JP2023524055A - サイトカイン免疫療法 - Google Patents

Abstract

本明細書では、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１～４とサイトカインタンパク質／ポリペプチドとをコードする核酸を含む、新規の免疫学的に活性のあるアルファウイルスレプリコンベクターを提供し、それは、がんおよび／または炎症性疾患の治療に有用なものである。

Description

本開示は、概して、がんおよび／または炎症性疾患に対するサイトカイン免疫療法分野に関し、詳細には、がんおよび／または炎症性疾患の治療に有用であるサイトカインを含むアルファウイルスレプリコンベクターに関する。

サイトカインは、自然および適応免疫の分子メッセンジャーであり、免疫系の細胞が近距離間で情報交換することを可能にし、リンパ系の発達、恒常性、分化、寛容、および記憶を含む、免疫応答のすべての態様の調節において欠くことのできない役割を果たしている。免疫系ががん細胞を認識し、破壊できることを考慮して、がんの治療のためにサイトカインを利用することには、数十年以上前から高い関心が持たれてきた。

インターフェロンアルファ（ＩＦＮａ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン（ＩＬ）－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１を用いた前臨床実験は、複数のマウスがんモデルにおける有効性を示している。

ＩＦＮａは、１９８６年に、ヒトがん、毛様細胞白血病（ＨＣＬ）の治療のために承認された最初のサイトカインであり、多数の治療レジメンが評価された後、高用量ＩＬ－２（ＨＤＩＬ－２）が、１９９２年に転移性腎細胞癌（ｍＲＣＣ）の治療のために、また１９９８年には転移性黒色腫（ＭＭ）の治療のために承認された。最初の承認以降、ＩＦＮａは、濾胞性リンパ腫、アジュバントとして黒色腫（ａｄｊｕｖａｎｔ ｍｅｌａｎｏｍａ）、ベバシズマブとの併用としてｍＲＣＣ、およびＡＩＤＳ関連カポジ肉腫に対する効能が追加されている。それにもかかわらず、単独療法としてのサイトカインは、当初期待されたほどのものではなかった。

全身的効果に対し、局所的効果の問題に対処する戦略としては、サイトカイン単独療法による穏やかな成果を増強させるための、局所または腔へのサイトカイン投与、およびプラスミドまたはウイルス送達による刺激細胞もしくはエフェクター細胞へのサイトカインをコードする遺伝子の形質導入などがあった。その他の新しいアプローチには、抗腫瘍応答を高め、比例的にＴｒｅｇの刺激を低下させるように、選択受容体に対する結合親和性を高めた「スーパーカイン（ｓｕｐｅｒｋｉｎｅ）」を生成させる、構造ベースのサイトカイン操作が含まれている。キメラ抗体－サイトカイン融合タンパク質の開発、およびサイトカインと関連する抗サイトカインの注入によって、天然のままの分子と比較して、それらの腫瘍局在化および薬物動態が改善されている。さらなる臨床的検討において、サイトカインを抗がんワクチン、チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）抗体（抗ＣＴＬＡ－４または抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１）と組み合わせて、またサイトカインの注入をがん指向性モノクローナル抗体と組み合わせて、これらの抗体の抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）を高め、これによって、それらの抗腫瘍有効性を増大させている（非特許文献１：Kevin C. Conlon et. al, JOURNAL OF INTERFERON & CYTOKINE RESEARCH Volume 39, Number 1, 2019、本文書の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）。

ＩＬ－１２は、ジスルフィドで連結された２つのタンパク質、ＩＬ－１２Ａ ｐ３５（３５ｋＤａ）およびＩＬ－１２Ｂ ｐ４０（４０ｋＤａ）から構成された７０ｋＤａのヘテロ二量体サイトカインであり、樹状細胞、マクロファージ、好中球、およびヒトＢ－リンパ芽球様細胞（ＮＣ－３７）によって天然に産生され、有効な免疫応答の開始に不可欠なものである。

ＩＬ－１２は、抗がん免疫療法のための最も強力な薬剤の１つとして登場した。Ｔ細胞およびＮＫ細胞が媒介する炎症反応におけるその中心的な役割から、局所的なＩＬ－１２発現は、免疫抑制を克服する最も有効な方法の１つであろうことに変わりはない。しかしながら、ＩＬ－１２に基づく治療法の臨床的適用には、全身的投与に伴う致死的毒性が潜在するため、依然として問題が多い。

