JPH01309685A - エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は新規なエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニ
ダーゼ（以下、ｅｎｄｏ−β−ＧＩｃＮＡｃ−ａｓｅと
略する。）およびその微生物による製造法に関するもの
である。さらに詳しくは、糖タンパク質のアスパラギン
結合型糖鎖の高マンノース型や混合型のみならず、複合
型糖鎖に対しても作用する広い基質特異性を有する、ｅ
ｎｄｏ−β　−ＧｌｃＮＡｃ−ａｓｅおよびその微生物
による製造法に間するものである。

塘タンパク質は動物の諸臓器や植物の＆ＩＩ襟、微生物
の細胞膜・細胞壁などに広く分布している。

近年、糖タンパク質の糖鎖が、細胞の分化や細胞間認識
など、生体内の分子識別現象に重要な役割を果たしてい
ることが明らかにされつつある。これらの役割の解明に
は、そのｔＩ！鎖の構造と８９能の究明が重要な課題と
なっている。このような１１！鎖の構造や機能を明らか
にするための手段として、微生物の生産するさまざまな
特異性の高いグリコシダーゼが注目されるようになり、
この酵素法を用いた研究が広く行われている。しかしな
がら、糖タンパク質のｔｉ　ｔｘは、通常、複雑な構造
を有しているので、エキソ型のグリコシダーゼのみによ
る分析はきわめて困難である。そこで、糖クンバク質か
ら糖部分をオリゴ糖として切り離す、エンド型のグリコ
シダーゼが非常に重要な酵素になると考えられてきた。

Ｅｎｄｏ−β−ＧｌｃＮＡｃ−ａｇｅは、糖タンパク質
に存在するアスパラギン結合型の糖鎖に作用して、以下
の様に糖鎖とタンパクとの結合部に存するＮ。

Ｎ′−ジアセチルキトビオース部分を切断し、糖鎖を遊
離する。

・−−−Ｍａｎβ１→４ＧＩｃＮＡｃβ１−＋　４Ｇｌ
ｃＮＡｃ−Ａｓｎｈ　ｅｎｄｏ−β−ＧＩｃＮＡｃ−ａ
ｓｅ・−−−Ｍａｎβ１→４ＧＩｃＮＡｃ＋　　ＧＩｃ
ＮＡｃ−Ａｓｎ本酵素は、糖タンパク質の糖鎖部分をタ
ンパク部分より遊離することができるために、糖タンパ
ク質糖鎖の構造および機能の解析に、非常に重要な酵素
である。

（従来の技術）（発明が解決しようとする問題点）従来
、ｅｎｄｏ−β−Ｇ１ｃＮＡｃ　−ａｓｅは、肺炎双球
菌（Ｄｉｐｌｏｃｏｃｃｕｓ　　ｐｎｅｕＩＩｌｏｎｉ
ａｅ）の生産するＥｎｄｏ−ＤＳＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕ
Ｉｌｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓの生産するＥｎｄｏ−ＣＩ
およびＣ■、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ　Ｐｌｉｃａｔ
ｕｓの生産するＥｎｄｏ−Ｈなどが知られており、糖タ
ンパクの糖鎖の研究に用いられているが、これらの酵素
はいずれも特定の糖鎖に対してのみ作用する。

即ち、アスパラギン結合型糖鎖の構成としては、以下に
示すような高マンノース型、混合型、複合型に分けられ
る。

高マンノース型 ±Ｆｕｃα１ ル →４ＧｌｃＮＡｃβ１−＊　４Ｇ１ｃＮＡｃ　４　Ａｓ
ｎ上記の従来知られているｅｎｄｏ−β−ＧｌｃＮＡｃ
−ａｓｅは、高マンノース型と混合型の糖鎖には作用す
るが、シアル酸の結合したままの複合型糖鎖には作用し
ない、最近見出されたＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｍ
ｅｎｉｎｇｏｓｅｐｔｉｃｕｍのｅｎｄｏ−β−Ｇｌｃ
ＮＡｃ−ａｓｅ（Ｅｎｄｏ−Ｐ）は高マンノース型と複
合型のＩ！鎖に作用するが、複合型ＩＪ！鎖には高ａ度
の２−メルカプトエタノールとノニデｙ　ト（ｎｏｎｉ
ｄｅｔ）−Ｐ２Ｏなどのタンパク質の変性剤の存在下で
なければ作用しない。

