JPH01287084A

JPH01287084A - リボフラビン−５′，−ホスフエートの塩の精製法

Info

Publication number: JPH01287084A
Application number: JP1078692A
Authority: JP
Inventors: Walter Dobler; ワルター・ドーブラー; Manfred Eggersdorfer; マンフレート・エツゲルスドルフアー; Joachim Paust; ヨアヒム・パウスト
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1988-03-31
Filing date: 1989-03-31
Publication date: 1989-11-17
Anticipated expiration: 2014-02-10
Also published as: EP0336214B1; EP0336214A1; JP2856760B2; US4987229A; DE3810957A1; DE58901065D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、リボフラビン−５７−ホスフェート（５′−
７ラビンモノヌクレオテド、したがって以下５’　−Ｆ
ＭＮと呼ぶ）の塩、特にリボフラビンをホスホリル化し
、得られたリボフラビンー５′−ホスフェートを水性塩
基と反応させることにより得られる市販の５’　−ＦＭ
Ｈのモノナトリウム塩の精製法に関する。

５’　−ＦＭＮは、生体内の種々の酵素反応の補酵素と
して重要な役割を果たし、したがってその塩の形で、特
にナトリウム−５’−ＦＭＮＯ形で医薬、食品及び飼料
の添加物として用いられる。

ナトリウム−５’　−ＦＭＮは、ビタミンＢ２−欠乏症
に対する治療剤として用いられるフラビン−アデニンジ
ヌクレオチドのための出発物質としても役立つ。

ナトリウム−５’　−ＦＭＮは工業的には、一般にリボ
フラビンをホスホリル化剤例えば部分的に水酸化された
塩化ホスホリルと反応させ、次いで得うれたフラビン−
５７−ホスフェートを苛性ソーダ溶液で処理することに
より得られる。したがってこのものは不純物として、未
反応リボフラビン、異性体のりボフラビ／モノヌクレオ
チド例えば２′−謳及び４′−団ならびにリボフラビン
ジヌクレオチド（５’、４’　−ＦＤＮ及び５’、　３
’−−ＦＤＮ　）及びポリリン酸塩を約５〜３０％含有
する。５’　−ＦＭＮのみが水溶性リボフラビンの生理
的活性形であり、すなわち異性体のリボフラビンモノホ
スフェート及び−ポリホスフェートはビタミンＢ２−活
性を示さない。したがってできるだけ高い百分率比の５
’　−ＦＭＮを有する製品が重要である。同様に未反応
リボフラビンの高い含量は好ましくない。なぜならばこ
れは、この製品から安定な透明な均質な水溶液を製造す
る妨げとなるからである。市販の調製物は、「高純度ナ
トリウム−５’　−ＦＭＮ　ｊとして言明されている場
合にも、一般に７４％以下のナトリウム−５’　−ＦＭ
Ｎを含有する。少なくとも７０％のナトリウム−５’　
−ＦＭＮ及び最高で５％のリボフラビンを含有する市販
製品、ならびに少なくとも８０％のナトリウム−５’　
−ＦＭＮを含有し、未反応のリボフラビンを含有せず、
そして副生物として異性体モノホスフェートのみを含有
する高純度の市販製品が望ましい。

技術水準：リボフラビンのホスホリル化によるすべての既知のモノ
ナトリウム−５’　−ＦＭＮの製法においては、かなり
の量の未反応リボフラビン、ならびに副生物としての異
性体の七ノー及びポ１７　リン酸塩を含有する粗生成物
が最初に得られる。

水に良く溶解する生成物（これから安定な溶液を製造で
きる）を得るためには、リボフラビン含量を本質的に減
少させることが絶対に必要である。そうしないとリボフ
ラビン含量に応じて多少とも速やかに溶液の混濁が生ず
る。

Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、　Ｎｏｖ
、　１９５４　＋　１２０頁以下によれば、製造工程に
おいて５’−ＦＭＮを富化することが知られており、こ
の場合はこれを冷水溶液中でエタノールアミンによりモ
ノ塩として数回溶解させ、そして濾過により不溶のリボ
フラビンを分離する。続くエタノールによる沈殿に際し
て、５’　−ＦＭＮが富化された形で得られる。しかし
精製度が不完全であるので、工程を数回繰り返すことが
必要である。この方法の他の欠点は、不溶のりボ７ラピ
ンを濾過するために高価な濾過装置を必要とすることで
ある。

