１〜3mlを、希釈された後
の浮遊密度が約1.079〜約1.089g/cm2である希釈された
試薬変性コロイドシリカ6.7mlの入つた管に加える。そ
の血液と希釈された試薬変性されているコロイドシリカ
とを、数回管を反転させて静に混合する。単核細胞を、
定角度ローター中、室温、2000xgで15分間遠心すること
により分離する。メニスカスのすぐ下に形成される単核
細胞と小板とを含む細胞バンドをピペツトと細胞除去管
を用いて取り去る。先のバンドの下に形成されるリンパ
球バンドは細胞除去管で取り去る。回収された細胞のバ
ンドは何れも、Hanks溶液10mlを加え、管を反転させて
洗浄する。それからその管を室温、300xgで10分間遠心
する。リンパ球の最高回収のためには、0.1％BSAを洗浄
緩衝液中に含ませる。
実施例７ 臨床研究用キツドを用いる、全血からのＢおよびＴリン
パ球細胞の分離 約70Åのコロイドシリカから作つた試薬変性されたコ
ロイドシリカ1.7mlと約130〜200Åのコロイドシリカか
ら作つた試薬変性されたコロイドシリカ4.0mlと約600Å
のコロイドシリカから作つた試薬変性されたコロイドシ
リカ1.0mlとを包含する希釈された試薬変性コロイドシ
リカ計6.7mlを全血１〜5.0mlと混合し、定角度ローター
中、2000xgで15分間遠心分離する。Ｂリンパ球は勾配中
の鋭い変り目でバンドを形成する。Ｂリンパ球はＴ細胞
バンドの上に分離してバンドを形成する。Ｂ細胞バンド
をピペツトと細胞除去管とで取り去る。それからＴ細胞
バンドを細胞除去管を用いて取り去る。集められた細胞
バンドは何れもHanks溶液、pH7.4、10mlで洗浄し、室
温、300xgで10分間遠心分離して回収する。
実施例８ 骨髄腫細胞を用いる融合に先立つ、Ｂリンパ球の分離 Hanks溶液、pH7.4、中細胞１×107〜５×107個/mlを
もつ、マウス脾細胞懸濁液１〜6mlを、希釈された試薬
変性コロイドシリカ6.7mlと混合し、定角度ローター
中、2000xgで10〜15分間遠心分離する。Ｂリンパ球は脾
の中の大部分の他の細胞より密でなく、メニスカスより
数mm下にバンドを形成する。その細胞バンドを細胞除去
管を用いて集める。その細胞を、Hanks溶液、pH7.4、10
ml加え、室温、300xgで10分間遠心して洗浄する。分離
した細胞は骨髄腫細胞を用いる融合に直接用いることが
できる。
実施例９ 単クーロン抗体で変性されたシリカ粒子を用いる細胞の
分離 部分的に試薬変性されたコロイドシリカ粒子（約600
Åのコロイドシリカから作つた）100mlを水性条件の下
で３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン0.5〜1.0
mlと反応させ、試薬変性されたコロイドシリカ表面にチ
オール基を含有するチオール変性コロイドシリカを形成
させる。そのチオール変性コロイドシリカを、水性条件
の下、チルールと反応してSPDP変性コロイドシリカを形
成するＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルチ
オ）プロピオネート（SPDP）0.26〜1.50gと反応させ
る。それから、プロテインA20〜2000gをSPDP変性コロイ
ドシリカに加える。SPDPはプロテインＡとアミド結合を
形成し、それを粒子にカツプリングさせ、プロテインＡ
変性されたコロイドシリカを形成する。それから、単ク
ーロン抗体（Mab）５〜200μｇをプロテインＡ変性コロ
イドシリカ0.1〜1.0mlと混合する。プロテインＡはMab
と結合し、抗体変性されたコロイドシリカを形成する。
抗体変性コロイドシリカを全血１〜5.0mlと混合し、15
分間培養し、抗体を細胞の抗原と結合させる。それか
