JPH0144720B2

JPH0144720B2 -

Info

Publication number: JPH0144720B2
Application number: JP63057954A
Authority: JP
Inventors: Kazumi Hanamitsu; Hideo Sakakibara; Masaki Takada; Masaru Kotani; Junzo Mizoguchi
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Toyo Jozo KK
Priority date: 1988-03-11
Filing date: 1988-03-11
Publication date: 1989-09-29
Also published as: JPS6410991A

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は、、少なくとも、ストレプトコツカ
ス・ミユータンスなどの口腔内細菌によるシユク
ロースの存在下不溶性グルカンの合成酵素である
グルコシルトランスフエラーゼを阻害する作用を
有する酸性蛋白質系のM5071様物質に関する。詳
しくは、少なくとも、グルコシルトランスフエラ
ーゼを阻害する作用を有する酸性蛋白質系の
M5071様物質M5094物質に関する。本発明者らは、先に、東京都下小笠原村父島に
て採取した値物の葉（樹脂不明）より分離した不
完全菌アースリニウム・エス・ピーM5071株
（Arthrinium sp.M5071：FERM―ＰNo.5352）の
培養物中に、虫歯の原因菌の一種であるストレプ
トコツカス・ミユータンスなどによるシユクロー
スの存在下不溶性グルカンの合成酵素であるグル
コシルトランスフエラーゼを阻害する作用を有す
る酸性蛋白質系の新規物質を見い出し、本物質を
M5071物質と命名した（特願昭55―5128号（特開
昭56―103193号））。さらに本発明者らは、東京都下小笠原村母島に
て採取したトウモロコシの茎部より分離されたフ
ザリウム（Fusarium）属に属すると固定された
糸状菌M5084株（Fusarium solaniM5084：
FERM―ＰNo.5546）の培養物中に、上記M5071
物質に類似する性状を有する、虫歯の原因菌の一
種であるストレプトコツカス・ミユータンスなど
によるシユクロースの存在下不溶性グルカンの合
成酵素であるグルコシルトランスフエラーゼを阻
害する作用を有する酸性蛋白質系の新規な物質２
種を見い出し、各々、M5071様物質M5084I物質、
M5071様物質M5084物質と命名した（特願昭55
―104056号）。さらにまた本研究者らは、マクロフオーミナ・
ハゼオリー・IFO7318株（Macrophomina
phaseoli IFO7318：INSTITUTE FOR
FERMENTATION OSAKA.LIST OF
CULTURES 1978.SIXTH EDITION）の培養
物中に、同様に上記M5071物質と類似する性状を
有する、シユクロースの存在下不溶性グルカンの
合成酵素であるグルコシルトランスフエラーゼを
阻害する作用を有する酸性蛋白質系の新規な物質
を見い出し、M5071様物質M4400物質と命名した
（特願昭55―104056号（特開昭57―28097号））。さらに本発明者らは、沖縄県竹富町にて採取さ
れた落葉（樹種不明）より分離されたノヅリスポ
リウム（Nodulisporium）属に属すると同定され
た糸状菌M5094株の各々の培養物中に、前記
M5071物質に類似する性質を有する、虫歯の原因
菌の一種であるストレプトコツカス・ミユータン
スなどによるシユクロースの存在下不溶性グルカ
ンの合成酵素であるグルコシルトランスフエラー
ゼの活性を阻害する作用を有する酸性蛋白質系の
新規物質を見い出し、M5071様物質M5094物質と
命名した。本発明の糸状菌M5094株の培養物より得られた
M5071物質M5094物質は、少なくとも、下記第１
表に示す理化学的性質を有する物質である（参考
として、特願昭55―5128号に記載のM5071物質の
理化学的性質を併記する）。