なぜならばリボフラビンがきわめて微細な結晶の形で沈
殿するからである。そのほか、この際生成したアンモニ
ウム塩を他の段階でさらにナトリウム塩に変化させねば
ならない。したがってこの方法は煩雑で高価であり、そ
して大量の溶剤消費と結付いている。

さらにＣＡ８！ｌ　（１９７５）７９５５１ａによれば
、ナトリウム−５’　−ＦＭＮを活性炭に吸着させ、溶
離液中に存在するリボフラビン又はそのジホスフェート
を分離することによる、ナトリウム−５’　−ＦＭＮを
精製できることが知られている。

ナトリウム−５’　−ＦＭＮを続いて希ＮａＯＨ溶液で
溶離すると、強く希釈された溶液の形で得られる。この
方法では希望の生成物が吸着されるので、多量の吸着剤
が必要であり、これによりこの方法は工業的方法のため
には費用がかかりすぎる。

ＣＡ　１０４　（１９８６）１９４５３ｎによれば、異
性体モノホスフェートを特定の陰イオン交換体に吸着さ
せ、食塩溶液で溶離することによる精製法が知られてい
る。この方法の欠点は、きわめて大きい容積のイオン交
換体を必要とし、さらに生成物分画から追加的に他のイ
オン交換体によりＮａＣ１を分離する必要のあることで
ある。

さらにＤＥ−Ｏ８３２３０８９５によれば、５’　−Ｆ
ＭＮを弱塩基性の変性イオン交換体上でのクロマトグラ
フィにより精製できることが知られている。

この場合溶離液として、蟻酸及びＮａＣ１から成るｐＨ
３，８の緩衝液が必要である。したがってこの方法でも
、分離後に緩衝液を除去するための他の精製工程が必要
である。

５’−ＦＭＨの精製に関する、現在の技術水準の概要は
、Ｐ、　Ｎｌｅｌｓｅｎ等著”Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　
Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ。

Ｖｏｌ、１２２，２０９〜２２０　（１９８６）”及び
Ｒ，Ｈａｕｓｊｎｇｅｒ等著″Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ
ｙｍｏｌｏｇｙ　Ｖｏｌ。

１２２．１９９〜２０８　（１９８６）”の概要論文に
記載されている。

これらの文献には粗製５′−懇のシリカゲルＲ，Ｐ−１
８上での予備精製も記載されており、この場合は蟻酸ア
ンモニウム／蟻酸緩衝液により溶離する。その他の精製
法としては下記の方法があげられる。

ａ）緩衝系例えばインプロパツール／トリエチルアンモ
ニウムアセテートを用いるポリスチロールを基礎とする
イオン交換体、ｂ）緩衝系例えば炭酸アンモニウムを用
いるセルロースを基礎とするイオン交換体ならびにＣ）固定化されたフラボキナーゼ上でのクロマトグラフ
ィ。しかしこの方法は、高価な分離媒質のため、僅かな
可使用時間しか有さす、きわめて少量のためにしか適し
ない。

したがって本発明の課題は、ホスホリル化混合物から未
反応のリボフラビンを、既知方法の欠点なしに簡単な手
段で、できるだけ大部分除去することのできる５’−Ｆ
ＭＨの塩の精製法を開発することであった。これはでき
るだけ１個だけの精製段階において少量の精製助剤だけ
を用いることを意味する。

本発明の課題はさらに、リボフラビンが大部分精製され
た５′−関の塩を、できるだけ簡単な手段で市場に適合
した好ましい製品に変えることであった。これは、溶離
液として塩溶液又は緩衝液を使用しない後続のクロマト
グラフィ精密精製法の開発、あるいは好適な結晶化法を
意味する。