ら、その混合物を、希釈された試薬変性コロイドシリカ
についての密度勾配遠心分離によつて分離する。抗体変
性コロイドシリカが結合した細胞は密度が変り、容易に
分離される。抗体変性コロイドシリカは結合した細胞と
共に細胞除去管を用いて集められる。細胞はジチオトレ
イトールまたは他のスルフヒドリール基減少剤例えばグ
ルタチオンまたはβ−メルカプトエタノールによる処理
により抗体変性コロイドシリカから取り除かれる。それ
から細胞をHanks溶液、pH7.4、10mlで洗浄し、300xgで1
0分間遠心分離することにより集める。
実施例10 単クーロン抗体で変性されたシリカ粒子を用いた細胞の
分離 完全に試薬変性されているコロイドシリカはエポキシ
有機シランまたは第３表に掲げたどの有機シランを用い
ても調製される。完全に試薬変性されたコロイドシリカ
（約600Åのコロイドシリカ粒子から作つた）100mlを1,
1−カルボニル−ジイシダゾール0.5〜5.0gまたはスクシ
ンイミド0.3〜3.0gと水性条件の下で反応させ、カルボ
ジイミド変性のコロイドシリカを形成させる。それから
そのカルボジイミド変性コロイドシリカを直接水中でプ
ロテインA13〜1300mgと反応させ、プロテインＡ変性コ
ロイドシリカを形成させる。それから、精製した単クー
ロン抗体（Mab）５〜200μｇをプロテインＡ変性コロイ
ドシリカ0.1〜1.0mlと混合する。プロテインＡはMabと
結合し、抗体で変性されたコロイドシリカを形成する。
その抗体変性されたコロイドシリカを全血１〜6.0mlと
混合し、15分間培養して抗体変性コロイドシリカを細胞
上の抗原と結合させるようにする。それから、その混合
物を、希釈された試薬変性されたコロイドシリカを通し
ての密度勾配遠心分離によつて分離する。抗体変性コロ
イドシリカが結合した細胞は密度が変り、それ故容易に
分離される。結合した細胞と共に、抗体変性したコロイ
ドシリカを細胞除去管を用いて集める。細胞はエタノー
ルアミンで処理することにより抗体変性されたコロイド
シリカから除去される。それから、細胞をHanks溶液、p
H7.4、10mlで洗浄し、300xgで10分間遠心分離して集め
る。
実施例11 精液標本からのＸおよびＹ精子の分離 精子１×107〜２×107個/mlを含有する精液試料１〜6
mlを、希釈後の密度がＸ精子とＹ精子との密度の中間の
1,185g/cm3である希釈された試薬変性コロイドシリカ6.
7mlと混合する。その勾配をつける材料は約70Åのコロ
イドシリカから作つた試薬変性コロイドシリカ1.7mlと
約200Åのコロイドシリカから作つた試薬変性コロイド
シリカ5.0mlからなる。その混合物を定角度ローター
中、2000xgで10〜15分間遠心分離する。Ｙ精子の密度
は、精子当りのDNA含有量が低いため、Ｘ精子の密度よ
り小さい。Ｙ精子をピペツトと細胞除去管を用いて取り
去る。Ｘ精子を細胞除去管を用いて取り去る。その分離
は、アクリジンオレンジを用いる分離精子の螢光染色法
により管理し、螢光活性化細胞分別（FACS）レーザーシ
ステムの使用により定量する。DNA含有量の大きいＸ精
子はＹ精子に比較してより大きい螢光像を作る。Biol.R
eprod.28:312−321（1983）。
実施例12 粒子寸法の組合せを用いる勾配の形の作成 希釈後何れも密度1,089g/cm3を持つ希釈された試薬変
性のコロイドシリカの独特の固体群の混合物計6.0mlを
全血3.0mlと混合し、定角度ローター中、室温、2000xg
で10分間遠心分離する。試薬変性されたコロイドシリカ
の独特の固体群を第７表に示す如く混合する。
血液試料中の細胞がバンドを形成する密度の測定には
密度試標ビーズ（pharmacia）を用いた。第７表に掲げ
た組合せについての結果を第１図に示す。

