JP7846986B2 - 生物学的製剤の投与のためのアルファウイルスベースのレプリコン - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その開示が参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年１０月８日出願の米国仮特許出願第６２／７４２，８６８号明細書の優先権を主張するものである。

電子的に提出された配列表への参照
本出願は、作成日２０１９年１０月７日およびサイズ１４７ＫＢを有するファイル名「６８９４０５．１０７ＷＯ＿ＳＬ」であるＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出された、配列表を含む。ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して提出された配列表は本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

アルファウイルスベースの自己増幅ＲＮＡ（レプリコン）は、ワクチン向けの汎用プラットフォームとして何十年も使用されてきた。レプリコンをかかるプラットフォームに適したものとする２つの特性とは、１）高度で長時間のタンパク質発現および２）堅牢な細胞性、体液性および粘膜性免疫の促進を後押しするプラットフォームの自己アジュバント性である。こういった特性が、レプリコンをワクチンプラットフォームとして優れたものとするが、他の領域では、特に生物学的製剤のｉｎ ｖｉｖｏ発現向けのプラットフォームとしてのレプリコン性能を妨げる可能性がある。

医学における生物学的製剤の使用が増えつつある。しかし、組換えにより産生されたこれらのタンパク質は、外来性としてしばしば認識され、免疫応答および抗薬物抗体（ＡＤＡ）の誘発を誘導し、その結果、タンパク質の治療有効性が低下する。抗薬物抗体（ＡＤＡ）応答の発生の原因となる要因は多様であるが、生物製剤または生物学的製剤が送達される炎症性環境によってＡＤＡ応答が促進および／または増強される可能性がある。したがって、自然に自己アジュバントであり炎症性であるレプリコン由来の生物製剤の送達によって、ＡＤＡ応答が促進し、コードされている生物学的製剤の臨床効能が低下するという危険を冒す。レプリコンから発現される異種タンパク質に対する免疫応答を下方制御する能力によって、ＡＤＡを生成する危険が低減し、ｉｎ ｖｉｖｏでの生物学的製剤の発現に関するレプリコンの有用性が増強することになると思われる。

したがって、望ましくない免疫応答を引き起こす危険が低減または排除された、ヒトまたは動物への生物学的製剤分子の投与を可能にする組成物および方法、を備えることは有用であると思われる。

本発明は、異種分子をヒトまたは動物に投与し、異種分子へのヒトまたは動物からの免疫応答を低減または排除するのに有用な、ＲＮＡレプリコンを提供する。本発明のＲＮＡレプリコンは異種分子（例えばタンパク質またはペプチド）をコードするＲＮＡ配列（例えば目的の遺伝子（ＧＯＩ））を有し、ＲＮＡ配列は新世界アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４；ならびにアルファウイルスのｎｓＰ３タンパク質マクロドメイン、中央ドメイン、および超可変ドメイン（ＨＶＤ）、をコードする。コードされている超可変ドメインは、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列を有してもよく、または新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインの一部に由来するアミノ酸配列、および旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する別の部分、すなわちキメラｎｓＰ３超可変ドメイン、を有してもよい。新世界アルファウイルスに基づくレプリコンを本明細書に記載のように改変すると、コードされている異種タンパク質またはペプチドによって引き起こされる免疫応答が軽減または排除されることが見いだされた。

ＲＮＡレプリコンは、タンパク質やペプチドなどの生物学的製剤分子の投与に有用であり、本発明のレプリコンは、レプリコンによってコードされている生物学的製剤とともにヒトまたは動物に投与され、コードされている生物学的製剤（例えば、異種タンパク質またはペプチド）は、ヒトまたは動物において発現される。

第１の態様では、本発明は、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；５’および３’のアルファウイルス非翻訳領域と；新世界アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列を有する超可変ドメインをコードするＲＮＡ配列、または新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分および旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分を含むアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を有する、ＲＮＡレプリコンを提供する。

一部の実施形態では、アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよびアルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインは新世界アルファウイルスに由来するが、他の実施形態では、アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよびアルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインは旧世界アルファウイルスに由来する。種々の実施形態では、旧世界アルファウイルスは、ＣＨＩＫＶ、ＳＩＮＶ、およびＳＦＶからなる群から選択される。新世界アルファウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）または西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、または東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）とすることができる。種々の実施形態では、旧世界アルファウイルスは、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、チクングニア（Chickungunya）ウイルス（ＣＨＩＫＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ゲタウイルス（ＧＥＴＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバーマ森林ウイルス（ＢＦＶ）、のいずれでもよい。

一部の実施形態では、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分は、ＦＧＤＦ（配列番号１８）およびＦＧＳＦ（配列番号１９）からなる群から選択されるモチーフを含む。旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分は、ＦＧＤＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２０）反復、ＦＧＳＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２１）反復、ＦＧＤＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２２）反復、およびＦＧＳＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２３）反復、からなる群から選択される反復を有することができる；ならびに反復配列を、少なくとも１０個および２５個以下のアミノ酸によって隔てることができる。一部の実施形態では、反復配列は、ＮＥＧＥＩＥＳＬＳＳＥＬＬＴ（配列番号６）、ＳＤＧＥＩＤＥＬＳＲＲＶＴＴＥＳＥＰＶＬ（配列番号７）、およびＤＥＨＥＶＤＡＬＡＳＧＩＴ（配列番号８）からなる群に由来するアミノ酸配列によって隔てられている。

ＲＮＡレプリコンの実施形態のいずれかでは、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分は、ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～４８２もしくは４９７～５００もしくは４７９～５００もしくは３３５～５１７のいずれか；またはＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４５４もしくは４６８～４７１もしくは４５１～４７１のいずれか；またはＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～４９３もしくは５１３～５１６もしくは４９０～５１６もしくは３３５～５３８を有することができる。これらの実施形態のいずれかでは（または本明細書に記載のいずれかの実施形態では）、新世界アルファウイルスはＶＥＥＶとすることができ、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分は、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５１８を含まない；または、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５４５を含まない；または、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１８を含まない。他の実施形態では、新世界アルファウイルスはＥＥＥＶとすることができ、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分は、ＥＥＥＶ超可変ドメインのアミノ酸５３１～５４７を含まない。あるいは、新世界アルファウイルスはＷＥＥＶとすることができ、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分は、ＷＥＥＶ超可変ドメインのアミノ酸５０４～５２０を含まない。

実施形態のいずれかでは、ＲＮＡレプリコンは、異種タンパク質をコードするＲＮＡ配列に作動可能に連結され、ＲＮＡ配列の翻訳を調節するサブゲノムプロモーターを有することができる。ＲＮＡレプリコンはまた、５’キャップおよび３’ポリＡテールを有することもできる。ＲＮＡレプリコンはポジティブセンス一本鎖ＲＮＡを有することができる。種々の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、１０～１２ｋｂのＲＮＡを有することができ、および／または３０～５０ｎｍの直径を有することができる。

種々の実施形態では、異種タンパク質とは生物学的製剤のタンパク質またはペプチドであり、これは、例えば、抗体もしくは操作されたキメラ抗体もしくは抗体断片、抗原性ポリペプチドまたはその他の任意の治療用もしくは免疫原性のポリペプチドもしくはペプチドとすることができる。

レプリコンの一部の特定の実施形態では、新世界アルファウイルスはＶＥＥＶであり、新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分は、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１８を含まず、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分は、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６を含む；または旧世界アルファウイルスはＳＩＮＶであり、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分は、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５３８を含む。

実施形態のいずれかでは、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４をコードするＲＮＡ配列に作動可能に連結することができる。

別の態様では、本発明は、異種タンパク質またはペプチドを哺乳動物に投与する、方法を提供する。本発明の方法は、異種タンパク質またはペプチドをコードする、本明細書に記載のＲＮＡレプリコンを哺乳動物に投与するステップであって、異種タンパク質またはペプチドは哺乳動物内で発現される、ステップを含む。ＲＮＡレプリコンは、本明細書に記載のものであればいずれでもよい。

別の態様では、本発明は、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；新世界アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；旧世界アルファウイルスのｎｓＰ３タンパク質に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列とを有するＲＮＡレプリコンであって、ｎｓＰ３タンパク質のＮ末端側および／またはＣ末端側の最初の１～６個のアミノ酸は新世界アルファウイルス配列に由来する、ＲＮＡレプリコンを提供する。したがって、１～６個のアミノ酸はｎｓＰ２とｎｓＰ３の間の接合部に存在してもよい；または、１～６個のアミノ酸はｎｓＰ３とｎｓＰ４の間の接合部に存在してもよい。種々の実施形態では、旧世界アルファウイルスは、本明細書に記載のものであればいずれでもよい。新世界アルファウイルスがＶＥＥＶである場合、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合配列はＬＨＥＡＧＣ／ＡＰＳＹ（配列番号１２）とすることができる；接合部がｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合部である場合、配列はＲＦＤＡＧＡ／ＹＩＦＳ（配列番号１３）とすることができる。実施形態のいずれかでは、最後から２番目のグリシン（その一文字コード「Ｇ」でも参照される）は保存することができ、残りのｎｓＰ３のアミノ酸は、本明細書に記載のように変えることができる。接合配列の前に終止コドン（ＴＧＡ）が任意選択で先行することができ、これは、リードスルー終止コドンとすることができる。新世界アルファウイルスがＥＥＥＶである他の実施形態では、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合配列はＱＨＥＡＧＲ／ＡＰＡＹ（配列番号１４）とすることができ、最後から２番目のＧは保存されている。新世界アルファウイルスがＥＥＥＶである場合、ｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合部での配列はＲＹＥＡＧＡ／ＹＩＦＳ（配列番号１５）とすることができ、最後から２番目のグリシンは任意選択で保存することができるが、残りのｎｓＰ３のアミノ酸は本明細書に記載のように変えることができる。これらの配列の前に、リードスルー終止コドン（ＴＧＡ）が先行することもできる。他の実施形態では、新世界アルファウイルスはＷＥＥＶであり、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合配列はＲＹＥＡＧＲ／ＡＰＡＹ（配列番号１６）とすることができ、最後から２番目のＧは保存されるが、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部の残りのアミノ酸は、本明細書に記載のように変えられる。ＷＥＥＶのｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合部の場合、配列はＲＹＥＡＧＡ／ＹＩＦＳ（配列番号１７）とすることができ、最後から２番目のグリシンは保存され、残りのｎｓＰ３のアミノ酸は本明細書に記載のように変えることができる；これらの配列の前に、リードスルー終止コドン（ＴＧＡ）が先行することもある。種々の実施形態では、配列番号１２～１７の配列はまた、Ｎ末端側および／またはＣ末端側に１つまたは２つまたは３つの置換を含有することもある。

上記の本発明の概要は限定的なものでなく、本発明のその他の特徴および利点は、本発明に関する以下の詳細な説明からおよび特許請求の範囲から、明らかとなるであろう。セクションの見出しまたは小見出しは、読者の便宜のためにのみ提供されるものであり、論議からの逸脱を、または必ずしも全く新しい主題分野を、記すものではない。任意の主題を、任意のセクション見出しまたは小見出しの下で論議または開示することができる。

本発明の前述の概要ならびに下記の詳細な説明は、添付の図面と併せて読み解くとさらによく理解されるであろう。本発明は図面に示された正確な実施形態に限定されるものでないことを理解されたい。