本発明者らは意外にも、ａ）ホスホリル化において得られる粗製５’−ＦＭＮ。

水、水酸化アルカリ又は窒素塩基特に苛性ンーダ溶液か
ら、所望により６０〜１００℃好ましくは４５〜５５℃
に加温して、４〜８好ましくは５．５〜６，５のｐＨ価
を有する約１〜１５重量％好ましくは約４〜６重量％の
均質な透明な粗製５’　＝　ＦＭＮ−塩の水溶液を製造
し、ｂ）得られる溶液を、不溶性の小球状の形の適宜な
重合体吸着剤樹脂（これは特別な機械的強度、マクロ網
状の多孔性、一様な孔径分布、大きな活性表面及び化学
的に均質なイオン化しない構造により優れており、そし
てポリスチロール／ジビニルベンゾール、アクリル酸誘
導体／ジビニルベンゾール又はメタクリル酸誘導体／ジ
ビニルベンゾールの共重合により製造される）を用いて
処理し、モしてＣ）その際得られる溶液から、未反応リ
ボフラビンが大部分精製された５’−ＦＭＮ−塩を単離
し、所望によりナトリウム−５’　−ＦＭＨに変え、そ
して所望によりこの溶液を次いでさらに精密精製に供給
するとき、リボフラビンをホスホリル化し、その際生成する未反応
リボフラビン、異性体のりボフラピンモノホスフエート
及び−ジホスフェートカ夾雑しているリボフラビン−５
′−ホスフェート（５′−ＦＭＮ　）を、アルカリ水酸
化物又は窒素塩基特に苛性ソーダ溶液と反応させること
により得られる５’　−ＦＭＨの塩から、未反応リボフ
ラビンを大部分精製することができることを見出した。

均質な粗製５’　−ＦＭＮ−塩の水溶液を、適当な重合
体吸着剤樹脂が充填されたカラムに導通し、その際得ら
れる溶離液から精製された５’−ＦＭＮ−塩を分離する
か又は溶離液を続いて精密精製に供給するとき、本方法
を特に有利に行うことができる。

本発明方法に好適な重合体吸着剤樹脂は、特別の機械的
強度、マクロ網状（スポンジ構造様）の多孔性、一様な
孔径分布、大きな活性表面及び化学的に均質なイオン化
しない構造を有する市販の重合体であって、このものは
ポリスチロール／ジビニルベンゾール（非極性）、アク
リル酸誘導体／ジビニルベンゾール（極性）又はメタク
リル酸誘導体／ジビニルベンゾール（中等度の極性）の
共重合により製造され、一般に不溶性小球状の形で市販
されている。

アクリル酸誘導体とジビニルベンゾールの共重合により
製造された極性の吸着剤樹脂の使用が特に有利である。

なぜならばこの場合は再生が簡単に行われ、水による湿
潤の問題が生じないからである。好適な吸着剤樹脂とし
ては、例えばいわゆるＲｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ社のＸＡ
Ｄ−シリーズのアンバーライト特にアンバーライトＸＡ
Ｄ　−１１８０及びアンバーライトｘＡＤ−７があげら
れる。

吸着剤樹脂１１当り一般に２０ｇまでのリボフラビンが
吸着され−るが、ホスホリル化されたリボフラビンは好
適なｐＨ価において結合されない。

本発明方法は、特に有利には次のように実施される。ホ
スホリル化方法において得られる未反応リボフラビンを
約５〜３０重量％含有する粗製ダーＦＭＮを水中に懸濁
させ、この懸濁液を水酸化アルカリ又は窒素塩基特にＮ
ａＯＨにより、ｐＨ価を４〜８好ましくは５．５〜６．
５特に６となし、そして軽微に加温しながら粗製５’　
−ＦＭＮ−塩の溶液を製造する。この粗製５’−ＦＭＮ
は、所望によりホスホリル化において得られる残留水を
含有するフィルターケーキの形でも用いることができる
。

ｐＨ価の調整及びこれによる５’　−ＦＭＮ−塩の生成
は、原則的には全ての水酸化アルカリ又は好適な窒素塩
基を用いて行うことができる。しかし従来は市販のナト
リウム塩だけが市場で需要があるので、一般に苛性ソー
ダ液（これはそのほか特に安価な試薬である）が用いら
れる。

ＮａＯＨ以外の塩基を用いて操作する場合は、精製され
た５’−ＦＭＮ−塩を所望により続いてナトリウム−５
’　−ＦＭＮに変えなければならない。

水酸化アルカリとしては、好ましいＮａＯＨのほかにＫ
ＯＨ又はＬｉＯＨがあげられる。窒素塩基としては、例
えばＮＨ，ＯＨ１そのアルキル基が１〜３個の炭素原子
を有するアルキルアミン、ジアルキルアミン又はトリア
ルキルアミン、ならびにエタノールアミン、環状脂肪族
アミン例えばモルホリン又はピペリジンが用いられる。

