JPH01137970A - ウイルス発現阻害剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野および従来の技術）本発明はＤＮＡ
ウィルスに関するものである。

パピローマウィルスはヒトおよびその他の動物にいぼな
どの疾患を引き起こす小型ＤＮＡウィルスの一種である
。　パピローマウィルスの一つの型にウシパピローマウ
ィルス（ｂｏｖｉｎｅ　ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ
、ＢＰＶ）がある。

ＢＰＶの初期遺伝子の直前にある上流調節領域（ｕｐｓ
ｔｒｅａｍ　ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ　ｒｅｇｉｏｎ、　
　ＵＲＲ）は、ＤＮＡ複製開始点（ラスキー（Ｌｕｓｋ
ｙ）ら、３６　Ｃｅ１ｌ　３９１（１９８４））および
初期遺伝子転写で機能するいくつかのプロモーター（ス
テンルンド（Ｓｔｅｎｌｕｎｄ）ら、１８２　Ｊ、　Ｍ
ｏ１．　Ｂｉｏ、　５４１　（１９８５））を含む、重
要なｃｉｓ作用を持つ調節シグナルを含んでいる。最近
の研究により、ＵＲＲはエンハンサ−の位置および活性
化するプロモーターに対する向きと独立に、これらのプ
ロモーターおよび異種のプロモーターの転写を促進でき
るエンハンサ−エレメントも含んでいることが示された
。　このエンハンサ−は、ＢＰＶ　　Ｅ２オープン・リ
ーディング・フレーム（ＯＲＦ）の遺伝子産物に活性化
された場合に転写を促進する点で条件的である（スバル
ボルツ（Ｓｐａｌｈｏｌｚ）ら、４２Ｃａｌｌ　　１８
３　　（１９８５））　。

（発明の構成） 一般的に、本発明は一つの局面で、核酸配列５’ＡＣＣ
ＸＮＮＮＰｙＣＧＧＴＸＹ３’　（Ｅ２結合部位）（こ
こで、Ｎ、　Ｘ、　Ｙはそれぞれ独立に任意のヌクレオ
チドを表し、ＰｙはＣあるいはＴを表す）を含むＤＮＡ
を有するウィルスの増殖を阻害する方法に関するもので
ある。該核酸配列にはウィルスＤＮＡにコードされてい
るタンパク質（Ｅ２タンパク質）が特異的に結合する。

　該タンパク質が該核酸配列に結合すると、ウィルスの
ＤＮＡの転写が促進される。　ウィルスの発現、劃りお
よび増殖は、（例えば、結合を阻害する物質を導入する
ことにより）Ｅ２タンパク質の該核酸配列への結合を妨
げ、Ｅ２タンパク質が介在する転写促進を妨げることに
より阻害される。

いくつかの好ましい態様では、本方法は、ウィルス性Ｄ
ＮＡを、上記核酸配列と少なくとも８０パーセントの相
同性（Ｎ、　ＰＶ、　Ｘ、　Ｙを除く）を持っ１４塩基
対領域を有する少なくとも１４塩基対（および望ましく
は２００塩基対以下）の核酸と接触させることを含む：
該核酸は該タンパク質に結合し、それにより該タンパク
質が該核酸配列に結合することを阻害する。

別の好ましい態様では、本方法は、ウィルス性ＤＮ＾を
、該核酸配列には結合するがウィルスのＤＮへの転写を
促進しない阻害タンパク質と結合させ、それによりウィ
ルスのＤＮＡにコードされパピローマウィルスが感染し
た細胞で合成されるＥ２タンパク質が該核酸配列（例え
ばＥ２結合部位）に結合することを阻害する。　該タン
パク質はＥ２タンパク質のＤＮ＾結合領域を含むアミノ
酸配列に実質的に同様なアミノ酸配列を含むことが望ま
しい。　ここで用いる”実質的に同様な”とは、該配列
が少なくとも８０χ（より望ましくは少なくとも９０χ
）の相同性を有することを意味する。

別の好ましい態様では、該ウィルスはパピローマウィル
ス（例えば、ヒトパピローマウィルス）であり、該タン
パク質はＥ２タンパク質である。

本発明は、別の局面では、１４から２００塩基対からな
り、その一方のＤＮＡ鎖が塩基配列５’　ＡＣＣＸＮＮ
ＮＰｙＣＧＧＴＸＹ３’　　（コ、ｍ　テ、Ｎ、　Ｘ、
　Ｙはそれぞれ独立に任意のヌクレオチドを表し、Ｐｙ
はＣあるいはＴである）；あるいは、３’　ＴＧＧＶＮ
ＮＮＰｕＧＣＣＡＶＷ５’　　（ココで、Ｎ、　Ｌ−は
それぞれ独立に任意のヌクレオチドを表し、ＰｕはＧあ
るいは八である）を含むオリゴヌクレオチドに関するも
のである。　　本発明は、ヒトにおけるいぼおよび他の
動物に於ける様々な疾患を、廉価で容易に作成できる化
合物で治療する簡便な方法を与える。　Ｅ２タンパク質
は既知の全てのパピローマウィルスに存在しており、し
たがって、パピローマウィルスによって生じるあらゆる
疾患が本発明の方法によって治療可能である。