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】試薬変性コロイドケイ酸粒子の安定な水性
    コロイド状懸濁液を含んで成る細胞分離用組成物であっ
    て、該懸濁液が、非イオン性の親水性基をもつオルガノ
    シランに各々共有結合し、目的の細胞の浮遊密度に近い
    浮遊密度を有する複数個のコロイドケイ酸粒子で構成さ
    れていることを特徴とする、密度による細胞分離用組成
    物。
  2. 【請求項２】オルガノシランとして、式 （Ｘ）３−Si（CH2）２−Ｙ （式中のＹは O2CCH3、Ｎ（CH2CH2OH）2CO2CH3、NH（CH2）2NH（CH2）
    2CO2CH3、NHCOCH2NHC（CH3）Ｏ、 から成る群から選んだものであり、ＸはH3CO、Cl、H5C2
    O、H3CCO2およびH3Cから成る群から選んだものである） で表されるものを含んで成る、前項１に記載の組成物。
  3. 【請求項３】オルガノシランとして、式 （Ｘ）３−Si（CH2）３−Ｙ （式中のＹは O2CCH3、Ｎ（CH2CH2OH）2CO2CH3、NH（CH2）2NH（CH2）
    2CO2CH3、NHCOCH2NHC（CH3）Ｏ、 から成る群から選んだものであり、ＸはH3CO、Cl、H5C2
    O、H3CCO2およびH3Cから成る群から選んだものである） で表されるものを含んで成る、前項１に記載の組成物。
  4. 【請求項４】オガノシランとしてγ−グリシドキシ−プ
    ロピルトリメトキシシランを含んで成る、前項１に記載
    の組成物。
  5. 【請求項５】コロイドケイ酸粒子の変性前寸法が直径約
    30Å〜約600Åのものである、前項１に記載の組成物。
  6. 【請求項６】試薬変性したコロイドケイ酸粒子が浮遊密
    度約1.06g/cm3〜約1.43g/cm3を有する、前項１に記載の
    組成物。
  7. 【請求項７】細胞混合物から興味ある成分を分離するに
    あたり、 （ａ）該成分の浮遊密度に近い浮遊密度を有しそして非
    イオン性親水性基をもつオルガノシラン試薬を共有結合
    させてあるコロイドケイ酸粒子の安定な水性懸濁液から
    成る細胞分離用組成物の上に細胞混合物をのせ、そして （ｂ）該細胞分離用組成物を通して細胞混合物を遠心分
    離して興味ある成分を他の成分から分離する、 各工程を含んで成る、細胞混合物から興味ある成分を分
    離する方法。
  8. 【請求項８】遠心分離により、細胞分離用組成物中に少
    なくとも２個の細胞帯を生成させる、前項７に記載の方
    法。
  9. 【請求項９】興味ある成分が単核細胞のコレクションで
    あり、細胞混合物が血液であり、そして浮遊密度が約約
    1.06g/cm3〜約1.074g/cm3である、前項７に記載の方
    法。
  10. 【請求項１０】興味ある成分が単核細胞であり、細胞混
    合物が血液であり、そして遠心分離が細胞分離用組成物
    中に単核細胞の帯を形成するために十分なものである、
    前項７に記載の方法。
  11. 【請求項１１】血液を密度約1.074g/cm3にまで希釈して
    行う、前項10に記載の方法。
  12. 【請求項１２】血液として抗凝固処理したものを使い、
    そして細胞分離用組成物として浮遊密度約約1.079g/cm3
    〜約1.099g/cm3を有するものを使う、前項10に記載の方
    法。
  13. 【請求項１３】興味ある成分がＢおよびＴリンパ球であ
    り、細胞混合物が全血であり、そして遠心分離がＢリン
    パ球の第１の帯とＴリンパ球の第２帯とを形成するため
    に十分なものである、前項７に記載の方法。
JP62502184A 1986-04-09 1987-03-25 細胞分離用試薬 Expired - Lifetime JP2628509B2 (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US849,819 1986-04-09
US06/849,819 US4927749A (en) 1986-04-09 1986-04-09 Reagent for cell separation