【表】

【表】また本発明のM5071様物質M5094物質の力価の
測定法としては、シユクロース存在下におけるグ
ルコシルトランスフエラーゼを用いた不溶性グル
カンの合成の阻害度を観察することによつて行な
われるもので、次の通りである。ストレプトコツカス・ミユータンスOMZ176を
BHI培地で２日間培養し、除菌後、培養液を
硫安沈澱し、この沈澱物を集め、水に溶解し、透
析して、培養液の約50培に濃縮した、ストレプ
トコツカス・ミユータンスによる不溶性グルカン
合成を触媒するグルコシルトランスフエラーゼ含
有液0.1ml、本発明のM5071様物質M5094物質含
有液0.1ml、0.5Mリン酸緩衝液0.1ml、1Mシユク
ロース0.1mlからなる反応液を37℃でインキユベ
イトする。一方対照として、本発明のM5071様物
質M5094物質含有液の代りに水を使用する。また
本発明のM5071様物質M5094物質含有液は、あら
かじめ数段階に希釈しておく。２時間後、対照の
場合にて不溶性グルカンが合成されていることを
確認する。活性は、各希釈されたM5071様物質
M5094物質含有液の状態を観察し、不溶性グルカ
ンの合成が阻害された最高希釈度をもつてその力
価とする（例えば、100培希釈で阻害作用を示し、
120倍希釈で阻害作用を示さない場合は、その力
価を100とする）。求める本発明のM5071様物質
M5094物質含有液の１ml当りの力価(A)は、Ａ＝ａ×10（Unit／ml）で求められる（ａはその最高希釈度を示す）。上述の(1)〜(9)にて示す本発明のM5071様物質
M5094物質の理化学的性質より、グルコシルトラ
ンスフエラーゼによる不溶性グルカンの合成を阻
害する作用を有する酸性蛋白質系の物質と認めら
れ、先に見い出したM5071物質と類似するものと
認められる。また本発明のM5071様物質M5094物
質は、その分子量、等電点などからM5071物質と
よく類似する物質と認められるものの、両者のPH
安定性のパターンにおいて明瞭な差異を有してな
る異なる物質と認められる。また本発明において見い出されたM5071様物質
M5094物質生産菌たるM5094株はノヅリスポリウ
ム属に属すると同定したもので、本菌をノヅリス
ポリウム・エス・ピー・M5094（Nodulisporium
sp.M5094）と命名した（工業技術院微生物工業
技術研究所、微生物受託番号通知書受託番号「微
工研菌寄第5800号FERM―ＰNo.5800」）。本菌ノヅリスポリウム・エス・ピー・M5094菌
株の菌学的性状について述べれば、次の通りであ
る。 (1) 各種培地における生育状態麦芽エキス寒天培地生育は非常に速く、26℃の場合１週間で直径85
mmのペトリ皿全面に生育する。菌叢は、平担で気
中菌糸は綿毛状で、色はカバート・タン
〔Covert Tan（2ge）〕。集落周辺部はくもの巣状。
拡散性色素を出し、色はハニー・ゴールド
〔Honey Gold（2ic）〕。浸出液は出さない。裏面
はミツドナイト・ブルー（14Pn）。バレイシヨ・ブドウ糖寒天培地生育は速く、26℃の場合１週間で直径65〜80mm
に達する。菌叢は平担だが、やや厚みがある。気
中菌糸は綿毛状で、色はカバート・ブラウン
〔Covert Brown（2li）〕。集落周辺部はくもの巣
状。拡散性色素を出し、色はハニー・ゴールド
（2ic）。浸出液は出さない。裏面はダーク・スプ
ルース〔Dark Spruce（20pn）〕。ツアペツク寒天培地生育は速く、26℃の場合１週間で直径45〜65mm
に達する。菌叢は薄く平担。気中菌糸はわずかに
綿毛状で、色はカバート・タン（2ge）。集落周
辺部はくもの巣状。拡散性色素をわずかに出し、
色はバンブー〔Bamboo（2ge）〕。浸出液は出さな
い。裏面はベイジユ・ブラウン〔Beige Brown
（3ig）〕。 (2) 顕微鏡的特色栄養菌糸は無色〜淡褐色で、壁は滑面、隔壁を
有する。ときどき、菌糸の周辺部に顆粒状物質を
蓄積する。分生胞子柄は40〜200×25〜3.5μ、隔
壁を有し、無色〜淡褐色。壁は粗面、２〜輪生状
に、比較的規則的に分枝する。分生胞子形成細胞
は単独〜輪生状に規則的に形成、淡黄褐色〜淡褐
色、10〜20×2.5〜3.5μ、粗面。分生胞子はふく
らんだ分生胞子形成細胞の先端に数個出きる小突
起上にシンポヅラエ（Sympodulae）型に形成さ
れる。下端が扁片で切れたようなやや不規則な楕
円形、無色〜淡黄褐色、4.5〜６×2.5〜3μ、壁は
滑面。 (3) 生理的性状生育し得るPH ：３〜11 最適生育PH ：４〜８生育し得る温度：12〜45℃ 最適生育温度：23〜37℃ 上記の菌学的性状において、本菌は外生する分
生胞子によつて増殖することから、ヒボマイセテ
ス（Hypomycetes）に属すると認められる。さ
らに分性胞子柄が比較的長く、やや規則的に分枝
すること、分生胞子形成様式がSympodulae型で
あること、分生胞子形成細胞の壁が粗面で、先端
へ行つても極端に細くならないこと、分生胞子の