さらに、該化合物が阻害するタンパク質−エンハンサ−
相互作用は治療されるウィルスに特異的なものであるた
め、該化合物はパピローマウィルスに感染していない細
胞に悪影響は及ぼさないと考えられる。

本発明の別の特徴および利点は、上述の特許請求の範囲
および以下の推奨される態様から明らかになるであろう
。

一７＝ ！＋：４Ｌ、へ憇」Ｕ針駁朋− （方法） Ｅ２結合配列５’ＡＣＣＸＮＮＮＰｙＣＧＧＴＸＹ３’
　（Ｘ、　Ｎ、、Ｙは、−に述と同様）は、既知の全て
のパピローマウィルスに見られる。　各々の型のパピロ
ーマウィルス、例えば、ＢＰＶ−１、ＩＩ　（ヒ））　
ＰＶ−１、ＩＩＰＶ−５などは、Ｅ２結合配列に結合し
、Ｅ２エンハンサ−のトランス活性化タンパク質として
働くタンパク質（Ｅ２タンパク質）をコードする遺伝子
ＣＥ２遺伝子）を含んでいる。　バビＩ：Ｉ−マウィル
スの多様な株のＥ２タンパク質は非常に相同性の高いア
ミノ酸配列を有する。　パピローマウィルスゲノムの例
として第１Ａ図について述べると、８ｋｂ　ＲＰＶ−１
ゲノム（旧ｎｄｌＩＩ切断部位で直鎖状化）をＨｐａ　
Ｉ切断部位をヌクレオチド１として、ヌクレオチド座標
で示している。

Ｅｌ−８は”初期領域”　（培養細胞内で発現される）
オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）である。

　ＵＲＲはｈ’ａ調節領域を示す。　Ｅ２結合部位（あ
るいは配列）はＵＲＲ内の数カ所、Ｉ’１ＰＶ−１ゲノ
ムおよび他のパピロ−マウィルスの別の部位に位置する
。　Ｅ２タンパク質は該結合部位に結合し、ＤＮＡの転
写を促進する。　この結合の阻害によりＤＮ＾転写が抑
制され、したがってウィルス増殖が阻害される。

Ｅ２タンパク質の結合を阻害する方法には二つの望まし
い方法がある。　第一の望ましい方法では、Ｅ２結合部
位のＤＮＡ配列を含む核酸をウィルス性ＤＮＡを含む細
胞に導入する。　該核酸はパピローマウィルスが感染し
ている細胞に存在するＥ２タンパク質に結合し、それに
より該タンパク質がウィルスゲノム中の核酸配列に結合
することを妨げる。

第二の望ましい方法では、上記核酸配列には結合できる
が転写を促進しないタンパク質を細胞に導入する。　該
タンパク質は該配列に結合し、それによりウィルスＤＮ
ＡにコードされるＥ２タンパク質が結合することを阻害
し、したがって、転写促進を阻害する。　Ｅ２タンパク
質の構造、産生法、および性質、Ｅ２タンパク質−結合
性核酸、および転写を促進することなくＥ２ＤＮＡ結合
部位内の核酸配列に結合可能なタンパク質について次に
述べる。

（Ｅ２タンパク質） Ｅ２遺伝子は、ＨＰＶ−１、ＨＰシー５、ＨＰＶ−６、
ＲＰＶ−８、ＨＰｖ−１６、ＲＰＶ−１８、およびＲＰ
Ｖ−３１などのヒト型株を含む多種のパピローマウィル
スゲノムで同定されている。　これらのパピローマウィ
ルスのＤＮＡ配列の多くは、例えばＧｅｎＢａｎｋなど
で容易に入手できる。　ＢＰＶ−１のＤＮＡ配列は、チ
ェノ（Ｃｈｅｎ）ら、７　Ｎａｔｕｒｅ　５２９　（１
９８２）に示されている。Ｅ２遺伝子のＤＮＡ配列が既
知であれば、コードされているＥ２タンパク質の構造は
容易に同定可能であり、該タンパク質あるいはその一部
を標準的方法で合成することができる。