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH01500216A JPH01500216A (ja) 1989-01-26
JP2628509B2 true JP2628509B2 (ja) 1997-07-09

Family

ID=25306597

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP62502184A Expired - Lifetime JP2628509B2 (ja) 1986-04-09 1987-03-25 細胞分離用試薬

Country Status (7)

Country Link
US (1) US4927749A (ja)
EP (1) EP0263867A4 (ja)
JP (1) JP2628509B2 (ja)
AU (1) AU7230487A (ja)
CA (1) CA1338492C (ja)
FI (1) FI875398A0 (ja)
WO (1) WO1987006233A1 (ja)

Families Citing this family (76)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4954452A (en) * 1987-07-09 1990-09-04 Abbott Laboratories Non-metal colloidal particle immunoassay
JPH0750086B2 (ja) * 1989-09-13 1995-05-31 ダイソー株式会社 クロマトグラフ充填剤及びこれによる水溶性有機化合物の分離法
DE3935098C2 (de) * 1989-10-21 1995-05-24 Macherey Nagel & Co Chem Chromatographisches Trägermaterial sowie seine Verwendung in einem Verfahren zur chromatographischen Trennung von Nukleinsäuren
US5641622A (en) * 1990-09-13 1997-06-24 Baxter International Inc. Continuous centrifugation process for the separation of biological components from heterogeneous cell populations
WO1994027698A2 (en) * 1993-05-28 1994-12-08 Baxter International Inc. Continuous centrifugation process for the separation of biologic components from heterogeneous cell populations
US5663051A (en) * 1994-08-31 1997-09-02 Activated Cell Therapy, Inc. Separation apparatus and method
US5840502A (en) * 1994-08-31 1998-11-24 Activated Cell Therapy, Inc. Methods for enriching specific cell-types by density gradient centrifugation
US5474687A (en) * 1994-08-31 1995-12-12 Activated Cell Therapy, Inc. Methods for enriching CD34+ human hematopoietic progenitor cells
US5789148A (en) * 1994-08-31 1998-08-04 Dendreon Corporation Cell separation composition
US5648223A (en) * 1994-08-31 1997-07-15 Activated Cell Therapy, Inc. Methods for enriching breast tumor cells
US5646004A (en) * 1994-08-31 1997-07-08 Activated Cell Therapy, Inc. Methods for enriching fetal cells from maternal body fluids
US6140040A (en) * 1995-10-06 2000-10-31 Advanced Minerals Corporation Method of mechanically separating microparticles suspended in fluids using particulate media
US6015843A (en) * 1998-01-14 2000-01-18 Dendreon Corporation Process for making silanized colloidal silica
US7078224B1 (en) * 1999-05-14 2006-07-18 Promega Corporation Cell concentration and lysate clearance using paramagnetic particles
US6535393B2 (en) * 1998-12-04 2003-03-18 Micron Technology, Inc. Electrical device allowing for increased device densities
US6153113A (en) * 1999-02-22 2000-11-28 Cobe Laboratories, Inc. Method for using ligands in particle separation
US7135335B2 (en) * 1999-05-28 2006-11-14 Stemcell Technologies Inc. Method for separating cells using immunorosettes
SE0004777D0 (sv) * 2000-12-22 2000-12-22 Amersham Pharm Biotech Ab Separation of X-and Y-sperm cells
AU2002223035A1 (en) * 2000-11-22 2002-06-03 Amersham Biosciences Ab Step-wise process to recover or eliminate biological substances by flotation from underlayered colloidal medium
US7205157B2 (en) * 2001-01-08 2007-04-17 Becton, Dickinson And Company Method of separating cells from a sample
US6493910B1 (en) 2001-05-18 2002-12-17 Delphi Oracle Corp. Shoelace with enhanced knot retention and method of manufacture
US6454319B1 (en) 2001-05-18 2002-09-24 Delphi Oracle Corp. Frictive fluid treatment and method of application for shoelaces
US7316932B2 (en) * 2001-10-01 2008-01-08 Stemcell Technologies Inc. Method for separating cells
US7056449B2 (en) * 2002-08-14 2006-06-06 Rohm And Haas Company Aqueous silica dispersion
US7553888B2 (en) * 2002-10-14 2009-06-30 Akzo Nobel N.V. Aqueous dispersion
US7544726B2 (en) * 2002-10-14 2009-06-09 Akzo Nobel N.V. Colloidal silica composition
EP2463299A3 (en) 2003-03-05 2012-10-17 Dendreon Corporation Compositions and methods employing alternative reading frame polypeptides for the treatment of cancer and infectious disease
ES2222099B1 (es) * 2003-07-09 2006-04-16 Alberto Arruga Artal Procedimiento de obtencion de celulas mononucleares.
US8309615B2 (en) * 2003-08-04 2012-11-13 Rohm And Haas Company Aqueous silica dispersion
DE10355409A1 (de) * 2003-11-25 2005-06-30 Magnamedics Gmbh Sphärische, magnetische Silicagel-Träger mit vergrößerter Oberfläche für die Aufreinigung von Nukleinsäuren
US8361946B2 (en) * 2004-04-08 2013-01-29 Akzo Nobel N.V. Detergent composition
MXPA06013985A (es) * 2004-06-01 2007-11-09 In Motion Investment Ltd Tecnicas in vitro para utilizarse con celulas germinales.
DE102005002343A1 (de) * 2005-01-18 2006-07-27 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Verfahren zur spezifischen oder unspezifischen Separation von Zellen und/oder Viren aus flüssigen Medien und dessen Verwendung
US20070015191A1 (en) * 2005-07-01 2007-01-18 Promega Corporation Network of buoyant particles for biomolecule purification and use of buoyant particles or network of buoyant particles for biomolecule purification
WO2007070381A2 (en) * 2005-12-09 2007-06-21 Promega Corporation Nucleic acid purification with a binding matrix
