JPH01157385A - α−アミラーゼインヒビター - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、穀物種子から精製される。または組換えＤＮ
Ａ技術により生産されるα−アミラーゼインヒビターの
調製に関する。このタンパクは発芽小麦中のα−アミラ
ーゼの主成分であるα−アミラーゼ■活性の阻害に有効
であり、従って１発芽したコムギから得られる粉のパン
製造における品質の改善に有用である。

（従来の技術） 発芽したコムギは２発芽していないコムギから得られる
粉に比較して、低品質であることはよく知られている。

そのような低品質の粉をパン製造に用いると、得られた
パンにはある程度の粘りがあり、そのため、そのような
パンの裁断にスライス装置を使用する場合にはめんどう
である。コムギの発芽は、デンプン分解酵素であるα−
アミラーゼ■の量の増加に関係している。

α−アミラーゼのレベルの増大はコムギの発芽に関連す
る主要因なので、α−アミラーゼ活性を低下させること
により発芽によるダメージを受けたコムギの粉による製
パン特性を改良することが可能であることが、いろいろ
な人々により示唆されている。多くの異なった物理化学
的因子（高温。

低ｐＨ）および化学的因子（界面活性剤２重金属。

キレート剤）がα−アミラーゼインヒビターまたは不活
性化剤の候補として研究されている。それには、　Ｍｅ
ｒｅｄｉｔｈ　ａｎｄ　Ｐｏｍｅｒａｎｚ、（１９８４
）、八ｄｖａｎｃｅｓｉｎ　Ｃｅｒｅａｌ　５ｃｉｅｎ
ｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　（Ｙ、Ｐｏｍｅ
ｒａｎｚ＆？）　、　２３９−３２０頁、　ＡＡＣＣ，
Ｓｔ、Ｐａｕｌ、ＭＮによる総説がある。

試験された多くの因子がα−アミラーゼの効果を抑制す
ることが見い出された。しかし、それらのうちのいくつ
かは、α−アミラーゼに影響を与えるのみならず、パン
製造に重要なグルテンタンパクの構造および機能の特性
を変化させ、パン製造の他の技術的特性の悪化をもたら
した。さらに。

食品添加物として研究されたα−アミラーゼインヒビタ
ーまたは不活性化剤のような種々の化学物質の適用は、
それらのうちのいくつかに、毒性があるため、制限され
る。従って、過剰なα−アミラーゼ活性を除くために発
芽したコムギの粉に安全に加えることのできる非毒性α
−アミラーゼインヒビターの適用が切望される。

（発明の要旨） 本発明は、α−アミラーゼインヒビターがオオムギのよ
うな穀物種子から単離することができ。

既知の方法による場合と比較して該タンパクを高収量で
精製して得られ得るという発見に基づく。

α−アミラーゼＩＩのインヒビターであるこのオオムギ
のタンパクは１発芽したコムギから得られる粉に加えら
れ、そしてそのタンパク含有粉はその後のパンの製造に
使用され、優れた性質のパンが調製され得ることもまた
。見い出された。

本発明に関するオオムギタンパクは２次の物理的および
化学的性質を有するα−アミラーゼ■インヒビターであ
る二分子量約２１，０００．および等電点ｐＨ７．２の
塩可溶性タンパクである；コムギα−アミラーゼ■とス
ブチリシン（ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ）　（バチルス　ス
ブチリス由来のアルカリプロテアーゼ）とを阻害する；
そして、ヒトのセリンプロテアーゼであるトリプシンお
よびキモトリプシンを阻害しない。このタンパクは自然
の起源から精製してもよく、あるいは組換えＤＮＡ技術
を用いて生産してもよい。

本発明の好適な実施態様によれば、穀粉タンパク、例え
ばオオムギタンパク（オオムギの粉から単離されたα−
アミラーゼ■インヒビターである）の単離および精製の
方法が提供される。この方法は、穀粉１例えばオオムギ
の粉を適切なｐ）Ｉ範囲の水系緩衝液で抽出し、粗イン
ヒビター抽出物を得。

そして得られた粗インヒビターをクロマトグラフィー法
により精製することを包含する。

本発明の他の面は、新規コムギ扮組成物であり。

この組成物は１発芽によるダメージを受けたコムギ粉に
α−アミラーゼインヒビターである穀粉タンパク、例え
ば上記オオムギタンパクが混合されたものを含有する。

上記穀粉タンパクは、過剰なα−アミラーゼ■活性を抑
制するための有効量が混合される。

本発明のさらに他の面は１発芽によるダメージを受けた
コムギの粉からパン製品を製造するための改良法であっ
て、該発芽によるダメージを受けたコムギの粉に、グル
テンタンパクに影響を与えることなく該発芽によるダメ
ージを受けたコムギの粉に存在するα−アミラーゼ■の
過剰な活性を抑制するのに有効な量の天然の非毒性α−
アミラーゼインヒビターを添加することを包含する。

第１図はオオムギα−アミラーゼインヒビターのアミノ
酸配列（Ｓｖｅｎｄｓｅｎら、す」刃刈１」朋」泣明（
１９８６）　５１　：　４３−５０）を示す。

第２図は、オオムギの品種（ｃｖ、）ポナンザ（Ｂｏｎ
ａｎｚａ）から分離しＣｕ−ＩＤＡ−セファロース６Ｂ
によるクロマトグラフィー、次いでＳ−セファロース　
ファストフロー（Ｓ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　
Ｆｌｏｗ）によるイオン交換クロマトグラフィーで精製
したα−アミラーゼ■インヒビターのドデシル硫酸ナト
リウム　ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＯ５−Ｐ
ＡＧＥ）の・パターンを示す。５Ｏ３−ＰＡＧＥは、　
Ｌａｅｍｍｌｉ（Ｎａｔｕｒｅ（１９７０）２２７　：
６８０−６８５）の不連続系を用いる勾配ゲル（１０〜
１８％）で非還元状態で行った。レーン１：オオムギイ
ンヒビター；　レーン２：標準分子量タンパクであり、
（下から上へ）ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、グ
ルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、ウシ
　カルボニックアンヒドラーゼ、およびダイズ　トリプ
シンインヒビター（Ｓｉｇｍａ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　
　Ｃｏｍｐａｎｙ＋　　Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ，ＩＪ
ＳＡ）。　　ル−ンあたり約１６μｇのタンパクをかけ
た。