ＩＬ－１２をコードする腫瘍溶解性ウイルスは、がんの前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍効果を示しているが（非特許文献２：Pan, W. Y. et al., Mol. Ther. 20(5), 927-937 (2012)、本文書の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）、腫瘍溶解性ウイルスによる送達後のＩＬ－１２の全身的蓄積は、患者に対する潜在的な致死性を残している。担体ベクターを用いる腫瘍細胞の効率の悪い形質導入が、目下、このアプローチの全般的な抗腫瘍効果を制限している。

より有望な薬物誘導性ＩＬ－１２システムは、臨床的使用のために、ＩＬ－１２レベルを、低い毒性レベルで長期にわたり管理することが期待されるものである。

Kevin C. Conlon et. al, JOURNAL OF INTERFERON & CYTOKINE RESEARCH Volume 39, Number 1, 2019 Pan, W.Y. et al., Mol. Ther. 20(5), 927-937 (2012)

本開示は、がんおよび／または炎症性疾患に対する改善されたサイトカイン免疫療法に関する。

詳細には、本開示は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４と、サイトカインを含むポリペプチドとをコードするポリヌクレオチドを含む、新規の免疫学的に活性のあるアルファウイルスレプリコンベクターに関する。斯かるベクターは、がんおよび／または炎症性疾患の治療のために有用でありながら、毒性が最少化している。

別の態様では、本開示は、上記で論じたアルファウイルスレプリコンベクターと薬学的に許容される担体とを含む組成物を提供する。薬学的に許容される担体は、ベクターが封入される送達媒体であってもよい。好ましい実施形態では、送達媒体は、カプシドおよび／またはエンベロープタンパク質を含みうるアルファウイルス構造タンパク質からなる、アルファウイルス粒子であってもよい。別の実施形態では、送達媒体は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）であってもよい。

別の態様では、本開示は、がんもしくは炎症性疾患に対する治療または免疫化における使用のための、上記で論じたアルファウイルスレプリコンベクターまたは組成物を提供する。

別の態様では、本開示は、がんもしくは炎症性疾患に対する治療または免疫化のための医薬の製造における、上記で論じたアルファウイルスレプリコンベクターまたは組成物の使用を提供する。

別の態様では、本開示は、対象におけるがんもしくは炎症性疾患に対する治療および／または免役化の方法を提供し、該方法は、それを必要とする対象に、有効量の上記で論じたアルファウイルスレプリコンベクターまたは組成物を投与することを含む。

図１は、アルファウイルスレプリコンベクターの代表的なコンストラクトを示す。 図２は、実施例３において作製したＩＬ－１２－リンカー－ＴＭを含むコンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含むコンストラクトの全長ＶＥＥＶ ＴＣ－８３ベクターを示す。 図３は、実施例３において作製したＩＬ－１２を含むコンストラクトをコードするポリヌクレオチドを含むコンストラクトの全長ＶＥＥＶ ＴＣ－８３ベクターを示す。 図４は、コンストラクト１を発現するように構築されたＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンの、ＭＣ－３８腫瘍モデルマウスに対する効果を示す。 図５は、コンストラクト１を発現するように構築されたＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンの、ＣＴ－２６腫瘍モデルマウスに対する効果を示す。 図６ａは、コンストラクト６を発現するように構築されたＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンの、ＣＴ－２６腫瘍モデルマウスに対する効果を示す。 図６ｂは、コンストラクト６を発現するように構築されたＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンの、ＣＴ－２６腫瘍モデルマウスに対する効果を示す。 図７ａは、コンストラクト１を発現するように構築されたＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンの、ＭＣ－３８腫瘍モデルマウスのＴＩＬにおけるマクロファージＭ１およびＭ２集団に対する効果を示す。 図７ｂは、コンストラクト１を発現するように構築されたＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンの、ＭＣ－３８腫瘍モデルマウスのＴＩＬにおけるＴｒｅｇ集団に対する効果を示す。 図８は、コンストラクト１を発現するように構築されたＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンの、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルマウスに対する効果を示す。

本明細書において使用される「サイトカイン」は、天然リンホカイン（リンパ球によって作られたサイトカイン）、モノカイン（単球によって作られたサイトカイン）、ケモカイン（走化活性を有するサイトカイン）、インターロイキン（ある種類の白血球によって作られ、別の種類の白血球に対して作用するサイトカイン）由来のポリペプチド／糖タンパク質、またはそれらの改変体である。改変されたサイトカインは、天然サイトカインの断片であってもよい。一実施形態では、改変されたサイトカインは、天然サイトカインに対して少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９８％のアミノ酸配列相同性を有する。一実施形態では、改変されたサイトカインは、天然サイトカインに対して最大１０％のアミノ酸が、欠失、置換、かつ／または追加されている変異体である。

