JPH01269497A - Ｌ−セリンの製造方法、およびそれに用いる粗酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は酵素反応によるし一セリンの製造法、及びセリ
ンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を有しセリ
ン分解酵素を選択的に失活させたＬ−セリン合成用粗酵
素に関する。

（従来の技術） Ｌ−セリンは医薬品、化粧品、化学品原料等に利用され
るアミノ酸であり、近年、セリンヒドロキシメチルトラ
ンスフェラーゼ産生能を有する大腸菌やクレブシェラ属
細菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）を酵素源とする酵素反応
によりグリシンとボルムアルデヒドからＬ−セリンを選
択的に製造する方法が注目を浴びている（特開昭６２−
１９０９２、特開昭６２−１７２２９３、Ｂｉｏｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ　ａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖ０＋、ＸＸ■　　１５１０−１５１８　（、＋９８６
）等）。しかし、細菌は一般にセリンを窒素源とＩノで
用いる能力を有しているため、セリンの合成と並行して
セリンの分解も行われる。そのため−旦産生じたセリン
が分解し、その結果として、セリンの収率が低くなる。

そこで、セリンの収率向上のためにセリン分解活性を欠
失している菌株を選択して用いる必要があったが、その
ような菌株は一般的でなく、また育種も容易ではない。

（発明が解決しようとする問題点） そこで木発明者らはかかるセリンの製造法、それに用い
る粗酵素に関する問題点を解決すへく鋭意努力した結果
、セリン分解活性を実質的に有しない菌株を酵素源とし
て用いなくとも、特定条件下での簡単な処理によりセリ
ンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性が実質的に
低下することなく夾雑するセリン分解酵素か失活した粗
酵素か得られることを見い出し、ざらにこの粗酵素を用
いることて）−−セリンを効率的に製造し得ることを見
い出し、本発明を完成するに到った。

（問題点を解決するための手段） かくして本発明によれは、第１の発明として、グリシン
とボルムアルデヒドを原料とする酵素反応によりＬ−セ
リンを製造する方法において、酵素源としてセリンヒド
ロキシメチルトランスフェラーゼ産生能を有する細菌の
培養液、菌体、または菌体処理物をクリシン存在下で熱
処理して得られる粗酵素を用いることを特徴とするし一
セリンの製造法か提供される。

また、第２の発明として、セリンヒトロギシメチルトラ
ンスフコ：ラーセ産生能を有する細菌の培養液、菌体、
または菌体処理物をクリシン存在下で熱処理して得られ
るし一セリン合成用用酵素か提供される。

本発明（ごおいて用いられる細菌はセリンヒドロキシメ
チルＩ・ランスフェラーゼ産生能を有する細菌であれは
、自然界から分離されたものでも、突然変異誘導等の手
法で育種されたものでも良く、エシェリヒア属、クレブ
シェラ属、シュードモナス属、コリネバクテリウム属、
プロテウス属、ミクロバクテリウム属、ザルモネラ属、
バチルス属）等に属する細菌、例えは、エシェリヒア・
コリＡ、　Ｔ　ＣＣ’＋　１５７、クレブシェラ・アエ
ロケネス　ＡＴＣＣ１３８８２、シ］、　−）モナス−
ブチグ　ＡＴＣＣ７９５、コリネハクテリウノ、・クル
タミカム　Ａ′ＦＣＣｌ３０３２、ブ［コブウス・レト
ゲリ　ＡＴＣＣ９２５０、ミク〔１ハソテリウノ、・オ
ーラム　ＡＴＣＣ２３０７０、ザルモネラ・ティフィム
リアム　ＡＴＣＣ７８２３、バチルス・ステアロサーモ
フィルス　ＩＦＯ１２５５０等が挙げられるが、特に、
セリンヒ！・ロキシメチルトランスフエラーゼを司るｇ
１ｙＡ遺伝子を遺伝子刊み換え手法ζ；二より菌体に導
入しセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ産生能
を向上させた大腸菌が賞月される。大腸菌のｇｌ）ＩＡ
遺伝子はすてにその塩基配列か決定されているため（ｇ
ｅｎｅ　　２７　１１？−５４（１９８４）　）、ｇｌ
ｙＡ遺伝子を改めてクローニングし発現ヘクターに絹み
込んてＥ。