第３図は、第２図において記載したように精製したオオ
ムギインヒビターの等電点電気泳動（ＩＥＦ）パターン
を示す。ＩＥＦは＋　Ｚａｗｉｓｔｏｗｓｋａ　ら、　
ＣｅｒｅｉａｌＣｈｅｍ（１９８８）６５　（印Ｈ１＋
中）、に従って行った。レーン１：オオムギインヒビタ
ー；レーン２：標準等電点タンパク（Ｐｈａｒｍａｓｉ
ａ　Ｃａｎａｄａ　Ｉｎｃ、、Ｄｏｒｖａｌ。

Ｃａｎａｄａ）であり、（上から下へ）トリプシノーゲ
ン、レンチルレクチン（それぞれの塩基性、中性。

酸性バンド）、ヒト　カルボニックアンヒドラーゼＢ、
ウシ　カルボニックアンヒドラーゼＢ、およびβ−ラク
トグロブリンＡ、ル−ンあたり約３０μｇのタンパクを
かけた。

■を　　するための　式 天然のα−アミラーゼインヒビターは、オオムギ、コム
ギ、ライムギ、トリティケール（ｔｒｉｔｉｃａｌｅ）
　＋および、おそらく他の穀類の胚乳に存在する低分子
量（〜２０，０００ダルトン）の塩可溶性タンパクであ
る。これらのタンパクは２発芽穀物種子の全α−アミラ
ーゼ活性の８４％を越える量を含む高等電点（６，０〜
６．５）α−アミラーゼの活性を阻害する。

オオムギおよびコムギから単離したインヒビターは、は
ぼ同一のアミノ酸組成を有しくＭｕｎｄｙら。

ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ（１９８４）１６７：　２１０−２
１４）、そしてそのアミノ酸配列は、　３ｖ６ｎｄｓｅ
ｎら、　（１９８６）　（前出）、およびＭａｅｄａ、
Ｂｉｏｃｈｅｍ　Ｂｉｏ　ｈ　ｓ　Ａｃｔａ（１９８６
）８７１：２５０−２５６、　　によりそれぞれ決定さ
れている。オオムギ中の抗α−アミラーゼ活性がコムギ
、ライムギ。

およびトリティケールのものより数倍高い（Ｗｅｓｅｌ
ａｋｅら、　Ｃｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ（１９８５）６２
：１２０−１２３）ので、オオムギが上記インヒビター
の好ましい起源である。

本発明の方法において用いられる水系緩衝液は。

好ましくは当該分野で既知のトリス−塩酸が好ましい。

トリスは、トリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン
の慣用名である。使用されるトリス塩酸緩衝液は、該溶
液のモル濃度に従って変更され得る。上記溶液のモル濃
度は、必要に応じて塩酸を加えることにより所望のｐＩ
Ｉの緩衝液に調製され得る。従って１例えば、オオムギ
粉の抽出工程において用いられるトリス−塩酸緩衝液は
、約０．０５Ｍから約０．１Ｍ、好ましくは約０．０５
Ｍの濃度であり。

一方、用いられるトリス−塩酸緩衝液のρ１１は、約５
．５から約８．０．　　好ましくは約５．５であり得る
。

クロマトグラフィー法による精製は１まず固定化金属ア
フィニティークロマトグラフィー、次いでイオン交換ク
ロマトグラフィーを用いる２段階で行われ得る。

アフィニティクロマトグラフィーは、を同一イミノニ酢
酸（ＩＤＡ）−非イオン性ゲル樹脂を用いて行われる。

そのような樹脂には１次の種類の樹脂が包含される：ハ
イオゲノＬ／Ａ−１，５Ｍ　（Ｒｉｏ−Ｒａｄ）、セフ
ァクリルＳ−３００，セファロースＣ１−６８，Ｃｌ−
４８，Ｃｌ−２Ｂ。

６Ｂ、　４Ｂおよびセファロース６　（Ｐｈａｒｍａｓ
ｉａ）、　　およびウルトロゲルＡｃＡ２２（Ｅ．ＫＢ
）　、マドレックスセルファインＧＬＣ２０００および
ＧＣ７００（Ａｍｉｃｏｎ、ＵＳＡ）、　　トヨパール
ＨＷ−６５Ｆ（Ｔｏｙｏ　５ｏｄａ、Ｊａｐａｎ）＋　
　）リスアクリルＧＦ２０００ＬＳ（ＩＢＦ、　Ｆｒａ
ｎ、ｃｅ）　、マクロソルブＫＧＡＸ、　Ｋ４ＡＸ。

およびに２ＡＸ（Ｓｔｅｒｌｉｎｇ　Ｏｒｇａｎｉｃｓ
、ＵＫ）、およびユーベルギットＣおよびＣＣ２５０Ｌ
（Ｒｏｈ　Ｐｈａｒｍａ、ＦＲＧ）。好ましくはマトリ
ックスとしては、セファロース６Ｂが用いられる。

イオン交換クロマトグラフィーとしては、カルボキシメ
チルセファロースおよびスルホネート（Ｓ）−セファロ
ースのような陽イオン交換マトリックスのカラムが用い
られ得る。Ｐｈａｒｍａｓｉａ社のＳ−セファロース（
ファスト　フロー）のような強陽イオン交換型が好適で
ある。

本新規コムギ粉組成物は１発芽によるダメージを受けた
コムギの粉にオオムギα−アミラーゼ■インヒビターを
混合したものを含有する。該粉中の上記インヒビターの
濃度は、コムギ粉１　ｋｇあたり約０．０２ｇから５ｇ
タンパクの範囲内が好ましい。

発芽によるダメージを受けたコムギの粉に加えるべき、
インヒビターとして用いられるタンパクの量は、コムギ
の発芽によるダメージの程度、つまり収穫前の日数（そ
の間に発芽が生じる）の間に生じるダメージの程度に本
質的に依存することを理解すべきである。１　ｋｇのコ
ムギ粉あたり１通常、約２ｇから約４ｇの該タンパク、
そして好ましくは約３ｇのタンパクの使用が効果的であ
ることが、見い出されるであろう。粉中のα−アミラー
ゼの質または含量に応じて、より少ない、または多い量
の該タンパクが使用され得る。

環準方広 ｃＤＮＡＯ単離、オリゴヌクレオチドの構築９部位特異
的変異処理、ベクタ−の構築、細胞の形質転換などに用
いられる技術のほとんどは当該分野で広〈実施されてお
り、そしてほとんどの技術者は。

