JPH07503230A - 乳頭腫ウイルス疾患の治療用薬剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 乳頭腫ウィルス疾患の治療用薬剤 本発明は分子生物学の分野に属し、とりわけ乳頭腫疾患、特に、ゆうぜいおよび 癌の治療に用いられ得る薬剤の同定に関する。

乳頭腫ウィルスは、ヒトを含めて多くのを椎動物に疾患をもたらす一因であると 長い間考えられてきた。乳頭腫ウィルスはエンベロープを有さない、小さいＤＮ Ａウィルスであり、鱗状の上皮細胞の核において自己複製するものである。それ らは自然界において広範囲に見受けられるものであり、上皮増殖における異常、 とりわけ良性線維乳頭腫の原因となるものであり、通常ゆうせいとして広く知ら れている。乳頭腫ウィルスはまた、多くの癌にも関係している。現在までに、約 ５８種類ものヒト乳頭腫ウィルスが、ゲノムの関わりの範囲および度合に基づい て同定されている。

ゆうぜいの臨床的重要性は場合によって異なり、決定因子としては、感染するウ ィルスの型、ゆうぜいの位置、および宿主細胞に特有の因子が挙げられる。例え ば、皮膚にあるゆうせいは自己限定性であり、臨床的に重要でない場合が多い。

しかし、声帯上のゆうせいは呼吸困難を引き起こし、その結果命を脅かす場合す らある。皮膚のゆうぜいのほとんどは、初期症状が現れてから２．３年以内に自 然治癒するが、長期に渡って持続する場合もある。例外は、まれにしか見られな いが、表皮発育異常のゆうぜいと呼ばれる、致命的な乳頭腫ウィルス疾患である 。この疾患では、感染された個体が自然治癒しないばかりか、感染が悪性段階に 移行する場合もある。

０ｒｔｈ、Ｇ、ｅｐｉｔｅｒｍｏｄｙｓｐａｓＩａ　ｖｅｒｒｕｃｉｆｏｒｍｉ ｓ、ｉｎ：ｓａｌｚｍａｎ、Ｎ、Ｐ、　Ｈｏｖｌｅｙ、　Ｐ、Ｍ、編、ｔｈｅ　 ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ、ｖｏｌ、２．　Ｎ、Ｙ、：　Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒ ｅｓｓ　１９８７：１９９−２４３゜この疾患は世界中に広がっているが、まれ な疾患であり、しばしば家族の中で発見されるものである。よって、遺伝因子は この疾患の原因に含まれると考えられる。

乳頭腫ウィルスはまた、性行為により伝染された生殖系におけるゆうぜいの生成 に関与している。米国内だけでもｌ。

Ｏ万作を越える症例が報告されている。Ｂｅｃｋｔｅｒ、　Ｔ、Ｍ、　５ｔｏｎ ｅ、　Ｋ、Ｍ、　Ａｌｅｘａｎｄｅｒ、　Ｅ、Ｒ，、Ｇｅｎ１ｔａｌ　Ｈｕｍａ ｎ　ＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓＩｎｆｅｃｔｉｏｎ：　Ａ　Ｇｒｏｗｉｎｇ 　Ｃｏｎｃｅｒｎ　０ｂｓｔｅｔ　Ｇｙｎｅｃｏｌ　Ｃ１１ｎ　Ｎｏｒｔｈａ＋ ａ　１９８７：　１４：３８９−３９６゜上述のように、乳頭腫ウィルスは頚部 癌を含め、異なる幾つかの癌の原因であると考えられており、それらの癌である と新たに診断された症例は年間約ｓｏｏ、　ｏｏｏ件にも及ぶ。Ｐｔｏ、。

Ｒ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ：　Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ　Ｐａｔｔｅｒｎｓ　 ａｎｄ　Ｔｒｅｎｄｓ、ｉｎ：Ｐｅｔｏ　Ｒ，、ｚｕｒ　ｆｌａｕｓｅｎ　Ｈ， 編、Ｖｉｒｏｌ　Ｅｔｉｏｌｏｇｙ　ｏｆ　Ｃｅｒｖｉｃａｌ　Ｃａｎｃｅｒ、 ＢａｎＢｕｒｙ　Ｒｅｐｏｒｔ　２１．　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　）Ｉａｒｂ ｏｒ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｙ、　１９８６；３−１５゜頚部癌に加えて、乳頭腫ウィルスは鼻孔腫 瘍、および種々の口腔癌の原因として影響を与えている。

ゆうぜいは一般に自然治癒するものであるため、患者は一時的苦痛または不快感 を和らげるため、あるいは美容上の理由から治療に臨む。ゆうぜいの治療は一般 に、寒冷療法を用いたり、またはＤＮＡ合成インヒビターを１種以上用いたり、 または単にゆうぜいを外科的に取り除くことにより行われている。さらに進んだ 治療では、とりわけ拭擦性の生殖系のゆうぜいの治療においては、種々のインタ ーフェロンが取り入れられてきた。この方法は、治癒率が約３６％であり、自然 治癒の３％と比べて、部分的には成功してきた。

乳頭腫ウィルス感染患者を管理または治療するための一貫した治療計画性の欠如 の一因は、インビトロでウィルスを増殖させることが不可能であり、よって効能 のある薬剤を同定するための簡便かつ信頼性あるアッセイを開発出来ない点にあ る◎乳頭腫ウィルスの研究は、細胞増殖の誘発におけるウィルスの機能の同定を 容易にするインビトロでの形質転換アッセイを開発することに多くを依存してき た。これらの研究に用いたプロトタイプの乳頭腫ウィルスはウシ乳頭腫ウィルス ■型（ＢＰＶ−１）であった。

乳頭腫ウィルスは約ａ、　ｏｏｏもの塩基対の二本鎖ＤＮＡから成る。

６つの動物乳頭腫ウィルスおよび９つのヒト乳頭腫ウィルスに基づいて研究した 結果、乳頭腫ウィルスのゲノム組織は著しく持続性があることが判明した。決定 的特徴としては、ウィルスの全てがウィルスＤＮＡの一本鎖上に配置されたオー ブンリーディングフレームを有している点が挙げられる。ウィルスのゲノム中に おける位置に基づいて分類すると約１０ものオーブンリーディングフレームがあ った。

ＢＰＶ−１を用いた遺伝子研究により、乳頭腫ウィルスのプラスミド複製は特定 のウィルスの初期遺伝子の発現に依存していることが示された。最初に同定され た遺伝子は、Ｅ２）ランス活性化因子であった。Ｅ２のＯＲＦによってコードさ れた分子は、有意なオーブンリーディングフレームを有さず、また乳頭腫ウィル スの性質に依ってサイズが異なる領域、いわゆる長制御領域（ＬＣＲ）において 、エンハンサ−と相互作用することにより転写ウィルス遺伝子を刺激する。

Ｅ２の他にも多くの乳頭腫ウィルス転写調節因子が同定された。Ｅ５と同様に、 Ｅ６およびＥｌが細胞形質転換に含まれており、またＥ５は既知の形質転換タン パク質としては最小のものである。これらの初期タンパク質がウィルスの形質転 換または転写において行う役割に加えて、それらがウィルスのプラスミド複製に おいて間接的に機能することを示唆するデータがある。事実、初期のＯＲＦの中 では、Ｅ３およびＥ４のみがウィルスのプラスミド複製に関わっていないことが 示された。ＥｌのＯＲＦはプラスミド複製に直接関与していると考えられている 因子をコードし、それは乳頭腫ウィルスゲノムにおいて最大のＯＲＦであり、ま たゲノムが配列された乳頭腫ウィルスの中では比較的維持力の高いものである。

少な（とも２つのタンパク質がＥｌのＯＲＦによってコードされている。Ｅｌの ＯＲＦの５°末端は約２３．０００ダルトンという適切な分子量を有するタンパ ク質をコードし、３′末端は６８．０００ダルトンのタンパク質をコードする。

後者のタンパク質はウィルスのＤＮＡ複製において重要な役割を果たすものと考 えられている。

本発明の目的は、乳頭腫ウィルスの複製に関与する薬物を同定するのに有用な方 法を記載することである。

本発明の第２の目的は、ウィルスのＤＮＡ複製の開始に関与するＥｌ／Ｅ２複合 体を形成する２つの初期段階の乳頭腫ウィルスタンパク質６８ｋＤ　Ｅｌおよび ４８ｋＤ　Ｅｌを用いるアッセイを説明することであって、このアッセイでは、 　Ｅｌ／Ｅ２複合体の形成に関与することによってウィルスの複製を阻害する乳 頭腫ウィルスタンパク質の能力によって乳頭腫ウィルス疾患の治療用の薬剤の同 定が可能になる。

本発明の第３の目的は、適切なＥｌおよびＥ２タンパク質からなる組成物、およ びこれらのタンパク質の組合せを容易にし、Ｅｌ／Ｅ２複合体形成に影響を与え るアッセイ混合物を生産する適切なアッセイ試薬を説明することである。

本発明の第４の目的は、Ｅｌ／Ｅ２ｆｉ合体を形成する２つの初期段階の乳頭腫 ウィルスタンパク質６８ｋＤ　Ｅｌおよび４８ｋＤ　Ｅｌを用いるアッセイ、お よびＥｌまたはＥ２タンパク質のみを結合させる、またはこれらを複合体の一部 として結合させる適切な核酸配列を説明することである。核酸配列に結合したＥ ｌ／Ｅ２複合体は、ウィルスのＤＮＡ複製の開始に関与するため、複製のインヒ ビターは、この配列に関連する複合体の形成を防止する能力によって同定され得 る。

本発明の第５の目的は、適切なＥｌおよびＥ２タンパク質からなる組成物および 核酸配列、ならびにこれらのタンパク質の組合せを容易にし、この配列の存在下 でのＥｌ／Ｅ２複合体の形成に影響を与えるアッセイ混合物を生産する適切なア ッセイ試薬を説明することである。