下端が扁平であることなどの特色から、本菌
M9094菌株はノヅリスポリウム属に属すると同定
され、よつてノヅリスポリウム・エス・ピー・
M5094と命名した。なお本菌の同定に当つて、M.B.E11is，1971，
Dematiaceous Hyphomycetes、608pp、CMI
England、G.L.Barron，1968、TheGenera of
Hyphomycetes from Soil、364pp、The
Williams ＆Wilkins Co.，USA、を引用した。色の標示は、Color Harmony Manual
（Container Corporation of America1958）の
標示法に従つた。次いで本発明のM5071様物質M5094物質を得る
に当つて、前記のM5071様物質生産菌たるノヅリ
スポリウム・エス・ピー・M5094株はその一例で
あつて、本菌に限らずM5071様物質M5094物質生
産菌であれば、天然または人工変異株などがあつ
て使用し得るものである。また本発明を実施するに当つて例示すれば、ノ
ヅリスポリウム属に属するM5071様物質M5094物
質生産菌、好ましくは前記のノヅリスポリウム・
エス・ピー・M5094株を、抗生物質や酵素などを
生産する通常の方法で培養する。培養の形態とし
ては、通常液体培養で行なうのが有利である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられているものが広く使用され得る。炭素源と
しては同化可能な炭素化合物であればよく、好ま
しくはシユクロースが用いられ、またグルコー
ス、ラクトース、マルトース、フラクトース、糖
蜜、デキストリンなどが用いられる。窒素源とし
ては利用可能な窒素化合物であればよく、例えば
ポリペプトリン、コーン・スチープ・リカー、肉
エキス、酵素エキス、大豆粉、カゼイン加水分解
物などが用いられる。その他、リン酸塩、炭酸
塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウ
ム、ナトリウム、鉄、亜鉛、マンガンなどの塩類
が必要に応じて使用される。培養温度は菌が発育し、本発明のM5071様物質
M5094物質を生産する範囲内で適宜変更し得る
が、通常26〜30℃程度、好ましくは26℃程度であ
り、また培養時間は条件によつて多少異なるが、
M5071様物質M5094物質が最高収量に達する時期
を見計つて適当な時期に培養を終了すればよく、
通常２〜４日程度である。次いで、このようにして得られた培養物から
M5071様物質5094物質を採取するのであるが、ま
ず得られた培養物を過または遠心分離などの手
段により、固形物を除去してその培養液を回収
する。得られた培養液よりM5071様物質M5094
物質を単離するに当つては、M5071様物質M5094
物質の溶媒に対する溶解性や塩析手段に基いて行
なうことが好ましく、例えば培養液に硫酸アン
モニウムを加えて塩析せしめ、それによつて生じ
た沈澱物を遠心分離などの手段にて回収すればよ
い。さらにこの沈澱物を安定PH域を有する緩衝液
に溶解後透析膜にて透析し、DEAE―セルロー
ス、DEAE―セフアデツクス、セフアデツクスな
どの吸着クロマトグラフイーやゲル過手段を用
いて精製し、さらに等電点電気泳動法により活性
区分を回収し、単一成分まで精製されたM5071様
物質M5094物質の精製物の区分を得、これを凍結
乾燥すればよい。このようにして得られたM5071様物質M5094物
質は少なくともグルコシルトランスフエラーゼに
よる不溶性グルカンの合成の阻害作用を有してい
るもので、特に虫歯原因菌の一種である口腔内細
菌ストレプトコツカス・ミユータンスによるシユ
クロースの存在下、菌表面等への粘着性物質たる
不溶性グルカンの生成を防止してなるもので、そ
のため、不溶性グルカンの粘着性による種々の虫
歯原因菌の歯表面への付着を防止してなるもの
で、その結果、虫歯を予防してなる有用なもので
ある。次に本発明の実施例を挙げて具体的に説明する
が、本発明は何んらこれによつて限定されるもの
ではない。実施例１グルコース１％、プロトフラワー１％、ペプト
ン１％、コーン・スチーブ・リカー１％、
KH₂PO₄0.1％、MgSO₄・7H₂O0.1％、セライト
１％からなる培地100ml（PH6.5）を有する500ml
容三角フラスコ（120℃、20分間滅菌処理、各５
本）に、ノヅリスポリウム・エス・ピー・M5094
株を接種し、26℃で４日間振盪培養した。次いで
この種培養物各５mlを、シユクロース1.5％、デ
キストリン1.5％、ポリペプトン２％、コーン・
スチープ・リカー２％、KH₂PO₄0.2％、
MgSO₄・7H₂O0.1％、FeSO₄・7H₂O0.01％、セ
ライト１％からなる培地100ml（PH6.5）を有する
500ml容三角フラスコ（120℃、20分間滅菌処理、
各100本）に移殖し、26℃、３日間振盪培養した。
培養後、セライトを用いてこの培養物を過し、
少量の水で洗浄して、約９の培養液（蛋白量