得られた粗製ダーＦＭＮ−塩の溶液を、次いで吸着剤樹
脂を充填したカラムに導通する。

溶離液は吸着剤樹脂の容積負荷に応じて、０〜５％好ま
しくは０〜１％特にわずかに約０．５％の未反応リボフ
ラビン及び６５〜８０％の５′−ＦＭＮ−塩を含有する
。

吸着剤樹脂の再生は、ＮａＯＨ水溶液での洗浄により行
われる。このＮａＯＨ溶液の濃度は０．０１〜５モル好
ましくは約０．１モルである。リボフラビンは、こうし
てそのＮａ−塩の濃厚溶液の形で回収することができる
。

ＮａＯＨ水溶液による再生の際に得られる溶離液から、
例えば鉱酸例えばＨＣＩ、Ｈ２ＳＯ４又は有機の強酸例
えば修酸又は蟻酸で酸性化することにより、リボフラビ
ンを結晶の形で回収することができる。

きわめて複雑な組成の５’　−ＦＭＨの溶液からのリボ
フラビンの分離を、その溶液を適当な吸着剤樹脂床に迅
速に通過させることにより、きわめて選択的にかつ整然
と行うことができ、これにより技術水準による濾過困難
なリボフラビンの困難な分離に伴う費用のかかる多数回
の溶解及び沈殿の操作を省略できることは、全く予想外
のことであった。

本方法のその他の決定的な利点は、下記のとおりである
。

１、　有価生成物に比べて本質的に小さい量で含有され
るリボフラビンを、吸着剤樹脂により選択的に除去でき
ることによって、有価生成物である５′−団が吸着され
る既知の精製法におけるよりも本質的に少量の吸着剤樹
脂しか必要としない。

２、生成物溶液は、吸着剤樹脂の通過により僅かしか希
釈されない（最大希釈＝２　：　１　）。

３、　溶剤として水だけで操作することができ、これに
より溶剤を回収しなくてよい。

４、５０サイクル後にも吸着剤の計測できる変化は起こ
らないので、吸着剤カラムのきわめて長い可使用時間（
寿命）を期待できる。

５、　未反応リボフラビンを精製された濃厚な形で溶離
できるので、損失の少ない迅速な吸着−／脱着工程が可
能である。

さらに、充分な量の希釈されていない水溶液をクロマト
グラフィ処理するとき、吸着剤樹脂による処理好ましく
は吸着剤樹脂カラムの通過により、リボフラビンなほと
んど含有しない５′−ＦＭＮ−塩を水溶液として、アル
キル基により誘導された逆相シリカゲル上でのクロマト
グラフィにより、系にとって異種の塩溶液又は緩衝液を
併用しなくてもさらに精製できることは、予想外のこと
であった。これに対して希釈水溶液をこの手段で分離す
ることはできない。

したがって本発明の対象は、前記のようにして、吸着剤
樹脂による処理好ましくは吸着剤カラムの通過により得
られる、未反応リボフラビンが大部分精製された５’−
ＦＭＮ−塩を、１〜１５重量％好ましくは４〜６重量％
の乾燥物質を含有する４〜８好ましくは５．５〜６．５
特に約６のｐＨ価を有する水溶液の形で、１０〜３００
μ好ましくは２０〜２００μの範囲の粒子分画を含有す
るアルキル基により誘導される逆相（ＲＰ）シリカゲル
上で、カラムの床容積（ＢＹ）の５〜５０％好ましくは
８〜２０％の最小量において、溶離剤としての水又は水
と低級脂肪族アルコールとの混合物（アルコール含量０
〜８０％）を用いて加圧下にクロマトグラフィ処理する
ことを特徴とする、リボフラビンをホスホリル化し、そ
の際生成するリボフラビン、異性体のリボフラビンモノ
ホスフエート及び−ジホスフェートカ夾雑しているリボ
フラビン−５７−ホスフエートを、水酸化アルカリ又は
窒素塩基好ましくは苛性ンーダ溶液と反応させることに
より得られる５’　−ＦＭＮ−塩の精製法である。