本発明の第６の目的は、乳頭腫ウィルス疾患を煩う動物を治療する方法を説明す ることである。

本発明のこれらおよび他の目的は、以下の開示を十分に考慮することにより明ら かになる。

図１は、適切なＥｌまたはＥ２タンパク質をコードする組換えバキュロウィルス を製造するのに用いた転写ベクターである、プラスミドｐＡｃｃ１３を示す。

図２は、４８ｋＤ　Ｅ２タンパク質がＥｌの特異的なりＮＡ結合活性を刺激する ことを示す。Ｅｌの量を一定にし、Ｅｌの量を変化させて、ＥｌおよびＥｌを、 末端ラベルされたＤＮＡフラグメントの混合物とインキュベートした。タンパク 質ＤＮＡ複合体を、記載のように、抗Ｅ１または抗Ｅ２と共に免疫沈降させた。

免疫複合体に結合したラベルされたＤＮＡを、５％の天然ポリアクリルアミドゲ ル上で分画し、オートラジオグラフィーによって明視化した。

「入力（１ｎｐｕｔ）　Ｊと記されたレーンは、開始混合物の部分を含んでいる 。各レーンの上部の数字は、実質的に精製されたＥｌまたは純粋なＥｌ（２，５ μｇ／ｍｌ）のいずれかのマイクロリフドルを示す。

図３は、Ｅｌ／Ｅ２ｍ合体が複製物のＢＰＶ−１起源に結合することを示す。実 質的に精製されたＥｌの量を一定にし、純粋なＥｌの量を変化させて、Ｅｌおよ びＥｌを、ラベルされたＤＮＡの異なる混合物とインキュベートした。タンパク 質−ＤＮＡ複合体を、抗Ｅ１または抗Ｅ２と免疫沈降させた。複合体に存在する ラベルされたＤＮＡを、天然のポリアクリルアミドゲル上で分画し、オートラジ オグラフィーによって明視化した。ｐＵＣ２３７を、パネルＡおよびＣにおいて 画およびＣ１ａｌ、またはパネルＢおよびＤにおいて図およびｎ虹で消化した。

図４は、ＥｌがＥ１複製タンパク質と共に、特異的な複合体を形成することを示 す。

図５Ａは、Ｅｌ／Ｅ２複合体の免疫アフィニティー精製を示す。

図５Ｂは、精製されたＥｌ／Ｅ２複合体のＤＮＡへの結合を示す。

精製されたＥｌ／Ｅ２ｆｉ合体または純粋なＥｌを、ＤＮＡフラグメント（Ｄｄ ｅ　ＩおよびＣ１ａｌで消化されたｐＵＣ２３７）の末端ラベルされた混合物と 共にインキ−ベートした。タンパク質−ＤＮＡ複合体を、上記のように、免疫沈 降し、処理し、明視化した。

本願に記載の本発明は、以前に出版された文献および係属中の特許出願を参考に している。実施例では、このような文献は、科学論文、特許または係属中の特許 出願からなる。上記または下記に引用される、これらの出版物および出願類のす べては、本願では参考のために引用している。

ｒＥｌおよびＥ２Ｊは、それぞれ約６８ｋＤおよび４８ｋＤの分子量を有し、乳 頭腫ウィルスＤＮＡに結合する複合体を形成し、結果としてウィルスのＤＮＡ合 成の開始に関与する、ＥｌおよびＥｌのオーブンリーディングフレームによって コードされる乳頭腫ウィルスタンパク質を指す。本願に記載の本発明の主要な局 面は、ＥｌおよびＥｌがこれまで存在すら知られてぃなかった複合体を形成する ことの発見であるため、異なる分子量を有し得るが、機能的には関連して作用す る、同様の乳頭腫ウィルスタンパク質もこの定義中に含めることとする。さらに 、ＥｌおよびＥｌのフラグメントがこの定義内にあることが評価され得る。

「制御配列」は、特定の宿主生物体中で操作可能に連結されたコード配列の発現 に必要なりＮＡ配列を指す。原核生物に適切な制御配列は、例えば、プロモータ ー、必要に応じて、オペレーター配列、リポソーム結合部位、および他のまだ十 分に理解されていない配列を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデ ニル化シグナルおよびエンハンサ−を用いることが知られている。

「発現系」とは、制御可能な結合に所望のコード配列と制御配列とを含有し、こ れによりこれら配列により形質転換された宿主がコードされたタンパク質を産生 じ得る、ＤＮＡ配列を意味する。形質転換を行うためには、発現系はベクター上 に含まれ得るが、このときは適切なりＮＡもまた宿主染色体に統合され得る。

本明細書で使用される「細胞」、「細胞系」、および「細胞培養物」は、同じ意 味に使用され得、またこれら名称のすベてが子孫を包含する。従って、「形質転 換体」または「形質転換細胞」は、転移数には関係なく、−次主細胞（ｐｒｉ■ ａｒｙ　５ｕｂｊｅｃｔ　ｃｅｌｌ）およびこの細胞由来の培養物を包含する。

また、すべての子孫は、故意あるいは故意ではない突然変異かによって、ＤＮＡ 含量が正確に同一であるとは限らないことは理解される。最初に形質転換された 細胞で、スクリーンされたものと同じ機能性を有する突然変異子孫が包含される 。

不明瞭な名称が表わそうとするものは、文脈から判明される。

本発明で使用される「薬学的に受容可能な」という用語は、活性成分の生物活性 の効果を妨害せず、また投与される宿主にとって毒性ではないキャリアー媒体を 意味する。投与は皮下および非経口投与を含むいかなる適切な方法によっても行 い得るが、非経口投与が好適である。非経口の例としては、静脈内、動脈内、筋 肉中、腹膜内投与が含まれるが、静脈内投与が好ましい。

本明細書で使用される「予防または治療」措置という用語は、乳頭腫ウィルス薬 物を宿主に投与することを意味する。

これがウィルスに曝す前に投与される場合はこの措置は予防であり（すなわち、 宿主が感染することを防ぐ）、一方、感染または発病後に投与される場合はこの 措置は治療である（すなわち現存する感染症まｔ：はがんと戦う）。

本明細書で使用される［乳頭腫ウィルス症Ｊという用語は、がんおよびゆうぜい を含むこのウィルスにより生じるすべての種類の病気を意味する。

本明細書に記載の本発明は、乳頭腫ウィルス６８ｋＤ　Ｅｌ複製タンパク質およ び４８ｋＤ　Ｅｌ）ランスアクティベータタンパク質がＥ　１／Ｅｌ複合体を形 成し、この複合体が複製のウィルス源に結合し、これによりウィルスＤＮＡ合成 を行うことを示す。以下、の記述において、ＥｌおよびＥｌの参照は、これらの タンパク質または同様の分子量および機能を有するタンパク質を指すことは理解 される。中心となる機能特性は、これらウィルスＤＮＡ合成を開始するときに包 含される複合体を形成するタンパク質の能力である。Ｅｌ／Ｅ２複合体形成のイ ンヒビターは、ウィルス複製を阻害し、乳頭腫ウィルス症の措置についての薬物 として適切に使用される。従って、Ｅｌ／Ｅ２？Ｊ［合体形成を阻害するこれら の能力によって薬物をアッセイするためには、ＥｌおよびＥ２タンパク質の適切 な源がアッセイを実行するために必要とされる。ＥｌおよびＥｌは好ましくは組 換えにより産生され、また様々な既知の生化学的精製方法またはその改良法を使 用して単離される。

一般的に、組換えＥｌまたはＥｌの産生は通常、以下のことを包含する。

先ず、タンパク質をコードするＤＮＡが得られ、これらタンパク質の発現は、こ れらを処理し得る適切な発現系で得られ得る。この配列は切除可能および回復可 能な形態であるべきである。

次に切除または回復されたコード配列は、好ましくは複製可能な発現ベクター中 で適切な制御配列と制御可能な結合で配置される。ベクターは適切な宿主を形質 転換するために使用され、形質転換された宿主は、組換えタンパク質の産生を行 うのに好適な条件の下で培養される。

各々の前述の工程は様々な方法で行われ得る。様々な宿主で制御可能な発現ベク ターについての構築は、以下に示すような適切なレプリコンおよび制御配列を使 用して行われる。

正常に得られない場合は、適切な制限部位が、コード配列の末端に付加され、こ れにより切除可能な遺伝子を提供してこれらベクターに挿入し得る。

制御配列、発現ベクター、および形質転換方法は、遺伝子を発現するために使用 される宿主細胞のタイプに依存する。

一般に、原核、イースト、昆虫、または哺乳類の細胞が現在は宿主として有用で ある。一般に原核細胞宿主が組換えタンパク質の産生には最も効果的かつ好都合 であるが、真核細胞、および特に哺乳類細胞または昆虫細胞が処理能力に関して は好適である。

原核細胞は、Ｅ、　ｃｏｌｉの様々な株により最も頻繁に記述される。しかし、 例えばＢａｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓなどのバクテリア、様々な種のＰｓ ｅｕｄｏ＋５ｏｎａｓ、または他の細菌株のような他の微生物株もまた使用され 得る。このような原核細胞系においては、宿主と適合し得る種由来の複製部位お よび制御配列を含むプラスミドベクターが使用される。例えば、Ｅ、　ｃｏｌｉ は通常は、Ｂｏｌｉｖａｒら、１９７７、Ｇｅｎｅ　ｉ：９５によるＥ、　ｃｏ ｌｉ種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２の誘導体を使用して形質転換される 。ｐＢＲ３２２はアンピシリンおよびテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含 有し、従って所望のベクターを構築するとき保持または破壊され得る追加マーカ ーを提供する。通常使用される原核細胞制御配列は、本明細書ではリポソーム結 合部位配列と共に転写開始のためのプロモーターを、任意にオペレータも共に、 含むと定義されるが、ベーターラクタマーゼ（ベニシリナーゼ）およびラクトー ス（ｌａｃ）プロモーター系（Ｃｈａｎｇら、１９７７、　Ｎａｔｕｒｅ　１９ ８：１０５６）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌら 、１９８０．　Ｎｕｃ　ｅ　ｃ　Ａｃ１ｄｓ　ｅｓ、、　ｉ：４０５７）、およ びラムダ由来のＰＬプロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、１９８１．１ｊａｔ ｕｒｅ　２９２：１２８）のような通常使用されるプロモーター、およびポータ プルな制御カセットとして有用化されているＮ−遺伝子リポソーム結合部位を含 む。これについては、全体を本明細書に参考文献として援用する１９８７年１２ 月８日付けの米国特許第４．７１１．８４５号に記載されており、Ｎｑｅｓ配列 の３°側の６塩基対内で（ｗｉｔｈｉｎ　６ｂｐ３’　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎｕ８ｓ 　５ｅｑｕｅｎｃｅ）開裂可能な少なくとも１つの制限部位を有する第３のＤＮ Ａ配列より上流側のＮＦ１９Ｓに対応する第２のＤＮＡ配列に制御可能に結合さ れたＰＬプロモーターである第１のＤＮＡ配列を有する。全体を本発明に参考文 献として援用する１９８７年５月１９日付けの米国特許第４．６６６、８４８号 は、発現能力が向上した追加ベクターについて開示している。また、本明細書に 参考文献として援用する１９８６年１０月８日付けのＣｈａｎｇらによる欧州特 許公開第１９６．８６４号に記載されているホスファターゼＡ　（ｐｈｏＡ）系 も有用である。