ＤＮ八へ列が決定されていないパピローマウィルスのＥ
２タンパク質も本分野の通常の技術に熟達した者によっ
て容易に得られる。　略述すると、問題のパピローマウ
ィルスのＤＮＡを断片化し、標準的なサザン分析を行い
、以下で述べるＲＰＶ−１のＥ２遺伝子断片（あるいは
他の適当なパピローマウィルスＥ２遺伝断片片）に相同
な断片を見つける。ＢＰＬＩ　Ｅ２遺伝子断片と結合す
る断片が、例えば２０００塩基対などと長い場合にば、
適当な相同性を持つより小さな断片が単離できるまで、
該断片を制限酵素で消化する。　該断片は発現ベクター
にサブクローニングし、該クローンのスクリーニングを
行い、Ｅ２結合配列（以下参照）に結合するタンパク質
を産生ずるものを決定する。　　ＤＮＡ結合領域を含む
ＢＰＶ−１のＥ２タンパク質断片は、以下のように産生
され、解析された。

第１図ニ示スヨうに、ＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２０ＲＦ１７）３
’側４分の３をラムダファージＰＬプロモーターを含む
発現ベクターであるｐｃｏ−５にクローニングし、アン
ドロフィ（Ａｎｄｒｏｐｈｙ）ら、２３０５ｃｉｅｎｃ
ｅ　４４２　（１９８５）に示されているように、ラム
ダｃｌｌタンパク質のアミノ末端と融合させた。ＢＰＶ
−１のＮａｒＴからＢａｍＨＩ断片（ヌクレオチド（ｎ
ｔ）２９４４−４４５０）をｐｃｏ−５のＣ１ａＩ／Ｂ
ａ５ａｌ切断部位に挿入してＰＬプロモーター、リボゾ
ーム結合部位、およびファージｃｌｌ　Ｎ末端を、ＤＮ
ＡがコードするＥ２タンパク質断片と融合させた。　得
られたベクター、ｐｃＯＥ−２はｅｌｌ　のＮ末端１３
アミノ酸に続き、同じ読み枠でＲＰＶ−Ｉ　　Ｅ２タン
パク質のＣ末端２９７アミノ酸の合成を行なわせる（同
じ読み枠の最初の終始コドンはｎｔ　３Ｂ３８にある）
。

上述のクローンをラムダＰＬのｃ１８５７　ｔｓ　　リ
プレッサーを含む大腸菌（Ｅ、ｃｏ＋１）Ｎ６４０５株
（２３０５ｃｉｅｎｃｅ　４４２；他の多くの既知の株
も使用可能である）に導入した。　大腸菌を最小培地で
３２℃で培養し、４２℃で１５分間誘導し、３５Ｓ−メ
チオニンで１５分間標識した。　菌をリゾチームおよび
ＤＮ＾アーゼ■で連続的に処理した後、タンパク質を４
Ｍ尿素７１ｍＭジチオトレイトール（ＤＴＴ）で可溶化
した。

この時点で、菌の総タンパク質のおよそ２パーセントが
３７キロドルトン（ｋＤａ）のＥ２―２−合タンバク質
断ある。

Ｅ２タンパク質断片に対する抗体を産生ずるために、３
７ｋＤａのバンドを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲルか
ら抽出し、フロイント免疫アジュバントとともに、３か
ら４週間の間隔をおいてウサギの免疫に使用した。　こ
れにより、ウサギ血清中にＥ２融合タンパク質断片を認
識するが同じｃＩＩアミノ末端を有する菌合成によるＢ
ＰＶ　Ｅ６融合タンパク質あるいはＨ−ｒａｓ融合融合
タンパ色質交差反応しない抗体が得られた。　この結果
は、該面端がＥ２特異的なエピトープを認識し、該タン
パク質のｃ１１部分は認識しないことを示唆する。

予想されるＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２融合タンパク質配列由来の
ｉｎ　ｖｉｔｒｏ合成ペプチドに対して作成された抗血
清で同じ分子量のバンドも免疫沈降され、３７ｋＤａの
バンドがＢＰＶ−Ｉ　Ｅ２融合タンパク質断片であるこ
とが確認された。

（Ｅ２タンパク質結合性ＤＮＡ　） Ｅ２タンパク質がパピローマウィルスのＤＮＡに特異的
に結合する能力を試験するために、きびしい（ストリン
ジェントな）条件のＯＮ八へ疫沈降アッセイを用いた（
１４５　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　４７１　（１９
８１）　；アンドロフィー　（Ａｎｄｒｏｐｈｙ）ら、
３２５　Ｎａｔｕｒｅ　７０　（１９８７）　”）。　
標識したＤＮＡ断片をまず、過剰量の競合用非標識ＤＮ
Ａの存在下で不溶性セファロースビーズに結合したタン
パク質−抗体複合体とインキュベートする。　複合体を
数回洗浄して結合していない断片を除去した後、結合し
た断片を遊離させ、ゲル電気泳動で解析した。　以下に
述べるのは、」１記アッセイの一例である。