野生型アルファウイルスの図画での例示を提供する図である。ウイルス粒子が、エンベロープを持つ球形の正二十面体であり、２４０個のモノマーから構成されるＴ＝４の正二十面体対称性である直径６５～７０ｎｍのキャプシドを有するものとして示される。エンベロープは８０のスパイクを含有し、各スパイクはＥ１／Ｅ２タンパク質のトリマーである。 図Ａ２は、赤色発光ホタルルシフェラーゼ（ｒＦＦ）をコードするＶＥＥＶベースのアルファウイルスレプリコンの図画での例示である。３つの実施形態が示されている：１つは、ｎｓＰ３の野生型ＶＥＥＶ ＨＶＤ（ＷＴ）を有するもの、１つは、ＳＩＮＶのＨＶＤの一部を有するＶＥＥＶ／ＳＩＮＶハイブリッド（ＶＥＥＶ／ＳＩＮＶ）（ＶＥＥＶ ＨＶＤのアミノ酸残基３３５～５３８をＳＩＮＶ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５３８に置換することによる）；およびＣＨＩＫＶ ＨＶＤの一部を有する別のハイブリッド（ＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶ）（ＶＥＥＶ ＨＶＤのアミノ酸残基３３５～５１８を、ＣＨＩＫＶ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５１７に置換することによる）である。図２Ｂおよび図２Ｃは、突然変異体ｎｓＰ３タンパク質を含有するレプリコンが、野生型ｎｓＰ３を含有するレプリコンと、同じレベルに複製され（図２Ｂ）、同じレベルのｒＦＦを発現する（図２Ｃ）ことを示す、図画での例示である。 図３Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏルシフェラーゼ活性をモニタリングした結果を示すグラフであり、総フラックスとして報告してある。生理食塩水に含まれる、図２Ａに記載のＶＥＥＶベースの３つのアルファウイルスレプリコンＲＮＡそれぞれ１０μｇを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿四頭筋（quadricep muscle）に筋肉内送達した。α．ＳＧＩ．ｒＦＦはＶＥＥＶ ＷＴをコードし、α．ＳＧＩ．ＳＩＮＶ．ｒＦＦはＶＥＥＶ／ＳＩＮＶをコードし、α．ＳＧＩ．ＣＨＩＫＶ．ｒＦＦはＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶをコードする。 図３Ｂは、図３Ａと同じであるがレプリコンＲＮＡ１μｇを用いてモニタリングした結果を示す。ｎｓＰ３の突然変異体型を発現するレプリコンは、野生型ｎｓＰ３のレプリコンと類似のレベルのルシフェラーゼ活性を呈した。 Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスからＨＡを発現するＶＥＥＶベースのレプリコンのｉｎ ｖｉｖｏ研究の結果を示すプロットおよび棒グラフである。データは、ＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶ ＨＶＤキメラをコードするレプリコンが、野生型ＨＶＤを発現するレプリコンと比較してＨＡ特異的ＩｇＧ力価を誘発しなかったことを示す。 図５Ａは、Ｈ５Ｎ１ ＨＡを発現する、示されたＶＥＥＶベースのレプリコンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＡ特異的短命エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＳＬＥＣ）の頻度を実証する図画フォーマットのプロットを提供する図である。ＷＴとは、ＶＥＥＶのＴＣ－８３株に由来する未改変のレプリコンバックボーンを指す；ＳＧＩとは、インターフェロン耐性になるように改変されたレプリコンバックボーンを指す。 図５Ｂは、Ｈ５Ｎ１ ＨＡを発現する、示されたＶＥＥＶベースのレプリコンで免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＨＡ特異的メモリー前駆エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＭＰＥＣ）の頻度を実証する図画フォーマットのプロットを提供する図である。ＷＴとは、ＶＥＥＶのＴＣ－８３株に由来する未改変のレプリコンバックボーンを指す；ＳＧＩとは、インターフェロン耐性になるように改変されたレプリコンバックボーンを指す。 新世界および旧世界アルファウイルスの代表的なメンバーのｎｓＰ３タンパク質のドメイン構造および配列アラインメントの一部を提供する図である。ｎｓＰ３タンパク質の概略図は、３つの予測構造ドメイン：マクロドメイン、アルファドメイン、およびＨＶＤを示す。様々なアルファウイルスのｎｓＰ３タンパク質の配列アラインメントをＣｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを用いて実行した。ドメイン配列には、略図で使用のものと同色で下線が引かれている。例示のｎｓＰ３タンパク質配列は以下のウイルスに由来した：ＳＦＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿７４０６６７．１）（示されているタンパク質は配列番号２４である）、ＳＩＮＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０３３１７．１）（示されているタンパク質は配列番号２５である）、ＣＨＩＫＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＰ＿６９０５８８．１）（示されているタンパク質は配列番号２６である）、ＶＥＥＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ２７２８２．２）（示されているタンパク質は配列番号２７である）、およびＥＥＥＶ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｑ４ＱＸＪ８．２）（示されているタンパク質は配列番号２８である）。Foy et al., Journal of Virology, Vol. 87, No. 4, pp. 1997-2010 (2013)からの画像である。 種々の新世界ウイルスおよび旧世界ウイルスのコードされているｎｓＰ３タンパク質のＨＶＤにおける様々な領域を示す例示を提供する図である（Gotte et al., Viruses, 2018, 10, 105の図２から複写）。図に使用されているｎｓＰ３配列のＵｎｉｐｒｏｔエントリは：ＭＡＹＶ（Ｑ８ＱＺ７３）、ＲＲＶ（Ｐ１３８８７）、ＳＦＶ（Ｐ０８４１１）、ＣＨＩＫＶ（Ｑ８ＪＵＸ６）、ＯＮＮＶ（Ｑ８ＱＺ７３）、ＢＦＶ（Ｐ８７５１５）、ＳＩＮＶ（Ｐ０３３１７）、ＶＥＥＶ（Ｐ３６３２８）、ＥＥＥＶ（Ｑ４ＱＸＪ８）、ＷＥＥＶ（Ｐ１３８９６）である。Ｇ３ＢＰ結合部位は、以下の旧世界ウイルスｎｓＰ３タンパク質に対して存在する：ＭＡＹＶの場合、アミノ酸４７０～４７３；ＲＲＶの場合、アミノ酸５１２～５１５および５２３～５２６；ＳＦＶの場合、アミノ酸４５１～４５４および４６８～４７１；ＣＨＩＫＶの場合、アミノ酸４７９～４８２および４９７～５００；ＯＮＮＶの場合、アミノ酸５１９～５２２および５３７～５４０；ＢＦＶの場合、アミノ酸４２９～４３２および４４７～４５０；ＳＩＮＶの場合、アミノ酸４９０～４９３および５１３～５１６。新世界のＰ１２３４の場合、ウイルスタンパク質Ｇ３ＢＰ（およびＦＸＲ）の結合部位は以下のように存在する：ＶＥＥＶの場合、アミノ酸４７８～５４５がＦＸＲ結合部位を有する；ＥＥＥＶの場合、アミノ酸４７１～４８３がＧ３ＢＰ結合部位を有し、アミノ酸５３１～５４７がＦＸＲ結合部位をコードする；ＷＥＥＶの場合、アミノ酸５０４～５２０がＦＸＲ結合部位を有する。

特に規定のない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用されるある特定の用語は、本明細書に記載される意味を有する。本明細書で引用されるあらゆる特許、公開された特許出願、および公開物は、それらが本明細書に完全に記載されているかのように参照により組み込まれる。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかに述べられていない限り、複数の参照物を含むことに留意しなければならない。

特に明記しない限り、本明細書に記載される％配列同一性または％配列同一性の範囲などの任意の数値は、すべての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は典型的に、記載される値の±１０％を含む。例えば、１０ｍｇの投薬量は９ｍｇ～１１ｍｇを含む。本明細書で使用される場合、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されていない限り、すべての可能な部分範囲、その範囲内の整数および値の分数を含めてかかる範囲内のすべての個々の数値を明示的に含む。

本明細書および以下の特許請求の範囲全体を通して、文脈からそうでないことが求められない限り、文言「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」ならびに変化形、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を含むが、任意の他の整数もしくはステップまたは整数もしくはステップの群を排除しないことを含意していることは理解されよう。本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、用語「含む／含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」もしくは「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」または場合によっては、本明細書で使用される場合、用語「有する（ｈａｖｉｎｇ）」と置き換えることができる。

本明細書で使用される場合、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」は、請求項の要素に明記されていない任意の要素、ステップまたは成分を排除する。本明細書で使用される場合、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」は、請求項の基本的で新規な特性に実質的に影響しない物質またはステップは排除しない。前述の用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む／含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」はいずれも、本発明の態様または実施形態の文脈において本明細書で使用される場合はいつでも、本開示の範囲を多様化するために用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」または「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」に置き換えることができる。

一般的な一態様では、本発明は、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡレプリコン、およびＲＮＡレプリコンを使用してそれらをヒトまたは動物に投与する方法に関する。本発明のＲＮＡレプリコンは、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列、および新世界アルファウイルスｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４の各タンパク質に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を含有する。レプリコンはまた、アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列、およびアルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を有する。本発明のＲＮＡレプリコンは、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに完全に由来するアミノ酸配列、または新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分と旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分とを有するアミノ酸配列、をコードするＲＮＡ配列をさらに有する。すなわち、ＨＶＤは、ハイブリッドのまたはキメラの新世界／旧世界配列とすることができる。本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」または「タンパク質」とは、ペプチド結合によって連結してポリペプチドを形成する少なくとも２個のアミノ酸残基を含む分子を意味する。

本明細書で使用される場合、アルファウイルスｎｓＰ３またはアルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメイン（ＨＶＤ）に関して、アミノ酸残基は、野生型アルファウイルスｎｓＰ３のアミノ酸配列と比べて番号が付けられている。野生型アルファウイルスｎｓＰ３のアミノ酸配列は、本明細書に記載されており、またはそうでなければＧｅｎＢａｎｋデータベースなどの公的記録から入手可能である。例えば、ＳＦＶ ｎｓＰ３に関して、アミノ酸残基は、配列番号２４の野生型ＳＦＶ ｎｓＰ３と比べて番号が付けられている；ＳＩＮＶ ｎｓＰ３に関して、アミノ酸残基は、配列番号２５の野生型ＳＩＮＶ ｎｓＰ３と比べて番号が付けられている；ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３に関して、アミノ酸残基は、配列番号２６の野生型ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３と比べて番号が付けられている；ＶＥＥＶ ｎｓＰ３に関して、アミノ酸残基は、配列番号２７の野生型ＶＥＥＶ ｎｓＰ３と比べて番号が付けられている；ＥＥＥＶ ｎｓＰ３に関して、アミノ酸残基は、配列番号２８の野生型ＥＥＥＶ ｎｓＰ３と比べて番号が付けられている；ＷＥＥＶ ｎｓＰ３に関して、アミノ酸残基は、配列番号２９の野生型ＷＥＥＶ ｎｓＰ３と比べて番号が付けられている。

レプリコンによってコードされているｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４の各タンパク質は、機能的または生物学的に活性なタンパク質である。本発明のＲＮＡレプリコンはまた、３’非翻訳領域（ＵＴＲ）および５’ＵＴＲをコードすることができ、これらはアルファウイルスの３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲとすることができる。ＲＮＡレプリコンは、制御エレメント（例えば、１つまたは複数のサブゲノムプロモーター）およびポリＡテールをコードすることもできる。プロモーター、５’ＵＴＲおよび／または３’ＵＴＲ、ならびに異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列は、レプリコンＲＮＡが生物体へ導入された際に自己増幅し、異種タンパク質またはペプチドが生物体において発現されるように、作動可能に連結することができる。

本出願の発明者らは、予期せぬことに、新世界アルファウイルス（ＮＷ）ゲノムに由来するＲＮＡレプリコンでは、ｎｓＰ３タンパク質をコードするＲＮＡの少なくとも一部を、旧世界アルファウイルス（ＯＷ）に由来するｎｓＰ３の少なくとも一部をコードするＲＮＡで置換すると、レプリコン中にコードされている異種タンパク質またはペプチドに対する哺乳動物の免疫原性が著明に低減または排除されること、を発見した。したがって、レプリコンに関する一部の実施形態では、ｎｓＰ３のマクロドメインおよび中央ドメインは新世界アルファウイルス配列に由来することができ、一方、ＨＶＤは、ａ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来するか、またはｂ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分と新世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分とを有する。

別の実施形態では、マクロドメインおよび中央ドメインは旧世界アルファウイルスのマクロドメインおよび中央ドメインの配列に由来し、ＨＶＤは、ａ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来するか、またはｂ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分と、新世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分を有する。

別の実施形態では、マクロドメインは新世界アルファウイルスマクロドメイン配列に由来し、中央ドメインは旧世界アルファウイルス中央ドメイン配列に由来し、ＨＶＤは、ａ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来するか、またはｂ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分と、新世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分とを有する。

別の実施形態では、マクロドメインは旧世界アルファウイルスマクロドメイン配列に由来し、中央ドメインは新世界アルファウイルス中央ドメイン配列に由来し、ＨＶＤは、ａ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来するか、またはｂ）旧世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分と、新世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分とを有する。

一部の実施形態では、レプリコンは、新世界アルファウイルスＨＶＤ配列に由来する部分と旧世界ＨＶＤ配列に由来する部分とを有する、ハイブリッドのまたはキメラの新世界／旧世界配列であるＨＶＤをコードする。種々の実施形態では、旧世界部分は、少なくとも５個または少なくとも１０個または少なくとも１５個または少なくとも２０個または少なくとも２５個または少なくとも３０個または少なくとも５２個または少なくとも５３個または少なくとも７５個または少なくとも１００個または少なくとも１２５個または少なくとも１５０個または少なくとも１７５個または少なくとも２００個のアミノ酸、とすることができる。両世界の部分は一緒になって、野生型の旧世界または新世界のアルファウイルスＨＶＤ配列と同じ長さを有するＨＶＤを含むことができ、あるいは、野生型の旧世界または新世界のアルファウイルスＨＶＤ配列よりも、最大１０個もしくは最大２０個もしくは最大３０個アミノ酸を短くすることができ；または、最大１０個もしくは最大２０個もしくは最大３０個もしくは最大４０個もしくは最大５０個もしくは最大６０個もしくは最大７０個もしくは最大８０個もしくは最大９０個もしくは最大１００個アミノ酸を長くすることができる。

一部の実施形態では、ＨＶＤのＮ末端部分は、新世界のｎｓＰ３ ＨＶＤ配列に由来することができ、ＨＶＤのＣ末端アミノ酸は、野生型ＯＷアルファウイルスＨＶＤアミノ酸配列に由来することができ、例えば、ＨＶＤのうち、少なくとも５個または少なくとも１０個または少なくとも１５個または少なくとも２０個または少なくとも２５個または少なくとも３０個または少なくとも３１個または少なくとも３２個または少なくとも３３個または少なくとも３４個または少なくとも３５個または３５～５５個または３５～６５個または少なくとも４０個または少なくとも４５個または少なくとも５０個または少なくとも５２個または少なくとも５３個または少なくとも６０個または少なくとも７０個または少なくとも８０個または少なくとも１００個または少なくとも１２５個または少なくとも１５０個または少なくとも１７５個のＣ末端アミノ酸は、ＯＷ ＨＶＤのアミノ酸に由来する（および任意選択で相当する）アミノ酸配列とすることができる。これらの実施形態のいずれかでは、ＨＶＤはまた、長さが２００個未満または１７５個未満または１５０個未満または１２５個未満または１００個未満または８０個未満のアミノ酸とすることができる。さらなる実施形態では、Ｃ末端アミノ酸を、例えば、末端の１～５個または５個または５～１０個または１０～１２個または１０～１３個または１０～１５個または１５～２０個のアミノ酸を、ＮＷアルファウイルスＣ末端ＨＶＤ配列から保持することができる一方で、残りのＣ末端アミノ酸は記載のようにＯＷアルファウイルスＨＶＤに由来することができる。