この操作段階における乾燥物質と分離材料の比は、１：
２００ないし１ニア好ましくは１：２５ないし１：１５
特に約１：２０である。

溶離材としては、市販の前記の粒子分画を有するアルキ
ル基により誘導されたＲＰ−シリカゲルが用いられる。

既知の好適な市販のＲＰ　−シリカゲルは、２０〜４５
μ又は３０〜７０μの粒子分画を有する。その例として
は、シリカゲル−ＲＰ−８、シリカゲル−ＲＰ−１２及
びシリカゲル−ＲＰ　−１８例えば０ｒｐｒｅｎ社のＨ
Ｄ　−３ＩＬ−ＲＰ−１８があげられる。

低級脂肪族アルコールとしては、本発明によれば例えば
メタノール、エタノール、インプロパツール及びエチレ
ングリコールがあげられ、メタノールの使用が特に有利
である。

前記の条件下で、得られるリボフラビンはシリカゲルに
吸着される。この精密精製のためにリボフラビン含量が
１％以下の５’−ＦＭＮの溶液を用いる場合には、精製
の品位の変化なしに、互いに連続する多くの分離を行う
ことができる。

断続的クロマトグラフィ工程ののち、吸着されたリボフ
ラビンを、多量のアルコールを含有する溶剤例えば６０
％水性メタノールで洗浄することにより、比較的簡単に
溶離することができる。

５’　−ＦＭＮとその副生物との本来のクロマトグラフ
ィ分離は、より少ないアルコールすなわち１〜２０％好
ましくは約１０％のアルコールを含有する水／アルコー
ル混合物により行われる。

例えばシリカゲルＨＤ−８ＩＬ−ＲＰ　１８　（２０〜
４０μ）及びメタノール／水＝ｌＯ：９０の混合物を用
いると、下記の分画が得られる。

１、　ポリホスフェート、ジホスフェート及び３′−Ｆ
囲を含有する前分画、２．３’−ＦＭＮ、　４’−関及び４’ｔ　５’　−Ｆ
ＤＮのほか、５’　−ＦＭＮ　７０−８５％を含有する
第２分画、ならびに３．４’−ＦＭＮ及び２’　−ＦＭＮのほか、５’−Ｆ
ＭＮを〉９０％含有する主分画。溶離液のピークの第２
の半分（ピークの後半分）中には、１−ＦＭＮを３％含
有する９７％５’　−ＦＭＮが存在する。

したがってこのクロマトグラフィ精密精製工程により、
９１％までの純粋な５’　−ＦＭＮを得ることができる
。

クロマトグラフィにおいて溶離液として用いられる水／
アルコール混合物は、等濃度すなわち一定の溶剤比率で
又は連続的に変化する溶剤比率（勾配溶離）で用いるこ
とができる。例えば水中のメタノールが０％から３０％
に増加する溶離剤で溶出することにより、きわめて良好
な分離を達成することができる。

この予備クロマトグラフィ分離のために緩衝液を必要と
しないことは、予想外のことであった。他のすべての条
件を守り、ただし分析量だけの５’−ＦＭＮ溶液を用い
ると、分離は達成されない。充分な量の分離混合物を装
入する場合に、装入原料溶液の特定のｐＨ価を保持する
と、系が緩衝されることは、意外である。これによって
、本方法の大きな利点、すなわち異種の緩衝液を使用せ
ずに操作できるという利点が生ずる。

緩衝液は高価であり、除去が困難である。緩衝液は他の
操作段階で有価生成物から除去しなければならず、その
際に有価生成物が失われ、廃水の問題が生じる。この方
法の他の大きな利点は、水又は低濃度のアルコールを溶
剤として用いて操作できることである。