上記の部分精製したＲＰＶ−Ｉ　Ｅ２タンパク質断片（
アクリルアミドゲル分析で５０χ）　５０ｎＢを０１８
．（２１ｍＭ　ＩＩＥＰＥＳ　ｐｌ＋　７．２．１５０
Ｍｍ　ＭＣＩ、　０．０５χＮＰ　４０．１ｍＭＥＩＩ
Ｔ＾、　１ｍＭ　ＤＴＴ、　１′ｔアプロチニン）で希
釈し、４℃でＥ２特異的抗血清とともにインキュベート
した。

複合体をタンパク質＾−セファロースで回収し、ＤｒＢ
で洗浄した。　制限酵素による分解および、ＤＮＡポリ
メラーゼＩのクレノー断片を用いた”Ｐ−ｄＮＴＰによ
る末端標識後、２０ｎＨのＤＮＡを４００ｎｇの非標識
ｐＭ１．２ｄ　（ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）ら、２９３　
Ｎａｔｕｒｅ　７９　（１９８１））を含む０．２ｍｌ
のＤＴＢに加えた。　３７℃で１時間置いた後、複合体
をベレット化し、ＤＩＲで４回洗浄、１χＳＤＳ中で６
５℃で解離、フェノール−クロロホルム抽出を行い、遊
離したＤＮ＾をキャリアＤＮＡを加えた後にエタノール
沈澱を行なった。　再懸濁したＯＮ八を変性させ、標準
的なアクリルアミドシーフェンスゲルあるいは勾配シー
フェンスゲルで解析した。

初めのＤＮＡ結合実験では、８キロベース（ｋｂ）の［
’Ｖゲノム全長をエンドヌクレアーゼＢａｍ１１１．１
ＩｉｎｄＩＩＩおよび５ａｕ９６１を組み合わせて切断
し、次に３２ｐで末端を標識した。二つの断片が８［’
Ｖ−Ｉ　Ｅ２タンパク質断片−抗体複合体と特異的に結
合した。　一つの断片は４９８ｂｐ（ｎｔ　６９８５−
７４５６）で、もう一方は２３３ｂｐ（ｎｔ　７５８６
−７８１６）であった。　いずれの断片もエンハンサ−
活性を有するＬＩＲＲ部分内のものであった。　特異的
結合はｐｌ＋の範囲が６．８から７．４、温度の範囲が
４℃から３７℃、界面活性剤ＮＰ４０の濃度範囲が０．
０５から０．５パーセントで見られた。　対照実験では
、前免疫面清をアッセイに用いた場合、あるいは、同じ
ｅｌｌペプチドをＢＩＩＶ−１１ｉ６タンパク質あるい
は１ｌ−ｒａｓタンパク質に結合させてアッセイをＥ２
抗血清あるいはＥ６またはＩＩ−ｒａｓペプチドを認識
する抗血清を用いて行なった場合に、ＤＮＡ結合は検出
されなかった。　したがって、二つの断片の結合はＥ２
融合タンパク質断片との配列特異的な相互作用によるも
のである。　ＢＴ’Ｖ　Ｅ２融合タン−１５＝ バク質断片はまた、単一の５ｓｂｐ断片（ｎｔ　２４−
１１２）への結合により、肝Ｖ１６　ＬＩＲＲ（シード
ルフ（Ｓｅｅｄｏｒｆ）ら、［５νｉｒｏｌｏｇｙ　１
８１　（１９８５））と特異的に反応する。　ＳＶ４０
ゲノムあるいはハーベイマウスサルコーマウィルス（Ｉ
ｌａｒｔ＋ｅｙ　ｍｕｒｉｎｅ　ｓａｒｃｏｍａ　ｖｉ
ｒｕｓ）ＬＴＲはどちらもエンハンサ−を含むが、本ア
ッセイでＥ２タンパク質断片に特異的に認識される配列
を有しておらず、該ペプチドに認識されるＤＮ八へ列は
他のエンハンサ−因子に共通ではないことを示唆する。

ＢＰＶ断片をＥ２−抗体複合体とのインキュベーション
前に熱変性した場合には、１００ｎｔ以上の全ての一本
鎖断片が結合し、Ｅ２タンパク質部分が一本鎖ＤＮＡに
非特異的に結合していることを示唆する。