特定の条件と操作法とを示した標準的な材料に熟知して
いる。しかし便宜上、以下にガイドラインを示す。

α−アミラーゼインヒビターは合成または天然のもの、
あるいはそれらの組合せであり得る。天然のインヒビタ
ー遺伝子（またはその一部）は。

オオムギのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーを調製し
、インヒビター遺伝子の存在についてスクリーニングを
行うことにより得られ得る。メツセンジャーＲＮＡ群か
らのｃＤＮＡライブラリーの調製はよく知られ、　Ｈｕ
ｙｎｈら（１９８４Ｌ　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｖｏ
ｌ　１：Ｐｒａｃｔｉ−ｃａｌ　Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ
、ＧＩｏｖｅｒ　１り　＋　４９〜７８頁、　ＩＲＬ　
Ｐｒｅｓｓ。

０ｘｆｏｒｄ、に十分に述べられている。一般に、ライ
ブラリーをヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼー
ションによりスクリーニングするときには。

挿入するベクタ−はいずれのものでも良いが、λ−ｇｔ
ｌｏが好適である。なぜなら、λ−ｇｔｌＯは非組換え
ファージに対して直接選択できるためである。

抗体プローブを用いてライブラリーをスクリーニングす
るときに、最も一般に使用される発現ベクタ−は、λ−
ｇｔｌｌであり、その場合にはクローン化コード配列は
β−ガラクトシダーゼのコード配列に融合している。

スクリーニングは、該ポリペプチドに特異的なラベル化
されたＤＮＡプローブを用いて、または遺伝子産物に対
する抗体を用いて１行われ得る。いずれの方法とも簡便
であり１文献に十分記載されている。適切な抗体は、オ
オムギの品種、ボナンザから得られる精製α−アミラー
ゼインヒビターに対して調製される。これは、後述の実
施例の項で述べられる。適切なりＮＡプローブは、イン
ヒビターのアミノ酸配列に基づいて、またはそれから導
かれるヌクレオチド配列に基づいて得られ得る。

合成ヌクレオチド配列を調製する場合には、天然のヌク
レオチド配列を修飾することが望ましいであろう。例え
ば、所望の宿主により優先的に認識されるコドンを用い
ることがしばしば好適である。酵母を宿主に用いる場合
には、酵母の解糖系酵素をコードする構造遺伝子に高頻
度で現れるコドンが用いられ得る。ある場合には９例え
ば、都合のよい発現ベクタ−内に遺伝子配列を挿入する
のを増強するために、制限部位を創製するかまたは除去
することを目的として、ヌクレオチド配列をさらに変更
することが望ましい。あるいは安定性を増強するために
、得られたポリペプチドに１つまたはそれ以上のアミノ
酸を置換することが望ましい。

合成オリゴヌクレオチドは、　Ｅｄｇｅら、　Ｎａｔｕ
ｒｅ　（前出）およびＤｕｃｋｗｏｒ　ｔｈら、　Ｎｕ
ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８１）　９　：
１６９１に述べられているホスホトリエステル法、また
は＋　Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｓ、Ｌ、、およびＣａｒｕ　
ｔｈｅｒｓ　＋Ｍ、ｌ＋、、　Ｔｅｔ　Ｌｅｔｔｓ（１
９８１）２２：１８５９およびＭａｔｔｅｕｃｃｉ。

Ｍ、Ｄ、、およびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｍ、Ｈ，、Ｊ　
Ａｎ＋　ＣｈｅＩＩＳｏｃ（１９８１）１０３：３１８
５に述べられているホスホルアミダイト法のいずれかに
よって調製され、そして、市販の自動オリゴヌクレオチ
ド合成装置を用いて調製され得る。

（以下余白） 宿」１乳とび」１■片死 原核細胞および真核細胞系の両方が、α−アミラーゼイ
ンヒビターをコードする配列の発現に用いられ得；もち
ろん、原核細胞の宿主がクローニング操作に最も便利で
ある。ベクタ−は、単コピー、または低コピーもしくは
高コピーの多コピーベクタ−であり得る。最も頻繁に用
いられる原核生物は、　Ｅ、　ｃｏｌｉの種々の株で代
表される。しかし、他の微生物株も用いられ得る。プラ
スミドベクタ−としては、複製部位９選択マーカーおよ
び宿主と和合性のある種に由来する制御配列を有するも
のが用いられる；例えば、　Ｅ、　ｃｏ旦は典型的には
、　　Ｂｏｌｉｖａｒら、　Ｇｅｎｅ（１９７７）　２
　：９５に記載のＥ。

並旦種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を
用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２はアンピシリンお
よびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでいる。

従ってｐＢＲ３２２は、所望のベクタ−の構築において
。

残存させるかまたは破壊させるかのいずれかにできる予
選択マーカーを与える。通常用いられる原核生物の制御
配列［それらは、転写開始のためのプロモーター（必要
に応じてオペレーターを有する）をリポソーム結合部位
配列と共に有することがここで定義される１には２次の
ような一般に用いられるプロモーターが含まれる：β−
ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトース（１
ａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、　Ｎａｔｕｒｅ
（１９７７）１９８：１０５６）。

トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄ
ｅｌら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｆｄｓ　Ｒｅ５（１９
８０）　８　：４０５７）、　　λ由来のＰＬプロモー
ター（Ｓｈｆｍａｔａｋｅら、　Ｎａｔｕｒｅ（１９８
１）％）２：１２Ｂ）、およびＮ−遺伝子リポソーム結
合部位。

およびｔｒｐ−１ａｃ（ｔｒｃ）プロモーター系（Δｍ
ａｎｎおよびＢｒｏｓｉｕｓ、Ｇｅｎｅ（１９８５）４
０：１８３）。

細菌に加えて、酵母のような真核微生物も宿主として用
いられ得る。サツカロミセス　セルビシアの実験室株で
あるパン酵母が最もよく用いられるが、多くの他の株ま
たは種が一般に入手可能である。例えば、　Ｂｒｏａｃ
ｈ、Ｊ、Ｒ，、Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ（１９８３）１０１：
３０７に記載の２〔μｍ〕の複製起点、または他の酵母
和合性の複製起点（例えば、　Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら
。

Ｎａｔｕｒｅ（１９７９）２８２：３９．　Ｔｓｃｈｕ
ｍｐｅｒ、Ｇ、ら、　Ｇｅｎｅ（１９８０）１０：１５
７およびＣＩａｒｋＥ３＋Ｌ、ら、　Ｍｅｔｈ　Ｅｎｚ
（１９８３）１０１：３００を参照のこと）を有するベ
クタ−が使用され得る。