本明細書に記載の実施形態のいずれかでは、新世界アルファウイルスは、ＶＥＥＶまたはＥＥＥＶまたはＷＥＥＶまたは本明細書に記載のもしくは当技術分野で知られている任意の新世界アルファウイルスとすることができ、旧世界アルファウイルスは、ＣＨＩＫＶ、ＳＩＮＶ、またはＳＦＶまたは本明細書に記載のもしくは当技術分野で知られている任意の旧世界アルファウイルスとすることができる。新世界および旧世界アルファウイルスを、任意の組み合わせで本発明において使用することができ、可能なあらゆる組み合わせおよびサブコンビネーションは、それらが本明細書に完全に記載されているかのように開示される。

アルファウイルスレプリコン
アルファウイルスは、第４群トガウイルス（Togaviridae）科のウイルスに分類される。これらのウイルスは、典型的には１１ｋｂ～１２ｋｂの範囲にあるポジティブセンス一本鎖ＲＮＡゲノムを担持する。本発明のアルファウイルスレプリコンは、長さが１１ｋｂ～１２ｋｂ、または長さが１０～１３ｋｂ、もしくは７～２０ｋｂもしくは７～２５ｋｂとすることができ、５’キャップおよび３’ポリＡテールを有することができ、これはアルファウイルスの５’キャップおよび３’ポリＡテールとすることができる。５’キャップは、当業者に知られているもの、例えば、７－メチルグアニル酸キャップ、またはアンチリバースキャップアナログ３’－Ｏ－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇもしくは別のアナログキャップ構造とすることができる。アルファウイルスは一般にエンベロープウイルスであり、形状が球形であり、約７０ｎｍの直径を有する。それらはまた等尺性ヌクレオカプシドを有することができる。レプリコンはＲＮＡの単一断片上にコードすることができる。アルファウイルスゲノムおよびレプリコンは、非構造性および構造性である２つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を有する。ゲノムの非構造性部分はタンパク質ｎｓＰ１～ｎｓＰ４をコードし、これらタンパク質は、ウイルスＲＮＡの転写と複製において役割を演じ、ポリタンパク質として産生され、そしてウイルスの複製機構である。しかし、レプリコンは、１または２または３つ以上のオープンリーディングフレームを有することができる。本発明のアルファウイルスレプリコンのいずれも、キャプシド、ヌクレオキャプシド、コートタンパク質、または核タンパク質を欠くか、または含まないか、またはそれらのうちに含まれていないか、またはそれらと会合していない、とすることができる。本発明のアルファウイルスレプリコンとはＲＮＡ分子であり得る。

ゲノムの構造性部分は、コアヌクレオカプシドプロテインＣ、およびヘテロダイマーとして会合するエンベロープタンパク質Ｐ６２およびＥ１をコードする。本発明のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスの記載された特性のうちの任意の１つまたは複数を有することができる。一部の実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス構造タンパク質をコードする配列を欠く；またはアルファウイルス（または任意選択で任意の他の）構造タンパク質をコードしない。一部の実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、それらが本明細書に完全に記載されているかのように、あらゆる組み合わせおよびサブコンビネーションを含めて、プロテインＣ、Ｐ６２、６Ｋ、およびＥ１のいずれか１つまたは複数をコードしない。一部の実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、プロテインＣ、Ｐ６２、６Ｋ、およびＥ１のいずれか１つをコードしない。

アルファウイルスファミリーの地理的隔離は、それらの独特の環境へのこれらのウイルスの進化および適応における要因とすることができる。循環アルファウイルス血清複合体は、旧世界または新世界アルファウイルスのいずれかとしてさらに分類することができる。旧世界および新世界アルファウイルスは、本明細書に記載のように本発明で利用することができる配列を有する。新世界アルファウイルスとして、任意の新世界アルファウイルス、例えば、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、フォートモーガン（ＦＭＶ）、ハイランドＪウイルス（ＨＪＶ）、バギークリークウイルス（ＢＣＲＶ）、ムカンボウイルス（ＭＵＣＶ）、およびピクスナウイルス（ＰＩＸＶ）、が挙げられる。旧世界アルファウイルスとして、任意の旧世界アルファウイルス、例えば、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ゲタウイルス（ＧＥＴＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、ヌドゥムウイルス（ＮＤＵＶ）、バーマ森林ウイルス（ＢＦＶ）、マヤロウイルス（ＭＡＹＶ）、アウラウイルス（ＡＵＲＡ）、ウナウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、およびキジラガウイルスが挙げられる。新世界および旧世界のウイルスならびにそれらの配列は、本発明のＲＮＡレプリコンにおいて任意の組み合わせまたはサブコンビネーションで使用することができ、それらが本明細書に完全に記載されているかのように、可能なあらゆる組み合わせおよびサブコンビネーションで開示される。

本発明のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルスゲノムに由来することができ、このことは、レプリコンがアルファウイルスゲノムの構造特性の一部を有するか、またはその構造特性に類似していることを意味する。本発明のＲＮＡレプリコンは、改変アルファウイルスゲノムとすることができる。本明細書に開示のレプリコンの一部の実施形態では、レプリコンの１つまたは複数の配列は、「トランス」で提供することができる、すなわち、レプリコンの配列は、２つ以上のＲＮＡ分子上で提供される。他の実施形態では、レプリコンの配列はすべて、単一のＲＮＡ分子上に存在し、これはまた、本明細書に記載のように処置される哺乳動物に投与することができる。

由来
本発明のＲＮＡレプリコンは、野生型の新世界または旧世界アルファウイルスゲノム（またはこれによってコードされているアミノ酸配列）からのＲＮＡ配列を含有することができる。本明細書に開示の本発明のＲＮＡレプリコンのいずれも、野生型アルファウイルスゲノム配列に「由来する」またはそれに「基づく」ＲＮＡ配列を含有することができ、これが意味するところは、これらＲＮＡ配列は、新世界または旧世界アルファウイルスゲノムとすることができる野生型ＲＮＡアルファウイルスゲノムからのＲＮＡ配列（相当するＲＮＡ配列とすることができる）と、少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも６８％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも８５％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％または８０～９９％または９０～１００％または９５～９９％または９５～１００％または９７～９９％または９８～９９％、の配列同一性を有する、ことである。本明細書に開示の核酸またはアミノ酸配列のいずれも、機能的または生物学的に活性とすることができ、アルファウイルスまたはレプリコンの自己複製に必要な別の配列に作動可能に連結することができる。分子は、その天然（または野生型）の相当する分子と同じ活性の少なくとも５０％を果たす場合、機能的または生物学的に活性であるが、機能性分子は、その天然（または野生型）の相当する分子と同じ活性の、少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または１００％を果たす場合もある。ＲＮＡレプリコンはまた、野生型アルファウイルスのアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列またはそれに基づくアミノ酸配列をコードすることもでき、これが意味するところは、これらＲＮＡ配列は、新世界または旧世界アルファウイルスゲノムとすることができる野生型ＲＮＡアルファウイルスゲノムによってコードされているアミノ酸配列（相当する配列とすることができる）と、少なくとも６０％または少なくとも６５％または少なくとも６８％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％または８０～９９％または９０～１００％または９５～９９％または９５～１００％または９７～９９％または９８～９９％の配列同一性を有する、ことである。他の配列に由来する配列は、本来の配列よりも最大５％または最大１０％または最大２０％または最大３０％長くても短くてもよい。実施形態のいずれかでは、配列同一性は、Ｇ３ＢＰまたはＦＸＲの結合部位（またはこれを有するアミノ酸配列）をその上でコードする任意のヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％または少なくとも９７％または少なくとも９８％または少なくとも９９％または１００％とすることができる。これらの配列はまた、本来の配列よりも最大５％または最大１０％または最大２０％または最大３０％長くても短くてもよい。

例えば、一部の実施形態では、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３マクロドメイン、ｎｓＰ３中央ドメイン、ｎｓＰ３超可変ドメイン、および／またはｎｓＰ４タンパク質のいずれか１つまたは複数をコードするＲＮＡ配列は、相当する野生型アルファウイルス配列に由来することができる。「相当する」配列は、別のタイプのアルファウイルスの類似配列であってもよい。相当する配列は本明細書に開示されており、当業者に知られている配列アラインメントツール（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）によって決定することもできる。図６に、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａを使用して取得した、旧世界および新世界アルファウイルスの代表的なメンバーからのｎｓＰ３タンパク質の相当する配列を例示する配列アラインメントを示す。しかし、当業者が認める他の配列アラインメントツールを使用してもよい。配列アラインメントの実行に役立つプログラムは、Molecular Systems Biology (2011) 7, 539にも見られる。したがって、新世界アルファウイルスからのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４の各配列は、それぞれ、旧世界アルファウイルスからのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４の各配列に「相当する」。配列は、同様に、相当する配列であってもよい。相当するアミノ酸配列は、少なくとも５個または少なくとも１０個または少なくとも１５個または少なくとも２０個または少なくとも２５個または少なくとも３０個または少なくとも５２個または少なくとも５３個または少なくとも７５個または少なくとも１００個または少なくとも１２５個または１５０個または少なくとも１７５個または少なくとも２００個のアミノ酸とすることができ、本来の配列よりも、最大５％または最大１０％または最大２０％または最大３０％長くても短くてもよい；相当する核酸配列は、少なくとも１５個または少なくとも３０個または少なくとも４５個または少なくとも６０個または少なくとも７５個または少なくとも９０個または少なくとも１５６個または少なくとも１５９個または少なくとも２２５個または少なくとも３００個または少なくとも３７５個または少なくとも４５０個または少なくとも５２５個または少なくとも６００個のヌクレオチドとすることができる。かかる配列は、本来の配列よりも最大５％または最大１０％または最大２０％または最大３０％長くても短くてもよい。

レプリコンの一部の実施形態では、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４の配列のそれぞれは、新世界アルファウイルスゲノムに由来するか、またはそれに基づくことができる。一部の実施形態では、野生型新世界アルファウイルスゲノムに由来するＲＮＡレプリコンまたはそれに基づくＲＮＡレプリコンは、野生型新世界アルファウイルスゲノムからではない少なくとも１つのＲＮＡ配列（少なくとも１つの異種タンパク質またはペプチドの他に）を含有することができるが、このＲＮＡ配列は、ｎｓＰ３の配列、またはｎｓＰ３の中央ドメインおよび／またもしくはマクロドメインの配列、またはＨＶＤの少なくとも一部の配列、とすることができる。一部の実施形態では、新世界アルファウイルスゲノムに由来するＲＮＡレプリコンは、野生型旧世界アルファウイルスゲノムからの相当する配列で置換された、ｎｓＰ３、またはｎｓＰ３のドメイン、またはｎｓＰ３のドメインの一部をコードするＲＮＡ配列を有することができる。レプリコン全体を指す場合、「由来する」または「基づく」とは、少なくとも１つの異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡの配列を数に入れず、任意選択で、任意の組み合わせまたはサブコンビネーションにおいて、ｎｓＰ３タンパク質、またはｎｓＰ３のマクロドメイン、中央ドメイン、および／もしくはＨＶＤドメインのいずれか１つまたは複数をコードする配列を数に入れなくてもよい。

「ＲＮＡレプリコン」という用語は、ヒト、哺乳動物、または動物の細胞であり得る許容細胞内でそれ自体の増幅または自己複製を誘導するのに必要な遺伝情報のすべてを含有するＲＮＡを指す。ＲＮＡレプリコンは、１）ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードし、これは、ウイルスまたは宿主細胞由来のタンパク質、核酸、またはリボ核タンパク質と相互作用して、ＲＮＡ増幅プロセスを触媒することができる。非構造タンパク質は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ４を含み、２）３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲ（非構造タンパク質媒介増幅用のアルファウイルスヌクレオチド配列）などのゲノムおよびサブゲノムＲＮＡの複製および転写に必要なシス作用性ＲＮＡ配列、ならびに／またはサブゲノムプロモーター、を含有する。これらの配列を、自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来タンパク質、核酸もしくはリボ核タンパク質、またはこれらの構成成分のいずれかどうしの複合体への複製プロセス過程で結合させることができる。一部の実施形態では、改変ＲＮＡレプリコン分子は典型的には、以下の順序のエレメントを含有する：複製のためにシスで必要な５’ウイルスＲＮＡ配列（例えば、５’ＵＴＲおよび５’ＣＳＥ）、生物学的に活性な非構造タンパク質をコードする配列（例えば、ｎｓＰ１２３４）、サブゲノムＲＮＡを転写するためのプロモーター、複製のためにシスで必要な３’ウイルス配列（例えば、３’ＵＴＲ）、およびポリアデニル化トラクト、ならびに任意選択で、サブゲノムプロモーターの後またはそれの制御下にある異種タンパク質またはペプチドをコードする１つの配列（または２つ以上の配列）。さらに、ＲＮＡレプリコンという用語は、ポジティブセンス（またはメッセージセンス）の分子を指すことができ、ＲＮＡレプリコンは、任意の既知の天然のＲＮＡウイルスの長さとは異なる長さのものであってもよい。本開示の実施形態のいずれかでは、ＲＮＡレプリコンは、構造性ウイルスタンパク質（例えば、ヌクレオカプシドプロテインＣ、ならびにエンベロープタンパク質Ｐ６２、６ＫおよびＥ１）の少なくとも１つ（またはすべて）の配列を欠く（または含有しない）ことができる。これらの実施形態では、１つまたは複数の構造性遺伝子をコードする配列を、例えば、少なくとも１つの異種タンパク質またはペプチド（または目的の他の遺伝子（ＧＯＩ））のコード配列などの１つまたは複数の異種配列で置換することができる。