（問題点を解決するこめの手段） しかし、本発明者らが土壌より単離した糸状菌であるム
コール属の一菌株が培養液中に生産するｅｎｄｏ−β−
ＧｌｃＮＡｃ−ａｓｅは、高マンノース型や混合型の糖
鎖のみならず、シアル酸が結合した複合型ｔ１！鎖にも
作用し、しかも活性の発現に２−メルカプトエタノール
や界面活性剤のようなタンパク質変性剤を必要としない
、新規なｅｎｄｏ−β−−ＧｌｃＮＡｃ　−ａｓｅであ
ると認められるものである。

本発明者らは、糖タンパク質のアスパラギン結合型糖鎖
の高マンノース型や混合型のみならず、シアル酸の結合
した複合型の糖鎖にも作用するという広い基質特異性を
有するとともに、天然に存在する糖タンパク質を変性す
ることなく、その糖鎖に直接作用しうるｅｎｄｏ−β−
ＧＩｃＮＡｃ−ａｓｅを生産する菌を検索した結果、土
壌より分離された糸状菌の培養液中に特異的な本酵素活
性を見出した。このような微生物の培養液より単一タン
パクとしてｅｎｄｏ−β−ＧＩｃＮＡｃ−ａｓｓを得る
ことに成功し、本発明を完成するに至った。

即ち、本発明は高マンノース型、混合型、複合型のいず
れのアスパラギン結合型ｔＩ鎖にも作用し、かつ天然の
糖タンパクＸＩ！鎖に１ｎｔａｃｔの状態のままに作用
する特徴を有する新規なｅｎｄｏ−β−ＧＩｃＮＡｃ−
ａｓｅを提供するものである。さらに、本発明は、ムコ
ール属に属し前記のｅｎｄｏ−β−Ｇ１ｃＮＡｃ−ａｓ
ｅを生産能を有する微生物を培養して、培養液よりｅｎ
ｄｏ−β−Ｇ１ｃＮＡｃ−ａｓｅ採取することを特徴と
するｅｎｄｏ−β−Ｇ１ｃＮＡｃ−ａ３ｅの製造方法を
も提供するものである。

本発明酵素は、糖タンパク賞に存在する複合型を含めた
ほとんどのアスパラギン結合型Ｉ！鎖を遊離することが
できると共に、タンパク賞変性剤などを添加してタンパ
ク質を変性処理する必要がなく、糖タンパク質からＩＩ
！鎖を遊離することができる極めて優れた性質を有して
いる。それ故に、糖タンパク質の＃ａ鎖およびタンパク
の機能的、生理的役割を研究する上で、本発明酵素をそ
の糖タンパク賞に作用させることにより明らかにするこ
とができる。即ち、本発明酵素を塘タンパクに作用させ
ることにより、複合型を含めたほとんど全てのアスパラ
ギン結合型糖鎖が除去されたタンパク質を得ることがで
き、その活性を調べることが可能である。また、最近、
癌細胞のアスパラギン結合型糖鎖の構造が、通常の細胞
のそれと異なる構造に変化するという報告が多く発表さ
れ、糖タンパクのＩＩＭ鎖の構造が注目されている。こ
のような状況の中で糖鎖をタンパク質部分から遊離する
ことができる本発明酵素は、糖鎖の構造解析にも有用な
酵素として利用されることが期待される。また、本発明
酵素は、通常の安価な培地で菌体を培養することにより
、閑体外に分泌されるので、容易にかつ多量の酵素タン
パクを得ることができ、研究用試薬として大量かつ安価
な供給が可能である。

以下に本発明を更に詳細に説明する。後に示す実施例の
方法で得られたｅｎｄｏ−β−ＧＩｃＮＡｃ−ａｓｅの
酵素化学的および理化学的性質は、下記のとおりである
。

１１作用 本発明酵素は、糖タンパク賞のアスパラギン結合型１！
１１のタンパクとの結合近傍にあるＮ、Ｎ’　−ジアセ
チルキトビオース部分を加水分解する作用を有する。

オリゴ嘘−・・−・！ｉａｎβ１−４ＧＩｅＮ１１ｃβ
１−＋　４ＧｌｃＮＡｃ　４Ａｓｎ−タンパク質オリゴ
糖・・・・・陽β１→４Ｇ因Ａｃ　＋　ＧｌｃＮＡｃ　
−＊　Ａｓｎ−タンパク質２、基質特異性 本発明酵素は、卵白アルブミンから調製した糖ペプチド
に含まれている異なった種類の全ての糖鎖、すなわち、
高マンノース型、混合型のいずれのタイプの糖鎖をも分
解する。−また、ヒト血漿中のトランスフェリンや子牛
血漿中のフェツインから調製した糖ペプチドに含まれる
複合型のＷｆｆｌも分解する。複合型糖鎖については、
シアル酸が結合したものであっても加水分解することが
できる。