TW200734462A (en) 2006-03-08 2007-09-16 In Motion Invest Ltd Regulating stem cells
US20070238088A1 (en) * 2006-03-29 2007-10-11 General Electric Company Hydrophilic functionalized colloidal silica compositions, methods of making, and uses therefor
WO2007142316A1 (ja) * 2006-06-08 2007-12-13 The University Of Tokushima 新規なナノシリカ粒子の製造方法と用途
US20090181078A1 (en) 2006-09-26 2009-07-16 Infectious Disease Research Institute Vaccine composition containing synthetic adjuvant
US9365460B2 (en) * 2006-11-09 2016-06-14 Akzo Nobel N.V. Pigment dispersion
CA2682661C (en) * 2007-03-22 2017-03-14 Dendreon Corporation Methods for inducing a natural killer (nk) cell-mediated immune response and for increasing nk cell activity
TWI477565B (zh) * 2007-04-19 2015-03-21 Akzo Nobel Coatings Int Bv 用於金屬基材之塗料組合物
US9404084B2 (en) 2007-06-20 2016-08-02 Kwalata Trading Limited Regulating stem cells
EP2154111A1 (de) 2008-07-10 2010-02-17 Cognis IP Management GmbH Wasserlösliche Silikate und deren Verwendung
MX2011004169A (es) * 2008-10-31 2011-09-27 Bio Merieux Inc Metodos para la separacion y caracterizacion de microorganismos utilizando agentes identificadores.
CN102317789B (zh) 2008-10-31 2014-08-27 生物梅里埃公司 利用质谱法分离、表征和/或鉴定微生物的方法
JP6182574B2 (ja) * 2008-10-31 2017-08-16 ビオメリュー・インコーポレイテッド 分光法を使用した微生物の分離、キャラクタリゼーションおよび／または同定方法
EP2216371A1 (de) 2009-02-07 2010-08-11 Cognis IP Management GmbH Lösemittelfreie wasserlösliche Silan modifizierte Silikate
US8039613B2 (en) 2009-08-28 2011-10-18 Promega Corporation Methods of purifying a nucleic acid and formulation and kit for use in performing such methods
US8222397B2 (en) * 2009-08-28 2012-07-17 Promega Corporation Methods of optimal purification of nucleic acids and kit for use in performing such methods
US9637639B2 (en) 2009-11-05 2017-05-02 Akzo Nobel Chemicals International B.V. Aqueous silica dispersion
CN103261387B (zh) 2010-12-16 2015-09-02 阿克佐诺贝尔化学国际公司 低条纹脱脂组合物
TWI546122B (zh) 2011-02-25 2016-08-21 東麗股份有限公司 血液成分吸附用載體及血液成分吸附管柱
AU2012234443B2 (en) 2011-03-25 2015-07-30 Akzo Nobel Chemicals International B.V. Alkyd-based coating composition
AU2013215525B2 (en) 2012-01-31 2017-02-16 Coimmune, Inc. Centrifuge vessels suitable for live cell processing and associated systems and methods
BR112014026411B1 (pt) 2012-05-09 2021-07-27 Akzo Nobel Chemicals International B.V. Dispersão de tinta aquosa
DK2890498T3 (en) 2012-08-29 2018-05-22 Inguran Llc MAGNETIC REMOVAL OR IDENTIFICATION OF DAMAGED OR COMPRIMATED CELLS OR CELL STRUCTURES
US10379026B2 (en) 2012-08-29 2019-08-13 Inguran, Llc Cell processing using magnetic particles
US10130658B2 (en) 2015-12-18 2018-11-20 Provectus Pharmatech, Inc. Method of ex vivo enhancement of immune cell activity for cancer immunotherapy with a small molecule ablative compound
SG10202009448VA (en) 2016-03-07 2020-10-29 X Zell Inc Compositions and Methods for Identifying Rare Cells
WO2018213050A1 (en) 2017-05-15 2018-11-22 Saudi Arabian Oil Company Composition and method for water and gas shut-off in subterranean formations
EP3768782A1 (en) 2018-03-21 2021-01-27 Nouryon Chemicals International B.V. Coatings with solar reflective properties
US11912904B2 (en) 2018-06-28 2024-02-27 Nouryon Chemicals International B.V. Adhesive compositions
JP7227370B2 (ja) 2018-11-13 2023-02-21 ヌーリオン ケミカルズ インターナショナル ベスローテン フェノーツハップ 熱膨張性セルロース系ミクロスフェア
KR102626778B1 (ko) 2019-01-11 2024-01-17 누리온 케미칼즈 인터내셔널 비.브이. 방오성 코팅
DK3708620T3 (da) 2019-03-14 2021-09-06 Keimfarben Gmbh Pigmentdispersion omfattende silanmodificerede kolloid-silika-partikler og en vandopløselig fortykkelsespolymer
WO2020229416A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Nouryon Chemicals International B.V. Pvc foams
WO2020229406A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Nouryon Chemicals International B.V. Composition comprising polyninyl chloride (pvc) and organosilane-modified colloidal silica and associated method of preparation
FR3099060B1 (fr) * 2019-07-26 2022-01-14 Bionuclei Complexe hybride mineral et organique et son utilisation pour le maintien de l’equilibre microbiologique de la peau et/ou d’une composition cosmetique et/ou dermopharmaceutique
US11230661B2 (en) 2019-09-05 2022-01-25 Saudi Arabian Oil Company Propping open hydraulic fractures
KR20220102643A (ko) 2019-12-05 2022-07-20 아크조노벨코팅스인터내셔널비.브이. 저용매 코팅 조성물
US11802232B2 (en) 2021-03-10 2023-10-31 Saudi Arabian Oil Company Polymer-nanofiller hydrogels
US11708521B2 (en) 2021-12-14 2023-07-25 Saudi Arabian Oil Company Rigless method for selective zonal isolation in subterranean formations using polymer gels
US11572761B1 (en) 2021-12-14 2023-02-07 Saudi Arabian Oil Company Rigless method for selective zonal isolation in subterranean formations using colloidal silica
EP4311817A1 (en) 2022-07-27 2024-01-31 Nouryon Chemicals International B.V. Colloidal silica-bonded mgo-containing refractory castables
WO2024089208A1 (en) 2022-10-26 2024-05-02 Nouryon Chemicals International B.V. Post heating of cellulose-based expandable microspheres