種々の実施形態では、本明細書に開示のＲＮＡレプリコンは、操作されたＲＮＡレプリコンであっても、合成のＲＮＡレプリコンであっても、組換えのＲＮＡレプリコンであってもよい。本明細書で使用される場合、組換え体という用語は、ポリヌクレオチドのヒトの処置からのものであるまたは間接的ではあるがそれから生じる、任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、等）を意味する。非限定的な例として、ｃＤＮＡとは、組換えＤＮＡ分子であり、同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって生成された、またはリンカーが付着された、またはクローニングベクターや発現ベクターなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。非限定的な例として、組換えＲＮＡレプリコンは以下の１つまたは複数であってよい：１）例えば、核酸分子の化学的もしくは酵素的技法を使用して（例えば、化学的核酸合成を使用することによって、または複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えば、メチル化を含めて）、もしくは組換え（相同および部位特異的組換えを含めて）に酵素を使用することによって）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成または改変されたもの、２）天然では結合されていない結合ヌクレオチド配列、３）天然のヌクレオチド配列に対して１つまたは複数のヌクレオチドを欠失しているように、分子クローニング技法を使用して操作されたもの、および４）天然のヌクレオチド配列に対して１つまたは複数の配列変化または再配列を有するように、分子クローニング技法を使用して処置されているもの。

本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドの配列に関する「パーセント同一性」または「相同性」または「共有配列同一性」または「パーセント（％）配列同一性」という用語は、最大パーセント同一性のために配列をアライメントさせ、必要に応じてギャップを導入して最大パーセント相同性を得た後の、既知のポリペプチドと同一である、候補配列中の、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。Ｎ末端またはＣ末端の挿入または欠失は、相同性に影響を及ぼすと解釈してはならず、約３０個未満、約２０個未満、または約１０個未満または５個未満のアミノ酸残基のポリペプチド配列への内部欠失および／または挿入は相同性に影響を及ぼすと解釈してはならない。ヌクレオチド配列レベルまたはアミノ酸配列レベルでの相同性または同一性は、配列類似性検索用に仕立てられているプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ（Altschul (1997), Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402およびKarlin (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268）で用いられるアルゴリズムを使用して、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）解析によって決定することができる。ＢＬＡＳＴプログラムにより使用されるアプローチは、まず、ギャップの有無にかかわらず、クエリー配列とデータベース配列の間の類似セグメントを熟慮し、次いで、同定された適合箇所すべての統計的有意性を評価し、最後に、それらの適合箇所のうちあらかじめ選択した有意性のしきい値を満たすもののみをまとめる、というものである。配列データベースの類似性検索における基本的な問題の議論については、Altschul (1994), Nature Genetics 6, 119-129を参照されたい。ヒストグラム、記載、アライメント、期待値（すなわち、データベース配列に対する適合箇所の報告のための、統計的有意性のしきい値）、カットオフ、マトリクスおよびフィルター（低複雑性）の検索パラメータは、デフォルト設定としてよい。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘによって使用されるデフォルトのスコアリングマトリクスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスであり（Henikoff (1992), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919）、長さが８５を超える（ヌクレオチド塩基またはアミノ酸）クエリー配列に対して推奨される。

ヌクレオチド配列を比較するのに設計されたｂｌａｓｔｎの場合、スコアリングマトリクスは、Ｍ（すなわち１対のマッチした残基のリワードスコア）とＮ（すなわち、ミスマッチ残基のペナルティスコア）との比によって設定され、ＭおよびＮのデフォルト値はそれぞれ＋５および－４としてよい。４つのｂｌａｓｔｎパラメータを、以下のように調節してよい：Ｑ＝１０（ギャップクリエーションペナルティ）；Ｒ＝１０（ギャップ伸長ペナルティ）；ｗｉｎｋ＝１（クエリーに沿って毎ｗｉｎｋ目の位置でワードヒットを生じる）；およびｇａｐｗ＝１６（ギャップのあるアライメントが生じるウィンドウ幅を設定する）。アミノ酸配列を比較するための同等のＢｌａｓｔｐパラメータ設定は、Ｑ＝９、Ｒ＝２、ｗｉｎｋ＝１、およびｇａｐｗ＝３２であってよい。ＧＣＧパッケージのバージョン１０．０で利用可能な配列間のＢＥＳＴＦＩＴ（登録商標）の比較はＤＮＡパラメータＧＡＰ＝５０（ギャップクリエーションペナルティ）およびＬＥＮ＝３（ギャップ伸長ペナルティ）を使用することができ、タンパク質比較における同等の設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２とすることができる。

本明細書に核酸またはポリペプチドの配列を開示する上で、例えば、開示されるｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、ｎｓＰ３マクロドメイン、ｎｓＰ３中央ドメイン、ｎｓＰ３超可変ドメイン、ｎｓＰ４、ＲｄＲｐ、Ｐ１２３４の配列もまた、本来の配列に基づくかまたはそれに由来すると考えられる配列である。したがって、開示される配列には、本明細書に記載の任意のポリペプチド配列の完全長ポリペプチド配列と、例えば、配列番号１～２９（および配列番号１～２９のいずれかをコードするヌクレオチド配列）、およびそれらの断片と、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、または少なくとも８５％、例えば少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％または８５～９９％または８５～９５％または９０～９９％または９５～９９％または９７～９９％または９８～９９％の配列同一性の配列同一性を有するポリペプチド配列、が含まれる。本明細書に開示の配列のいずれかの断片または部分も開示される。配列の断片または部分には、全体の配列のうち、少なくとも５個もしくは少なくとも７個もしくは少なくとも１０個もしくは少なくとも２０個もしくは少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも７５個、少なくとも１００個、少なくとも１２５個、１５０個もしくはそれ超、または５～１０個もしくは１０～１２個もしくは１０～１５個もしくは１５～２０個もしくは２０～４０個もしくは２０～５０個もしくは３０～５０個もしくは３０～７５個もしくは３０～１００個のアミノ酸残基を有する配列（またはかかる断片をコードする核酸）、あるいは、少なくとも１００個もしくは少なくとも２００個もしくは少なくとも３００個もしくは少なくとも４００個もしくは少なくとも５００個もしくは少なくとも６００個もしくは少なくとも７００個もしくは少なくとも８００個もしくは少なくとも９００個もしくは少なくとも１０００個もしくは１００～２００個もしくは１００～５００個もしくは１００～１０００個もしくは５００～１０００個のアミノ酸残基を有する配列（またはかかる断片をコードする核酸）、あるいは、これらの量のいずれかであるが、配列番号１～２９のいずれかのまたは本明細書に開示の任意の断片の５００個未満もしくは７００個未満もしくは１０００個未満もしくは２０００個未満の連続するアミノ酸、またはかかる断片をコードする、核酸が含まれ得る。また、例えば、少なくとも１個または２個または３個または４個または５個のアミノ酸残基が、挿入および置換を含有する開示された配列にＮ末端および／もしくはＣ末端で、ならびに／またはその配列の中に挿入されている、かかる配列の変異体も、かかる変異体をコードする核酸配列も開示される。企図される変異体は、以下を付加的にまたは交互に含むことができる：例えば、相同組換えまたは部位特異的もしくはＰＣＲ変異誘発による所定の突然変異を含有するもの、およびそれらに限定されないが、本明細書に記載されるものを含めて他の種の相当するポリペプチドまたは核酸、挿入および置換を含有する、ポリペプチドまたは核酸のファミリーの対立遺伝子または天然の他の変異体；ならびに／あるいは、ポリペプチドが、挿入および置換を含有する、天然のアミノ酸以外の部分（例えば、酵素などの検出可能な部分）で、置換、化学的手段、酵素的手段または他の適切な手段によって共有結合で改変されている、誘導体。本明細書に記載の核酸配列は、ＲＮＡ配列であり得る。

ＲＮＡレプリコンの構成成分または配列のいずれもが、構成成分または配列の他のいずれにも作動可能に連結することができる。ＲＮＡレプリコンの構成成分または配列は、宿主細胞または処理された生物体における少なくとも１つの異種タンパク質もしくはペプチド（もしくは生物学的製剤）の発現向けに、および／またはレプリコンが自己複製する能力向けに作動可能に連結することができる。「作動可能に連結された」という用語は、それらの通常の機能を実行するように構成されている２つ以上の配列間の機能的連結を意味する。したがって、コード配列に作動可能に連結されたプロモーターまたはＵＴＲは、適当な酵素が存在する場合、コード配列の転写および発現に影響を及ぼすことができる。プロモーターは、その発現を誘導するように機能する限り、コード配列が隣接している必要はない。したがって、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と調節配列（例えば、プロモーターまたはＵＴＲ）との間の作動可能な連結とは、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的結合である。作動可能に連結されているとは、ＲｄＲｐをコードする配列（例えば、ｎｓＰ４）、ｎｓＰ１～４、ＵＴＲ、プロモーター、およびＲＮＡレプリコン内のコードしている他の配列などの配列を指すこともでき、これらの配列が生物学的製剤分子の転写および翻訳ならびに／またはレプリコンの複製を可能とするように連結されている。ＵＴＲは、コードされている他の配列の、リボソームによる認識と翻訳に必要な配列と間隔を提供することにより、作動可能に連結することができる。

Ｇ３ＢＰおよびＦＸＲ
Ｇ３ＢＰ（Ｒａｓ－ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（Ｓｒｃ－ホモロジー３（ＳＨ３）ドメイン）結合タンパク質）およびＦＸＲ（脆弱Ｘファミリータンパク質）は両方とも、自己集合してリボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成するＲＮＡ結合タンパク質である。両者ともＨＶＤドメインに結合する。Ｇ３ＢＰとＦＸＲによって形成されたＲＮＰ複合体は、細胞内で個別の機能を果たす。例えば、Ｇ３ＢＰは、免疫応答におけるストレス顆粒の核生成および形成にとって極めて重要である。ストレス顆粒は、ｍＲＮＡの翻訳を隔離およびシャットダウンするように、さらにはＩ型インターフェロンおよびその他のサイトカインの誘発および分泌を調節するように機能する。これらの活性が一緒になって細胞内での抗ウイルス状態を補強し、適応免疫応答を促進する。一方、ＦＸＲファミリーのタンパク質は、先天性免疫において役割を演じているとは考えられていないが、ポリリボソームと会合しニューロンでＲＮＡ輸送顆粒を形成する。図７に、これらのＲＮＡ結合タンパク質がアルファウイルス配列に結合する、種々のアルファウイルスｎｓＰ３ ＨＶＤ上の領域を示す。

非構造タンパク質
アルファウイルスゲノムは、非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードし、これらは、Ｐ１２３４（またはｎｓＰ１～４またはｎｓＰ１２３４）と称されることもある単一のポリタンパク質前駆体として産生され、かつタンパク質分解プロセシングを通して成熟タンパク質へと切断される。ｎｓＰ１はサイズが約６０ｋＤａであり、メチルトランスフェラーゼ活性を備え、ウイルスキャッピング反応に関与することができる。ｎｓＰ２はサイズが約９０ｋＤａであり、ヘリカーゼおよびプロテアーゼの活性を備えることができる一方、ｎｓＰ３は約６０ｋＤａであり、３つのドメイン：マクロドメイン、中央（またはアルファウイルス独特の）ドメイン、および超可変ドメイン（ＨＶＤ）を含有する（図６を参照されたい）。ｎｓＰ４はサイズが約７０ｋＤａであり、コアＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲｐ）触媒ドメインを含有する。感染後、アルファウイルスゲノムＲＮＡは翻訳されてＰ１２３４ポリタンパク質を生じ、これは個々のタンパク質に切断される。

ｎｓＰ３
アルファウイルスのｎｓＰ３タンパク質は３つのドメイン：ａ）マクロドメイン、ｂ）中央（またはアルファ）ドメイン、およびｃ）超可変ドメイン（ＨＶＤ）、を含有する。旧世界および新世界アルファウイルスの一部の代表的なメンバーの３つのドメインについて相当するアミノ酸配列を図６に示す。種々の実施形態では、本発明のレプリコンは、野生型アルファウイルスｎｓＰ３に由来するｎｓＰ３マクロドメインと野生型アルファウイルスｎｓＰ３に由来するｎｓＰ３中央ドメインとをコードする、ＲＮＡ配列を有する。種々の実施形態では、マクロドメインおよび中央ドメインは、両方とも、新世界の野生型アルファウイルスｎｓＰ３に由来してもよく、両方とも、旧世界の野生型アルファウイルスのｎｓＰ３タンパク質に由来してもよい。一部の実施形態では、マクロドメインは新世界の野生型アルファウイルスマクロドメインに由来してもよく、中央ドメインは旧世界の野生型アルファウイルス中央ドメインに由来してもよく、またはその逆であってもよい。様々なドメインは、本明細書に記載の任意の配列とすることができる。

超可変ドメイン（ＨＶＤ）
一部の実施形態では、レプリコンは、ＦＸＲ結合部位が開始しているアミノ酸のＣ末端側の配列を削除し、旧世界の野生型アルファウイルスＨＶＤ配列またはその部分の置換配列に置き換えることができる、新世界アルファウイルスＨＶＤを有することができる。旧世界アルファウイルス置換配列を本明細書に記載する。したがって、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶである場合、ｎｓＰ３のアミノ酸４７８のＣ末端側にあるそういったアミノ酸を削除できる；新世界アルファウイルスがＥＥＥＶである場合、ｎｓＰ３のアミノ酸５３１のＣ末端側にあるそういったアミノ酸を削除できる；新世界アルファウイルスがＷＥＥＶである場合、ｎｓＰ３のアミノ酸５０４のＣ末端側にあるそういったアミノ酸を削除できる（図７を参照されたい）。これらの実施形態のいずれかでは、置換配列を、本明細書に記載のように置換することができる。本明細書に別段で記載のように、新世界アルファウイルスＨＶＤのＣ末端アミノ酸の一部を、旧世界配列のＣ末端側にそれでも保持することができる。