酵母ベクタ−の制御配列には、解糖系酵素の合成のため
のプロモーターが包含される（Ｈｅｓｓら。

Ｊ　　Ａｄｖ　　Ｅｎｚ　　ｍｅ　　Ｒｅ　　（１９６
８）７　　：１４９；　　Ｈｏ１ｌａｎｄ　　ら、　　
Ｂｉｏ−φμ山匹び（１９７８）　１７：４９００）。

当該技術分野で公知の他のプロモーターには、３−ホス
ホグリセレートキナーゼのプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍ
ａｎら、史上初づ−Ｃｈｅｍ　（１９８０）　２５５　
：２０７３）が包含される。増殖条件および／または遺
伝的背景により転写が制御される付加的な利点を持つ他
のプロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２．
イソチトクロームＣ１酸性ホスフアターゼ、窒素代謝に
関連した分解酵素、α因子系、ならびにマルトースおよ
びガラクトースの利用に関する酵素のプロモーター領域
がある。ターミネータ−配列は、コード配列の３゛末端
にあることが望ましいと考えられている。このようなタ
ーミネータ−は、酵母由来の遺伝子のコード配列に続り
３゛側の非翻訳領域に見い出されている。

ベクタ−は２発現のための酵母宿主とクローニングのた
めの原核生物（例えば、　Ｅ、　ｃｏｌｉ）宿主との両
方でレプリコンを維持させる。２つの複製系を含み得る
。このような酵母−細菌シャトルベクタ−には＋　ＹＥ
ｐ２４（Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、　Ｇｅｎｅ（１９７９）
　８　：１７−２４）、　ｐｃｉ／１（Ｂｒａｋｅら、
　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ｔｌｓ＾（
１９８４）　８１：４６４２−４６４６）、　　および
ＹＲｐ１７（Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、　Ｊ　Ｍｏｌ　
Ｂｉｏｌ（１９８２）１５８：１５７）が包含される。

本発明を実施するための、適切な酵母および他の微生物
宿主（例えば、２倍体、半数体、栄養要求株など）の選
択は、当業者の技術範囲内である。

発現用の酵母宿主を選択する場合、適切な宿主は。

とりわけ優れた分泌能、低いタンパク分解活性。

および全体的に強い性質を持つことを示す宿主を包含し
得る。酵母および他の微生物は、　ｔｈｅ　Ｙｅａｓｔ
Ｇｅｎｅｔｉｃ　５ｔｏｃｋ　Ｃｅｎｔｅｒ、　Ｄｅｐ
ａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓａｎｄ　
Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｈｙｓｉｃｓ、　Ｕｎｉｖｅｒｓｉ
ｔｙ　ｏｆ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ。

Ｂｅｒｋｌｅｙ＋　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ；　　および
ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　ＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅ　
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ、　Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、　Ｍａ
ｒｙｌａｎｄを含む種々の源から一般に人手可能である
。

クローニングおよび細菌での発現にここで使用するため
の入手可能な宿主株は、　ＭＣ１０６１，ＤＩｌｌ、　
ＲＲＩ。

Ｂ、　Ｃ６００ｈｆｌ、　Ｋ２Ｏ２，）ＩＢＩＯＩ、　
ＪＡ２２１．およびＪＭＩＯＩのようなＥ、　ｃｏｌｉ
株を包含する。

彰１転換 用いる宿主細胞に基づいて、そのような細胞に適した標
準法を用いて形質転換が行われる。Ｃｏｈｅｎ。

Ｓ、Ｎ、、　　Ｐｒｏｃ　　Ｎａｔｌ　　Ａｃａｄ　　
Ｓｃｉ　　ＵＳＡ　　（１９７２）　　６９：　　２１
１０に記載されているような塩化カルシウムを用いるカ
ルシウム処理、またはＭａｎｉａｔｉｓら、　ル壮ｅＣ
ｕｌａｒすμ住吐：　Ａ　Ｌａｂｏｒａ山卯し１時計（
１９８２）Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏｒ　Ｐ
ｒｅｓｓ、　ｐ、２５４および１ｌａｎａｈａｎ、Ｄ、
、Ｊ　Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ（１９８３）月瓜；５５７−５
８０によるＲｂ（１：１２法が、原核細胞または実質的
な細胞壁境界を有する他の細胞に用いられ得る。

酵母を形質転換するためには、広い範囲の種々の方法が
ある。例えば、スフェロプラスト形質転換が１例えばｌ
１ｉｎｎｅｎら、　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ八ｃａへ　Ｓｃ
ｉ　（ＩＳＡ（１９７８）７５：　１９１９−１９３３
およびＳｔｉｎｃｈｃｏｍｂら、欧州特許公開第４５．
５７３号により報告されている。形質転換体は、適当な
栄養培地で増殖され、そして適当に内在生ＤＮＡの保持
を確実にするための選択圧のもとで保存される。発現が
誘導的である場合は。

酵母宿主を高い細胞密度となるまで増殖させることがで
き９次いで発現が誘導される。分泌され。

プロセッシングされた非酵母タンパクは、いずれかの従
来法により集めることができ、クロマトグラフィー、電
気泳動、透析、溶媒−溶媒抽出などにより精製される。

丘久久二悲Ｍ築 所望のコード配列および制御配列を含む適当なベクタ−
の構築には、当該技術分野でよく知られている標串の連
結および制限技術を使う。単離されたプラスミド、　Ｄ
ＮＡ配列、または合成オリゴヌクレオチドは、所望の形
に切断、加工、および再連結される。

ベクタ−を形成するＤＮＡ配列は、多くの起源から得ら
れる。骨格となるベクタ−および制御系は。

通常、構築における配列の大部分に使用される利用可能
な“宿主”ベクタ−に見い出される。適切なコード配列
のためには、構築は、まず最初にｃＤＮＡライブラリー
、ゲノムＤＮＡ　ライブラリー、または寄託されたプラ
スミドからの適当な配列を持って来ることにより行われ
得２通常そのように行われる。しかし、−度この配列が
示されると、全遺伝子配列を個りのヌクレオシド誘導体
からインビトロで合成することが可能である。かなり長
い遺伝子の全遺伝子配列（例えば、５００〜１０００ｂ
ｐ　）は。

個々の重複する相補的オリゴヌクレオチドを合成し、１
本鎖の非重複部分をデオキシリボヌクレオチド３リン酸
の存在下でＤＮ八へリメラーゼを用いて充填することに
より調製し得る。この方法は。

いくつかの公知配列の遺伝子の構築に使われ成功してい
る。例えば、　Ｅｄｇｅ、　Ｍ、Ｄ、、　Ｎａｔｕｒｅ
（１９８１）２９２ニア５６；　Ｎａｍｂａｉｒ、に、
Ｐ、　　ら、　５ｃｉｅｎｃｃｚ（１９８４）２２３：
１２９９；Ｊａｙ、Ｊ　Ｂｉｏｌ　Ｃｈｅｍ（１９８４
）２５９：６３１１を参照のこと。