タンパク質過剰の条件下でアッセイした場合には他の配
列特異的ＤＮＡ結合タンパク質はＤＮＡに非特異的に結
合する可能性もあるため、上記の実験をＥ２タンパク質
断片を低濃度で行なった。　該アッセイでより多くのＥ
２タンパク質断片を用いた場合に、さらに二つの結合部
位がＲＰＶ−１ゲノム内に現われた。　一つはＵＲＲの
さらに」１流（ｎ　ｔ７８］　９−９３）に位置する２
１９ｂｐの断片、もう一方はＥ２　ＯＲＦ内（ｎｔ　２
９０４−３２５９）に位置する３５５ｂｐの断片である
。　したがって、ＢＰＶゲノムには数カ所のＥ２結合部
位が存在し、その多くはＵＲＲ内に位置し、これらの部
位のペプチドに対する親和性の階層性が存在する。

Ｅ２タンパク質断片の濃度をさらに増した場合に、少な
くともさらの一つの結合部位がＩＩＰＶ１６ゲノム内に
検出された。

高親和性Ｅ２結合部位の数および位置をより正確に決定
するために、９８７ｂｐの旧ｎｄｌＴ＋からＨｐａｌ（
ＮＴ６９５８−７９４５）　ＵＲＲ断片を単離し、多様
な制限酵素で切断した後の該断片をＥ２タンパク質断片
が認識する能力を試験した（第２図）。　３９５．２７
５、および６０ｂｐの三つの断片がＦｏｋｌ切断後に免
疫沈降されたＨ　ＤｄｅｌおよびＴａｑｌ切断により、
３１７および７０ｂｐの断片が示された；１ｌｐａｒｌ
および５ａｕ９６１切断により１７９および５６塩基対
の断片が生じた。　ペプチドが結合する５６．６０、お
よび７ｏｂｐの断片は重なりがないため、Ｆ、２タンパ
ク質断片はＬＩＲＲ内のｎｔ’＋３６６−７４０６、ｎ
ｔ　１６２４−７６８３、およびｎｔ　７７６７−７８
２２の間に位置する少なくとも三つの高親和性因子を認
識する（第２図）。　この結果もＥ２複合体が小さなり
ＮＡ断片に特異的に効率よく結合する能力があることを
示している。　ペプチドが結合する断片のＤＮＡ配列を
比較し、共通の配列を含んでいるかどうかを決定した（
第３図）。　Ｅ２タンパク質断片に特異的に結合する全
ての断片は５゛＾ＣＣ（Ｇ）ＮＮＮ！’ｙＣＧＧＴ（Ｇ
Ｃ）３’　　（括弧内のヌクレオチドは望ましいが絶対
的ではないものを表し：Ｎは任意のヌクレオチドを表し
、ＰｙｉＪＣあるいはＴを表す）というコンセンサス配
列を含む類似したモチーフを含んでいる。　このそチー
フはＤＮ＾のいずれの鎖にも見られ、二つの場合には２
コピーが互いに近接している（第２図の部位１−ＩＶ）
。　部位Ｉはｔ！ｐａＩＩ−３ａｕ９６Ｉ切断物には結
合せず、１ｌｐａｌｌはこの部位断片の推測されるＥ２
認識配列を切断する。　ＲＰＶおよびＩＩＰｖ１６の配
列分析により、Ｅ２タンパク質断片に認識されるこれら
のモチーフはこれらの断片に限られていることが示され
た。このモチーフと類似の配列が、塩基配列決定さ光た
他の全てのパピローマウィルスのＵＲＲで報告された（
ダートマン（Ｄａｒｔｍａｎ）ら、１５］　Ｖｉｒｏｌ
ｏｇｙ　１２イ（１９８６）　）。　　しかし、ＳＶ４
０、ポリオーマ、ウシ白血病ウィルス、およびそりニー
マウス白血病ウィルスを含む、コンピューターで検索し
た他のウィルスゲノムには、これらの配列は存在しない
。

（Ｅ２タンパク質結合の阻害） コンセンサス配列を含む２３ｂｐ　　ＵＲＲ断片がＲＰ
Ｖ−］Ｅ２タンパク質断片断片ＰＶ　　ＤＮＡに特異的
な結合を阻害する能力を競合阻害アッセイで試験した。

コンセンサス配列を含まない２３ｂｐ　　ＬＩＲＩＩ　
Ｗｆｒｈの結合阻害能も調べた。

アッセイは、１−１０００ｎＨの競合用非標識断片を、
抗体−！Ｅ２Ｍ合体とのインキュベーション前に標識Ｂ
ＰＶ　　［］ＮＡに加える以外は」二連と間じＤＮＡ沈
澱法で、２５ＩＩＩｇのＢＩ’Ｖ−Ｉ　　Ｅ２タンパク
質断片を用いて行なった。　競合用二本鎖１）ＮＡ断片
は塩基配列　５’　　ＣＧＴＣＡＡ八すρ−ｐ　Ｔ　Ｃ
Ｔ　ＴｑＩＧ　Ｇ　Ｔ　Ｇ　ＣＴ　Ｃ３”　　（Ｅ２結
合部位配列１！Ｉｈを下線で示す）、あるいは　５’　
ＧＣＧＣＡＴＡＡＴＣＡＧＣＴＴＡＡＴＴＧＧＴＧ３’
　　　ＣＩ＋２結合部位配列を含まない）のいずれかを
含んでいた。　Ｅ２結合部位配列を含む断片はＢＰＶ断
片の免疫沈降を効果的に阻害した；ご１ンセンサス配列
を含まない２３ｂｐ断片よりも約千倍効果的であった。