一部の実施形態では、新世界アルファウイルスのＦＸＲ結合部位をコードする配列の少なくとも一部を削除し、本明細書に記載される置換配列に置き換えることができる。したがって、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶである場合、ｎｓＰ３のアミノ酸４７８～５１７または４７８～５４５を削除し、旧世界アルファウイルスの置換配列に置き換えることができる。あるいは、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶである場合、ｎｓＰ３のアミノ酸４７８～５４５の間に存在する反復のうちの少なくとも１つを削除し、旧世界アルファウイルス置換配列に任意選択で置き換えることができる。新世界アルファウイルスがＥＥＥＶである場合、ｎｓＰ３のアミノ酸５３１～５４７を削除し、旧世界の置換配列に置き換えることができる。新世界アルファウイルスがＷＥＥＶである場合、ｎｓＰ３のアミノ酸５０４～５２０を削除し、旧世界の置換配列に置き換えることができる。他の実施形態では、ＦＸＲ結合部位をコードする全体の配列を削除することができ、またはＦＸＲ結合部位の少なくとも５０％もしくは少なくとも７０％もしくは少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％を削除することができ、置換配列に任意選択で置き換えることができる。実施形態のいずれかでは、示された配列を削除することができ、置換配列を挿入しなくてもよい。

旧世界アルファウイルス置換配列は、１つまたは複数のＧ３ＢＰ結合部位、またはＧ３ＢＰ結合部位の少なくとも一部を有するアミノ酸断片を含むことができる。したがって、置換配列は、ＦＧＤＦ（配列番号１８）であってもＦＧＳＦ（配列番号１９）であってもよい。置換配列は、旧世界アルファウイルスの野生型ｎｓＰ３超可変ドメインの少なくとも一部に由来することもできる。旧世界アルファウイルス置換配列のさらなる例を下に記載する。旧世界アルファウイルス置換配列を、本明細書に記載の新世界アルファウイルスＨＶＤ配列のいずれかの配列を有するレプリコンで使用することができる。実施形態のいずれかでは、新世界アルファウイルスは、ＶＥＥＶ、ＥＥＥＶ、ＷＥＥＶ、または本明細書に記載の任意の新世界アルファウイルスであり得る。

旧世界アルファウイルスがＣＨＩＫＶである場合、置換配列は、ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３のアミノ酸４７９～５８２または４７９～５００または４７９～５００であり得る。

旧世界アルファウイルスがＳＩＮＶである場合、置換配列は、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３のアミノ酸４９０～４９３または５１３～５１６または４９０～５１６を含む配列であり得る。

旧世界アルファウイルスがＳＦＶである場合、置換配列は、ＳＦＶ ｎｓＰ３のアミノ酸４５１～４７１、または４５１～４５４、または４６８～４７１を含む配列であり得る。

旧世界アルファウイルスがＭＡＹＶである場合、置換配列は、ＭＡＹＶ ｎｓＰ３のアミノ酸４７０～４７３を含む配列であり得る。

旧世界アルファウイルスがＲＲＶである場合、置換配列は、ＲＲＶ ｎｓＰ３のアミノ酸４１２～４２６、または５１２～５１５、または５２３～５２６を含む配列であり得る。

旧世界アルファウイルスがＯＮＮＶである場合、置換配列は、ＯＮＮＶ ｎｓＰ３のアミノ酸５１９～５４０、または５１９～５２２、または５３７～５４０を含む配列であり得る。

旧世界アルファウイルスがＢＦＶである場合、置換配列は、ＢＦＶ ｎｓＰ３のアミノ酸４２９～４５０、または４２９～４３２、または４４７～４５０を含む配列であり得る。

新世界および旧世界アルファウイルスは、本明細書に記載のいずれでもよく、可能な任意の組み合わせまたはサブコンビネーションで組み合わせることができ、これらはすべて、それらが本明細書に完全に記載されているかのように開示される。

アルファウイルスゲノムは、ｎｓＰ４のコアＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする。ポリタンパク質の切断をｎｓＰ２／３接合部で行うことができ、その結果、ゲノム複製過程で使用されるＲＮＡテンプレートに影響を及ぼす。切断後、ｎｓＰ３は、ｎｓＰ２を取り囲むリング構造を創り出すことができ、これら２つのタンパク質は実質的なインターフェースを備える。したがって、ｎｓＰ２／３および／またはｎｓＰ３／４の接合部周辺の配列の保存は有用であり得る。

したがって、一部の実施形態では、ｎｓＰ３タンパク質のマクロおよび／または中央および／またはＨＶＤの各ドメインは、新世界アルファウイルスに由来するアミノ酸配列である（本明細書に記載の）Ｃ末端部分および／またはＮ末端部分を有することができる一方で、ドメインの残りの部分（単数／複数）は旧世界アルファウイルス配列に由来する。例えば、マクロおよび／または中央および／またはＨＶＤの各ドメインは、相当する旧世界アルファウイルスドメインに由来する配列を有することができるが、（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４が由来する新世界アルファウイルスとすることができる）新世界アルファウイルス配列に由来するｎｓＰ３のＮ末端および／またはＣ末端の最初の４個または５個または６個または４～６個または６～８個または６～１０個のアミノ酸を有することができる。したがって、レプリコンは、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３マクロおよび／または中央および／またはＨＶＤの各ドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を有する本明細書に記載のものとすることができ、ドメインのＮ末端側および／またはＣ末端側の最初の１～３個または１～４個または１～５個または１～６個または１～７個または１～８個のアミノ酸は、新世界アルファウイルスドメインに由来するか、その上に１つまたは２つまたは３つの置換を有する場合がある。この文脈で使用される場合、「Ｃ末端」および「Ｎ末端」という用語は、真の末端を示すのではなく、ポリタンパク質（例えば、Ｐ１２３４）が個別のポリペプチド（例えば、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４）へと切断されるポイントを示す。ｎｓＰをコードする配列は終止コドンを特徴とし、通常、転写はそのポイントで停止することになる。しかし、終止コドンがリードスルー終止コドンとして処理される場合、末端は、配列番号１２～１７に示される「／」とすることができ、これは、ｎｓＰのＮ末端および／またはＣ末端を表すことができる。接合配列は、末端のいずれかの側の、例えば、ｎｓＰ３側のそうした１～６個のアミノ酸とすることができる。このような実施形態は、ｎｓＰ３配列が旧世界配列に由来することを可能にするが、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３間およびｎｓＰ３／ｎｓＰ４間の接合部を保存する。これらの接合部の保存により、新世界アルファウイルス酵素を使用したＰ１２３４タンパク質接合部の切断が可能となり得る。一部の実施形態では、最後から２番目のグリシンが接合部に保存されている。旧世界アルファウイルスは、本明細書に記載のいずれでもよい。例えば、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶである場合、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３配列はＬＨＥＡＧＣ／ＡＰＳＹ（配列番号１２）とすることができ、スラッシュ（「／」）はｎｓＰ２とｎｓＰ３の間の境界を表し、最後から２番目のＧは保存される一方で、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部の残りのアミノ酸は、本明細書に記載のように変えられる。ＶＥＥＶのｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合部の場合、配列はＲＦＤＡＧＡ／ＹＩＦＳ（配列番号１３）とすることができ、最後から２番目のグリシンがここでも保存され、残りのｎｓＰ３のアミノ酸は本明細書に記載のように変えることができる。これらの配列の前に終止コドン（ＴＧＡ）が先行することもでき、これは、上記のように、リードスルー終止コドンとして処理され得る場合がある。新世界アルファウイルスがＥＥＥＶである場合、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３配列はＱＨＥＡＧＲ／ＡＰＡＹ（配列番号１４）とすることができ、スラッシュ（「／」）はｎｓＰ２とｎｓＰ３の間の境界を表し、最後から２番目のＧは保存される一方で、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部の残りのアミノ酸は、本明細書に記載のように変えられる。ＥＥＥＶのｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合部の場合、配列はＲＹＥＡＧＡ／ＹＩＦＳ（配列番号１５）とすることができ、最後から２番目のグリシンがここでも保存され、残りのｎｓＰ３のアミノ酸は本明細書に記載のように変えることができる。これらの配列の前に、上のようにリードスルー終止コドン（ＴＧＡ）が先行することもできる。新世界アルファウイルスがＷＥＥＶである場合、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３配列はＲＹＥＡＧＲ／ＡＰＡＹ（配列番号１６）とすることができ、スラッシュ（「／」）はｎｓＰ２の端または末端（およびｎｓＰ２とｎｓＰ３の間の接合部）を表し、最後から２番目のＧは保存される一方で、ｎｓＰ２／ｎｓＰ３接合部の残りのアミノ酸は、本明細書に記載のように変えられる。ＷＥＥＶのｎｓＰ３／ｎｓＰ４接合部の場合、配列はＲＹＥＡＧＡ／ＹＩＦＳ（配列番号１７）とすることができ、最後から２番目のグリシンがここでも保存され、残りのｎｓＰ３のアミノ酸は本明細書に記載のように変えることができる。これらの配列の前に、本明細書で説明のようにリードスルー終止コドン（ＴＧＡ）が先行することもできる。これらの配列（配列番号１２～１７）のいずれも、Ｎ末端側および／またはＣ末端側に１つまたは２つまたは３つの置換を含有することもできる。

反復モチーフ
アルファウイルスは、種にまたがって核酸配列またはポリペプチドにおける類似または同一の配列である保存配列エレメント（ＣＳＥ）を含有することができる。ＣＳＥは、新世界または旧世界アルファウイルスｎｓＰ３のＨＶＤに生じる場合もあり、当技術分野で知られている。

旧世界アルファウイルスはまた、ＦＧＤＦ（配列番号１８）またはＦＧＳＦ（配列番号１９）アミノ酸モチーフを含有することができ、これは、配列内で反復して、反復配列または反復モチーフを形成することができる。本発明のＲＮＡレプリコンの実施形態のいずれかでは、旧世界アルファウイルスのＨＶＤは、ＦＧＤＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２０）反復、またはＦＧＳＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２１）反復、またはＦＧＤＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２２）反復、またはＦＧＳＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２３）反復、を含有することができる。反復が存在するすべての実施形態では、２つの反復モチーフを、１つまたは複数のアミノ酸残基によって隔てることができる。種々の実施形態では、２つの反復モチーフを、５個もしくは６個もしくは７個もしくは８個もしくは９個もしくは１０個もしくは少なくとも１０個もしくは１１個もしくは１２個もしくは１３個もしくは１４個もしくは１５個もしくは１６個もしくは１７個もしくは１８個もしくは１９個もしくは２０個もしくは２１個もしくは２２個もしくは２３個もしくは２４個もしくは２５個のアミノ酸残基によってまたは２５個超のアミノ酸残基によって、隔てることができ、一実施形態ではこれらはランダムアミノ酸とすることができる。一実施形態では、モチーフまたは反復モチーフは、少なくとも１０個および２５個以下のアミノ酸によって隔てられており、これらもまたランダムアミノ酸とすることができる。種々の実施形態では、２つの反復モチーフを、ＮＥＧＥＩＥＳＬＳＳＥＬＬＴ（配列番号６）、ＳＤＧＥＩＤＥＬＳＲＲＶＴＴＥＳＥＰＶＬ（配列番号７）、またはＤＥＨＥＶＤＡＬＡＳＧＩＴ（配列番号８）、またはこれらのいずれかに由来する配列によって隔てることができ、これらは同じ長さのものとすることができる；したがって、配列番号６、７、または８によって隔てられた反復モチーフを開示するが、これらモチーフは、１）両端にＦＧＤＦ（配列番号１８）モチーフ；２）両端にＦＧＳＦ（配列番号１９）モチーフ；３）３’または５’端のいずれかにＦＧＤＦ（配列番号１８）モチーフおよび反対側の端にＦＧＳＦ（配列番号１９）モチーフ、を有する。種々の実施形態では、アミノ酸配列はまた、第２のモチーフに続くことができる。例として、アミノ酸配列、ＤＤＶＬＲＬＧＲＡＧＡ（配列番号１１）もしくはＥＰＧＥＶＮＳＩＩＳＳＲＳＡＶＳＦＰＬＲＫＱＲＲＲＲＲＳＲＲＴＥＹ（配列番号１０）もしくはＬＰＧＥＶＤＤＬＴＤＳＤＷＳＴＣＳＤＴＤＤＥＬＲＬＤＲＡＧＧ（配列番号９）またはこれらのいずれかに由来する配列が挙げられ、これらのいずれもが、本明細書に開示のモチーフまたは反復モチーフに続くことができる。

非翻訳領域
本発明のレプリコンのいずれもが、５’および３’の非翻訳領域（ＵＴＲ）を含むことができる。ＵＴＲは、野生型の新世界または旧世界アルファウイルスＵＴＲ配列、またはこれらのいずれかに由来する配列とすることができる。種々の実施形態では、５’ＵＴＲは、約６０ｎｔまたは５０～７０ｎｔまたは４０～８０ｎｔなどの適切な任意の長さとのものすることができる。一部の実施形態では、５’ＵＴＲはまた、保存された一次または二次構造（例えば、１つまたは複数のステムループ）を有するとともにアルファウイルスのまたはレプリコンＲＮＡの複製に関与することができる。一部の実施形態では、３’ＵＴＲは、最大数百ヌクレオチドとすることができ、例えば、５０～９００または１００～９００または５０～８００または１００～７００または２００ｎｔ～７００ｎｔとすることができる。３’ＵＴＲは、二次構造、例えばステップループを有することもでき、ポリアデニル化トラクトまたはポリＡテールがこれに続くこともできる。本発明の実施形態のいずれかでは、５’および３’の非翻訳領域は、レプリコンによってコードされている他の配列のいずれかに作動可能に連結することができる。ＵＴＲは、他のコードされている配列の認識および転写に必要な配列および間隔を提供することによって、異種タンパク質またはペプチドをコードするプロモーターおよび／または配列に作動可能に連結することができる。