ｃｏｌｉ　Ｃ６００やＥ、ｃｏｌｉ　ＪＭＩ０３等を形
質転換しセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ産
生能を向上させた大腸菌を育種することは容易に実施し
得る。

本発明において用いられる細菌の培養に使用する培地に
特に制限はなく、使用菌株の利用し得る炭素源、窒素源
、無機塩類、有機栄養物、さらに必要に応じ抗生物質等
を含有した培地であれは良い。培養条件は、使用菌株に
好適な条件であれは良く、大腸菌を用いる場合は、通常
、好気的条件下、培養温度２５〜４０℃、培養液のρ１
１６〜８で行われる。

本発明では、このようにして得られた培養液、培養液を
遠心分離や濾過等を行って集菌した菌体、菌体に適当な
処理を施して得た菌体抽出物、または抽出物より得られ
る分画両分、あるいは菌体、菌体抽出物、菌体抽出物の
分画両分を常法により吸着、または共有結合等の手段で
適当な担体に固定化させたもの等を、クリシン存在下で
熱処理することによりセリン分解酵素の失活が行われる
。

菌体抽出液を得る方法としては、菌体の機械的破壊、超
音波処理、凍結融解処理、酵素処理等を採用することが
できる。

かくして得られた酵素源のグリシン水溶液中での熱処理
は、通常、グリシン濃度０．０１〜２５％、好ましくは
０．１〜５％、処理温度は４０〜１００℃、好ましくは
５０〜７５°Ｃ１処理時間０．５〜９０分、好ましくは
５〜４５分の条件で行われる。グリシンの濃度が低すぎ
ると粗酵素のセリンヒドロキシメチルトランスフェラー
ゼ活性か低下し、逆に濃度が高すぎるとグリシンか熱処
理液中で析出するためそれを除去する操作が必要となる
。また、温度か低く処理時間も短いと粗酵素に含まれる
セリン分解酵素か失活せず、温度か高く処理時間が長ず
ぎるとセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性
を低下させる。セリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼ活性の低下の有無を調べるためには、粗酵素液の一
部を採取し、フェニールセリンを用いるセリンヒドロキ
シメチルトランスフェラーゼ活性測定を行えは良い。

本発明においては、かくして得られた粗酵素を触媒とし
て用いること以外、常法に従ってクリシンとボルムアル
デヒドからし一セリンが合成される。反応は通常、ｐ１
１６〜９、温度２０〜６０℃、クリシン濃度は０．１〜
２５％、ホルムアルデヒド濃度は０．１〜３０ｍＭ、好
ましくは１〜１５ｍＭの条件で行われる。ボルムアルデ
ヒドの濃度が低すきると反応が進まず、濃度が高ずきる
とセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ活性を低
下させる。グリシン、ホルムアルデヒドは、反応開始時
に全量添加しておいてもよいか、反応の進行に応じて濃
度を一定に保つよう添加していくことが好ましい。なお
、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼは補酵素
としてテトラヒドロ葉酸とピリドキザルリン酸を要求す
るので、テトラヒドロ葉酸０．０１〜１０ｍＭ、ピリド
ギザルリン酸帆０００１〜］ｍＭを反応系に添加するこ
とにより反応が高められることかある。

（発明の効果） かくして本発明によれは、セリン分解活性を実質的に有
さない細菌を選択し・て酵素源として用いなくとも、セ
リンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ ない粗酵素が提供され、これを触媒として用いるクリシ
ンとボルムアルデヒドからの効率的なし一セリンの製造
法が提供される。

（実施例） 以下実施例及び比較例、参考例により本発明を具体的に
説明する。

参考例　１ 本発明に用いることのできるセリンヒドロキシメチルト
ランスフェラーセ産生能を有する細菌は以下のようにし
て育種することができる。

制限酵素ＥｃｏＲ　Ｉて消化したＥ．ｃｏｌｉ　Ｃ６０
０株の染色体ＤＮＡを常法（Ｃｅｌ　ｌ　　ＩＬ　　６
８７　（１９７８）　）に従って調整した入ファーシヘ
クター　Ｃｂａｒｏｎ　２８（ＢＲＬ社製）を用いて常
法（ＤＮＡ　ｃｌｏｎｉｎｇｖｏｌ．Ｉ　　ａ　ｐｒａ
ｃｔｉｃａｌ　ａｐｐｒｏａｃｈ　　Ｅｄ己ｅｄ　ｂｙ
　Ｄ．Ｍ。