　該配列を含む一本鎖オリゴヌクレオチドは、二本＆Ｍ
　ＲＰＶ　　ＤＮＡ　Ｆｉ　片の免疫沈降を阻害しなか
った。

（ＢＰＶ形質転換細胞におけるＥ２特異的ＤＮＡ結合活
性） ＢＰＶ形質転換Ｃ１２７細胞（ＩＤＭ）から単離した核
由来のタンパク質両分および対照のＣｊ２７＃ＩＩＩ胞
を、上記のＤＮＡ免疫沈降アッセイで、Ｅ２抗血清によ
って免疫沈降される特異的ＤＮＡ結合活性の存在につい
て試験した。　四つの結合モチーフを含む、２３３ｂｐ
Ｓａｕ９６１　ＢＩ’Ｖ　ＵＲＲ断片は特異的に結合し
、ＩＤ１４抽出物では免疫沈降されたが０１２７抽出物
では免疫沈降されなかった。　ＤＮ八へ片番よ抗Ｅ２１
Ｉｆｌ清によって免疫沈降されたが、前免疫血清では免
疫沈降されず、結合タンパク質はＥ２特異的エピトープ
を有することが示唆された。

２３３ｂＰ断片の免疫沈降はＥ２結合部位配列を含む２
３ｂｐ断片によって競合的に阻害されたが、該配列を含
まない断片では阻害されず、ＢＰｖ形質転換細胞はＥ２
タンパク質を合成し、ＢＰＶ形質転換細胞由来のＥ２タ
ンパク質は菌合成によるＥ２タンパク質と同等のＤＮＡ
結合活性を有することが示唆された。、（Ｅ２結合部位
配列に対するタンパク質結合）第４図に示すように、Ｅ
２タンパク質のＤＮ八へ合領域、すなわちＤＮＡ結合活
性に必要なタンパク質部分は該分子のＣ末端部分を含む
１３５アミノ酸内に位置する（アミノ酸１はカルボキシ
末端アミノ酸）。

特に、ＤＮＡ結合領域はアミノ酸１０から１１０の間に
位置する。　Ｉｉ２タンパク質の転写促進活性領域は少
なくとも部分的に該分子のＮ末端部分くアミノ酸２９７
からＮ末端アミノ酸）内に位置する。

Ｅ２タンパク質のＤＮＡ結合領域を含むが転写促進領域
を含まないタンパク質のパピローマウィルス感染細胞へ
の導入により１、ウィルスＤＮＡの転写促進を起こすこ
となくＦ、２タンパク質結合部位を遮断する。　適当な
阻害タンパク質は、　（ａ）　　ＤＮＡ結合領域からな
るＥ２２タンパク質分；　（ｂ）　　断片（ａ）にＣ末
端部分のアミノ酸１−１１０あるいは１０−１１０の残
りの一部あるいは全部を加えたもの；（Ｃ）　　断片（
ａ）あるいは（ｂ）にＥ２タンパク質のアミノ酸１１０
−２９７の一部あるいは全部を加えたちの：（ｄ）　　
断片（Ｃ）に転写促進活性に関与しないＥ２タンパク質
Ｎ末端部分の全部あるいは一部のアミノ酸を加えたもの
：および、（ｅ）　　断片のＮあるいはＣ末端のいずれ
かに付加された非Ｅ２タンパク質アミノ酸配列を有する
上記の断片のいずれか。　該タンパク質は５００以上（
より望ましくは１８０、最も望ましくは１３５）のアミ
ノ酸を含まないことが望ましい。