もちろん、他の方法で製造された、未反応のリボフラビ
ンが大部分精製された粗製５’　−ＦＭＮ−塩の溶液も
、前記の方法により精製できる。

したがって本発明の対象は、ナトリウム−５′−ＦＭＨ
の溶液を、１０〜３００μの範囲の粒子分画を有するア
ルキル基により誘導されたＲＰ−シリカゲル上で所望に
より加圧下にクロマトグラフィ処理し、その際１〜１５
重量％好ましくは４〜６重景％の乾燥物質濃度を有する
、水中の又は水と低級脂肪族アルコールからの混合物（
アルコール含量０〜８０重量％）中の４〜８のｐＨ価を
有する溶液を、シリカゲルの床容積の５〜５０％好まし
くは８〜２０％の最小量において、溶離剤としての水又
は水と低級脂肪族アルコールからの混合物（アルコール
含量０〜８０重量％）を用いてクロマトグラフィ処理す
ることを特徴とする、リボフラビンが大部分除去されて
おり、異性体の蜘嚇フラビンモノヌクレオチド及びフラ
ビンジヌクレオチドが夾雑しているモノナトリウム−リ
ボフラビン−５′−ホスフェートの予備精製法である。

さらに本発明の対象は、前記のようにして適宜な吸着剤
樹脂を用いる処理により得られる、未反応リボフラビン
が大部分精製された５’　−ＦＭＮ−塩を、４〜８好ま
しくは５．５〜６のｐＨ価を有する水溶液の形で、２０
〜１００℃好ましくは４０〜６０℃の温度で５′−闇が
晶出するまで蒸発濃縮し、結晶懸濁液を好ましくは約２
０℃に冷却し、結晶性５′−簡一塩を分離し、そして母
液を、所望により新たな蒸発濃縮及び第２の結晶の単離
ののち、製造工程に返送することを特徴とする、リボフ
ラビンをホスホリル化し、その際生成する未反応リボフ
ラビン、異性体のリボフラビンモノホスフエート及び−
ジホスフェートが夾雑しているリボフラビン−５７−ホ
スフェートを、水酸化アルカリ又は窒素塩基特に苛性ン
ーダ溶液と反応させることにより得られる５’　−ＦＭ
Ｎ−塩の精製法である。

技術水準によれば、ナトリウム−５’　−ＦＭＮを水溶
液から５〜６．５のｐＨ価で、エタノールの添加によっ
ても沈殿させることができる。この際特にジホスフェー
トが溶液中に残る。

本発明による結晶化は前記の技術水準に比べて下記の実
質的な利点を有する。

１、　ホスホリル化工程に由来する無機塩例えばＮａＣ
１又は燐酸ナトリウムがいずれの場合も溶存するので、
常に仕様に適合する生成物が得られる。

２．５′−闇一塩は優先性をもって、４’　−ＦＭＮ−
塩は若干小さい優先性をもって、−七してなお存在する
場合は一リボフラビンも結晶化するが、３’　−ＦＭＮ
は大部分、そしてジホスフェートはほとんど完全に母液
中に留まる。

母液から、部分的加水分解及び酸触媒的転位によって、
さらにダー関−塩を製造できる。

６、　きわめてきれいな結晶が生成し、すなわち好適な
冷却により、これは容易に濾過して洗浄できる製品に適
合した結晶を製造できる。

４、使用溶剤の水は安価であり、そして仕上げ処理の問
題を除くことができる。

５、　ジホスフェートの返送及び異性体フラビンモノヌ
クレオチドの異性化が可能であることにより、一方では
全体として５’−ＦＭＮが最大収率で得られ、他方では
廃水は有機炭化物によりあまり負荷されない。

蒸発結晶化のこの条件下で所定のｐＨ価において、ダー
関−塩又はリボフラビンの加水分解が起こらないことは
、予想外のことであった。

さらに予想外のことは、この条件下で５７−蘭を大部分
富化することができ、こうして結晶化段階により、型に
適合した生成物が得られることである。

本発明方法を用いると、リボフラビンのホスホリル化に
より得られる５’　−ＦＭＮから、簡単な手段で未反応
リボフラビン、異性体のＪＪ＝＝Ｍフラビンモノヌクレ
オチド及びフラビンジヌクレオチドを大部分精製するこ
とができる。

実施例１Ｒｏｈｍ　＆　Ｈａａｓ社製の吸着剤樹脂ＸＡＤ　−７
が充填された直径９ｃｍ、床容積（Ｂｖ）２１のカラム
に、順次にａ）　　リボフラビンのホスホリル化により得ら゛れ、
ＮａＯＨによりｐＨ＝　６にした第１表に示す組成を有
する５％溶液２１゜ｂ）水２１゜ｃ）　　０．ｌｍ−ＮａＯＨ水溶液１１及びｄ）水２１
をポンプ供給した。