Ｇｌｏｖｅｒ）によりインビトロパッケージングし、Ｅ
。

ｃｏｌｉ　ＬＥ３９２　　（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　＆　
Ｇｅｎｅｒａｌ　ＧｅｎｅｔｉｃｓＬ５ｕ　　５３　（
１９７７）　’）に感染させて］、２Ｘ　１０６ｐｆｕ
（プラークフォーミングユニット）のＤＮＡライブラリ
ーを調製した。次いて、既に報告されているＥ．ｃｏｌ
ｉ　ｇ１ｙＡ遺伝子の塩基配列（ｇｅｎｅ　　２Ｌ１４
７−５４　　（＋９８４）　）を参考に作製した３２ｐ
末端ラベルの５　’　−　ＧＣＧＴＧＡＡＡＴＣＧＣＴ
ＧＡＣＡＧＣＡＴＣＧＧＴ−　３　’の配列を持つ合成
りＮＡプローブを用いて前記ＤＮＡライブラリーをブラ
ークハイプリダイセーション法（Ｓｃｉｅｎｃｅ　山＋
８９　（１９７？）　）によりスクリーニングし、ｇｌ
ｙＡ遺伝子を含むクローンを選択した。

クローニンクされたｇｌｙＡを含むＤＮＡ断片の制限酵
素切断点地図を第１図に示す。

このようにして得られたＤＮＡ断片を第１図に示す手順
（こ従って制限酵素ＨａｅｌｌＴとＰｖｕｌＩて切断し
約１．８ｋｂｐの断片として回収し、ＢａｍＨＩリンカ
−をＴ４リカーセを用いて連結させた後、制限酵素Ｂａ
ｍＨ　Ｉで切断し接着末端を生じさせ、ｔ１１〕プロモ
ーター・オペレーターをもつブラスミトノ＼クター１］
ＤＲ？２０　（ファルマシア社製）のＢａｍＨ　Ｔ切断
物とＴ４リカーセを用いて連結させｇｌｙＡ発現プラス
ミド１１　Ｔ　ｌ（　７　３　３を構築した。

こうして得られたｐＴ＋＜７３３を用いてＥ．ｃｏｌｉ
　Ｃ６００を常法（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅ
ｒｉｏｌｏｇｙ　　５，３　　１５４（１９７０）　）
により形質転換し、常法（　Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃｅ、［６
　　１８９　（＋９７７）　）により−ヒ記のＤＮＡプ
ローブを用いてコロニーハイフリタイセーションを行い
、強力なセリンヒドロキシメチルＩ・ランスフェラーゼ
産生能を有する大腸菌を育種した。

実施例　１ アンピシリン（５０μＢ　／　＋ｎＱ）を含んだし培地
（トリプトンｌｏｇ／Ｑ、イーストエキストラクトｇ／
　Ｑ，　　ＮａＯ８　５ｇ／　Ｑ　）　　ＩＱ　（こ参
考例１に示した大腸菌を植菌し、３７°Ｃで２時間震盪
培養し、インドールアクリル酸を最終濃度１００μｇ／
−になるように添加した。さらに２０時間培養を続けた
後、遠心分離し、　４．１ｇの湿菌を得た。こうして得
た湿菌を２０．４ｍＱの１％グリシン水溶液に懸濁し０
℃で５分間超音波処理し１２，０００ｒｐｍ、１０分間
の遠心分離で菌体抽出液を回収した。次いて、この抽出
液０．５−を試験管に移し水浴で６５℃、１０分間の熱
処理を行い粗酵素液を得た。

この粗酵素液は本発明で言う粗酵素である。

実施例　２ 実施例１で得た粗酵素液を用いてセリン合成反応を実施
した。反応液は、１Ｍリン酸バッファー（ｐＨ７，５）
　　１００μ２．２０％グリシン水溶液２５塵、０．４
５％ホルムアルデヒド水溶を夜２０ＯｆｌＵ、　０．３
％テトラヒドロ葉酸３３４塵、０．０１％ピリドキサー
ルリン酸１０縛、１４．４Ｍ　２−メルカプトエタノー
ル２塵、蒸留水２２９縛、粗酵素液１００１ｔ９からな
るものを使用し、３７℃で反応を行った。反応開始時な
らびに１６時間後の反応液のセリン量をアミノ酸分析器
（アトー社製）で分析したところセリン蓄積量は２６．
８／１ｍｏｌ　／　ｍＱであった。