しかし、原核細胞と適合可能で利用可能なプロモーター系はすべて利用され得る 。

ＥｌおよびＥ２核酸配列は、プライマーを使用してベクターへクローン化され得 る。それは１９８７年７月２８日付けの米国特許第４．６８３，１９５号、１９ ８７年７月２８日付けの米国特許第４．６８３．２０２号および全体を本明細書 に参考文献として援用する１９８９年１月２４日付けの米国特許第４，８００． １５９号に開示されている一般的な方法に従って、非相補末端に制限部位を含有 する配列を増幅させる。熱安定なＴｈｅ　ｍｕｓ　ａ　ｕａｔｉｃｕｓ　（Ｔａ ｑ）　Ｄ　Ｎ　Ａポリメラーゼの使用を含むこの方法の改変については、全体を 本明細書に参考文献として援用する１９８８年３月２日付けの欧州特許公開第２ ５８．０１７号に記載ならびに特徴付けられている。また、全体を本明細書に参 考文献として援用する１９８７年９月９日付けの欧州特許公開第２３６．Ｏｆ＋ ９号に記載されているＴｈｅｒｍａｌ　Ｃｙｃｌｅｒ器機（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌ ｍｅｒ−Ｃｅｔｕｓ）もまた有用である。

一般に、クローン化される核酸配列は、各株に対して１つのオリゴヌクレオチド ブライマーで処理され、各核酸株に相補的である各プライマーの伸張産生物が合 成される。ＥｌおよびＥ２タンパク質をＰＣＨのためのテンプレートとしてコー ドするプラスミドＤＮＡを使用することに代わる方法は、米国特許第４．８００ ．１５９号に記載のように、これらタンパク質を産生するすべての細胞由来のＲ ＮＡをＰＣＨに対するテンプレートとして使用することである。ＲＮＡが利用可 能な出発材料である場合は、その相補体から分離されるとき１つのプライマーか ら合成される伸張産生物は、他のプライマーの伸張産生物の合成のためのテンプ レートとして役立ち得る。前述のように、各プライマーは、５°末端に制限部位 を含む。この制限部位は他のプライマーの制限部位と同じかまたはこれと異なる 。十分な増幅が行われた後、増幅産生物は適切な制限酵素により処理され、制限 消化物中に開裂産生物が得られる。次にクローン化される所望のフラグメントが 単離され、適当なりローニングベクターへと結合される。

配列改変を必要とするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ由来のベクターの部分につい ては、部位特異的プライマー指向の変異誘発が使用される。この方法は当該分野 では現在標準であり、小数の非適合を除けば変異誘発される一本鎖状のファージ ＤＮＡに相補的であるプライマー合成オリゴヌクレオチドを使用して行われ、所 望の突然変異を示す。簡潔に述べれば、合成オリゴヌクレオチドは、ファージに 相補的である一本鎖の合成するプライマーとして使用され、得られる二本鎖ＤＮ Ａはファージ支持宿主細菌へ形質転換される。形質転換された細菌の培養物は寒 天に置かれ、ファージを含む単一細胞からのプラーク形成が可能となる。

所望のＥｌおよびＥ２コード配列を含有する適切なベクターの構築は、当該分野 で公知の標準的な結合および制限方法を使用する。単離されたベクター、ＤＮＡ 配列、または合成オリゴヌクレオチドは所望の形態に開裂、適応（ｔａｉｌｏｒ ）、および再結合される。

部位特異的ＤＮＡ開裂は、当該分野で一般的に理解される条件、およびこれら市 販の制限酵素の製造業者により特定される事項の下で適切な制限酵素により処理 することにより行われる。例えば、Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｌｏｌａｂｓ、 　Ｐｒｏｄｕｃｔ　Ｃａｔａｌｏｇを参照せよ。一般には、約ｌｔｔｇのプラス ミドまたはＤＮＡ配列が約２０μｌの緩衝溶液中で１単位の酵素により開裂され る。

本明細書に示す実施例では、ＤＮＡ基質の完全な消化を確実にするために過剰の 制限酵素が使用される。約３７℃で約１〜２時間のインキュベージコン時間が実 行可能であるが、変動も可能である。各インキュベーション後、タンパク質はフ ェノール／クロロホルムによる抽出で除去され、次にエーテル抽出が行われ得、 回収された核酸は、エタノールによる沈澱、次に５ｅｐｈａｄｅｘ　Ｇ−５０ス ピンカラムを使用するクロマトグラフィにより、水相フラクションを形成する。

所望であれば、開裂フラグメントのサイズ分離は、標準の方法を用いたポリアク リルアミドゲルまたはアガロースゲル電気泳動により行われ得る。サイズ分離に ついての一般的な記述はＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚ１珈Ｊ１．１９８０．廷 ・４９９−５６０に示されている。

制限開裂フラグメントは、５０＋ｅＭのトリスｐＨ７，６，５０ｍＭのＮａＣ１ 、６ＩＩＭのＭｇＣ＋２．６＋＋ＭのＤＴＴおよび１０ｍＭのｄＮＴＰ中で２０ 〜２５°Ｃで約１５〜２５分のインキュベーンコン時間を使用して、４つのディ オキシヌクレオチドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）の存在下で、Ｅ、　ｃｏｌｔ 　ＤＮＡポリメラーゼ■の大きなフラグメント、すなわちフレノウフラグメント により処理することにより鈍端とされ得る。フレノウによる処理の後、混合物は フェノール／クロロホルムおよびエタノールを沈澱させて抽出される。Ｓｔヌク レアーゼによる適切な条件下での処理により、一本鎖部分が加水分解される。

結合は以下の標準的な条件および温度の下で１５〜３０μｌ容量テ行ワレル。ｔ 　すｈ　チ２０ｍＭ（７）　ｌ−’Ｊ　ス−ＣＩ　ｐＨ７，５，１０ｍＭ（７） 　ＭｇＣｌ２．１０ｍＭのＤＴＴ、　３３μｇ／ｓｌのＢＳＡ、　１０ｍＭ〜５ ０ａＭのＮ　ａＣＬ　および１ｍＭのＡＴＰ、　０．３〜０．６　（Ｗｅｉｓｓ ）単位Ｔ４　ＤＮＡ　リガーゼ、１４℃、「粘着性末端」結合用または「鈍端」 結合用には、１ｍＭ　ＡＴＰを使用、および０．３〜０．６　（ｆｅｉｓｓ）単 位Ｔ４リガーゼ。分子間「粘着性末端」結合は通常は３３〜１００μｇ／１１１ 全ＤＮＡ濃度で行われる。鈍端結合では、末端の全ＤＮＡ濃度は約ｌμＭである 。

「ベクター断片」を用いたベクター構築物において、５°ホスフヱートを取り除 き、且つ、ベクターの再結合を阻止するために、ベクター断片を通常、細菌性ア ルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）により処理する。ＢＡＰ消化は、約１５０ｍＭ トリス中においてｐＨ８で、Ｎａ’およびＭｇ　’　２の存在下において、ベク ター１μｇにつき約１ユニツトのＢＡＰを用いて６０’Ｃで約１時間行われる。

フェノール／クロロホルムにより調製物を抽出し、その後、エタノール沈澱によ り、核酸断片を回収する。また、所望でない断片をさらなる制限酵素消化により 二重に消化して得られたベクターにおいても、再結合は阻止され得る。

以下に述べる構成において、まず適切なＬｉＬＬＬ株を結合混合物により形質転 換させることにより、正確な結合を確認する。良好な形質転換細胞を、アンピシ リン、テトラサイクリンまたはその池の抗生物質に対する耐性により、または、 当［１において理解されているように、プラスミドの構築様式によっては他のマ ーカーを用いることにより、選択する。

ミニブレツブＤＮＡは、Ｄ、１ｓｈ−Ｈｏｖｏｖｉｅｚら、１９８１、Ｎ肛お注 り紅ｉｄｓ　Ｒｅｓ、　９：２９８９の方法により形質転換細胞から調製され得 、且つ、Ｆ、Ｓａｎｇｅｒら、１９７７　ｆｉ、１４：５４６３に記載され、さ らにＭｅｓｓｉＢら、１９１１１　Ｎｕｔ　ｅｉｃ　ｃｌｄｓ　ｅｓ、、隻：３ ｏｓに記載されているジデオキ７法、またはＭａｘａｉら、１９８０■ｔｈｏｄ ｓ　ｉｎ　Ｅｒｌカｍ、６５：４９９の方法により制限および／または配列され ることにより分析され得る。

ＭＩ３におけるクローニングに用いられる宿主株は、ファージ感染し易いＥ、　 ｃｏｌｔ株から成り、Ｅ、ｃｏｌｔ　［１２株Ｄ０９Ｂのようなものが用いられ る。ＤＧ９８株は、１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに寄託され、受諾番号１９ ６５を得ている。

用いられる宿主細胞によっては、形質転換は、このような細胞に適した標準の技 術を用いて行われる。Ｓ、　Ｎ、　Ｃｏｈｅｎ、　１９７２　ｆｉ　６９：２１ １０に記載されているような塩化物を用いたカルシウム処理、または、Ｍａｎｉ ａｔｉｓら、１９８２　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｏｎｔｎ　°Ａ　Ｌａｂｏ　ａ ｔｏｒ　Ｍａｎｕａ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ。