Family Cites Families (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3652761A (en) * 1969-09-04 1972-03-28 Corning Glass Works Immunochemical composites and antigen or antibody purification therewith
US3795313A (en) * 1970-05-22 1974-03-05 Du Pont Chromatographic packing with chemically bonded organic stationary phases
US3984349A (en) * 1971-07-26 1976-10-05 Societe Rhone-Progil Modified porous bodies
JPS5011448A (ja) * 1973-06-04 1975-02-05
US3983299A (en) * 1974-03-04 1976-09-28 Purdue Research Foundation Bonded carbohydrate stationary phases for chromatography
US3977982A (en) * 1975-01-20 1976-08-31 Corning Glass Works Controlling viscosity of silica-silicone oil gels
US4034072A (en) * 1975-07-21 1977-07-05 Corning Glass Works Serum hepatitis test
US4049496A (en) * 1976-05-27 1977-09-20 Henry Philip D Rapid separation of plasma creatine kinase isoenzymes
US4172803A (en) * 1976-10-21 1979-10-30 Terumo Corporation Liquid separating composition and apparatus for applying said composition
US4177315A (en) * 1977-03-04 1979-12-04 E. I. Du Pont De Nemours And Company Coated Polymeric substrates
US4108603A (en) * 1977-05-18 1978-08-22 Purdue Research Foundation Method for rapid analysis of hemoglobin variants by high speed liquid chromatography
US4190535A (en) * 1978-02-27 1980-02-26 Corning Glass Works Means for separating lymphocytes and monocytes from anticoagulated blood
US4188451A (en) * 1978-04-12 1980-02-12 General Electric Company Polycarbonate article coated with an adherent, durable, silica filled organopolysiloxane coating and process for producing same
ZA814216B (en) * 1980-06-27 1982-07-28 Akzo Nv Porous inorganic support material coated with an organic stationary phase for use in chromatography and process for its preparation
US4457782A (en) * 1980-08-18 1984-07-03 Sekisui Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Composition for partitioning blood components
EP0069133B2 (en) * 1981-01-15 1990-04-11 Battelle Development Corporation Photo setting composition for coating substrates with an abrasion-resistant transparent or translucent film
US4474704A (en) * 1981-05-26 1984-10-02 Texaco Inc. Novel process
US4406792A (en) * 1981-11-16 1983-09-27 Glad Magnus J Separation agent
DE3208598A1 (de) * 1982-03-10 1983-09-22 Degussa Ag, 6000 Frankfurt Verfahren zur herstellung von mit organosilanen oberflaechenmodifizierten zeolithen
DE3211309A1 (de) * 1982-03-26 1983-09-29 Metin Dipl.-Ing. 6100 Darmstadt Colpan Chromatographisches verfahren zur isolierung von makromolekuelen
US4487700A (en) * 1983-02-18 1984-12-11 Technicon Instruments Corporation Method and apparatus for separating lymphocytes from anticoagulated blood
US4644077A (en) * 1984-07-11 1987-02-17 The Sherwin-Williams Company Process for producing organophilic silica
US4681870A (en) * 1985-01-11 1987-07-21 Imre Corporation Protein A-silica immunoadsorbent and process for its production
CH663728A5 (fr) * 1985-06-10 1988-01-15 Battelle Memorial Institute Procede de purification de substances bioactives par adsorption biospecifique.