さらに本発明酵素は、トランスフェリンそのものを基質
とした場合でも、ＩＩ！鎖を遊離することが認められる
ことから、天然の糖タンパク質に対しても作用し得るし
、シアル酸の有無に関わらず作用することができる。

３、力価の測定方法 本酵素の活性の測定は、ヒト血漿トランスフェリンを徹
底プロナーゼ処理後、シアリダーゼによってシアル酸を
除去して得られる糖ペプチド（アシアロ糖ペプチド）の
ダンシル化合物を基質として行った。ＰＨ６，０のリン
酸カリウム緩衝液中、３７℃で反応を行い、４０％トリ
クロル酢酸を加えて反応を停止させた後、分解生成物を
ｎ−ブタノール−アセトン−水（３：１：１）を展開剤
とするペーパークロマトグラフィによって分離し、水で
抽出した後、蛍光法にて定量する方法により行った。３
７℃における反応で、１分間に１μｍｏｌの基質を分解
する酵素量を１単位（Ｕｎｉｔ：本明細書において「Ｕ
」と略称する）とする。

４、至適ｐＨおよび安定ｐ　Ｈ 至適ｐＨは、第１図に示すとおりｐ　Ｈ６，０〜７．０
であり、安定ＰＨは４℃で４日間処理した場合、ｐＨ７
゜Ｏ〜８．０であった。

５、温度安定性 ｐ　Ｈ７，０において各温度で１０分間保持した後、残
存する酵素活性を測定した。その結果、第２図に示した
ように４０゛Ｃまで安定であった。

６、阻害、活性化および安定化 本発明酵素に対する、種々の添加物質の影響について検
討した結果、著しく活性化する添加物質は存在しなかっ
た。金属塩の中では、ＨｇＣ１！、により阻害が認めら
れたが、その他のものについては著しい影響は見られな
かった。

本発明酵素の安定化剤はまだ見出されていない。

７、精製方法 本発明酵素の精製は、塩析法、各種のクロマトグラフ法
などを適宜に組合わせて行うことができる。精製の具体
例は実施例に示すとおりである。

８、分子量 本発明酵素の分子量は、セファデックスＧ−１５０によ
るゲルろ過法により約９５，０００〜１０５，０００と
算出された。

次に、本発明酵素を微生物の培養によって製造する方法
を具体的に示す。

本発明酵素の製造に使用される微生物は、ムコール（Ｍ
ｕｃｏｒ）属に属し、本発明酵素を生産する能力を有す
る微生物であればいかなるものでもよい。このような微
生物の具体例としては、本発明者らにより土壌より分離
されたＭｕｅｏｒ　ｈｉｅａ＋ａｌｉｓＳＫ−３１４が
挙げられる。この菌株の菌学的性質を以下に記載する。

Ａ、顕微鏡的観察 菌糸は隔壁がなく、胞子のう柄は気菌糸から長く伸長す
る。まれに分岐が見られた。先端に黒色の丸い胞子のう
が形成する。胞子は、だ円形でなめらかである。栄養菌
糸はよく発達している。

Ｂ、肉眼的観察 各種培地における、生育の肉眼的観察の結果は次のとお
りである。生育状態の観察は、２８°ｃ１２〜３日間培
養した場合の結果である。

（１）普通寒天培地（肉エキス寒天培地）生育は良好で
、白色の菌糸が立毛しビロード状でコロニーの周辺はな
めらかである。基菌糸は淡黄色で、菌糸の平均生育速度
は０．７〜０．８ｃｍ／日。

（２）麦芽寒天培地 生育は良好で、菌糸が立毛しビロード状となる。

基菌糸は淡褐色で、菌糸の平均生育速度は１．２〜１．
３ｃｍ／日。

（３）ＭＹ２０寒天焙地 生育は良好で、黄褐色の綿毛状の菌糸が中央から拡がり
、周縁は白色で表面になめらかに伸長する。基菌糸は淡
黄褐色で、菌糸の平均生育速度は１．１〜１．２ｃｍ／
日、培地中への淡黄褐色の色素の生育が認められる。

（４）ムコール合成培地 生育は中程度で、淡黄色を帯びた白色の綿毛状の菌糸が
伸長し、周辺は無色の菌糸が伸展している。基菌糸は極
めて鮮明な黄色で、菌糸の平均生育速度は０．１〜０．
８　ｃｍ１日。

（５）ＰＤＡ培地（ポテト・グルコース培地）生育は中
程度で、淡黄色を帯びた白色の綿毛状の菌糸が伸長し、
周辺は無色の菌糸が伸展している。基菌糸は淡黄色で、
菌糸の平均生育速度は０．８ｃｍ／日。