−度、所望のベクタ−の成分が利用可能となると、該ベ
クタ−成分を標準的な制限および連結方法を用いて切断
および連結できる。

“ベクタ−断片”を用いるベクタ−の構築では。

５′リン酸を除去してベクタ−の自己連結を防ぐために
９通常、該ベクタ−断片を細菌のアルカリホスファター
ゼ（ＢＡＰ）またはウシのアルカリホスファターゼ（ｃ
ｒｐ）で処理する。その他、別の制限酵素分解で２重に
分解し、望ましくない断片を分離したベクタ−では再連
結を防ぐことができる。

配列の修飾を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮ＾由
来のベクタ−の部分については１部位特異的変異処理が
使用され得る（Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ、Ｊ、およびＳｍ１ｔ
ｈ。

Ｍ、、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９８
２）１０：６４８７−６５００および八ｄｅ１ｍａｎ、
Ｊ、Ｐ、ら、　ＤＮＡ（１９８３）　２　：１８３−１
９３）　。これは、所望の変異を示す限定されたミスマ
ツチを除いては変異を起こさせるべき１本鎖ファージＤ
ＮＡに相補的である１合成オリゴヌクレオチドプライマ
ーを用いて行われる。

開５諺ｌｕ 以下に示す構築では、プラスミド構築のための正しい連
結は、まずｙユｃｏｌｉまたは他の適当な宿主を連結混
合物で形質転換することにより確認される。うまく形質
転換した形質転換体は、アンピシリン、テトラサイクリ
ン、または他の抗生物質耐性により、または当該技術分
野で公知のプラスミド構築の様式による他のマーカーを
用いて選択される。次いで、形質転換体のプラスミドは
ＣＩｅｗｅｌＬＤ、Ｂ、ら−、Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　　
Ａｃａｄ　　Ｓｃｉ　　ＵＳ＾（１９６９）６２：１１
５９の方法に従って調製され、続いて任意にクロラムフ
ェニコール増幅（Ｃ１ｅｈｅｌｌ、Ｄ、Ｂ、Ｊ　Ｂａｃ
ｔｅｒｉｏｌ（１９７２）月、Ｏ：６６７）が行われる
。いくつかの少ｌＤＮＡ調製法が一般に用いられる（例
えば、　ｌｌｏｌｍｅｓ、Ｄ、Ｓ、ら。

単離されたＤＮ八は、ドツトプロット分析（Ｋａｆａｔ
ｏｓ。

Ｆ、Ｃ，ら、　Ｎｕｃｌ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５（１９７
７）　７　：１５４１−１５５２に記載されている）、
制限酵素分析により分析される。

または、ジデオキシヌクレオチド法（Ｓａｎｇｅｒ、Ｆ
。

ら＋　Ｐｒｏｃ　Ｎａｔｌ　Ａｃａｄ　Ｓｃｉ　ＵＳ＾
（１９７７）７４：５４６３の方法であり、さらにＭｅ
ｓｓｉｎｇ　ら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ
５（（１９８１）　９　：３０９により記載された）に
より、またはＭａｘａｍらの方法ＣＭａｘａｍら、　Ｍ
ｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ戸」互ｕ（１９８０）　６
５　：　４９９）により配列決定される。

（以下余白） （実施例） 以下の実施例は本発明を説明することのみを目的とし１
本発明の範囲を限定することを意図しない。

オオムギ（ｃｖ、ボナンザ）の穀粒を２０秒間精麦機に
かけて殻をとり、　Ｃｙｃｌｏｎｅ　Ｓａｍｐｌｅ　Ｍ
ｉｌｌ　ＭＳ型（Ｕｄｙ　Ｃｏｒｐ、、　Ｆｏｒｔ　Ｃ
ｏ１１ｉｎｓ、　Ｃｏ、、　Ｕ、Ｓ、八、）で粉にひい
た。１ｋｇのオオムギ粉を、４！の０．０５Ｍトリス−
塩酸緩衝液（ｐＨ５，５）とともに４　’Ｃにて６０分
間撹拌することにより抽出した。１３．０００Ｘｇ　。

４°Ｃにて２０分間遠心分離した後、上清液のｐＨを１
４ＮａＯＨでｐＨ７，５に調整し、塩化ナトリウムを０
．１５Ｍの濃度になるまで添加した。形成された沈澱を
４°Ｃにて１時間放置し、　１３．ＯＯＯＸｇ　、　　
４°Ｃにて３０分間遠心分離することにより除去した。

もし必要ならば、さらに上清を５μｍのザルトリウス膜
（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ。

ＧＭＢＨＧｏｔｔｉｎｇｅｎ＋　Ｗｅｓｔ　Ｇｅｒｍａ
ｎｙ）を通して濾過し。

いっそう精製するために用いた。

インヒビターを精製するために３次の２つの工程を採用
した： １、セファロース６Ｂ　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のよう
な銅−１０八−非イオン性ゲル樹脂での固定化金属アフ
ィニティークロマトグラフィー；に続いて２、　３−セ
ファロース　ファストフローのような陽イオン交換樹脂
でのイオン交換クロマトグラフィー。

・化合がアフィニティークロマトグラフィーセファ０−
ス６Ｂを、　　ＳｕｎｄｂｅｒｇおよびＰｏｒａ　ｔｈ
（Ｊ、　Ｃｈｒｏｍ、（１９７４）　　９０　：　８７
−９８　）のエポキシ活性化法を用いて活性化した。Ｉ
ＤＡのエポキシ活性化セファロース６Ｂへのカップリン
グは、　Ｐｏｒａｔｈ、Ｊ。

ら（Ｎａｔｕｒｅ　（１９７５）　２５８：５９８−５
９９）に従って行った。

２つのカラムシステムをインヒビターの１８Ｍに用いた
：分離用カラム（５Ｘ　１４．５ｃｍ　）およびガード
カラム（５Ｘ９ｃｍ）。この両方のカラムに脱イオン水
で平衡化したｒＤＡ−セファロース６Ｂゲルをを充填し
、ベツド容積の６倍量の脱イオン水で洗浄した。次いで
１分離用カラムに硫酸銅溶液（ＣｕＳＯ４・５＋１２０
を６　ｍｇ　／　ｍｌで含有する）を溶出液に銅イオン
の青色が検出されるまで流し２その後ヘツド容積の６倍
量の脱イオン水で洗浄した。両方のカラムを、　０．１
５Ｍ　ＮａＣ１を含有する０、０５員　トリス−塩酸暖
冷ｉ液（ｐＨ７，５）で別々に１晩平衡化し。