」−記の断片は標準的な組み替えＤＮＡ技術、あるいは
固相タンパク質合成法によって容易に合成することがで
きる。

ある断片、例えばＥ２タンパク質のＣ末端部分の１０−
１１０アミノ酸より少ない部分からなる断片が、阻害タ
ンパク質としての使用に適しているかどうかを決定する
ために、」−述のＤＮＡ結合アッセイを用いて試験する
。　断片がＥ２　ＤＮΔ結合配列に結合し、Ｅ２タンパ
ク質のＮ末端部分を含まない場合は、該断片は転写促進
活性を持たないと占えられるので、さらにスクリーニン
グを行なわなくとも阻害タンパク質としての使用に適し
ている。　試験する断片がＥ２タンパク質のＮ末端部分
の一部も含む場合には該断片はさらに、例えば前記スパ
ルボルツら、による−船釣な方法で、該断片が転写促進
活性を持たないことを決定するための試験を行なうこと
が必要である。　例えば、試験した断片をコードするＤ
ＮＡがＳＶ／ｌｏある（ハはシト１ｆｆウイルスＬＴＲ
などの適当なプロモーターと結合している場合、指示遺
伝子（例えばｃＡｒｚ伝子）と結合したＥ２結合部位と
ともに適当な細胞系（ＣＶ−１細胞など）に双方を形質
転換する場合などである。　細胞系は試験される断片を
産生し、該断片はＥ２結合部位に結合する。　該断片が
転写促進活性に関与する１ミ２断片のＮ末端部分を含ん
でいる場合には、ＣＡＴ遺伝子は発現され、該断片は阻
害タンパク質として適さない。　該断片が転写促進活性
に関与するＥ２Ｎ末端部分を欠いている場合には、遺伝
子は発現されず、該断片は阻害タンパク質として適して
いる。

阻害タンパク質の特異的な例は上述のＢＰＶ−ＩＥ２タ
ンパク質断片である。

（使用法） 上述の規定にしたがったＤＮＡ配列を有するオリゴヌク
レオチドは、ｉｎ　ｖｉｖｏであらゆるパピローマウィ
ルスト２タンパク質に結合することができる。

パピローマウィルスが感染した細胞はオリゴヌクレオチ
ドで飽和し、パピローマウィルスに産生されたＥ２タン
パク質に結合して該タンパク質がウィルス性ＤＮＡと相
互作用してウィルス遺伝子の発現促進を妨げ、結果とし
てウィルスの発現を阻害する。

オリゴヌクレオチドはパピローマウィルスに感染した領
域に薬学的に受容可能な溶媒中で、あるいは動物への注
射で投与される。　これらはヒトのいぼへの適用が特に
有用である。　オリゴヌクレオチドは少なくとも１２−
１４ヌクレオチド長であるべきである：いぼなどへの外
用の場合には、オリボヌクレオチドは２００塩基対以下
（より望ましくは１００塩基対以下、最も望ましくは５
０塩基対以下）であるべきであり、そうでない場合には
皮膚を透過しない。　オリゴヌクレオチドは溶液中で遊
離しているか、感染細胞へのトランスフェクションのた
めに非病原ウィルスのＤＮＡと連結している。　　もし
くは、小量（約０．１１−１Ｏｕなど）のオリゴヌクレ
オチド調製液（例えば、ＤＭＳＯおよび／または生理食
塩水に溶解したオリゴヌクレオチド）を、調製液を感染
領域に適用することによりウィルス感染細胞に浸透させ
ることができる（例えば、８２　Ｐ、　Ｎａｔ、　Ａｃ
ａｄ、　Ｓｃｉ、　２７８１　（１９８６）の方法なト
）：ヌクレアーゼ活性を阻害するために、調製液にＥＤ
ＴＡが含まれていることが望ましい。

パピローマウィルスＥ２タンパク結合合領域を含む（し
かし転写促進領域を含まない）ペプチドはパピローマウ
ィルスの増殖および発現の阻害にも使用可能である。　
該ペプチドをウィルス感染細胞に導入すると、Ｅ２　Ｄ
Ｎ＾結合部位に結合し、元来のＥ２タンパク質が結合す
ることを阻害する。　あらゆるＥ２タンパク質の結合領
域を含むペプチドはあらゆるパピローマウィルス感染の
治療に用いることができる。　該ペプチドを薬学的に受
容可能な緩衝液に溶解し、感染細胞に適用する。Ｉ）Ｍ
ＳＯおよびＥＤＴＡはペプチドの取り込みの補助および
プロテアーゼ分解の阻害のために使用できる。　あるい
は、該ペプチドを化学的に、あるいは、標準的な遺伝子
工学的技術によって上皮性成長因子などの細胞特異的レ
セプターペプチドと融合し、ペプチドをより容易に細胞
に取り込ませることが可能である。　さらに、ペプチド
を核標的配列（７Ｈ。

］、　Ｃｅ１１．　Ｂｉｏ、　２４５１　（１９８７）
　；３９　Ｃｅｌ＋　４９９　（１９８４）；４６　Ｃ
ｅ１ｌ　５７５　（１９８６）；　６　Ｍｏ１．　Ｃｅ
１１．　Ｂｉｏ、　４１３６　（１９８６）；　３１１
　Ｎａｔｕｒｅ　３３　（１９８４）参照）と融合させ
、Ｅ２タンパク質断片がウィルスの増殖を阻害できる核
に移動させることもできる。　ペプチドは動物１ｋｇあ
たり１１−１Ｏ００ｕの範囲で、あるいは局所的には１
−１０００ｕｇ／＋ｎ　Ｉの範囲で使用することが望ま
しい。