（６）ＰＣＡ培地（ポテト・人参培地）生育は良くない
。透明感のある薄毛状および白色の柔毛状菌糸が伸長す
る。白色の気菌糸は上方に伸長し、先端に黒色胞子のう
を多数形成する。

基閑糸はやや淡黄色で、菌糸の平均生育速度は０．５〜
０．６ｃｍ７日。

（７）　Ｃｚａｐｅｋ寒天培地 生育は極めて悪く、寒天上に薄く拡がって灰白色を呈す
る。低温の方が良く生育する。菌糸の平均生育速度はお
そ＜０．１〜０．２　ｃｍ／日。

Ｃ２生理的性質 生育ＰＨ範囲は、ｐ　Ｈ４，０〜９．０　テアリ、ｐＨ
６，０〜７．０が最適である。生育温度範囲はｉｏ’ｃ
〜３０’Ｃであり、３４℃では生育しない。２０　’Ｃ
〜２５℃が最適である。

以上の諸性質よりこの菌株をムコール・ヒエマリス（Ｍ
ｕｃｏｒ　ｈｉｅ＋ｍａｌｉｓ）と同定し、微生物工業
技術研究所に微工研菌寄第１００２０号で寄託されてい
る。

前記使用微生物の培養に用いる培地組成は、通常の微生
物の培養に用いられるようなものであればどのようなも
のでもよい、炭素源としては、例えハ、クルコース、フ
コース、アラビノース、シュクロース、可溶性デンプン
、糖蜜、デキストリンなどのｕＭ賞、窒素源としてはペ
プトン、肉エキス、酵母エキス、カザミノ酸、コーンス
テイープリカー、各種アンモニウム塩、各種硝酸塩、尿
素などが挙げられる。無機塩としては、各種のすトリウ
ム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マンガン塩、マグネ
シウム塩、リン酸塩、硝酸塩などの塩類が用いられ、場
合によってはビタミン類などを、菌の生育を促進する目
的で添加してもよい。

培養は、培地を通常の方法で滅菌し、本発明の菌株を接
種し、２０〜３０℃，ｐ　Ｈ６，５〜７．０　テ２〜３
日間振とうまたは、通気撹拌により、好気的に行う。

（実施例） 本発明酵素は、以下の実施例により採取することができ
る。以下の実施例は、本発明の範囲を何ら限定するもの
ではない。

実施例１ グルコース０．５％、ペプトン０．５％、酵母エキス０
．５％を含む培地５００　ｍ／を、容４］２２の振とう
フラスコに分注し、１２０”ｃ、１５分間加圧滅菌した
後、同じ組成の培地で前培養したムコール・ヒエマリス
５Ｋ−３１４の菌株を５　ｍｌ接種し、２８℃１４日間
振とう培養した。培養終了後、が過により菌体を除き、
得られた培養炉液にｌ０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）で緩衝化したＣＭ−セルロースを１２当たり
２５ｇ加えて、４℃にて２時間撹拌した。樹脂を濾過に
より除いた後、その炉液に硫安を７０％飽和になるよう
に添加して、４℃で２〜３０間放置し、生成した沈でん
を１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶解
し、同緩衝液で一夜透析した。この透析内液を同緩衝液
であらかじめ平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−
６Ｂカラム（３，４Ｘ　６０　ｃ＋ｎ）に通し、吸着し
た酵素を０．３ＭＮａαを含む同緩ｆｆｊ液を用いて溶
出した。溶出された活性画分を集め硫安を８０％飽和に
なるように加え、４℃にて２日間放置した。生成した沈
澱を、１ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）に溶
解し、同緩衝液で一夜透析した後、この透析内液を同緩
衝液で平衡化したハイトロキシルアパタイトカラム（３
，ＯＸ　７．Ｏｃｍに通し、吸着した酵素を１００ｍＭ
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）で溶出した。溶出
された活性画分を集めて硫安を８０％飽和になるように
添加し、生成した沈澱を１０１ｍＭ’Ｊン酸緩衝液（ｐ
Ｈ７，０）に溶解した。この溶液を、あらかじめ同緩衝
液で平衡化したセファデックスＧ−２００カラム（１，
６Ｘ　１１４　ｃｍ）を用いてゲルｔｆｉ過を行った。

活性画分を集めて限外が過器で濃縮後、１０ｍＭリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ７，０）であらかじめ平衡化した
コンカナバリンＡ−セファロース４Ｂのカラム（１，Ｏ
Ｘ　４．５ｃｍ）に通し、同緩衝液で洗浄した後、１０
％のメチル−α−マンノシドを含む同緩衝液で酵素を溶
出した。活性画分を集めて限外濾過により濃縮し、精製
酵素標品を得た。