互いに接続した。

１ｋｇのオオムギ粉から上述のようにした調製した上清
液を、Ｃｕ−ＩＤ八−セファロース６Ｂ／ＩＤ八−セフ
ァロース６Ｂカラムに添加し、流速１２６ｍｆｆ／時間
で流した後に以下の液で順次カラム洗浄した：１、０．
０５Ｍ　　トリス−塩酸緩衝液（ｐ）１７．５　）。

０、］、５５ＭＮａＣ１（平衡化緩衝液）；および２．
０．０５Ｍグリシンを含有する平衡化緩ｊ）ｉ液。

Ｃｕ−ｌ０Ａ−セファロース６Ｂに結合した他のタンパ
クを除去するために、　　２８０ｎｍでの吸光度が無視
できるようになるまで上記緩衝液のそれぞれで洗浄を続
けた。インヒビタータンパクは、　０．２００１’グリ
シンを含有する平（４化緩衝液で溶出された。

インヒビター活性を含む両分を合わせ、濃縮し。

分子ｉ１０，０００カットオフの膜を用いたミニタン（
Ｍｉｎｉｔａｎ　；　Ｃａｎａｄａ　Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ　Ｌｔｄ、＋　ＭｉｓｓｉｓｓａｕＨａ。

０ｎｔａｒｉｏ　）で脱イオン水に対して透析した。

旦−４交」レリηヱ上ノ゛ラフイー Ｃｕ　−ＴＤＡ−セファロース６Ｂで精製し、環１宿し
たインヒビターを１分子Ｈ６，ｏｏＯ〜８，０００　カ
ットオフのスペクトラポー（５ｐｅｃｔｒａｐｏｒ　）
膜チューブで０．０２５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ６，８
）に対して透析した。

この透析物を、同様の緩衝液で平衡化したＳ−セファロ
ース　ファストフローカラム（５Ｘ　１５．５ｃｍ　）
にかけた。このカラムを平衡化緩衝液に続いて。

９００ｍｆの０．０２５Ｍ　トリス−塩酸（ｐＨ６．８
　）と９００ｍｎの０．０２５Ｍ　ｌ−リス−塩酸（ｐ
Ｈ６，８，０，４Ｍ　ＮａＣ１を含有する）とのグラジ
ェントを用いて、　２２０　ｍｌ／時間の流速で溶出し
た。インヒビターを含む両分を合わせ、脱イオン水に対
して透析した。次いで、透析物を１３．０００　Ｘ　ｇ
で２０分間遠心分離し、上清液を凍結乾燥した。

オオムギ由来のα−アミラーゼ■インヒビターの精製結
果の一例を表１に示す。１ｋｇのオオムギ（ＣＶ、ボナ
ンザ）から得たオオムギインヒビターの収量は、　　２
３９ｍｇタンパクであった。この収率は。

他の公知の方法（Ｗｅｓｅｌａｋｅら、　Ｐｌａｎｔ　
肋り吋が工（１９８３）互：　８０９−８１２　）の収
率よりも約１０倍高い。

オオムギインヒビターの調製物の純度は、　５Ｏ５−Ｐ
ＡＧＥ　（第２図）および等電点電気泳動分子（ＩＥＦ
。

第３図）により測定した。

（以下余白） 王ｙ当」≧吐：た近 インヒビター分析は、　ｐｏａ、ｏの緩衝液（０，０４
Ｍトリス−塩酸、　１０−’Ｍ　ＣａＣ１ｚ　）　、　
３５°Ｃで行った。

α−アミラーゼのＢｒ１ｇｇ５分析法（Ｂｒｉｇｇｓ、
　　Ｊ　Ｉｎ５ｔ敗堕（１９６１）　６７　：　４２７
−４３１）を、精製工程におけるインヒビター活性を測
定するのに用いた。適当に希釈したインヒビター溶液０
．５ｄを、適当に希釈したコムギのα−アミラーゼＩ［
０，５ｄとともに１５分間ブレインキュベートした。イ
ンヒビターなしの対照となる消化物を調製した。１　ｍ
ｌのβ−限界デキストリン（０，６５■／ｄ）を添加す
ることにより反応を開始させ、１５分後に５　ｍｌの酸
性１．−ＫＩ　（。

０．０５Ｎ　ＨＣＩ　、　０．５ｍｇ　Ｋｌ　７ｍ１．
０．０５ｍｇ１ｚ／ｍＡ　）を添加することにより反応
を停止させた。ヨウ素結合能力の減少を５４０ｎｍで測
定した。インヒビターの１単位は、１単位のα−アミラ
ーゼを阻害するインヒビターの量と定義した。

コムギのα−アミラーゼ■のｆｉｆＡｌ！−発芽したコ
ムギに−パワ；　Ｎｅｅｐａｗａ　）からの総α−アミ
ラーゼは、基本的にはＷｅｓｅｌａｋｅおよび１１ｉ１
１（Ｃｅｒｑａｌ　Ｃｈｅｍ　（１９８３）　６０　：
　９８−１０１　）の方法に従い、これを少し改変した
方法により調製した。

本性においては、粗抽出物は、ポリビニルポリピロリド
ン（１’ＶＰ）で処理しなかった。シクロへブタアミロ
ース（ＣＩＩＡ）を分離するのに、　　Ｂｌｏ−Ｇｅ１
　Ｐ４の代わりにＢｌｏ−Ｇｅ１　Ｐ６（２００−４０
０メッシ：ｘ、、　Ｂｉｏ−ＲｏｄＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ、　Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、０ｎｔａｒｉｏ　
）を用いた。

α−アミラーゼ■（高い等電点（ｐｌ）を持つα−アミ
ラーゼのアイソザイム）は、　０．０２Ｍ酢酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５，ｏ　、　１０−３Ｍ　　ＣａＣＩｚ
）で平衡化したＣＭ−セファロースカラム（２，６Ｘ２
６ｃｍ）を用いて、α−アミラーゼ先（低いｐＩを持つ
アイソザイム）から分離した。試料を添加した後、カラ
ムを平衡化緩衝液、　０．０８Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＩ
（５，１゜１０−’Ｍ　ＣａＣ＋□）で順次洗浄した。

α−アミラーゼ■は、　　１００ｍｊ！の０．２Ｍ酢酸
ナトリウム緩衝液（ｐＨ５，１，１０−’Ｍ　ＣａＣ１
ｚ）と１００ｍｊ！の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
５，１，１０−３Ｍ　ＣａＣ１ｚ）とのグラジェントで
溶出した。α−アミラーゼ画分の純度は２等電点電気泳
動に続いてタンパクおよび酵素活性の染色（Ｚａｗｉｓ
ｔｏｗｓｋａら、　（１９８８）、前出）を行うことに
より測定した。α−アミラーゼ■を含む高い等電点の両
分を合わせ１分子、１１０，０００カツトオフの膜を備
えたアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）セルで濃縮し、０．１％
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ　）の存在下で４０°Ｃに
て保存した。