Also Published As

Publication number Publication date
EP0263867A4 (en) 1988-11-24
FI875398A (fi) 1987-12-08
AU7230487A (en) 1987-11-09
EP0263867A1 (en) 1988-04-20
CA1338492C (en) 1996-07-30
JPH01500216A (ja) 1989-01-26
FI875398A0 (fi) 1987-12-08
US4927749A (en) 1990-05-22
WO1987006233A1 (en) 1987-10-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2628509B2 (ja) 細胞分離用試薬
US4927750A (en) Cell separation process
US9739768B2 (en) Methods and reagents for improved selection of biological materials
JP6126619B2 (ja) 細胞分離方法
US4687748A (en) Magnetic carbohydrate particles as carriers for affinity separation purposes
JP3863373B2 (ja) 生物学的流体の分離のための装置を用いる方法
Karr et al. Immuno-affinity partition of cells in aqueous polymer two-phase systems
JPH10502011A (ja) サンプルの集団又は副次集団の選択方法
MXPA03009258A (es) Composiciones y metodos para separacion celular.
AU2002255678A1 (en) Cell separation compostions and methods
JP2001520382A (ja) 安定なタンパク質−ニッケル粒子並びにその生産の方法及び使用
EP0877941B1 (en) Method for bulk enrichment of a population or subpopulation of cells
WO2007117968A1 (en) Hydrophilic functionalized colloidal silica compositions, methods of making, and uses thereof
JP3993892B2 (ja) 細胞分離の組成物、キット、および方法
JP2010505107A (ja) 超音波法
Karr et al. Cell separation by immunoaffinity partitioning with polyethylene glycol-modified protein A in aqueous polymer two-phase systems
US20030109618A1 (en) Magnetic, silanised polyvinylalcohol-basedcarrier materials
JPH10501613A (ja) ポリマービーズに共有結合により固定化した抗体
JP2001228149A (ja) 臨床検査用微粒子分散剤、検査用試薬、試薬の製造方法、検査方法および用途
Gordon et al. Light microscope identification of murine B and T cells by means of functional polymeric microspheres
FI72822B (fi) Immunologisk reagens foer bestaemning av graviditet, foerfarande foer framstaellning av detta och foerfarande foer bestaemning av graviditet.
NO875090L (no) Reagens for celleseparasjon.
EP0246103A2 (en) Bioaffinity and ion exchange separations with liquid exchange supports
JPH08338842A (ja) 梅毒抗原の製造方法
NZ208021A (en) Antibody composition for isolating white blood cell components

Legal Events

Date Code Title Description
R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

EXPY Cancellation because of completion of term