一実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、異種タンパク質またはペプチド（例えば、モノクローナル抗体または生物学的製剤のタンパク質もしくはペプチド）をコードするＲＮＡ配列と、野生型新世界アルファウイルスのｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４の各タンパク質配列に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と、５’ＵＴＲ配列および３’ＵＴＲ配列（非構造タンパク質媒介の増幅用）と、を有することができる。ＲＮＡレプリコンはまた、５’キャップおよびポリアデニル化（またはポリＡ）テールを有することもできる。ＲＮＡレプリコンはまた、新世界アルファウイルスマクロドメインに由来するアミノ酸配列と、新世界アルファウイルス中央ドメインに由来するアミノ酸配列と、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来するアミノ酸配列と、をコードすることができる。代替の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、本明細書に記載のように、新世界超可変ドメインに由来するアミノ酸配列を有する一部と、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来するアミノ酸配列を有する別の部分と、をコードすることができる。

異種タンパク質またはペプチドの免疫原性は、当業者にとって知られているいくつかのアッセイ、例えば、短命エフェクターおよびメモリー前駆エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞等の、エピトープ特異的Ｔ細胞集団による細胞内サイトカインまたは分泌型サイトカインの免疫染色によって、またはエピトープ特異的Ｔ細胞の頻度および総数を定量化することおよびそれらの分化と活性化状態を特徴付けることによって、決定することができる。免疫原性は、抗体媒介の免疫応答を、例えば、血清のＩｇＡまたはＩｇＧの力価を測定することによる抗体の産生を測定することによっても、決定することができる。

異種タンパク質およびペプチド
本発明のＲＮＡレプリコンは、ＲＮＡ配列であって、アルファウイルスに対して異種であるとともに体内で上記ＲＮＡ配列を発現するヒト、哺乳動物、または動物に対しても異種とすることもできる（必ずしもそうではないが）少なくとも１つのタンパク質またはペプチドをコードする、ＲＮＡ配列を含む。任意の実施形態では、レプリコンは、２つまたは３つまたはこれより多い異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列を有することができる。種々の実施形態では、異種タンパク質またはペプチドは、本明細書に記載の生物学的製剤分子である。ヒト、哺乳動物、または動物への生物学的製剤分子の投与は、抗薬物抗体免疫応答を引き起こすリスクを抱えるが、本発明によれば、ヒト、哺乳動物、または動物の体へのレプリコンの投与、およびヒト、哺乳動物、または動物の体での生物学的製剤の発現が可能になる一方で、レプリコンを投与され、生物学的製剤分子を発現しているヒト、哺乳動物、または動物の細胞からの免疫応答が実質的に低下しているまたは全くない。実施形態のいずれかでは、異種タンパク質またはペプチドをコードする配列は、レプリコンの他の１つまたは複数の配列（例えば、プロモーターまたは５’ＵＴＲ配列もしくは３’ＵＴＲ配列）に作動可能に連結させることができるとともにサブゲノムプロモーターの制御下とすることができ、その結果、異種タンパク質またはペプチドがヒト、哺乳動物、または動物において発現される。

異種タンパク質またはペプチドは、任意のタンパク質またはペプチドであり得、例として、サイトカイン、増殖因子、免疫グロブリン、モノクローナル抗体（Ｆａｂ抗原結合断片、Ｆｃ融合タンパク質を含めて）、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、調節ペプチドおよびタンパク質が挙げられる。異種タンパク質であり得るモノクローナル抗体の具体例として、ラキシバクマブ、トシリズマブ、ブレンツジマブベドチン、第ＩＸ因子Ｆｃ融合タンパク質、リロナセプト、オファツムマブ、ベバシズマブ、ベリムマブ、セルトリズマブペゴル、ラムシルマブ、第ＶＩＩＩ因子Ｆｃ融合タンパク質、エタネルセプト、ベドリズマブ、セツキシマブ、アフリベルセプト、オビヌツズマブ、トラスツズマブ、アダリムマブ、カナキヌマブ、インフリキシマブ、アドトラスツズマブエムタンシン、ペンブロリズマブ、アレムツズマブ、ラニビズマブ、ロミプロスチム、ベラタセプト、アバタセプト、ペルツズマブ、デノスマブ、インフリキシマブ、カツマキソマブ、インフリキシマブ、アブシキシマブ、リツキシマブ、ゴリムマブ、バシリキシマブ、エクリザマブ、ウステキヌマブ、シルツキシマブ、パリビズマブ、ナタリズマブ、パニツムマブ、デノスマブ、オマリズマブ、イピリムマブ、ジバフリベルセプト、およびイブリツモマブチウキセタン、が挙げられる。他の実施形態では、異種タンパク質またはペプチドは、内皮増殖因子（例えば、血管ＥＧＦ、ホルモン（例えば、インスリン、リラキシン）、エクソンスキッピングオリゴヌクレオチド、モルホリノオリゴマー、モルホリノアンチセンスオリゴマー、または腫瘍特異的抗原をコードするＲＮＡとすることができる。一部の実施形態では、異種タンパク質またはペプチドは、最大５ｋｂまたは最大６ｋｂまたは最大７ｋｂまたは最大８ｋｂ、または最大９ｋｂまたは最大１０ｋｂまたは最大１１ｋｂまたは最大１２ｋｂ、のＲＮＡ配列によってコードされ得る。異種タンパク質はまた一本鎖抗体分子でもよい。

本発明のアルファウイルスレプリコンはまた、異種タンパク質またはペプチドの発現用のサブゲノムプロモーターを有することができる。本明細書で使用される「サブゲノムプロモーター」という用語は、ウイルス核酸のサブゲノムｍＲＮＡのプロモーターを指す。本明細書で使用される場合、「アルファウイルスサブゲノムプロモーター」とは、アルファウイルス複製プロセスの一部としてサブゲノムメッセンジャーＲＮＡの転写を誘導する、野生型アルファウイルスゲノムにおいて元々定義されたプロモーターである。

ポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、タンパク質または酵素に関して使用される場合、「異種」という用語は、宿主種に由来しないポリヌクレオチド、遺伝子、核酸、ポリペプチド、タンパク質または酵素を指す。例えば、本明細書で使用される「異種遺伝子」または「異種核酸配列」とは、それが導入される宿主生物体の種とは異なる種からの遺伝子または核酸配列を指す。異種配列はまた、合成であってもよく、生物体に由来しないものでもよく、または自然界で見られないものであってもよい。遺伝子調節配列を参照する場合、または遺伝子配列（例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、ポリＡ付加配列、イントロン配列、スプライス部位、リボソーム結合部位、内部リボソーム進入配列、ゲノム相同性領域、組換え部位等）の発現を処理するのに使用される補助核酸配列を参照する場合、またはタンパク質ドメインもしくはタンパク質局在化配列をコードしている核酸配列を参照する場合、「異種」とは、調節配列もしくは補助配列またはタンパク質ドメインもしくは局在化配列をコードする配列が、調節配列もしくは補助核酸配列またはタンパク質ドメインもしくは局在化配列をコードする核酸配列がゲノム、染色体やエピソーム内で並置されている遺伝子とは異なる供給源からのものであることを意味する。したがって、その天然状態（例えば、遺伝子操作されていない生物体のゲノムにおいて）において作動可能に連結されていない遺伝子に作動可能に連結されたプロモーターは、本明細書では、プロモーターが、それが連結される遺伝子と同じ種（または場合によっては、同じ生物体）に由来することができる場合でも、「異種プロモーター」と称される。同様に、操作されたタンパク質のタンパク質局在化配列またはタンパク質ドメインについて言及する場合、「異種」とは、局在化配列またはタンパク質ドメインが、遺伝子工学によってそれが組み込まれるものとは異なるタンパク質に由来すること、を意味する。

本明細書で使用される、「組換え」または「操作された」核酸分子という用語は、ヒトの介入により変更された核酸分子を指す。非限定的な例として、ｃＤＮＡとは、組換えＤＮＡ分子であり、同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって生成された、またはリンカーが付着された、またはクローニングベクターや発現ベクターやレプリコンなどのベクターに組み込まれた任意の核酸分子である。非限定的な例として、組換え核酸分子とは、１）例えば、核酸分子の化学的もしくは酵素的技法を使用して（例えば、化学的核酸合成を使用することによって、または複製、重合、エキソヌクレアーゼ消化、エンドヌクレアーゼ消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えば、メチル化を含めて）、または組換え（相同および部位特異的組換えを含めて）に酵素を使用することによって）、ｉｎ ｖｉｔｒｏで合成または改変されたもの、２）本質的に結合されていない結合ヌクレオチド配列を含むもの、３）天然の核酸分子配列に対して１つまたは複数のヌクレオチドを欠失しているように、分子クローニング技法を使用して操作されたもの、および／または４）天然の核酸配列に対して１つまたは複数の配列変化または再配列を有するように、分子クローニング技法を使用して処置されているものである。非限定的な例として、ｃＤＮＡとは、組換えＤＮＡ分子であり、同様に、ｉｎ ｖｉｔｒｏポリメラーゼ反応によって生成された、またはリンカーが付着された、またはクローニングベクターや発現ベクターなどのベクターに組み込まれた、またはＲＮＡレプリコンに組み込まれた、任意の核酸分子である。

方法
本発明はまた、核酸をヒト、哺乳動物、または動物の患者に投与する、方法を提供する。核酸は、タンパク質またはペプチド（異種タンパク質またはペプチドとすることができる）をコードするＲＮＡ配列とすることができる。方法は、本明細書に記載のＲＮＡレプリコンを患者に投与するステップを含み、ここでレプリコンによってコードされているタンパク質またはペプチドが患者において発現（または転写）され、これは、患者の身体の細胞成分を利用して行うことができる。本明細書の（非限定的な）実施形態のいずれかでは、哺乳動物は、ヒト、家畜、食用動物、または伴侶動物とすることができる。動物はまた、任意の鳥、魚（例えば、サケ科（Salmonidae）のもの）、家禽、または大型の家禽、例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ダチョウ、エミュー、ハクチョウ、クジャク、キジ、ヤマウズラ、またはホロホロチョウとすることができる。レプリコンは、薬学的に許容される担体、例えば、生理食塩水、水、または別の許容される担体で投与してもよい。

本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」とは、個体への投与における使用に適した任意の物質を意味する。例えば、薬学的に許容される担体は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）や注射用水などの滅菌水溶液であってもよい。一部の実施形態では、薬学的に許容される担体は、緩衝剤、防腐剤、等張剤、安定剤、界面活性剤、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、またはキレート剤とすることができる。当然ながら、かかるさらなる成分は、本発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を及ぼさないことが求められる。

レプリコンはまた、薬学的に許容される塩として投与することができる。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される塩」とは、核酸化合物やポリヌクレオチドなどの化合物の生理学的および薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、それに望ましくない毒物学的効果を付与しない、塩を意味する。本発明で使用するための薬学的に許容される酸性／アニオン性塩としては、それらに限定されないが、酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、重炭酸塩、酒石酸水素塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、二塩酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストル酸塩、エシル酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩（glyceptate）、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリルアルサニル酸塩、ヘキシルレソルシン酸塩、ヒドラバミン、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヒドロキシナフトエ酸塩、ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル臭化物、メチル硝酸塩、メチル硫酸塩、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、サリチル酸塩、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、タンニン酸塩、酒石酸塩、テオクル酸塩、トシル酸塩、およびトリエチオダイドが挙げられる。有機または無機の酸としてはまた、それらに限定されないが、ヨウ化水素酸、過塩素酸、硫酸、リン酸、プロピオン酸、グリコール酸、メタンスルホン酸、ヒドロキシエタンスルホン酸、シュウ酸、２－ナフタレンスルホン酸、ｐ－トルエンスルホン酸、シクロヘキサンスルファミン酸、サッカリン酸、またはトリフルオロ酢酸が挙げられる。薬学的に許容される塩基性／カチオン性塩としては、それらに限定されないが、アルミニウム、２－アミノ－２－ヒドロキシメチル－プロパン－１，３－ジオール（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、トロメタン、または「ＴＲＩＳ」としても知られる）、アンモニア、ベンザチン、ｔ－ブチルアミン、カルシウム、クロロプロカイン、コリン、シクロへキシルアミン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、リチウム、Ｌ－リジン、マグネシウム、メグルミン、Ｎ－メチル－Ｄ－グルカミン、ピペリジン、カリウム、プロカイン、キニーネ、ナトリウム、トリエタノールアミン、または亜鉛が挙げられる。

本発明はまた、異種タンパク質またはペプチドを哺乳動物に投与する方法であって、上記異種タンパク質またはペプチドをコードする本明細書に記載のＲＮＡレプリコンを哺乳動物に投与するステップを含み、上記異種タンパク質またはペプチドは哺乳動物内で発現される、方法を提供する。本発明の方法によれば、ネイキッドである異種タンパク質およびペプチドの投与と対比して、哺乳動物からの免疫応答がより低いかまたは排除された、異種タンパク質またはペプチドの哺乳動物への投与が可能となる。

実施形態
実施形態１は、
異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
５’および３’のアルファウイルス非翻訳領域と；
新世界アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
ａ．旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列；または
ｂ．新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分および旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分を含むアミノ酸配列
を含むアルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と
を含むＲＮＡレプリコンである。