精製の全工程において、α−アミラーゼはＢｒ１ｇｇ５
法により分析した。活性の１単位は、β−限界デキスト
リンの光学密度（０，０，）を１００分間に０．６〜０
．４に変化させるのに必要な酵素量として定義した。

ＸｊＪ′Ｄｉ−涯Ｉ この実施例で使用する基本のコムギ粉は、市販の゛°多
用途”コムギ粉であり、カナデイアンハードレッド春コ
ムギ（Ｃａｎａｄｉａｎ　ｈａｒｄ　ｒｅｄ　ｓｐｒｉ
ｎｇｗｈｅａｔ　）から粉にしたものである。このコム
ギ粉のタンパクおよび灰分含有量は、基本）易度１４％
では、それぞれ１２．０％および０．４０％であった。

標阜のアミログラフテスト（八ＡＣＣＡｐｐｒｏｖｅｄ
　Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｍｅｔｈｏｄ　２２−１０　）、　
Ｔｈｅ　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ、　Ｓｔ、　Ｐａｕｌ
。

ＭＮ　（１９８７）　）では、このコムギ粉のピーク粘
度は３１０Ｂ、Ｕ、であった。このコムギ扮のアミラー
ゼ活性は、　Ｋｒｕｇｅｒ、　Ｊ、Ｅ、ら、　Ｃｅｒｅ
ａｌ　ｑｈｅｍ　（１９８１）５８　：　２７１〜２７
４により述べられているようにして測定すると、８．１
単位であった。

α−アミラーゼ活性を２３．０単位に増加させてアミロ
グラフのピーク粘度を１８０Ｂ、Ｕ、に下げるために、
適当量の発芽させたオオムギの粉（Ｄｉａｍａｌ　ｔ　
Ｕ　＋Ｆ　ｌｅｉｓｃｈｍａｎｎ）を添加し、α−アミ
ラーゼ活性の高いコムギ粉を調製した。α−アミラーゼ
インヒビクーは、実施例１の方法によりオオムギ（Ｃν
、ボナンザ）から調製した。

ベーキングは１日木製の全自動「ブレッドヘーカリーＪ
　（Ｐａｎａｓｏｎｉｃ、５Ｄ−ＢＴ−２Ｎ型）で行っ
た。この「ベーカリ−」で用いられる方法は、　Ｉｒｖ
ｉｎｅ＋Ｇ、Ｎ、らＣｅｒｅａｌ　Ｃｈｅｍ　（１９６
０）　３７　：　６０３−６１３　（ここに参照文献と
して引用する）に記載のカナデイアン「再混合」ベーキ
ングテストに類似する。このパン製造機では、材料を混
合することに始まりベーキングで終わる全ての工程は自
動的に行われる。

使用したベーキングの配合（表■）は、　Ｐａｎａｓｏ
ｎｉｃのマニュアルに推奨されているのと同しであった
。

ベーキング実験のために、アミログラフ粘度が３１０Ｂ
、Ｕ、である市販の多用途のコムギ粉を「対照」として
用いた。α−アミラーゼのレヘルを、「対照」のコムギ
′扮に発芽処理したオオムギ粉を１：４００の割合で添
加することにより人為的に増加させた。

α−アミラーゼの高いコムギ粉は、アミログラフ粘度が
１８０　Ｂ、υ、であることにより特徴付けられた。

オオムギのインヒビター調製物は、全材料と混合する前
に水に溶かした。

表■ 基本的なパンの配合 ベーキングの結果は、α−アミラーゼを過剰に（通常の
ベーキングに必要とされるよりも多く）添加すると、パ
ンの品質に予想された影ツを与えることか示された。一
つまり、パンの頂上や側面がへこんでいたり、孔が多く
てきめの粗いパンだったりする。パンの生地は、対照の
パンが紺のようになめらかであるのに対して著しくべと
ついていた。パンのべとつく性質および口の中で固まる
傾向は２食べている間、特に著しかった。反対に「対照
」のコムギ粉は、頂上が丸味をおびた通常の形および比
較的通常の生地構造を結果した。

パンの材料の１つとしてアミラーゼインヒビターを添加
すると、過剰なα−アミラーゼの悪影客が完全になくな
った。パンの大きさおよび外見は。

対照のパンの大きさおよび外見と木質的に同じであった
。もとのきめおよび生地が完全に回復した。

ごれらの結果により、パンの製造には通常は不適当なコ
ムギ粉にオオムギから単離した天然のα−アミラーゼイ
ンヒビターを添加すると１発芽によるダメージを受けた
コムギからつくられたコムギ扮で満足のいくパンの製造
が可能となることが示された。

沃」１殊↓ α−アー辷ラう−だ４ｚよ一占一乞二重にＪ±Ｊ〉配Ａ
Ｌ丈／仁只二α−アミラーゼに対するポリクローナル抗
体を。

ウサギで産生させた。若い雌のウサギを、皮肉注射によ
り免疫した。精製されたα−アミラーゼインヒビターを
脱イオン水に２　ｍｇ　／　ｍｌのタンパク濃度で溶解
し、抗原の原液を得た。フロイント完全アジュバントを
２等量の原液と完全に混合した。

この混合物を、ウサギの背中下方の刺毛した部分に皮肉
注射で投与した。１回目の注射で６００μｇの計の抗原
が与えられた。その後、１回目の注射の１６日、２８日
および３２日後に、免疫促進のための注射による投与（
それぞれ６００μｇ）が行われた。

注射と注射の間で採血しく５〜１０ｍ１）、血清の力価
を測定した。１回目の注射の前に採取した血清を一４０
°Ｃで保存し、対照として用いた。ウサギは１回目の注
射の５２日後に心臓穿刺により採血され。

血清はその後の分析のために一４０°Ｃで保存された。

免疫グロブリン（ＩｇＧ）画分は、主にＦａｈｎｅｙ　
（１９６７）（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｉｍｍｕｎｏｌ
ｏｇｙ　　ａｎｄ　　Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
（ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＣｈａｓｅｒＪＨ）　＋　ｐ
、３２１．　ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ、　Ｎｅ１ｙ
　Ｙｏｒｋ）に従って単離した。精製は、硫安沈澱およ
びそれに続＜　　ＤＥＡＥ−セファセルカラム（Ｐｈａ
ｒｍａｃｉａ＋　ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）での
イオン交換クロマトグラフィーを包含する。ＤＥＡＥ−
セファセルカラムに保持されなかったＩｇＧ画分を含む
ピークを、　ＰＭＩＯ膜を用いたアミコン　セルで濃縮
し、０．９％Ｎ　ａ　Ｃ１に対して透析し、　０．２２
μｍフィルター（Ｓｙｒｉｆｉｌ−肝、　Ｎｕｃｌｅｏ
ｐｏｒｅ　Ｃｏｒｐ、）で濾過し、−４０°Ｃで凍結保
存した。