比較例　１ 熱処理過程を省略する以外は実施例１とまったく同様に
操作して得た粗酵素を用いる以外は実施例２とまったく
同様に操作し、セリン量を測定したところ、セリンの蓄
積はわずか０．２ｍｏｌ／−に留まった。

実施例２との比較から、酵素源をグリシン存在下て熱処
理して得た粗酵素は、熱処理しない粗酵素に比較して、
ホルムアルデヒドとグリシンを基質とするＬ−セリンの
合成用粗酵素として優れていることが判った。

実施例　３ 実施例１と同様にして得た湿菌各１ｇを５ｍ９０１％グ
リシン水溶液、リン酸バッファー（１００，ｍＭ、ｐｔ
＋　６．８）に各々懸濁し０℃で５分間超音波処理し１
２．０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で菌体抽出液を
回収した。次いて、この抽出液を各々０．５＋ｎ９試験
管に移し、第１表に示す所定の条件下で７０℃の熱外＝
１２− 理を行い粗酵素液を得、各々のセリンヒドロキシメチル
トランスフェラーゼ活性を測定した。測定法は常法（Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　ｈａ　　２４　５３４３（
１９７７））に従い、セリンヒドロキシメチルトランス
フェラーゼによるフェニルセリンの分解によって生じる
ベンズアルデヒドの２７９ｎｍの吸収を測定することに
より実施した。結果を第１表に示す。

この結果から、セリンヒドロキシメチルトランスフェラ
ーゼ活性はグリシン存在下では熱処理による低下が抑制
されることが判った。

（以下余白） ＝１３− 第１表 たたし、表中のＳｔ−ＩＭＴ活性とはセリンヒＩ−ロキ
シメチルトランスフエラーゼ活性のことであり、各溶媒
条件の無処理の場合の活性を１００％とした値である。

実施例　４ 実施例１で得た粗酵素液３０ｍＱを、２０％グリシン水
溶ｔ＆５０ｄ、団リン酸バッファ　　（１）Ｈ７，５）
　１０ｍ１ｌ’、０．０１％ビリドキサルリン酸１．０
ｍ９、テトラヒドロ葉酸０．１ｇ、１４．４Ｍ　２−メ
ルカプトエタノール０．２ｍ！ＩＩの組成からなる反応
液に添加した。窒素気流下、３７°Ｃてマグネチックス
ターラーを用い、１１００ｒｐの速度で撹拌し、反応液
中のボルムアルテヒト濃度がｌ　ＯｍＭ程度を保つよう
に１０％ボルムアルテヒト水溶液をペリスタポンプによ
り添加した。

その結果７４．５時間の反応で８０ｍｍｏ　ｌのホルム
アルデヒドかフィートされ、反応液（最終液量約１００
艷）には７，７ｇのセリンか蓄積し、ホルムアルデヒド
とグリシンを原料とし酵素源をグリシン存在下で熱処理
して得た粗酵素を用いるし一セリンの製造法が優れてい
ることが判った。

【図面の簡単な説明】

第１図はセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ遺
伝子（ｇｌｙＡ）のトリプトファンプロモーターによる
発現ヘクターｐＴＫ７３３の作製工程を表している。図
中、ＳＤはＳＤ配列＋　８１／Ａはｇ１ｙＡ構造遺伝子
、　Ａｍｐ’はアンピシリン耐性遺伝子、Ｇａ１Ｋはカ
ラクト−スギナーセ遺伝子を示す。図の最」二部にはｇ
ｌｙＡを含んだファージベクターのｇｌｙＡ近傍制限酵
素切断点地図を示す。 特許出願人　日本七オン株式会社

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）グリシンとホルムアルデヒドを原料とする酵素反
   応によりＬ−セリンを製造する方法において、酵素源と
   してセリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ産生能
   を有する細菌の培養液、菌体、または菌体処理物をグリ
   シン存在下で熱処理し得られる粗酵素を用いることを特
   徴とするＬ−セリンの製造法。
2. （２）セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ産生
   能を有する細菌の培養液、菌体、または菌体処理物をグ
   リシン存在下で熱処理して得られるＬ−セリン合成用粗
   酵素。