（発明の効果） 従来知られているｅｎｄｏ−β−Ｇ１ｃＮＡｃ　−ａｓ
ｅは、アスパラギン結合型ｔＪ！ｔｒｔの高マンノース
型と混合型には作用するが複合型糖鎖には作用しないも
の、（例えば、特開昭６ｌ−２６５０８８）高マンノー
ス型と複合型糖鎖に作用するが、複合型糖鎖には変性剤
の存在下でなければ作用しないもの等であった。

本発明のｅｎｄｏ−β−ＧｌｃＮＡｃ　−ａｓｓは、高
マンノース型や混合型のｔＪ！鎖のみならず、複合型糖
鎖にも作用し、しかも活性の発現に、２−メルカプトエ
タノールや界面活性剤のようなタンパク質変性剤を必要
としない、新規な酵素である。

この新規ｅｎｄｏ−β−Ｇ１ｃＮＡｃ　−ａｓｅは、本
発明者らによって土壌より単離されたムコール層の一菌
株Ｍｕｃｏｒ　ｈｊｅｍａｌｉｓから容易に採取するこ
とができ、かかる方法によって得られた本発明の酵素は
、癌細胞表面のｔ１！鎖の構造解析を含め、生体内の分
子識別現象解明のための有力な手段として、利用される
ことが大いに期待される。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明酵素の作用ｐＨ範囲を示す０−−０はク
エン酸−塩酸、ト→は酢酸、ムームはリン酸カリウム、
Ｌ−△はトリス−塩酸、０−仁はホウ酸の各緩衝液を示
す。 第２図は本発明酵素の安定温度範囲を示す。 出願人　　製鉄化学工業株式会社 代表者　増１）裕治 箋　１　ｌ Ｈ 兜２記 １　度 手続補正１こ（自発） 昭和６３年９月τ１日 １　事件の表示 昭和６３年特許願第１４００５５号 ２、発明の名称 エンド−β−Ｎ−アセチルグルコ サミニダーゼおよびその製造法 ３、補正をする者 事件との関係　　　　　特許出願人 〒６７５−０１ 住所　兵庫県加古郡播磨町宮西３４６番地の１（置０７
９４−３７−２１５１） ４、補正の対象　　　明細書 ５、補正の内容 明細書第７頁第１１行「（問題を解決するこめの手段）
」を「（問題を解決するための手段）」と訂正する。 以上

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）糖タンパク質のアスパラギン残基の結合する糖鎖
   に作用して、糖鎖のＮ，Ｎ′−ジアセチルキトビオース
   部分を特異的に加水分解しオリゴ糖を遊離する活性を持
   つエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ。
2. （２）アスパラギン残基に結合する糖鎖が高マンノース
   型、混合型のみならず、複合型にも作用する特許請求の
   範囲（１）記載のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミ
   ニダーゼ。
3. （３）アスパラギン残基に結合する糖鎖がシアル酸を含
   む複合型である特許請求の範囲（２）記載のエンド−β
   −Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ。
4. （４）アスパラギン残基に結合する糖鎖が、ペプチド、
   アミノ酸および天然の高分子タンパク質に結合した形で
   ある特許請求の範囲（１）記載のエンド−β−Ｎ−アセ
   チルグルコサミニダーゼ。
5. （５）酵素が作用する至適ｐＨがｐＨ６．０〜７．０で
   ある特許請求の範囲（１）記載のエンド−β−Ｎ−アセ
   チルグルコサミニダーゼ。
6. （６）４℃、４日間の保持条件において、酵素の安定ｐ
   Ｈ範囲がｐＨ７．０〜８．０である特許請求の範囲（１
   ）記載のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
   。
7. （７）ｐＨ７．０、１０分間の保持条件において、酵素
   の安定温度範囲が４０℃までである特許請求の範囲（１
   ）記載のエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
   。
8. （８）ゲルろ過法で測定した酵素の分子量が９５，００
   ０〜１０５，０００である特許請求の範囲（１）記載の
   エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ。
9. （９）ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属に属し、エンド−β−
   Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼを生産する能力を有す
   る微生物を該微生物が生育しうる培地に培養し、培養物
   より目的物を採取することを特徴とするエンド−β−Ｎ
   −アセチルグルコサミニダーゼの製造方法。
10. （１０）微生物がムコール・ヒエマリス（Ｍｕｃｏｒｈ
    ｉｅｍａｌｉｓ）である特許請求の範囲（９）記載の製
    造方法。