1302ｇ、比活性0.21）を得た。得られた培養液
に硫安4.6Kgを加えて撹拌後、氷室（４℃）に一
晩放置した。次いで生じた沈澱物を遠心分離して
回収し、これを0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）約
500mlに溶解した後、セロフアンチユーブを透析
膜として0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）に対して
透析した。12時間おきに透析外液を替え、120
の透析液で72時間透析した。透析後さらに、あら
かじめ0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）で平衡化し
たDEAE―セルロースのカラム（径５×40cm）に
チヤージして吸隊せしめ、0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.3）で洗浄した後、0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.3）２〜0.5MNaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.3）２を用いて濃度勾配法で溶出せしめ、
0.1MNaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）近辺
の溶出区分433ml（蛋白量2.42ｇ、比活性88）を
得、さらにメンブランPM―10にて濃縮した。さ
らに、この濃縮液を、セロフアンチユーブを透析
膜として0.01Mリン酸緩衝液に対して透析せし
め、12時間おきに透析外液を替え、80の透析液
で48時間透析した。透析した液は、あらかじめ
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）で平衡化したDEAE
―セフアデツクスＡ―25でカラム（径３×25cm）
チヤージして吸着せしめて、0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.3）で洗浄した後、0.01Mリン酸緩衝液（PH
6.3）２〜0.3MNaCl含有0.01Mリン酸緩衝液
（PH6.3）２を用いて濃度勾配法で溶出して、
0.05MNaCl含有0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）近
辺にて溶出されるM5071様物質M5094物質含有活
性区分283ml（蛋白量85mg、比活性201）を得、凍
結乾燥した。さらにこのM5071様物質M5094物質
含有乾燥物を、少量の水に溶解させ、0.01Mリン
酸緩衝液（PH6.3）で平衡化したセフアデツクス
Ｇ―100のカラム（径2.5×60cm）にチヤージし、
0.01Mリン酸緩衝液（PH6.3）にて１フラクシヨ
ン4.8mlずつ溶出して、そのフラクシヨンNo.85〜
97を回収し、併合し（蛋白量23mg、比活性1121）、
凍結乾燥した。次いでこの凍結乾燥物を少量の水
に溶解させ、あらかじめ水で平衝化したセフアデ
ツクスＧ―25コースで脱塩し、凍結乾燥して22mg
を得た。さらに、これを、少量の0.01Mリン酸緩
衝液（PH6.3）に溶解した後、グリセリン中でPH
2.4〜４のキヤリア―アンホライトを用いてなる
等電気泳動（700V、24時間）を行ない、泳動後、
２mlずつ分画して、その活性区分を回収し、さら
に、あらかじめ水で平衡化したセフアデツクスＧ
―50フアインのカラム（径2.4×40cm）にチヤー
ジし、水で１フラクシヨン4.8mlずつ溶出し、そ
の活性フラクシヨンNo.2.1〜25を回収し、これを
凍結乾燥して精製されたM5071様物質M5094物質
の白色粉末17mgを得た（本品は、培養液のもの
に比べ比活性で約6800倍上昇し、SDS―ポリアク
リルアミド電気泳動（PH９）にて単一バンドを示
すものであつた）。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明のM5071様物質M5094物質のPH
安定性曲線、第２図はM5071物質のPH安定性曲
線、第３図はM5071様物質M5094物質の熱安定性
曲線、第４図はM5071物質の熱安定性曲線を示
す。

Claims

【特許請求の範囲】１少なくとも、下記の理化学的性状を有してな
るM5071様物質M5094物質。 Γ 分子量約33000、 Γ 等電点 PH3.5付近、 Γ 紫外部吸収スペクトル λmax 280mμ、λmax（シヨルダー）290mμ Γ 溶解性水に易溶、メタノール、アセトン、クロロホル
ム、酢酸エチルに不溶、 Γ 呈色反応ビウレツト反応、キサントプロテイン反応、フ
オーリン反応は陽性、 Γ 色性状白色 Γ 作用少なくともグルコシルトランスフエラーゼによ
る不溶性グルカンの合成を阻害する、 Γ PH安定性 PH４〜７で安定である、 Γ 熱安定性 40℃まで安定で、60℃でほぼ100％失活する。