ｐ、　２５４に記載のＲｈＣＩ２法を、原核生物のために用いた。

上記のように、ＥｌおよびＥ２のクローニングおよび発現のために、数々の組換 えシステムが使用可能である。しかし、好適な／ステムは、バキュロウィルスで ある。したがって、本発明を説明するために、バキュロウィルス中に発現したウ シの乳頭震ウィルス構築物を用いてＥｌおよびＥ２を調製した。本明細書で用い られるバキュロウィルストランスファーベクター、たとえばｐＡｃｃ１３は、上 記のＧ、　Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈらによる１９８３年の文献に記載のトランスファー ベクター由来のものである。これらのベクターを元来、Ｖｉｅｉｒａら、１９８ ２、Ｇｅｎｅ　ｌｉ：２５９−２６８に記載されているように、ポリヘトリン遺 伝子を含むＡｃＮＰＶ　９ｏＲ１−１断片を、Ｅ、　ｃｏｌｔプラスミドｐｔｌ ｃｌｌのむ立１部位にクローニングすることにより構築した。ポリヘトリン遺伝 子の様々な場所に単一のＢａｍＨｌクローニング部位を有するプラスミドのファ ミリーは、上記のＳｍ１ｔｈらによる１９８３年の文献に記載されているように 生成した。これらのうちで最もよく用いられるｐ＾ｃ’Ａ１’Ａは、ポリへドリ ンキャップ部位から５０塩基対下流、すなわち、ポリヘトリンＡＴＧ翻訳開始コ ドン（ＬｕｃｋｏｖおよびＳｕｍ■ｅｒｓ　１９８８、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ　ｏ ■、６：４７）の８塩基対前に唯一のむＩ■部位を有する。

バキュロウィルスベクターｐＡｃｃ１３を、別のトランスファーベクターｐＡｃ ｃ１２から構築した。ｐＡｅｃ１２は、以前から存在するベクター、特にＬｕｅ ｋｏｖおよびＳｕｍｍｅｒｓＳｉｏｔｅｃ　、　ｉ：４７（１９８８）；米国特 許第４．７４５．０５１号；および欧州特許出願第１２７．８３９号に記載され ているようなｐＡｃ３１１およびｐＡｃ３７３から構築した。さらなる詳細な点 は、Ｓｕ＋ｕ＋ｅｒＳおよびＳｍ１ｔｈ、”Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈ ｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　’／ｅｅｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ−１Ｔｅｘａｓ　Ａ ｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ　５ｔａＬｉｏｎ　Ｂｕｌｌｅ ｔｉｎ　Ｎｏ、　１５５５．１９８７年５月に記載されている。これらの文献の すべては完全に本明細書に援用されている。

要約すると、ｐＡｅｃ！　２を以下のように構築した。Ｍ１３突然変異誘発技術 を用いてトランスファーベクターｐＡｃ３１１に部位特定の突然変異を誘発する ことにより、ポリードリン遺伝子開始コドンＡＴＧをＡＴＴに転換した。得られ たベクターをｐＶＬ９４１と称し、これはＬｕｃｌｔＯｙおよびＳｕｍ＋１ｅｒ ｓが！に掲載した゛旧ｇｈＬｅｖｅｌ　ｏｆ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｎ ｏｎ−Ｆｕｓｅｄ　Ｆｏｒｅｉｇｎ　Ｇｅｎｅｓ　ｗｉｔｈ　Ａｕｔｏｇｒａｐ ｈａ　Ｃａ１ｉｆｏｒｎｉａ　Ｎｕｃｌｅａｒ　Ｐｏ１ｙｈｅｄｒｏｓｉｓ　Ｖ ｉｒｕｓ　Ｅｘｐｒｅｓｓｊｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒｓ”と題された論文に詳細に記 載されている。ＡＴＴ配列の３０塩基対下流の唯一のＢａｍＨ１部位に、ポリリ ンカーを挿入した。ｐＶＬ９４１をＢａｗｌ（Ｉにより消化し、以下に示す配列 を有する、目己アニーリングした２つの相補的オリゴマーＥ）［１２９およ（Ｊ 　ＥＸ　１３０から成るポリリンカーを結合することにより、異なる方位にポリ リンカーを担持するベクターｐＡｃｃ８およびｆ＋Ａｃｃ９を生成した。ポリリ ンカーは、ＥｃｏＲ１用の制限部位および他の制限酵素用の制限部位を有する。

ＥＫ１２９； ｆｆＧＡＴｃｃＡｃＣＡＴＧＧＡＧ　ＣＴｃａＡａＡｒｃｒＡａＡＡｍｃｒａＣ Ａ（３ＣＣＣｏｏＯｒＡｃｃＣ３ＡＥ３　ＥＫ１３０： ５”ＧＡ丁ＣＧＧＴＡＣＣＣＧＧ（３ＣＴＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＡＧＡＴＣＴＣ ＧＡＧＣＴＣＣＡＴＧＯＴＧＧＡＴＣ３’ｐＡｃｃ８およびｐＡｃｃ９は、２つ のむσ■制限部位を有し、一方をポリリンカーに、他方をプラスミドＤＮＡに有 しているため、プラスミドＥｃｏＲ１部位を排除することが望ましい。このこと を、トランスファーベクターｐＡｃ３７３を用いて達成した。ｐＡｃ３７３は、 ポリヘトリン開始コドンにまたがるヌクレオチド配列が異なる以外はｐＡｃ３１ １に類似である。したがって、ベクターを旺註１により完全に消化することによ り扛劇は部位をｐＡｃ３７３から取り除き、適切な反応条件下でフレナラ（Ｋｌ ｅｎｏｖ）断片を用いて末端部をプラントにした。結合およびＥ、　ｃｇＪｌ　 ＤＨ５への形質転換に続いて、ミニブレツブＤＮＡの制限分析により、七σ■部 位を欠（コロニーを同定した。

さらに、ベクターをＢａｍｊ■により消化し、その後、オリゴマーを結合するこ とにより、上記のオリゴマーＥＫ１２９およびＥＫＩ３０から成るポリリンカー を組み込み、■ｍ部位を欠＜　ｐＡｃ３７３を改変した。得られたベクターｐＡ ｃｃ６およびｐＡｃｃ７は、異なる方位でポリリンカーを含む。

最後の構築物であるｐＡｃｃ１２を、ｐＡｅｃ７およびｐＡｃｃ９から生成した 。これらのベクターは、同一の方位でポリリンカーを含む。これらのベクターを 両方とも、ＢｓｔＥＩｌおよびｍにより消化し、得られた断片を電気泳動的に精 製した。ｐＵＣ８配列を含む、ｐＡｃｃ７のＢＳ　ｔＥ旦ル坦■断片および部分 的ポリリンカー配列を、ｐＡｃＣ９の大きなりｓｔＥ旦ル競…断片に結合した。

後者の断片は、ＡＴＴ配列および残りのポリリンカー配列を含む。

最後に、Ｍｕｎｅｍｉｔｅｓｕ、Ｓ、ら、１９９０、ＭＩ　ＣＢｏ、ｌｉ：５９ ７７−５９８２またはＱｕｉｌｌｉａｍ、Ｌ、ら、１９９０、Ｍｏ１．　Ｃ１， Ｂｉｏｌ。

１０：２９０１−２９０８に記載されているように、ｐＡｃｃ１２からｐＡｃｃ １３を誘導した。図１は、プラスミドのマツプを示す。要約すると、４７、ブユ ニットと４．５マツプユニツトとの間のＬ１断片を、以下のポリリンカーを含む 合成オリゴヌクレオチドに置換することにより、ｐＡｃｃ１２からｐＡｃｃ１３ を誘導した。

５’ＧｒＡＣＣＡＣＩＡＴＣｒＧＣＡＧＡＡＴｒＣｒＡＧＡＧＧＡＴＣＣｒＧＡ ＴＣＡＧσＡＧＣＡＧＡＣＯα３ＣＧＧＣα３ＣＣＣＧＧＧＣＣＧＴＡＣ−３゜ ウシの乳頭腫ウィルスＥＩ　ＯＲＦの供給源として、プラスミドｐＭＴＥＩＤＭ を用いることによりトランスファーベクターｐＡｃＥ１を生成した。この構築物 は、５ｈａｖ　Ｓｕｎら、１９９０、Ｊ、　ｏｆ　Ｖｉｒｏｌ。

Ｕ工６４：５０９に詳細に記載されているプラスミドｐＭＴＥ１から誘導された 。ｐＭＴＥＩＤＭは、ｐＭＴＥＩＤＭがヌクレオチド１２３６においてＧがＡに 置換されている以外は、本質的にｐＭＴＥｌと同一である。

この置換は、スプライスされたＭタンパク質の生成を阻止する。したがって、ｐ ＭＴＥＩＤＭにより生成された６８　ｋＤ　ＥＬタンパク質は、染色体外要素と してウシの乳頭腫ウィルスＤＮＡを保持する。次に、Ｘｂａｌ断片をフードする ＥｌをｐＭＴＥＩＤＭから取り除き、上記断片をトランスファーベクターｐＡｃ ｃ１３の匣部位に挿入することにより、トランスファーベクターｐＡｃＥ１を生 成した。

ｐＭＴＥＩＤＭからの、Ｘｂａｌ断片をコードするＥｌが、バキュロウィルスポ リヘトリンプロモーターの下流にあることは注目すべきである。

組換えウィルスを生成するために、ＳｕｍｍｅｒｓおよびＳｍ１ｔｈ、”Ａ　Ｍ ａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ　Ｖｅｃ ｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｐｒｏｃｅｄｕ ｒｅｓ−１Ｔｅｘａｓ　Ａ　＆　Ｍ　Ｐｒｅｓｓ：１９８６に記載されているよ うに、２μｇのトランスファーベクターを１μｇの野生型ＤＮＡでＳｆ９細胞に 同時トランスフェクトした。Ｓｍ１ｔｈら、１９８３、凪■、　Ｃｅロエ」１（ 社）ニジ：２１５６−２１６５に記載されているように、プラーク精製により、 組換えウィルス（吸蔵（ｏｃｃｌｕｓｉｏｎ）陰性）を、トランスフェクシコン 上澄から単離した。タンパク質の生成をウェスタン分析法によりモニターした。