実施形態２は、アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよびアルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインが、新世界アルファウイルスからのものである、実施形態１に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態３は、アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよびアルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインが、旧世界アルファウイルスからのものである、実施形態１に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態４は、アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインが、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列を含む、実施形態１～３のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態５は、旧世界アルファウイルスが、ＣＨＩＫＶ、ＳＩＮＶ、およびＳＦＶからなる群から選択される、実施形態１～４のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態６は、新世界アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である、実施形態１～５のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態７は、新世界アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）である、実施形態１～５のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態８は、新世界アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、および東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、からなる群から選択される、実施形態１～５のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態９は、旧世界アルファウイルスが、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ゲタウイルス（ＧＥＴＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバーマ森林ウイルス（ＢＦＶ）、からなる群から選択される、実施形態１～８のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１０は、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、ＦＧＤＦ（配列番号１８）およびＦＧＳＦ（配列番号１９）からなる群から選択されるモチーフを含む、実施形態１～９のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１１は、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、ＦＧＤＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２０）反復、ＦＧＳＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２１）反復、ＦＧＤＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２２）反復、およびＦＧＳＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２３）反復、からなる群から選択される反復を含み、さらに、反復配列は、少なくとも１０個および２５個以下のアミノ酸によって隔てられている、
実施形態１～１０のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１２は、反復配列が、ＮＥＧＥＩＥＳＬＳＳＥＬＬＴ（配列番号６）、ＳＤＧＥＩＤＥＬＳＲＲＶＴＴＥＳＥＰＶＬ（配列番号７）、およびＤＥＨＥＶＤＡＬＡＳＧＩＴ（配列番号８）からなる群に由来するアミノ酸配列によって隔てられている、実施形態１１に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１３は、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、
ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～４８２もしくは４９７～５００もしくは４７９～５００もしくは３３５～５１７；または
ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４５４もしくは４６８～４７１もしくは４５１～４７１；または
ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～４９３もしくは５１３～５１６もしくは４９０～５１６もしくは３３５～５３８
を含む、実施形態１～１２のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１４は、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、
ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～５００もしくは３３５～５１７；または
ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４７１；または
ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６
を含む、実施形態１～１２のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１５は、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５１８を含まない、実施形態１３に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１６は、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５４５を含まない、実施形態１３に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１７は、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１８を含まない、実施形態１３に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１８は、旧世界アルファウイルスがＣＨＩＫＶであり、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３のアミノ酸３３５～５１７を含む、実施形態１４に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態１９は、旧世界アルファウイルスがＳＩＮＶであり、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３のアミノ酸３３５～５３８を含む、実施形態１４に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２０は、新世界アルファウイルスがＥＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＥＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５３１～５４７を含まない、実施形態１３に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２１は、新世界アルファウイルスがＥＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＥＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５３１～５４７を含まず、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、
ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～５００；
ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４７１；または
ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６
を含む、実施形態２０に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２２は、新世界アルファウイルスがＷＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＷＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５０４～５２０を含まない、実施形態１３に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２３は、新世界アルファウイルスがＷＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＷＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５０４～５２０を含まず、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、
ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～５００；または
ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４７１；または
ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６
を含む、実施形態２２に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２４は、異種タンパク質をコードするＲＮＡ配列に作動可能に連結され、ＲＮＡ配列の翻訳を調節するサブゲノムプロモーターをさらに含む、実施形態１～２３のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２５は、５’キャップおよび３’ポリＡテールをさらに含む、実施形態１～２４のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２６は、ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡを含む、実施形態１～２５のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２７は、１０～１２ｋｂのＲＮＡを含み、３０～５０ｎｍの直径を有する、実施形態１～２６のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２８は、異種タンパク質が生物学的製剤のタンパク質またはペプチドである、実施形態１～２７のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態２９は、異種タンパク質が抗体である、実施形態１～２８のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態３０は、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインが、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１８を含まない新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分と、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～４９３または５１３～５１６または４９０～５１６または３３５～５３８を含む旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分と、を含む、実施形態１に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態３１は、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６を含む、実施形態３０に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態３２は、旧世界アルファウイルスがＳＩＮＶであり、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５３８を含む、実施形態３０に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態３３は、異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列が、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４をコードするＲＮＡ配列に作動可能に連結されている、実施形態１～３２のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンである。

実施形態３４は、異種タンパク質またはペプチドを哺乳動物に投与する方法であって、異種タンパク質またはペプチドをコードする実施形態１～３３のいずれか一実施形態に記載のＲＮＡレプリコンを哺乳動物に投与するステップを含み、異種タンパク質またはペプチドが哺乳動物内で発現される、方法である。

実施形態３５は、新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、ＲＮＡレプリコンは実施形態１４に記載のレプリコンである、実施形態３４に記載の方法である。

実施形態３６は、ＲＮＡレプリコンが実施形態１９に記載のレプリコンである、実施形態３４に記載の方法である。

実施形態３７は、ＲＮＡレプリコンが実施形態２２に記載のレプリコンである、実施形態３４に記載の方法である。

実施形態３８は、ＲＮＡレプリコンが実施形態２５に記載のレプリコンである、実施形態３４に記載の方法である。

実施形態３９は、
異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
新世界アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
旧世界アルファウイルスのｎｓＰ３タンパク質に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列とを含むＲＮＡレプリコンであって、ｎｓＰ３タンパク質のＮ末端側および／またはＣ末端側の最初の１～６個のアミノ酸は新世界アルファウイルス配列に由来する、ＲＮＡレプリコンである。

実施形態４０は、５’末端から３’末端に以下の順序で、
（１）アルファウイルスレプリコンの複製を誘導するためのアルファウイルス５’非翻訳配列と；
（２）アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードするＲＮＡ配列と；
（３）アルファウイルスサブゲノムプロモーター配列と；
（４）１つもしくは複数の異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
（５）アルファウイルス３’非翻訳配列と
を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡであって、
ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４は、１つまたは複数の新世界アルファウイルスからのものであり、
ｎｓＰ３は、アミノ末端からカルボキシル末端への順序で、マクロドメイン、中央ドメイン、および超可変ドメイン（ＨＶＤ）を含み、
マクロドメインおよび中央ドメインは、１つもしくは複数の新世界アルファウイルスおよび／または旧世界アルファウイルスからのものであり；
ＨＶＤは旧世界アルファウイルスからのものであるか、またはＨＶＤは新世界アルファウイルスからのＨＶＤの一部と旧世界アルファウイルスからのＨＶＤの一部とを含む、
アルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４１は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ４が、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、および東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）からなる群から選択される、１つまたは複数の新世界アルファウイルスからのものである、実施形態４０に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４２は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ４が、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）からのものである、実施形態４０に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４３は、旧世界アルファウイルスが、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ゲタウイルス（ＧＥＴＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバーマ森林ウイルス（ＢＦＶ）、からなる群から選択される、実施形態４０～４２のいずれか一実施形態に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４４は、旧世界アルファウイルスが、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、またはセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）である、実施形態４３に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４５は、マクロドメインおよび中央ドメインが、１つまたは複数の旧世界アルファウイルスからのものである、実施形態４０～４４のいずれか一実施形態に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４６は、マクロドメインおよび中央ドメインが、１つまたは複数の新世界アルファウイルスからのものである、実施形態４０～４４のいずれか一実施形態に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４７は、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ４、マクロドメインおよび中央ドメインが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）からのものであり、ＨＶＤは、ＶＥＥＶからのＨＶＤの一部と、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）からなる群から選択される旧世界アルファウイルスからのＨＶＤの一部と、を含む、実施形態４０に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４８は、ＶＥＥＶのｎｓＰ３のアミノ酸残基３３５～５３８が、ＳＩＮＶのｎｓＰ３のアミノ酸残基３３５～５３８に置換されていることを除いて、ＨＶＤは、ＶＥＥＶからのＨＶＤを含む、実施形態４７に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

実施形態４９は、ＶＥＥＶのｎｓＰ３のアミノ酸残基３３５～５１８が、ＣＨＩＫＶのｎｓＰ３のアミノ酸残基３３５～５１７に置換されていることを除いて、ＨＶＤは、ＶＥＥＶからのＨＶＤを含む、実施形態４７に記載のアルファウイルスレプリコンＲＮＡである。

[実施例１]
ＶＥＥＶベースのレプリコンの免疫原性
突然変異体ｎｓＰ３をコードするＶＥＥＶベースのアルファウイルスレプリコンを、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３のアミノ酸３３５～５１８をコードするヌクレオチド配列を、チクングニア（ＣＨＩＫＶ）ｎｓＰ３のアミノ酸３３５～５１７をコードするヌクレオチド配列に置き換えて、ＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３キメラ（配列番号３０）を発現するＶＥＥＶベースのレプリコンを創製することによって構築した。この置換えにより、ＶＥＥＶから反復配列の最初のモチーフを削除し、（アミノ酸４７９～４８２および４９７～５００にて）そのモチーフをＣＨＩＫＶゲノムからのＦＧＤＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２０）反復配列に置き換えた。並列実験では、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３（ＨＶＤ領域）のアミノ酸３３５～５３８を、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）ｎｓＰ３のアミノ酸（ＨＶＤ領域）のうちのアミノ酸３３５～５３８に置き換えて、ＶＥＥＶ／ＳＩＮＶ ｎｓＰ３キメラ（配列番号３１）をコードするレプリコンを生み出した（図２および図７を参照されたい）。この置換えにより、ＶＥＥＶから反復配列を削除し、その反復配列をＳＩＮＶからのＦＧＳＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２１）反復配列に置き換えた。ＷＴ、ＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶまたはＶＥＥＶ／ＳＩＮＶキメラｎｓＰ３を含有し、サブゲノムＲＮＡ（ＳＧＩα－ｒＦＦ）からの赤色発光ホタルルシフェラーゼ（ｒＦＦ）レポーターを発現するレプリコンを、電気穿孔によって３回ＢＨＫ－２１細胞中に送達した。電気穿孔の後に、細胞の一部を６ウェルプレートの１ウェルと９６ウェルプレートの１ウェルにプレーティングし、２０時間回復させた。電気穿孔した細胞をｄｓＲＮＡの存在について染色し、フローサイトメトリーで解析して、レプリコン増幅の物差しとしてｄｓＲＮＡ陽性細胞の頻度を決定した。突然変異体ｎｓＰ３を含有するレプリコンは、ＷＴ ｎｓＰ３を含有するレプリコンと同レベルまで複製することが見いだされた（図２Ｂ）。ルシフェラーゼ活性について分析したところ、ＷＴ含有レプリコンとｎｓＰ３の示された突然変異体型との間に差は全く見られなかった（図２Ｃ）。

[実施例２]
レプリコンからの異種タンパク質の発現
この実施例では、図２Ａに記載の突然変異体ｎｓＰ３をコードするレプリコン（実施例１）からの組換えホタルルシフェラーゼ（ｒＦＦ）のｉｎ ｖｉｖｏ発現について調べた。生理食塩水中のレプリコンＲＮＡ １または１０マイクログラムを、ＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿四頭筋に筋肉内（ＩＭ）送達した。示された時点で、ルシフェラーゼ活性を、市販のｉｎ ｖｉｖｏイメージングシステムを使用してｉｎ ｖｉｖｏでモニタリングし、総フラックスとして報告した（図３Ａおよび３Ｂ）。データが示すところは、ｎｓＰ３の突然変異体型を発現するレプリコンが、ＶＥＥＶからの野生型ｎｓＰ３を含有するレプリコンと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで同様のレベルのルシフェラーゼ活性を呈したこと、である。

[実施例３]
免疫原性
この実施例では、野生型（ＷＴ）ＶＥＥＶ ｎｓＰ３を有するレプリコンの免疫原性と比較して、ｎｓＰ３のＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶキメラ形態をコードするＶＥＥＶベースのレプリコン（実施例１から）の免疫原性について調べた。各レプリコンは、異種タンパク質としてインフルエンザのＨ５Ｎ１株からの血球凝集素（ＨＡ）をコードし、発現した。生理食塩水中のＲＮＡ ２．０μｇまたは０．２μｇを０日目にＢＡＬＢ／ｃマウスの大腿四頭筋に筋肉内送達し、２８日目に同じレプリコンＲＮＡと用量でブーストした。ブーストの２週間後（プライム後４２日目）、脾臓と血清を収集した。ＥＬＩＳＡによって血清をＨＡ特異的抗体について解析した（図４）。データが示すところは、ＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３キメラをコードするレプリコンでは、野生型ｎｓＰ３を有するレプリコンと比較して、ＨＡ特異的ＩｇＧ力価が有意に低下していたことである。

対照的に、短命エフェクターおよびメモリー前駆エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞の解析によって、試験した異なるレプリコン間でＨＡ特異的細胞の頻度に差はないことが示された（図５Ａおよび５Ｂ）。図５Ａから、野生型、ＶＥＥＶ／ＳＩＮＶ ｎｓＰ３、およびＶＥＥＶ／ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３の各ＲＮＡレプリコン間でのＨＡ特異的短命エフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞の頻度は同様であることがわかる。図５Ｂに、メモリーエフェクターＣＤ８＋ Ｔ細胞に関する同様の結果を示す。

当業者であれば、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく、本明細書に開示の本発明に対して様々な代替および改変をなし得ることを、容易に理解するであろう。

本明細書において言及されるすべての特許および刊行物は、本発明の属する分野の当業者の水準を示すものである。

本明細書に例示的に記載されている発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数／複数）、限定（単数／複数）がなくても適切に実施することができる。したがって、例えば、本明細書における各例において、「含む」、「から本質的になる」および「からなる」という用語のいずれも、他の２つの用語のいずれかに置き換えることができる。用いられた用語および表現は、説明の用語として使用するものであり、限定ではない。かかる用語および表現の使用において、例示および記載した特徴、またはその部分の任意の均等物を除外することは意図されておらず、様々な修正形態が、特許請求された本発明の範囲内で可能であることが理解される。加えて、発明の特徴または態様がマーカッシュグループの用語で記載されている場合、当業者であれば、本発明がまた、これによりマーカッシュグループのメンバーの任意の個々のメンバーまたはサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。例えば、Ｘが、臭素、塩素およびヨウ素からなる群より選択されると記載されている場合、Ｘが臭素であるという特許請求ならびにＸが臭素および塩素であるという特許請求も完全に記載されている。他の実施形態については、以下の特許請求の範囲内にある。