他の態様は、前述の特許請求の範囲で明らかになるであ
ろう。

【図面の簡単な説明】

第１図は、ＢＰＶ−１ゲノムおよびヘクターｐｃｏＥ２
−１の略図である。 第２図は、ＲＰＶ−１のエンハンサ−領域の制限酵素地
図である。 第３図は、ＢＰＶ−１のＥ２タンパク質が結合するＤＮ
Ａ配列図である。 第４図は、Ｅ２タンパク質の略図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、ウィルス増殖の阻害方法において、 ウィルスのＤＮＡが核酸配列５’ＡＣＣＸＮＮＮＰｙＣ
   ＧＧＴＸＹ３’（ここでＮ、Ｘ、およびＹは独立に任意
   のヌクレオチドを、ＰｙはＣあるいはＴを表す）を含み
   、該核酸配列が該ウィルスのＤＮＡにコードされるタン
   パク質に結合可能であり、該タンパク質は、該核酸配列
   と結合する際に該ウィルスのＤＮＡの転写を促進するこ
   とができ、 該タンパク質が該核酸配列に結合することを阻害して該
   ウィルスのＤＮＡの転写を抑制して該ウィルスの増殖を
   阻害する、 ことよりなるウィルス増殖を阻害する方法。 ２、該方法が、該ウィルスのＤＮＡが該核酸配列と少な
   くとも８０％の相同性を持つ１４塩基対領域を有する少
   なくとも１４塩基対の核酸と接触し、該核酸断片が該タ
   ンパク質に結合し、それによって該タンパク質が該核酸
   配列に結合することを阻害することからなる、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ３、該核酸が塩基配列５’ＡＣＣＸＮＮＮＰｙＣＧＧＴ
   ＸＹ３’（ここで、Ｎ、Ｘ、Ｙはそれぞれ独立に任意の
   ヌクレオチド、ＰｙはＣあるいはＴを表す）を含む、特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 ４、該核酸が塩基配列３’ＴＧＧＶＮＮＮＰｕＧＣＣＡ
   ＶＷ５’（ここで、Ｎ、Ｖ、Ｗはそれぞれ独立に任意の
   ヌクレオチド、ＰｕはＧあるいはＡを表す）を含む、特
   許請求の範囲第２項記載の方法。 ５、該核酸が２００塩基対以下からなる、特許請求の範
   囲第２項記載の方法。 ６、ＸがＣであり、ＹがＧである、特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ７、ＶがＧであり、ＷがＣである、特許請求の範囲第３
   項記載の方法。 ８、該ウィルスがパピローマウイルスである、特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ９、該タンパク質がパピローマウイルスＥ２タンパク質
   である、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １０、該ウィルスがヒトパピローマウイルスである、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 １１、該ウィルスがウシパピローマウイルスである、特
   許請求の範囲第１項記載の方法。 １２、該方法が、該ウィルスのＤＮＡを該核酸配列に結
   合可能な阻害タンパク質と、該転写の促進を引き起こす
   ことなく接触させ、それにより該ウィルスのＤＮＡにコ
   ードされた該タンパク質の結合を阻害することからなる
   、特許請求の範囲第１項記載の方法。 １３、該核酸を該ウィルスに感染した患者の皮膚に適用
   することをさらに含む、特許請求の範囲第２項記載の方
   法。 １４、該タンパク質がＥ２タンパク質のＤＮＡ結合領域
   を含むアミノ酸配列に実質的に類似しているアミノ酸配
   列を含む、特許請求の範囲第１２項記載の方法。 １５、該ＤＮＡ結合領域がＥ２タンパク質のＣ末端１３
   ５アミノ酸内に位置する、特許請求の範囲第１４項記載
   の方法。 １６、該ＤＮＡ結合領域がＥ２タンパク質のＣ末端１１
   ０アミノ酸内に位置する、特許請求の範囲第１４項記載
   の方法。 １７、該ＤＮＡ結合領域が、アミノ酸１をカルボキシ末
   端アミノ酸とするＥ２タンパク質のＣ末端１０−１３５
   アミノ酸内に位置する、特許請求の範囲第１４項記載の
   方法。 １８、該ＤＮＡ結合領域が、アミノ酸１をカルボキシ末
   端アミノ酸とするＥ２タンパク質のＣ末端１０−１１０
   アミノ酸内に位置する、特許請求の範囲第１４項記載の
   方法。 １９、該阻害タンパク質を該ウィルスに感染した患者の
   皮膚に適用することをさらに含む、特許請求の範囲第１
   ４項記載の方法。