好適な電気泳動工程は、Ｂｕｒｎｅｔｔｅ、　１９８１、Ａｎａｌ、　Ｂｉｏ、 　Ｃｅｔ、１１２：１９５に記載されているようなウェスタンプロットゲル分析 法である。ウェスタンプロットを、１５０■Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ７，，４） 、０．１％牛血清アルブミン（ｖ／ｖ）、および０．１％オバルブミン（Ｖ／Ｖ ）を含む、好適には１０■Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液中でブロックし、洗浄し 、そしてプローブする。さらに、好適にはＴｗｅｅｎ　２０のような界面活性剤 を濃度的０．１％で用いる。上記溶液にはアジ化ナトリウムもまた、濃度０．０ ２％で含まれ得る。

プロットを洗浄し、Ｘ線フィルムを用いたオートラジオグラフィーにかける。

Ｅｌを発現するバキュロウィルスを同様に調製した。Ｅ２発現ベクター構築物お よび特異的オリゴヌクレオチドアフィニティークロマトグラフによるＥ２タンパ ク質の精製の詳細は、ＫｎｉｇｈｔおよびＢｏｔｃｈａｎ、　１９９１、ＰＮＡ Ｓ　（ＵＳＡ）に記載されている。

組換えＥｌを生成するために、Ｓｆ９細胞を、細胞あたり組換えウィルスの５− １０　ＰＦＵで感染させた。Ｓｆ９細胞を感染させ、かつ、成長させる方法は、 当該分野で公知であり、詳細な工程は、Ｍ、　ＳｕｍｍｅｒｓおよびＧ、　Ｓｍ １ｔｈＳ”Ａ　Ｍａｎｕａｌ　ｏｆ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｆｏｒ　Ｂａａｕｌｏｖ ｉｒｕｓ　Ｖｅｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ−１Ｔｅｘａｓ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｅｘｐｅ ｒｉｍｅｎｔ　５ｔａｔｉｏｎ、Ｂｕｌｌｅｔｉｎ　Ｎｏ、１５５５　（１９８ ７年５月）またはＧ、　Ｅ、　Ｓｍ１ｔｈおよびＭ、　Ｄ、Ｓｕｍｍｅｒｓ、Ｅ ＰＯ１２７，８３９に記載されている。好適な媒地および培養条件は、１９８７ 年７月２４日出願の”Ａｉｒｌｉｆｔ　Ｉｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｃｕ１ｔｕｒ ｅ”と題された上記２人による同時係属中の米国特許出願第７７．１８１号、− Ｓｅｒｕｍ　Ｆｒｅｅ　Ｍｅｄｉａ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　Ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　Ｉ ｎ５ｅｃｔ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｒｏｄｕｃ ｔｓ　Ｔｈｅｒｅｂｙ−と題された米国特許出願第７７．３０３号、およびＬｉ ｐｉｄ　Ｍｌｃｒｏｅｍｕｌｓｉｏｎｓ　ｆｏｒ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｍｅｄｉａ ”と題された米国特許出願第７７、１８９号に記載されている。これらの公報お よび特許出願は、本明細書に参考のため援用されている。

Ｓｆ９細胞を、１　ｍｌあたり１−１５　Ｘ　１０６細胞の割合で感染させ、感 染後４８時間で回収した。感染した細胞のペレットを液体窒素中で凍結し、７０ ℃で保存した。細胞を解凍することにより溶解させ、その後ただちにハイポ緩衝 液（１０＋ｓＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ？。

４．５　ｍＭ　）ｆｃｌ、１　ｍＭ　ＭｇＣｌ２．１　＋ｓＭ　ＤＴＴ、１０　 ｍｇ／ｍｌロイペプチン、１　ｍＭ　ＰＭＳＦ）　５ベレツト容量中に懸濁した 。ダウンス（ｄｏｕｎｃｅ）ホモジナイザー（Ｂ−ｐｅｓｔｌｅ）の１８ストロ ークにより、核両分を調製し、その後、５．０００　ｘ　ｇで１０分間遠心分離 （ＨＢ４０−ター）することにより混合物を浄化した。ペレットをＮｕｅｌｅｉ ｃ　Ｗａｓｈ緩衝液（２０＋１Ｍ　）リス−ＨＣＬ　ＰＨ８，０，１ｄ　ＤＴＴ 、１　ｍＭ　ＥＤＴＡ、１＋ｅＭ　ＰＭＳＦ、１０μｇ／ａｌロイペプチン、１ ０％スクロース）により２度洗浄し、ハイポ緩衝液５ペレツト容量中に懸濁した 。ＮａＣ１を最終濃度０．３Ｍになるまでゆっくりと添加し、混合液を４℃で３ ｏ分間ゆっくりと攪拌した。ＲＢ４０−ターで１ｏ分間、１０．００Ｏｒｐｍテ 遠心分離した後、０．３　Ｍ　ＮａＣ１（Ａ／３００）を含む緩衝液Ａ（２０ｍ Ｍ　）　’Ｊ　ス−１４ＣＩ　ｐＨ８，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％り’）セａ −／ｌ／、０．０５％　トリトンＸ−１ｏｏ）中で平衡したＤＥＡＥセファロー ス速流カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に、上澄を適用した。カラムを、Ａ／３０ ０の３容量で洗浄し、これは、ＤＥＡＥ通過画分に沿って、緩衝液Ａにより０． ２　Ｍ　ＮａＣ１に調整した。その後、個々の部分を、Ａ／Ｚｏｏ中で平衡した ホスホセルロースＰ−１１マトリクス（Ｗｈａｔｓａｎｎ）　ニｔｌｌｉ　ニ適 用した。カラムをＡ／２００で洗浄し、０．４　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａで 溶出し、その後、Ｉ　Ｍ　ＮａＣ１を含む緩衝液Ａで、段階的に溶出した。その 後、これらの個々の部分をＡ／Ｚｏｏ　（５００ｍｌを各々２５分ずつ約４度交 換）に対して透析し、必要に応じて緩衝液Ａで０．２　Ｍ　ＮａＣ１に調整した 。各々のプールを別々に、２５−Ｍト’Ｊ　スｐＨ８，０，２００＋ｓＭ　Ｎａ Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、５％グリセロール、０．１％トリトンＸ−１００中で 平衡したＭｏｎｏＱ　５１５カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用した。カラム をこの緩衝液で洗浄した。その後、同一の緩衝液中でＩ　Ｍ　ＮａＣ＋で段階的 に溶出した。Ｅｌを含む部分をウェスタンブロッティング法で同定し、プールし 、そして、示された量を本発明を説明するために用いた。

（以下余白） Ｅｌ、Ｃ２、またはＥｌおよびＣ２からなる複合体が乳頭腫ウィルスＤＮＡに結 合することを証明するため、好ましくは、乳頭腫ウィルスＤＮＡ複製の起点と相 同な配列を有する、Ｃ２に結合するＤＮＡを用いる。また、乳頭腫ウィルスゲノ ムが多数の利用し得るＣ２結合部位を含むことも、注目すべきである。実際、ウ シ乳頭腫ウィルスゲノムは約１７の８２結合部位を含む。従って、精製されたＥ ｌ、Ｃ２、またはこれらのタンパク質の混合物が乳頭腫ウィルス起点ＤＮＡと結 合する能力は、下記のように標識化ＤＮＡフラグメントを用いて研究された。

プラスミド、ｐＵｃ２３７は、ｐｕｃｔａ中にクローンされた、ＢＰＶ−１の独 創ヨ慣〔フラグメン）　（ｎ、　ｔＪ６１３２−９４５）上の、乳頭腫ウィルス の起点配列を含む（ＹａｎｇおよびＢｏｔｃｈａｎ、（１９９０年、Ｌ二１皿ｎ 訂、６４：５９０３−５９１１））。起点ＤＮＡを調製してＣ２存在下のＥ１結 合を証明するために、このプラスミドを旧ｎｄｌｌ＋、註、およびＥｃｏＲＩで 消化し、子ウシ腸アルカリホスファターゼで処理し、その後にγ−３２Ｐ　ＡＴ Ｐでキナーゼ処理した。標識化ＤＮＡをフェノールおよびクロロホルムで抽出し 、そしてエタノールで沈澱させた。４μｍの部分的に精製されたＥｌを、２５　 ｎｇの標識化ｐＵＣ２３７と、種々の量の精製されたＣ２の存在下または非存在 下に、最終的な容量を５０μｌとしてインキュベートした。結合用緩衝液は１０ ５Ｍ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ？、４．１００ｍＭ　ＫＣＩ、　１＋ｍＭ　ＭｇＣｌ２ ．５％グリセロール、１μＭ　ＤＴＴ、　および２０ｕｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮ Ａがらなった。反応の最終的なイオン強度は１６０＋ａＭから２００＋ｍＭの間 に保たれた。反応物を３７°Ｃで４０−５０分間インキコベートした後、室温に 戻した。１．５μｌの抗Ｅ１ポリクローナル血清を次に加え、そして２０分間イ ンキュベートを続けた。５０ｍＭ　Ｉ（ｅｐｅｓ　ｐＨ７，４，２゜ＯｍＭ　Ｎ ａＣ１、ＳｍＭ　ＥＤＴＡ％０．０５％トリト：／Ｘ−１００２０μｇ／ｍＨＤ 　サケ精子ＤＮＡで平衡化した、ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐ ｈａｒｖａｃｉａ）の１０％懸濁物１００μｌを加え、そして反応物を室温で５ ０分間振盪した。

ヒースヲヘレット化し、５０ｍＭ　Ｈｅｐｅｓ　ｐＨ７，４，２００ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．０５％トリトンｘ−ｔｏｏで３回洗浄した。反 応物を抗Ｅ２組織培養液上清でさらに希釈することを防ぐため、反応物に加える 前に、Ｃ２モノクローナルＢ２０２をｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ ビーズ（１００μｌの１０％ｐｒｏｔｅｉｎ　Ａ　５ｅｐｈａｒｏｓｅにつき５ ０μｉの８２０２）に予備結合した。あるいは、１０μｇの純粋なり２０２を加 え、そして抗Ｅ１に関して記載したように免疫沈降を行った。８２０２は、７５ ０　Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ　５ｔｒｅｅｔ、ボストン、マサチューセッツ州ｏ２ １１１のＮｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｍｅｄｉｃａｌ　ＣｅｎｔｅｒＳＴｕｆｔｓ 　ＵｎｔｖｅｒｓｉｓＬｙ　５ｃｈｏ。

ｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｄｅｒｍａｔｏｌ ｏｇｙにおいてＥｌｌｉｏｔＡｎｄｒｏｐｈｙから入手し得る。最終的なペレッ トを１％ＳＤＳおよび２５ｍＭ　ＥＤＴＡに再懸濁し、６５℃で１５分間保持し た。次に反応物を２０ｍＭ）　’）　’Ｘ　ｐＨ８，ｏｌコ調整し、プロティナ ーゼＫを、５０μｇ／ｍｌになるように加えた。３７”Ｃで６０分後、５μｇの キャリアーｔ　ＲＮＡを加え、反応物をフェノールおよびクロロホルムで抽出し 、そしてエタノールで沈澱させた。免疫複合体から精製されたＤＮＡフラグメン トを、５％の化ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。ゲルをＤＥ−８１ ろ紙（ｌｆｈａｔｍａｎ）上で乾燥し、Ｋｏｄａｋ　ＸＡＲフィルムに感光した 。

図２は、実質的に純粋なＥｌが、Ｃ２結合部位５−１３を含む１．４ｋＤのバン ドに弱い親和性を示すことを示す。さらに、この図において、この弱い結合が４ ８ｋＤのＣ２タンパク質の存在により刺激されることを示す。すなわち、一定量 のＥｌの存在下にＣ２量を増加させることは、結合されるＤＮＡフラグメントの 量を増加させる。対照実験は、抗Ｅ１抗体を用いる免疫沈降実験によって明らか にされたように、Ｅ１タンパク質非存在下においてはＣ２のＤＮＡフラグメント への結合は検出されないが、しかし抗Ｅ２抗体を用いる免疫沈降実験によっては 検出され得ることを、明らかにした。Ｃ２のより高濃度においては、より弱いＣ ２結合部位を有するより小さなフラグメントもまた、Ｃ２抗体で観察される。従 って、Ｃ２４８ｋＤタンパク質がＥ１タンパク質のＤＮＡとの会合を著しく促進 することは明白である。

前記実験のＥｌ／Ｅ２複合体によって結合された特異的なりＮＡフラグメントは 、ヌクレオチド７４８０−９４５に及んだ。Ｅｌ／Ｅ２複合体によって認識され たｃｉｓ成分を詳述するために、結合基質を調製して、異なる制限酵素で消化し た。タンパク質ＤＮＡ複合体を次に、抗Ｅ１または抗Ｅ２のいずれかで免疫沈降 し、そして前述のように処理した。精製されたＣ２タンパク質（抗Ｅ２で免疫沈 降した）は、Ｄｄｅ／Ｃｌａ混合物中の５９６　ｂｐフラグメントおよびＤｄｅ ／Ｔａｑ混合物中の３１９　ｂｐフラグメントに結合したく３Ｃ）。この３１９ 　ｂｐフラグメントはヌクレオチド７４７フー７７９６に及び、モしてＣ２結合 部位５−１０を含む。このフラグメント上には、転写の制御に関するＤＮＡ配列 （Ｓｐａｌｈｏｌｚ、　Ｂ、ｉ、１９８７年、Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、、　旦ｉ：２ １２８−２１３７）に存在するおよび復製の起点が存在する（Ｙａｎｇ。

Ｌ、およびＢｏｔｃｈａｎ、　Ｍ、　１９９０年、ムーｕ工如工、　６４：５９ ０３−５９１１）。

図３は、抗Ｅ１で免疫沈降した結合実験の結果を示す。部分的に精製されたＥ１ タンパク質は、Ｃ２非存在下で弱い特異的ＤＮＡ結合活性を示す。精製されたＣ ２の添加量の増加は、５９６　ｂｐ　Ｄｄｅ。

Ｃ１ａフラグメントまたは３１９　ｂｐ　Ｔａｑフラグメントのいずれかに対す る結合を増加した。このことは、Ｅｌ／Ｅ２複合体が、Ｅ２ＲＥ１転写増強成分 を含む配列と特異的に結合することを証明する。

適切な初期タンパク質が乳頭腫ウィルスＤＮＡと結合し得ることを証明した後、 Ｅｌ／Ｅ２複合体の存在を示すための研究に着手した。このことは、Ｓｆ９昆虫 細胞を、Ｅｌ、Ｃ２のいずれかを発現するバキュロウィルス、または両方のウィ ルスで感染させ、次にＥｌ／Ｅ２複合体形成が起こったかどうかを細胞を分析し て確認することからなった。これは、以下のように行った。Ｓｆ９細胞を３５Ｓ メチオニンで標識し、細胞抽出物をＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅに通して内因 性の核酸を除去した。抗Ｅ１または抗Ｅ２抗体を用いて免疫沈降物を形成させ、 これをオートラジオグラムと組み合わせた電気泳動によって分析した。

免疫複合体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動にかけ、オートラジオ グラムにより検出した。分子量マーカーを右に示す。標識化「抗血清」の行の番 号は、抗Ｅｌ（１）または抗Ｅ（２）抗体に対応する。３Ｘ　１０６のＳｆ９細 胞を、懸濁培養液から６Ｃ■プレートに移した。単層を次に、Ｅｌ、Ｃ２のいず れかまたは両方の組換えバキュロウィルスで感染させた（感染の多重度は重感染 につき約１０で、共感染についてはそれぞれのウィルスの５つであった）。感染 後４８時間で、感染した細胞を、１０％の透析したウシ胎児血清を含むＧｒｉｃ ｅのメチオニン欠乏培地で１時間、飢餓状態にした。細胞を、１００μＣｔの３ ６Ｓ変換樟識（ＩｃＮ）を含む０．７５ｍ１の培地中で５時間、Ｉｎｋ化した。

抽出物を、０．５ｍｌの５０ｍＭ　Ｒｅｐｅｓ　ｐＨ？、６．３００ｍＭ　Ｎａ Ｃ１，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．５％ＮＰ４０．１０μｓ／ ｍｌのロイペプチン、１■Ｍ　ＰＭＳＦで細胞を溶解して調製した。プレートを ０℃でＳ０分間インキュベートした後、内容物をマイクロフユージチューブ内に かき取り、２分間回転した。上清を、溶菌緩衝液で平衡化したべ・ソドヴオリュ ームを０．２１のＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｐａ５ｔ　ｆｌｏｗ（Ｐｈａ ｒｉ＋ａｃｌａ）を含む容器に移した。混合物を、４℃で５分間回転し、マイク ロフユージ中で回転し、そしてＣ１，４ｍｌの溶菌緩衝液で樹脂を洗浄した。プ ールした上清の０．２　ｍｌを、ＯＪ　ｍ＋１の５０＋ｍＭ　）ｌｅｐｅｓ　ｐ Ｈ７，６，２００ｍＭ　ＮａＣｌ、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、１０％グリセロールで希 釈した。抗Ｅ１または抗Ｅ２抗体のいずれかで予備結合したｐｒ□ｔｅｉｎＡ　 ５ｅｐｈａｒｏｓｅ　（１００＋ｅＭ　ＮａＣ１を含む溶菌緩衝液中の）を次に 加え、反応物を４℃で１時間回転した（それぞれの反応物には、６μｌの親和性 精製された抗Ｅ１ポリクローナル抗血清または５０μｌの抗Ｅ２　Ｂ２Ｏ２組織 培養液上清のいずれかの等量を加えた）。ビーズをマイクロフユージ中でベレッ ト化し、そして５０諺Ｍ　ＲａｐｅＳ　ｐＨ１，６，２００＋＊Ｍ　ＮａＣ１， １＋ｅＭ　ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、０．０５％ＮＰ−４０で４回洗浄し た。ベレ１トをＬａｅ＋ｉｌｉ緩衝液で煮沸し、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル 上で電気泳動した。ゲルを固定し、乾燥し、そしてＫｏｄａｋ　ＸＡＲフィルム に感光すせた。

図４は、種々の免疫沈降の対照を示す。すなわち、抗Ｅ１が６８ｋＤ　ＥＬを沈 降させ、一方で抗Ｅｚが４１１ｋＤ　Ｅｚを沈降させることを示す。さらに、最 も重要なことには、抗Ｅ１および抗Ｅ２の両方が、両方の組換えバキュロウィル スで共感染させた細胞からの６８ｋＤ　Ｅｌおよび４８ｋＤ　Ｃ２を免疫沈降さ せる。従って、このことは、ＥｌおよびＣ２も物理的な複合体を形成し、そして そのような複合体が外因性の核酸の非存在下で形成することを確証する。

図５Ａは、固定したＢ２Ｏ２抗Ｅ２を含む免疫アフィニティーマトリックスから 溶出した両分のＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。ＬおよびＦは、それぞれ 、投入およびフロースルーを示し、レーンＥは、カラムから溶出された物質を示 す。ゲルを銀で染色した。モしてＭＷママ−−（レーンＭ）は、以下の通りであ る：　２００ｋＤ、　１１６ｋＤ、　９７ｋＤ、　６８ｋＤ、　４５ｋＤ、　３ ０ｋＤ、組換えＥｌおよびＣ２ウィルスが同時感染したＳｆ９細胞から調製した ４００ｍＭのホスホセルロース画分を、緩衝液ＡでＡｌ２Ｏ２に調整し、固定し たＢ２Ｏ２を含むカラムに投入した。この樹脂を、ｌＯ容量のＡｌ２Ｏ２，５０ 容量の緩衝液Ａ＋ＩＭのＬｉＣｌで洗浄し、さらに、１０容量のＡｌ２Ｏ２で再 平衡した。タンパク質を２０ｍＭのトリエチルアミンで溶出し、画分を１７２０ 容量のＩＭのＨｅｐｅｓ　ｐＨ７，４ですばやく中和した。ピーク断片をプール し、ドライアイスエタノール浴でス急速凍結し、−７０℃に保存した。ｌｏｏｍ ＭのトリスｐＨ８，０（樹脂１ｍｌ当り６０Ｄ２１１９抗体）中で純粋なり２０ ２抗体をタンパク質Ａセファロースと共に回転装置上４℃で一昼夜インキユベー トすることによって、免疫アフィニティーマトリ・クロスを構築した。