溶離液はｐＨ−ゾンデ及びＵＶ−検出器により制御した
。

ＵＶ−吸収が最高値の１０％になるまで溶離液を集めた
。その際第１表に示す組成の溶離成約２１が得られた。

続く再生の際に別に集めた溶離液は、ＮａＯＨ溶液によ
りイオン交換体から溶離されたリボフラビンを濃厚な形
で含有していた。ＵＶ−制御により、できるだけ濃厚な
リボフラビン溶液が得られた。これを次いでＨＣＩ又は
ＨＣＯＯＨで酸性化し、５分間沸騰加熱し、沈殿を戸別
し、中性に水洗して乾燥した。こうして吸着されたリボ
フラビンの約８５％が、約９８％の純度の生成物として
回収された。

第　　１　　表Ｉ　２０．８６４．５１４．４　０．６８０．３１９．
ＩＩＩ　１８．９５７．９２３．９　０．５７６．０２
３．５Ｉｌｌ　１４．５６０．１２５．４　０．０７４
．５２５．７実施例２実施例１と同様に操作し、ただしイオン交換体ＸＡＤ−
７の代わりに同社のイオン交換体ＸＡＤ−１１８０を用
いた。その際下記の結果が得られた。

第　　■　　表ＩＶ　１６．２６６．３１７．５　１．８７４．３２２
．９実施例３（第３請求項による精密精製）内径６０ｃｒｎのクロマトグラフ用カラムに、メタノー
ル／水（１０／９０）中のＯｒｐｒｅｇｅｎ社製シリカ
ゲルＨＤ　−５ＩＬ−ＲＰ　１８　（２０〜４５μ）を
、１５ｃｒｎの高さに充填した。次いで実施例１と同様
に吸着剤で処理し、５重量％の乾燥物質（ＴＳ）の濃度
にした６のｐＨ価を有する５’−ＦＭＮ水溶液を、Ａ、１０００１００Ｏ，ｔＢＹ）及びＢ、２０００ｍＡ’（０，２Ｂｖ）の脩でその上に供給し、そしてメタノール／水（１０／
９０）を用いてクロマトグラフ処理した。

溶離液を、５３０　ｎｍでのＵＶ−吸収の測定により調
べ、溶離液ダイヤグラムにより３つの分画を集めた。第
１及び第２の分画はＢＶの約１７３で、第３分画は約２
　ＢＶであった。用（・た５′−ＦＭＮ溶液及び得られ
た分画をＨＰＬｃ　（Ｈｙｐｅｒｓｉｌ−ＯＤＳ　ＲＰ
−１８；　０．１　ｍ蟻酸アンモニウム／蟻酸；ｐＨ＝
＆９；２４％メタノール；ＵＶ＝４３５　ｎｍ　）によ
り調べた。用いた５’　−ＦＭＮ溶液、ならびにｏ、ｔ
Ｂｖ（Ａ）又は０．２　ＢＹ　（Ｂ）出発溶液ノ供給後
に得られた３分画の組成を、第■表に示す。有価分画（
分画■及びｍ）を６０℃で回転蒸発装置で蒸発濃縮し、
２０℃に冷却した。結晶析出した生成物を吸引濾過し、
氷水で後洗浄した。

実施例４リボフラビン７０ｇをＰＯＣｌ３・Ｈ２Ｏによりホスホ
リル化することにより得られた５’　−ＦＭＮ溶液を、
ＮａＯＨによりｐＨ価５．５及び濃度５重量％となし、
実施例１と同様に吸着剤床（ＸＡＤ　−７）に誘導した
。これにより未反応リボフラビンが大部分除去された５
’　−ＦＭＮ溶液が得られた。その組成を第■表に示す
。こうして得られた溶液を約５０℃で蒸発濃縮した。そ
の際過飽和溶液２００ｇが得られ、これからすでに温時
に５′−ＦＭＮが高純度で結晶析出した。この結晶懸濁
液を約２０℃に冷却して濾過し、結晶を少量の氷水で洗
浄した。その際第Ｖ表に示す組成の第１結晶６２ｇが得
られた。