抗体の力価は、ニトロセルロース膜でのドツト−ブロッ
ティング技術を用いた二抗体分析法で測定した。第２の
抗体として、ヤギ抗ウサギ抗体−西洋ワサビ　パーオキ
シダーゼ結合体（Ｂｉｏ−ＲａｄＬａｂｏｒａｔｏｒｉ
ｅｓ　（Ｃａｎａｄａ　）　　Ｌｔｄ、、　Ｍｉｓｓａ
ｓｓａｕｇａ。

０ｎｔａｒｉｏから入手できる）を用いた。力価は約１
：１０．０００であった。

次いで、これらの抗体を、オオムギのｍＲＮＡからのｃ
ＤＮＡライブラリーを調べるために用い、α−アミラー
ゼインヒビターをコードするヌクレオチド配列を単離し
た。

（発明の要約） α−アミラーゼＩＩのインヒビターであるタンパクの新
しい調製法を記述する。このタンパクは。

オオムギ粉をトリス−塩酸緩衝液で抽出し、得られた粗
インヒビターをクロマトグラフィー法で精製することに
より調製され得る。あるいは、このタンパクは１組換え
ＤＮＡ技術によっても調製され得る。このタンパクは発
芽によるダメージを受けたコムギの紛への添加物として
適用することができ、パンの品質を改善するのに用いる
ことができる。

４、”Ｏ□ 第１図は、オオムギα−アミラーゼインヒビターのアミ
ノ酸配列図であり、第２図は、精製α−アミラーゼ■イ
ンヒビターおよび標準分子量タンパクの電気泳動図、そ
して第３図は２精製オオムギインヒビターおよび標準等
電点タンパクの等電点電気泳動図である。

ｌａ Ｑ 工 ；１．３０ ６．５５ ５．８５ ５．２０

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、α−アミラーゼインヒビターである穀類タンパクの
   調製方法であって、 適切なｐＨ範囲の水系緩衝液で穀粉を抽出して粗インヒ
   ビター抽出物を得る工程；および クロマトグラフィー法により該粗インヒビターを精製し
   て該タンパクを得る工程；を包含し、該タンパクが、次
   の物理学的および化学的特性を有する、方法： 分子量約２１，０００および等電点ｐＨ７．２の塩可溶
   性タンパクである； コムギのα−アミラーゼIIおよびバチルススブチリス（
   ￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥　￥ｓｕｂｔｉｌｉｓ￥）由来の
   アルカリ性プロテアーゼであるスブチリシンを阻害する
   ；および ヒトのセリンプロテアーゼであるトリプシンおよびキモ
   トリプシンを阻害しない。 ２、前記穀類がオオムギであり、前記水系緩衝液が約０
   ．０５Ｍから約０．１Ｍの濃度のトリス−塩酸緩衝液で
   ある、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、前記抽出がｐＨ約５．５から約８．０の水系緩衝液
   を用いて行われる、特許請求の範囲第１項または第２項
   に記載の方法。 ４、濃度約０．０５ＭおよびｐＨ約５．５のトリス−塩
   酸緩衝液が使用される、特許請求の範囲第３項に記載の
   方法。 ５、前記クロマトグラフィー法が、固定化金属アフィニ
   ティクロマトグラフィーに続いてイオン交換クロマトグ
   ラフィーにより行われる２工程法である、特許請求の範
   囲第１項に記載の方法。 ６、前記固定化金属アフィニティクロマトグラフィーが
   銅−ＩＤＡ−非イオン性ゲル樹脂を用いて行われ、そし
   て、前記イオン交換クロマトグラフィーがスルホネート
   セファロースゲル樹脂を用いて行われる、特許請求の範
   囲第５項に記載の方法。 ７、α−アミラーゼインヒビターである穀類タンパクの
   、過剰なα−アミラーゼII活性を抑制するための有効量
   を混合した発芽によるダメージを受けたコムギの粉を含
   むコムギ粉組成物であって、該タンパクは、次の物理学
   的および化学的特性を有する、組成物： 分子量約２１，０００および等電点ｐＨ７．２の塩可溶
   性タンパクである； コムギのα−アミラーゼIIおよびバチルススブチリス（
   ￥Ｂａｃｉｌｌｕｓ￥　￥ｓｕｂｔｉｌｉｓ￥）由来の
   アルカリ性プロテアーゼであるスブチリシンを阻害する
   ；および ヒトのセリンプロテアーゼであるトリプシンおよびキモ
   トリプシンを阻害しない。 ８、前記穀類タンパクがオオムギから単離され、前記コ
   ムギ粉１ｋｇあたり約０．０２ｇから約５ｇのインヒビ
   ターが存在する、特許請求の範囲第７項に記載の組成物
   。 ９、前記コムギ粉１ｋｇあたり約３ｇのインヒビターが
   存在する、特許請求の範囲第７項または第８項に記載の
   組成物。 １０、発芽によるダメージを受けたコムギの粉からパン
   製品を製造するための改良法であって、該発芽によるダ
   メージを受けたコムギの粉に、グルテンタンパクに影響
   を与えることなく該発芽によるダメージを受けたコムギ
   の粉に存在するα−アミラーゼIIの過剰な活性を抑制す
   るのに有効な量の天然の非毒性α−アミラーゼインヒビ
   ターを添加すること； を包含する方法。 １１、前記α−アミラーゼインヒビターがオオムギから
   単離されるか、または組換えタンパクである、特許請求
   の範囲第１０項に記載の方法。 １２、組換えα−アミラーゼインヒビターをコードする
   遺伝子が発現ベクタ−に挿入され、大腸菌（￥Ｅ．￥　
   ￥ｃｏｌｉ￥）または酵母を形質転換するのに用いられ
   る、特許請求の範囲第１１項に記載の方法。 １３、形質転換された酵母が、α−アミラーゼインヒビ
   ター源およびパン酵母としての２つの目的に使用される
   サッカロミセスセルビシア（￥Ｓ．￥￥ｃｅｒｅｖｉｓ
   ｉａｅ￥）である、特許請求の範囲第１２項に記載の方
   法。