この混合物をさらに１００ｗ＋Ｍのホウ酸塩緩衝液ｐＨ９，０で洗浄し、２０ｄ の塩酸ジメチルビメリミデート（Ｐｉｅｒｃｅ）中に懸濁し、室温で１時間回転 した。未反応の架橋（クロスリンカ−）を、４０ｍＭのエタノールアミン−〇Ｃ Ｉ　ｐＨ１１，０中のビーズを室温で懸濁することによってブロックした。この ビーズを、１００ｍＭのホウ酸塩緩衝液ｐＨ８，０（６８，６９）に保存した。

生化学分析用の調製量のＥｌ／Ｅ２複合体を得るため；こ、免疫アフィニティー 精製手法を開発した。Ｅｌおよび８２組換え／Ｘ／キュロウイルスで同時感染し た昆虫細胞からの核抽出物を、ＤＥＡＥセファロースおよびホスホセルロースで 分画した。精製された）：２は、ホスホセルロースを通過し、　Ｅｌの画分ζよ 、ホスホセルロースに結合するため、このことは、Ｃ２力（Ｅｌとの結合のため にこの樹脂上に保持されることを示唆してｔ）る。ホスホセルロースから４００ ｍＭのＮａＣ１で溶出されたタン１＜り質画分を、タンパク質Ａセファロースに 固定化されたＥ２モノクローナル抗体Ｂ２Ｏ２を含む免疫アフィニティーマトリ ・クロスζこ充填したＯついで、この樹脂をＩＭのＬｉＣ１緩衝液で洗浄し、高 ｐＨで溶出し、画分をすばやく中和した。図４Ａは、６８ｋＤのＥ１タンＡり質 および４８ｋＤのＣ２タンＡり質が、このカラム力）ら溶出された主要なタンパ ク質種であり、これらのタン、４り質１６（銀染色１こよって、化学量論量で存 在したことを示す。それらの同定（ま、ウェスタン分析（図示されていない）に よって確認された。この複合体の緊縮した高塩濃度洗浄に対する安定性は、その 形成が疎水性相互作用によって進行し得ることを示唆している。

このマトリックスから溶出された物質は、その特異的ＤＮＡ結合活性を保持する 。抗Ｅ１で免疫沈降するとき、増加する量の複合体が、増加する量の５９６ｂｐ 　Ｄｄｅ／Ｃ１ａフラグメントに結合した（図５Ｂ）。より高いタンパク質濃度 では、より弱いＣ２結合部位を含む１４０ｂｐフラグメントもまた結合される。

乳頭腫ウィルス薬剤は、Ｅｌ／Ｅ２？ｊ［合体形成、形成されたときの複合体の 中断、またはＥｌのみの、Ｃ２のみの、あるいは複合体としての乳頭腫ウィルス ＤＮＡへの結合を妨げるそれらの能力によって同定され得る。つまり、上記Ｅｌ ／Ｅ２？ｌＪ［合体形成、形成されたときの複合体の中断、またはＥｌのみの、 Ｃ２のみのあるいは複合体としての乳頭腫ウィルスＤＮＡに対する結合を明らか にする上記のアッセイは、分析混合物中にそれらを取り込むことおよび選択され た反応へのそれらの効果をモニターすることによって、そのような薬剤を同定す るために使われ得る。

例えば薬剤として、Ｃ２に対するＥｌの結合を阻害するペプチドが挙げられる。

好ましくは、そのようなペプチドは、Ｃ２のアミノ酸末端から生じ、さらに好ま しくは、最初の１６２個のアミノ酸から生じる。この領域のペプチドとしては、 例えば以下のものを含む。

ＮＯ３−ＥＬＳ）［ＴＥＦＧＤＥＰＷＳＬ−ＣＯＯＨＮＨ２−ＤＴＳＷＤＲＹＭ ＳＥＰＫＲ−ＣＯＯＨＮＨ２−ＦＫＫＧＡＲＶＶＥＶＥＦＤＧＮＡＳＮＴＮＷＹ ＴＶ−ＣＯＯＨ皮膚病のような乳頭腫ウィルス疾患に対して有効であるために、 ペプチドの１橿以上のものが、単独あるいは組み合わされて、病域に適応できる ように適当なりリーム中に処方され得る。１回の服用量および投与様式は、ペプ チドが、治療用に投与されるか予防用に投与されるかの作用および患者の服用歴 による。典型的には、１回に投与されるペプチドの量は、体重の約０．１から２ ５ｍｇ／ｋｇの範囲であり、より好ましくは、体重の約０．１から１０ｍｇ／ｋ ｇの範囲である。

非経口的な投与について、ペプチドは、薬物的に許容される非経口的な賦形剤と 組み合わされた注射形式で処方される。

そのような賦形剤は、当該分野で知られたものであり、例えば、水、塩類溶液、 リンガ−溶液、デキストローズ溶液、および少量の人体直情アルブミンからなる 溶液を含む。そのような溶液の調製は、当該分野の範囲内である。典型的には、 ペプチドは、約２−８．０ｗｇ／ｍｌから約１００ｍｇ／ｍｌの濃度で、そのよ うな賦形剤中で処方される。

乳頭腫ウィルスの複製を阻害する薬剤を同定するための免疫沈降を利用する上記 のそれらのアッセイに加えて、他のアッセイ形式も利用され得るということが、 当業者によって評価される。例えば、より好ましいアッセイとして、Ｓ■ｅｅｎ ｋ、　Ｒ、Ｊ、Ｔ、らの１９８７．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ　Ｒｈｅｕｍ、３０：６ ０７に記載されたＥＬＩＳＡアッセイが挙げられる。さらにＥＬＩＳＡアッセイ 法に対する記述は、しａｎｇｏｎｅ、Ｊ、ａｎｄ　Ｉ／ａｎ　ｌ／１ｎａｋｉｓ 、Ｉ（、のＬ９［１３，Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｏｆＥ　ｚ　ｓ。

ＬＱＪＬｌ、　９２．　Ｐａｒｔ　Ｅ、を参照する。

ＥＬ　Ｉ　ＳＡアッセイの例としては、例えばＥｌのような所望の初期相タンパ ク質の固体支持体に対する直接あるいは間接的な結合を利用した方法が挙げられ る。Ｅｌは、抗体を経て、支持体へ結合され得る。つぎに、ｐＨ１塩などの適切 な反応条件下で、Ｅｌは、乳頭腫ウィルス薬剤特性に対してテストされる化合物 の存在あるいは不在下で加えられ得る。そのような特性を有するこれらの化合物 は、対照と比較して、Ｅｌ／Ｅ２複合体形成を阻害するか、減少させる。複合体 形成の程度は、Ｅｌに結合したラベル分子を使うことによって、好適にモニター され得る。

この抗体は、Ｅｌに対して特異的なラベル化されたこの抗体であれば最も好まし い。

本発明において使われる抗体は、あらゆる適切な技術によりあらゆる適切な固体 テスト支持体上に固定化され得る。固体テスト支持体は、免疫アッセイで、抗体 の結合に対してあらゆる適切な不溶担体物質であり得る。それらの物質の多くは 、ニトロセルロースシートあるいはフィルター、アガロース、樹脂、プラスチッ ク（例えば、Ｐｖｃあるいはポリスチレン）ラテックス、金属ビーズ、プラスチ ック容器などが含まれるがこれに限定されないことが当該分野で知られている。

抗体を固定化する多くの方法も、当該分野で知られている。５ｉｔｌａｎらの１ ９６６、Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｔ　、　３５：８７３；　Ｍｅｌｒ ｏｓｅの１９７１．匠Ｐｕｒｅ　＆　Ａ　、Ｃｈｅｉ、、２１：８３ＨＣｕａｔ ｒｅｃａａｓらの１９７１，１１Ｌ旦収刀りぷ、参照。そのような方法は、共有 結合カップリング、直接吸着、物理的な包括、およびタンパク質コート表面への 付着を含む。タンパク質コート表面への付着について、まず表面が、ゼイン、フ ラーゲン、フィブリノゲン、ケラチン、グルテリンなどのような水不溶性タンパ ク質でコートされる。抗体は、単にタンパク質コートされた表面を、抗体の水溶 液と接触させ、それを乾燥させることによって付着する。

あらゆる支持体および結合技術の組合せであって、抗体を免疫活性にし、かつ抗 体を、洗浄の間あらゆる結合をした抗原に保持され得るのに十分な程に固定化す る組合は、本発明において使用し得る。好ましい固体テスト支持体は、プラスチ ックビーズである。

上述ノように、本発明のアッセイには、ラベル化された第２の抗体を使用する。

上述の例において、この抗体はＥｌと結合するが、アッセイは、Ｅｌを固体支持 体に付着させて、そしてＥｌに結合しているラベルした抗体を使うことによって 行われ得る。いずれの場合においてもラベルは、支持体と結合して、抗体の検出 を認めるあらゆる形態となり得る。一般的に、ラベルは、直接的にまたは間接的 に測定可能な信号の結果となって終わり、そして試料中に存在するラベルの総量 に関係する。例えば、直接的に測定可能なラベルは、放射能ラベル（例えば、１ ２５１．３５Ｓ、１４Ｃなど）を包含し得る。好適な、直接的に測定可能なラベ ルは酵素であり、抗体に結合して、適切な基質の存在で呈色反応を生じる。（例 えば、西洋わさびペルオキシダーゼ１０−フェニレンジアミン）。間接的に測定 可能なラベルの例は、ビオチニル化された抗体である。このラベルの存在は、ラ ベルされたアビジン複合体を含有する溶液でそれを処理することにより測定され 、それによって、アビジンは、ビオチニル化された抗体に結合する。その後、ア ビジンと結合したラベルが測定される。間接的ラベルの好適な例は、アビジンに 結合した酵素を使用し、この酵素は上記のように呈色反応を生じる、アビジン／ ピオチンシステムである。

どのようなラベルが選択されても、それは、測定され得る信号の結果に終わり、 そして試料中のラベルの総量に関係する。通常の信号は、放射能ラベル（放射性 同位元素が使用された時）、光学的密度（例えば酵素呈色反応が使用された時） および蛍光（蛍光を発する化合物が使用された時）である。

酵素反応によって生じる光学密度（または色調強度）のような非放射性信号を使 用するのが好ましい。適切な信号を生成し得る免疫アッセイ技術において、多く の酵素／基質の組み合せが公知である。米国特許第４．３２３．６４７号および 第４．１９０．４９６号を参照のこと。それらの開示は、本明細書中に援用され ている。。