涙液を約５０℃で約１００ｙにさらに濃縮して約２０℃
に冷却することにより、第■表に示す組成の第２結晶２
０ｇ及び母液が得られた。

得られた第２結晶を最初の結晶化に返送し、母液をホス
ホリル化工程に返送した。

第■表結晶化前　第１結晶　　第２結晶　　母液の溶液

Claims

【特許請求の範囲】１、リボフラビンをホスホリル化し、その際生成する未
反応のリボフラビン、異性体のリボフラビンモノホスフ
ェート及び−ジホスフェートが夾雑している粗製リボフ
ラビン−５′−ホスフェート（５′−ＦＭＮ）を、水酸
化アルカリ又は窒素塩基と反応させることにより得られ
るリボフラビン−５′−ホスフェートの塩を精製し、そ
の際ａ）ホスホリル化において得られる粗製５′−ＦＭ
Ｎ、水、水酸化アルカリ又は窒素塩基から、所望により
３０〜１００℃に加温して、４〜８のｐＨ価を有する約
１〜５重量％の均質な透明な粗製５′−ＦＭＮ−塩の水
溶液を製造し、ｂ）得られる溶液を、不溶性の小球状の
形の重合体吸着剤樹脂（これは特別な機械的強度、マク
ロ網状の多孔性、一様な孔径分布、大きな活性表面及び
化学的に均質なイオン化しない構造により優れており、
そしてポリスチロール／ジビニルベンゾール、アクリル
酸誘導体／ジビニルベンゾール又はメタクリル酸誘導体
／ジビニルベンゾールの共重合により製造される）を用
いて処理し、そしてｃ）その際得られる溶液から、未反
応リボフラビンが大部分精製された５′−ＦＭＮ−塩を
単離し、そして所望によりこの溶液を次いでさらに精密
精製に供給することを特徴とする、リボフラビン−５′
−ホスフェートの塩の精製法。２、吸着剤樹脂としてアンバーライトＸＡＤ−１１８０
又はアンバーライトＸＡＤ−７を使用することを特徴と
する、第１請求項に記載の方法。３、吸着剤樹脂を用いる処理により得られる、未反応リ
ボフラビンが大部分精製された５′−ＦＭＮ−塩を、乾
燥物質１〜１５重量％を含有する４〜８のｐＨ価を有す
る水溶液の形で、アルキル基により誘導された１０〜３
００μの範囲の粒子分画を有するＲＰ−シリカゲルのカ
ラムの床容積の５〜５０％の最小量において、溶離剤と
しての水又は水と低級脂肪族アルコールからの混合物（
アルコール含量０〜８０％）を用いて、クロマトグラフ
ィ処理することを特徴とする、第１請求項に記載の方法
。４、吸着剤樹脂を用いる処理により得られる、未反応リ
ボフラビンが大部分精製された５′−ＦＭＮ−塩を、４
〜８のｐＨ価を有する水溶液の形で、２０〜１００℃の
温度で５′−ＦＭＮ−塩が晶出するまで蒸発濃縮し、結
晶懸濁液を約２０℃に冷却し、結晶性５′−ＦＭＮ−塩
を分離し、そして母液を、所望により新たな蒸発濃縮及
び第２の結晶の単離ののち、製造工程に返送することを
特徴とする、第１請求項に記載の方法。５、ナトリウム−５′−ＦＭＮの溶液を、１０〜３００
μの範囲の粒子分画を有するアルキル基により誘導され
たＲＰ−シリカゲル上で所望により加圧下にクロマトグ
ラフィ処理し、その際１〜１５重量％好ましくは４〜６
重量％の乾燥物質濃度を有する、水中の又は水と低級脂
肪族アルコールからの混合物（アルコール含量０〜８０
重量％）中の４〜８のｐＨ価を有する溶液を、シリカゲ
ルの床容積の５〜５０％の最小量において、溶離剤とし
ての水又は水と低級脂肪族アルコールからの混合物（ア
ルコール含量０〜８０重量％）を用いてクロマトグラフ
ィ処理することを特徴とする、リボフラビンが大部分除
去されており、異性体のフラビンモノヌクレオチド及び
フラビンジヌクレオチドが夾雑しているモノナトリウム
−リボフラビン−５′−ホスフェートの予備精製法。