本発明の様々な実施形態を以下に示す。
１．異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
５’および３’のアルファウイルス非翻訳領域と；
新世界アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインに由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
ａ．旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列；または
ｂ．新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分および旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分を含むアミノ酸配列
を含むアルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメイン（ＨＶＤ）に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と
を含むＲＮＡレプリコン。
２．５’末端から３’末端に以下の順序で、
（１）前記アルファウイルスレプリコンの複製を誘導するためのアルファウイルス５’非翻訳配列と；
（２）アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードするＲＮＡ配列と；
（３）アルファウイルスサブゲノムプロモーター配列と；
（４）１つもしくは複数の異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
（５）アルファウイルス３’非翻訳配列と
を含むアルファウイルスレプリコンＲＮＡであって、
前記ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４は、１つまたは複数の新世界アルファウイルスからのものであり、
前記ｎｓＰ３は、アミノ末端からカルボキシル末端に以下の順序で、アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメイン、アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメイン、およびアルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメイン（ＨＶＤ）を含み、
前記マクロドメインおよび前記中央ドメインは、１つもしくは複数の新世界アルファウイルスおよび／または旧世界アルファウイルスからのものであり；
前記ＨＶＤは旧世界アルファウイルスのＨＶＤを含むか、または前記ＨＶＤは新世界アルファウイルスからのＨＶＤの一部と旧世界アルファウイルスからのＨＶＤの一部とを含む、
アルファウイルスレプリコンＲＮＡ。
３．前記アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよび前記アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインが、新世界アルファウイルスからのものである、上記１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
４．前記アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよび前記アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインが、旧世界アルファウイルスからのものである、上記１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
５．前記アルファウイルスｎｓＰ３が、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列またはそれのアミノ酸配列を含む、上記１～４のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
６．前記旧世界アルファウイルスが、ＣＨＩＫＶ、ＳＩＮＶ、およびＳＦＶからなる群から選択される、上記１～５のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
７．前記新世界アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である、上記１～６のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
８．前記新世界アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、および東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）からなる群から選択される、上記１～６のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
９．前記旧世界アルファウイルスが、シンドビスウイルス（ＳＩＮＶ）、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）、サギヤマウイルス（ＳＡＧＶ）、ゲタウイルス（ＧＥＴＶ）、ミドルバーグウイルス（ＭＩＤＶ）、ベバルウイルス（ＢＥＢＶ）、オニョンニョンウイルス（ＯＮＮＶ）、ヌドゥム（ＮＤＵＶ）、およびバーマ森林ウイルス（ＢＦＶ）、からなる群から選択される、上記８に記載のＲＮＡレプリコン。
１０．前記超可変ドメインが、ＦＧＤＦ（配列番号１８）およびＦＧＳＦ（配列番号１９）からなる群から選択されるモチーフを有する前記旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分を含む、上記１～９のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
１１．前記旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する前記部分が、ＦＧＤＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２０）反復、ＦＧＳＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２１）反復、ＦＧＤＦ／ＦＧＳＦ（配列番号２２）反復、およびＦＧＳＦ／ＦＧＤＦ（配列番号２３）反復、からなる群から選択される反復を含み、さらに、前記反復配列は、少なくとも１０個および２５個以下のアミノ酸によって隔てられている、上記１０に記載のＲＮＡレプリコン。
１２．前記反復配列が、ＮＥＧＥＩＥＳＬＳＳＥＬＬＴ（配列番号６）、ＳＤＧＥＩＤＥＬＳＲＲＶＴＴＥＳＥＰＶＬ（配列番号７）、およびＤＥＨＥＶＤＡＬＡＳＧＩＴ（配列番号８）からなる群に由来するアミノ酸配列によって隔てられている、上記１１に記載のＲＮＡレプリコン。
１３．旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、
ａ．ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～４８２もしくは４９７～５００もしくは４７９～５００もしくは３３５～５１７；または
ｂ．ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４５４もしくは４６８～４７１もしくは４５１～４７１；または
ｃ．ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～４９３もしくは５１３～５１６もしくは４９０～５１６もしくは３３５～５３８
を含む、上記１０に記載のＲＮＡレプリコン。
１４．旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、
ａ．ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～５００もしくは３３５～５１７；または
ｂ．ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４７１；または
ｃ．ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６
を含む、上記１１に記載のＲＮＡレプリコン。
１５．前記新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５１８を含まない、上記１０～１４のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
１６．前記新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５４５を含まない、上記１０～１４のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
１７．前記新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１８を含まない、上記１～１４のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
１８．旧世界アルファウイルスがＣＨＩＫＶであり、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＣＨＩＫＶのアミノ酸３３５～５１７を含む、上記１７に記載のＲＮＡレプリコン。
１９．旧世界アルファウイルスがＳＩＮＶであり、旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＳＩＮＶのアミノ酸３３５～５３８を含む、上記１７に記載のＲＮＡレプリコン。
２０．新世界アルファウイルスがＥＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＥＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５３１～５４７を含まない、上記１０～１４のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
２１．前記新世界アルファウイルスがＥＥＥＶであり、前記新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する前記部分が、前記ＥＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５３１～５４７を含まず、前記旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する前記部分が、
ａ．ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～５００；
ｂ．ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４７１；または
ｃ．ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６
を含む、上記２０に記載のＲＮＡレプリコン。
２２．新世界アルファウイルスがＷＥＥＶであり、新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する部分が、ＷＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５０４～５２０を含まない、上記１０～１４のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
２３．前記新世界アルファウイルスがＷＥＥＶであり、前記新世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する前記部分が、前記ＷＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸５０４～５２０を含まず、前記旧世界アルファウイルス超可変ドメインに由来する前記部分が、
ａ．ＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４７９～５００；
ｂ．ＳＦＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４５１～４７１；または
ｃ．ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６
を含む、上記２２に記載のＲＮＡレプリコン。
２４．前記異種タンパク質をコードする前記ＲＮＡ配列に作動可能に連結され、前記ＲＮＡ配列の翻訳を調節するサブゲノムプロモーターをさらに含む、上記１～２３のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
２５．５’キャップおよび３’ポリＡテールをさらに含む、上記１～２４のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
２６．ポジティブセンス一本鎖ＲＮＡを含む、上記１～２５のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
２７．１０～１２ｋｂのＲＮＡを含み、３０～５０ｎｍの直径を有する、上記１～２６のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
２８．前記異種タンパク質が生物学的製剤のタンパク質またはペプチドである、上記１～２７のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
２９．前記異種タンパク質が抗体である、上記１～２８のいずれかに記載のＲＮＡレプリコン。
３０．前記新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、前記ＨＶＤが、ＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１８を含まない新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分と、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～４９３または５１３～５１６または４９０～５１６または３３５～５３８を有する旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分とを含む、上記１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
３１．旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する前記部分が、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸４９０～５１６を含む、上記３０に記載のＲＮＡレプリコン。
３２．前記旧世界アルファウイルスがＳＩＮＶであり、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する前記部分が、ＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５３８を含む、上記３０記載のＲＮＡレプリコン。
３３．前記異種タンパク質またはペプチドをコードする前記ＲＮＡ配列が、前記ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４をコードする前記ＲＮＡ配列に作動可能に連結されている、上記１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
３４．異種タンパク質またはペプチドを哺乳動物に投与する方法であって、前記異種タンパク質またはペプチドをコードする上記１～３３のいずれかに記載のＲＮＡレプリコンを前記哺乳動物に投与するステップを含み、前記異種タンパク質またはペプチドが前記哺乳動物内で発現される、方法。
３５．新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、前記ＲＮＡレプリコンが上記１４に記載のレプリコンである、上記３４に記載の方法。
３６．前記ＲＮＡレプリコンが上記１９に記載のレプリコンである、上記３４に記載の方法。
３７．前記ＲＮＡレプリコンが上記２２に記載のレプリコンである、上記３４に記載の方法。
３８．前記ＲＮＡレプリコンが上記２５に記載のレプリコンである、上記３４に記載の方法。
３９．異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
新世界アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列と；
旧世界アルファウイルスのｎｓＰ３タンパク質に由来するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列とを含むＲＮＡレプリコンであって、ｎｓＰ３タンパク質のＮ末端側および／またはＣ末端側の最初の１～６個のアミノ酸は新世界アルファウイルス配列に由来する、ＲＮＡレプリコン。

Claims (18)

1. ＲＮＡレプリコンであって、
   （ｉ）異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
   （ｉｉ）５’および３’のアルファウイルス非翻訳領域と；
   （ｉｉｉ）ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードするＲＮＡ配列とを含み、ｎｓＰ１、ｎｓＰ２およびｎｓＰ４のアミノ酸配列は、新世界アルファウイルスの非構造タンパク質に由来し、ｎｓＰ３は、非構造タンパク質であり、アミノ末端からカルボキシル末端に以下の順序で：
   （ａ）アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインに由来するアミノ酸配列；
   （ｂ）アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインに由来するアミノ酸配列；および
   （ｃ）ＦＧＤＦ（配列番号１８）またはＦＧＳＦ（配列番号１９）モチーフを含む旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメイン（ＨＶＤ）の少なくとも部分を含むアルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメイン（ＨＶＤ）に由来するアミノ酸配列
   を含み、前記旧世界アルファウイルスｎｓＰ３ＨＶＤが、
   ａ．前記旧世界アルファウイルスｎｓＰ３ＨＶＤの前記部分を含む旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来するアミノ酸配列；または
   ｂ．新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分および前記旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインの前記部分を含むアミノ酸配列
   を含み、
   旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５１７または配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５３８を含み、ＦＸＲ結合部位を含む新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する領域が、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する前記部分に置換されており、
   前記レプリコンが、プロテインＣおよびＥ１の少なくとも１つをコードしない、
   ＲＮＡレプリコン。
2. ＲＮＡレプリコンであって、
   ５’末端から３’末端に以下の順序で、
   （１）前記ＲＮＡレプリコンの複製を誘導するためのアルファウイルス５’非翻訳配列と；
   （２）アルファウイルスの非構造タンパク質ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３、およびｎｓＰ４をコードするＲＮＡ配列と；
   （３）アルファウイルスサブゲノムプロモーター配列と；
   （４）１つもしくは複数の異種タンパク質またはペプチドをコードするＲＮＡ配列と；
   （５）アルファウイルス３’非翻訳配列と
   を含み、
   前記ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４は、１つまたは複数の新世界アルファウイルスからのものであり、
   前記ｎｓＰ３は、アミノ末端からカルボキシル末端に以下の順序で、アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメイン、アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメイン、およびアルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメイン（ＨＶＤ）を含み、
   前記マクロドメインおよび前記中央ドメインは、１つもしくは複数の新世界アルファウイルスおよび／または旧世界アルファウイルスからのものであり；
   前記ＨＶＤは旧世界アルファウイルスのＨＶＤを含むか、または前記ＨＶＤは新世界アルファウイルスからのＨＶＤの部分と旧世界アルファウイルスからのＨＶＤの部分とを含み、前記レプリコンは、プロテインＣおよびＥ１の少なくとも１つをコードせず、
   旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５１７または配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＳＩＮＶ ｎｓＰ３ ＨＶＤのアミノ酸３３５～５３８を含み、ＦＸＲ結合部位を含む新世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する領域が、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する前記部分に置換されており、
   前記旧世界アルファウイルスからのＨＶＤの前記部分が、ＦＧＤＦ（配列番号１８）またはＦＧＳＦ（配列番号１９）モチーフを含む、ＲＮＡレプリコン。
3. 前記アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよび前記アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインが、新世界アルファウイルスからのものである、請求項１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
4. 前記アルファウイルスｎｓＰ３マクロドメインおよび前記アルファウイルスｎｓＰ３中央ドメインが、旧世界アルファウイルスからのものである、請求項１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
5. 前記新世界アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）である、請求項１～４のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
6. 前記新世界アルファウイルスが、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、および東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）からなる群から選択される、請求項１～４のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
7. 前記新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、旧世界アルファウイルスに由来する部分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５１８を置換している、請求項１～５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
8. 前記新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、旧世界アルファウイルスに由来する部分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸４７８～５４５を置換している、請求項１～５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
9. 前記新世界アルファウイルスがＶＥＥＶであり、旧世界アルファウイルスに由来する部分が、配列番号２７に記載のアミノ酸配列からなるＶＥＥＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１８を置換している、請求項１～５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
10. 旧世界アルファウイルスがＣＨＩＫＶであり、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列からなるＣＨＩＫＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５１７を含む、請求項９に記載のＲＮＡレプリコン。
11. 旧世界アルファウイルスがＳＩＮＶであり、旧世界アルファウイルスｎｓＰ３超可変ドメインに由来する部分が、配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるＳＩＮＶ ｎｓＰ３超可変ドメインのアミノ酸３３５～５３８を含む、請求項９に記載のＲＮＡレプリコン。
12. 前記異種タンパク質をコードする前記ＲＮＡ配列に作動可能に連結され、前記ＲＮＡ配列の翻訳を調節するサブゲノムプロモーターをさらに含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
13. ５’キャップおよび３’ポリＡテールをさらに含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
14. １０～１２ｋｂのＲＮＡを含み、３０～５０ｎｍの直径を有する、請求項１～１３のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
15. 前記異種タンパク質が生物学的製剤のタンパク質またはペプチドである、請求項１～１４のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
16. 前記異種タンパク質が抗体である、請求項１～１５のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコン。
17. 前記異種タンパク質またはペプチドをコードする前記ＲＮＡ配列が、前記ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、およびｎｓＰ４をコードする前記ＲＮＡ配列に作動可能に連結されている、請求項１または２に記載のＲＮＡレプリコン。
18. 前記異種タンパク質またはペプチドをコードする請求項１～１７のいずれか一項に記載のＲＮＡレプリコンを含む、異種タンパク質またはペプチドを哺乳動物に投与する方法において使用するための組成物であって、前記異種タンパク質またはペプチドが前記哺乳動物内で発現される、組成物。