上記のＥＬ　Ｉ　ＳＡアンセイにおいて、抗−Ｅｌおよび抗−Ｅ２抗体は、ポリ クローナルまたはモノクローナルであり得る。ポリクローナル抗体を生成する手 順は、当該分野において周知であり、モノクローナル抗体は、幾つかの方法で生 産し得る。例えば、Ｎａｔｕｒｅ　２５６：４９５（１９７５）に記載されてい るＫ。

ｈｌｅｒおよびＭｔｌｓｔｅ［ｎの手法、またはＦｅｎｄｌｙ、ｅｔ　ａｌ、、 １１ＢＴ、ｌｉｉｄ鼓ｕ、ｔ：３ｓ９　；Ｂｕｃｋ、ｌａ、　、　１９８８．Ｌ ｔｄ土剖１口：３７７によって示されるような改変された手法を参照のこと。イ ンビトロ手法は、一般的にＬｕｂｅｎ、　Ｒ，およびＭｏｈｌｅｒ、　Ｍ、　、 　１９８０．　鯨ｎ懇圧旺」罠」Ｌ慧ｌＵ２」Ｊλ」Ｌｔ、ｌｌｌａ３５．Ｒｅ ａｄｉｎｇ、Ｃ，Ｍｅｔｈｏ　ｓ　ｎ　ｍ　ｏ　、ｕｌ（Ｐａｒｔ　０ｎｅ）： １ｇ、またはＶｏｓｓ、　Ｂ１．１９８６．Ｍ　ｔｈｏｄｓ　ｎ　５ｏｌｏ　、 ｔ２１：２７に記載されている。

簡潔には、適切な手順は、１ｍｇ／ｍｌのＥｌまたはＢ２で、マウスを免疫する 工程からなる。免疫化は、Ｆｒｅｕｎｄの完全アジュバント中で行われる。２つ の付加的な免疫化または増強が、アジュバントなしで月に一度の間隔で行われ、 そして最後の増強の一ケ月後、マウスは、１０μｇのＥｌまたはＢ２いずれかの １、ｖ、増強を与えられる。１．ｖ、増強の３日後、マウスは犠牲にされ、肺臓 が除去され、そして肺臓細胞が単離されそして生存化された薬剤で選択可能なミ エローマパートナ−細胞株に融合される。そのような多くのミエローマ株が当該 分野で公知であり、それの大部分は、ＨＡＴ添加細胞培養培地で生育できない。

典型的なミエローマ細胞株は、ＳＰ−２１０Ａｇ１４である。

このように、ハイブリドーマは、肺臓細胞およびミエローマ細胞を５＝１比、そ れは一般的に２Ｘ　１０’　！エローマ細胞対１×１０７牌臓細胞からなる、で 結合することにより形成される。細胞混合物はベレット化され、培地は除去され 、そして融合は、室温で６０秒にわたる滴下による、ポリエデリックリコール１ ５００の４０％（ｖ／ｖ）溶液１．０＊ｌの添加、次いで３７℃で６０秒間のイ ンキュベー／ｇンにより行われる。穏やかに撹拌した細胞懸濁液に９■ｌのＤｕ ｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅｓ培地を５分間に渡って添加する。

混合液中の細胞の塊を、穏やかに再懸濁し、すべての残存するＰＥＧを除去する ために細胞を洗浄し、そして２０％のウシ胎児血清を添加したＤＭＥＭ中に約２ Ｘ１０５細胞／ウエルでマイクｏタイターブレートにフ゛レートした。２４時間 後、細胞にヒポキサンチンおよびアザセリン選択培地の２×溶液を供給した。陽 性の細胞増殖を示すウェルからの培地を、可溶性、または非可溶性抗原を検出し 得、そしてＬａｎｇｏｎｅ、　Ｊ　、およびＶａｎ　Ｖｉｎａｋｉｓ、Ｌ、■Ｉ 剋１ユＬ江ｍ　！　（１９８３）によって示される、当該分野で公知のアッセイ を用いて、抗−Ｅｌまたは抗−Ｂ２をアッセイし得る。

抗体が、ポリクローナルまたはモノクローナルであるかにかかわらず、当該分野 で公知の標準手法、またはＳｐｒＬｎｇｅｒ、　１９８０、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａ 　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：１９４．（Ｅｄｓ、Ｋｅｎｎｅｔｔ、Ｔ、ＭｃＫｅａ ｒｎ　ａｎｄ　１［、Ｂｅｃｈｔｏｌ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙ ｏｒｋ）に記載されているように抗体を精製するのが好ましい。一般的には、こ れは、５０％硫酸アンモニウム溶液を用いた少なくとも一回の抗体の硫酸アンモ ニウム沈澱からなる。抗体アフィニティーカラムもまた、使用し得る。

本発明の実施または試験において、すべての類似のまたは相当する方法および物 質を使用し得、好適な方法および物質が本明細書に記載される。

出願人が、発明であると信じる事項を記載したが、本発明を説明するために存在 する以下の実施例は、本発明の範囲を制限するとして解釈されるべきではない。

例えば、供給源、タイプ、または抗体を生産する方法の変形；異なるラベルおよ び／または信号；異なる物質および立体配置の試験支持体；異なる固定化法が、 本発明の範囲から逸脱することなく使用ＦＩＧ、　１ つ １’−３ｊｌｌｌ１ｍ 国際調査報告 国際調査報告 フロントページの続き （７２）発明者　ボッチャン、マイケル　アール。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４７０７ケンジントン、アートモア　パス 　１ （７２）発明者　クラーク、ロビン アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４６１１オークランド、コルトン　ブール バード（７２）発明者　モア、イアン　ジェイ。

アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４７０８バークレー、タマルバイス　ロー ド　５８（７２）発明者　サン、ショー アメリカ合衆国　カリフォルニア　９４５３９フレモント、パイン　ストリート 　３５０

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．実質的に精製された、それぞれ約６８ｋＤおよび４８ｋＤの乳頭腫ウィルス タンパク質Ｅ１およびＥ２を含有する組成物。
2. ２．実質的に精製された、それぞれ約６８ｋＤおよび４８ｋＤの乳頭腫ウィルス タンパク質Ｅ１およびＥ２、およびＥ１またはＥ２のいずれかに結合するヌクレ オチド配列を含有する組成物。
3. ３．前記Ｅ１またはＥ２のいずれかに結合するヌクレオチド配列が、Ｅ２に結合 する乳頭腫ウィルスＤＮＡ中に存在する配列を含有する、請求項２に記載の組成 物。
4. ４．実質的に純粋な、それぞれ約６８ｋＤおよび４８ｋＤのＥ１およびＥ２を含 有する乳頭腫ウィルスタンパク質の複合体。
5. ５．乳頭腫ウィルスタンパク質とヌクレオチド配列との複合体であって、 それぞれ約６８ｋＤおよび４８ｋＤの、実質的に純粋なＥ１およびＥ２であって 、および Ｅ１またはＥ２のいずれかに結合するヌクレオチド配列、を含有する複合体。
6. ６．乳頭腫ウィルスタンパク質とヌクレオチド配列との複合体であって、 前記ヌクレオチド配列がＥ２に結合する、請求得５に記載の複合体。
7. ７．乳頭腫ウィルスタンパク質とヌクレオチド配列との複合体であって、 前記ヌクレオチド配列が、Ｅ２に結合する乳頭腫ウィルスＤＮＡ中に存在する配 列を含有する、請求項６に記載の複合体。
8. ８．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤であって、Ｅ１／Ｅ２複合体形成を予防 または妨害することを特徴とする薬剤。
9. ９．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤であって、Ｅ１／Ｅ２複合体形成を中断 させることを特徴とする薬剤。
10. １０．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤であって、乳頭腫ウィルスウィルスＤ ＮＡへのＥ１またはＥ２の結合を予防または妨害することを特徴とする薬剤。
11. １１．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤であって、乳頭腫ウィルスウィルスＤ ＮＡへのＥ１またはＥ２複合体の結合を予防または妨害することを特徴とする薬 剤。
12. １２．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤を同定する方法であって： ａ）Ｅ１およびＥ２の複合体を形成するために、Ｅ１およびＥ２を溶液中で混合 する工程； ｂ）Ｅ１およびＥ２複合体形成を測定する工程；およびｃ）該薬剤の存在下で工 程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、を包含する方法。
13. １３．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤を同定する方法であって； ａ）乳頭腫ウィルスＤＮＡにＥ１を結合させる条件下で該ＤＮＡと該Ｅ１を混合 する工程； ｂ）該ＤＮＡヘのＥ１結合を測定する工程；およびｃ）該薬剤の存在下で工程（ ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、を包含する方法。
14. １４．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤を同定する方法であって： ａ）乳頭腫ウィルスＤＮＡにＥ２を結合きせる条件下で該ＤＮＡと該Ｅ２を混合 する工程； ｂ）該ＤＮＡヘのＥ２結合を測定する工程；およびｃ）該薬剤の存在下で工程（ ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、を包含する方法。
15. １５．乳頭腫ウィルス疾患を治療する薬剤を同定する方法であって： ａ）乳頭腫ウィルスＤＮＡに結合したＥ１およびＥ２の複合体を形成させる条件 下で該ＤＮＡと該Ｅ１およびＥ２を混合する工程； ｂ）該ＤＮＡに結合したＥ１およびＥ２の複合体形成を測定する工程；および ｃ）該薬剤の存在下で工程（ａ）および（ｂ）を繰り返す工程、を包含する方法 。
16. １６．乳頭腫ウィルス疾患の動物を治療する方法であって、該動物に請求項８に 記載の薬剤を有効量で投与する工程を包含する方法。
17. １７．乳頭腫ウィルス疾患の動物を治療する方法であって、該動物に請求項９に 記載の薬剤を有効量で投与する工程を包含する方法。
18. １８．乳頭腫ウィルス疾患の動物を治療する方法であって、該動物に請求項１０ に記載の薬剤を有効量で投与する工程を包含する方法。
19. １９．乳頭腫ウィルス疾患の動物を治療する方法であって、該動物に請求項１１ に記載の薬剤を有効量で投与する工程を包含する方法。