サイトカインの例としては、ＩＬ－１α、ＩＬ－１β、ＩＬ－２、－３、－４、－５、－６、－７、－８、－９、－１０、－１１、－１２、－１３から－３７などの３０タイプ以上を含むインターロイキン（ＩＬ）；ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－５β、およびＩＦＮ－γなどのインターフェロン（ＩＦＮ）；ＴＮＦ－αおよびＴＮＦ－βなどの腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）；ＴＧＦ－αおよびＴＧＦ－βなどのトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）；顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー１０刺激因子（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ－ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ－ｃｏｌｏｎｙ １０ ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ）（ＧＭ－ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、および単球化学走化性活性化因子（ＭＣＡＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、インスリン様増殖１５因子（ｉｎｓｕｌｉｎ ｌｉｋｅ ｇｒｏｗｔｈ １５ ｆａｃｔｏｒ）（ＩＧＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、および骨形成タンパク質２０（ｂｏｎｅ ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ２０）（ＢＭＰ）などの増殖因子（ＧＦ）；ならびにＬＩＦ、ＫＩＴリガンド（ＫＬ）、ＭＰＯ（ミエロペルオキシダーゼ）、およびＣＲＰ（Ｃ反応性タンパク質）を含むその他のポリペプチド因子；ＣＯＸ－１、ＣＯＸ－２、およびＣＯＸ－３などのＣＯＸ（シクロオキシゲナーゼ）、ＮＯＳ－１、ＮＯＳ－２、およびＮＯＳ－３などのＮＯＳ（一酸化窒素シンターゼ）；ならびにそれらの改変体が挙げられるが、これらに限定されない。

サイトカインにはまた、走化性を誘導するサイトカインであるケモカインも含まれる。２つの主要なクラスのケモカイン、ＣＸＣおよびＣＣがある。好中球活性化タンパク質－２（ＮＡＰ－２）および悪性黒色腫成長刺激活性５タンパク質（ｍｅｌａｎｏｍａ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ ａｃｔｉｖｉｔｙ ５ ｐｒｏｔｅｉｎ）（ＭＧＳＡ）などのＣＸＣケモカインは、主に好中球およびＴリンパ球に対して走化性であり、一方、ＲＡＮＴＥＳ、ＭＩＰ－ｌαおよびＭＩＰ－ｌβを含むマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ）、ケラチノサイト由来ケモカイン（ＫＣ）、単球１０走化性タンパク質（ｍｏｎｏｃｙｔｅ １０ ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－２、ＭＣＰ－３、ＭＣＰ－４、およびＭＣＰ－５）、ならびにエオタキシン（－１および－２）などのＣＣケモカインは、特にマクロファージ、Ｔリンパ球、好酸球、好中球、樹状細胞、および好塩基球の細胞型に対して走化性である。また、主要なケモカインサブファミリーのどちらにも分類されないケモカイン、リンホタクチン－１、リンホタクチン－２（いずれもＣ１５ケモカイン）、およびフラクタルカイン（ＣＸ３Ｃケモカイン）も存在する。

サイトカインの好ましい例は、ＩＬ－１２であるが、それに限定されない。

本開示のアルファウイルスレプリコンベクターでは、サイトカインをコードする遺伝子は、膜貫通ドメインをコードする遺伝子に融合されていてもよい。本明細書において使用される場合、「膜貫通ドメイン（ＴＭ）」は、天然または合成供給源のいずれか由来のタンパク質である。供給源が天然である場合、一部の態様におけるドメインは、何らかの膜結合型または膜貫通型タンパク質由来である。一態様において、膜結合型または膜貫通型タンパク質は、サイトカインとは異種のタンパク質である。膜結合型または膜貫通型タンパク質の例としては、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤＳ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４；ヒトではＴＬＲ１～ＴＬＲ１０、およびマウスではＴＬＲ１～ＴＬＲ９、ＴＬＲ１１～ＴＬＲ１３などのＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）；ＩＬ－１－２８受容体などのインターロイキン（ＩＬ）受容体、ＲＡＮＴＥＳ受容体（ＣＣＲ１、ＣＣＲ３、ＣＣＲ５）、ＭＩＰ－１受容体、ＰＦ４受容体、Ｍ－ＣＳＦ受容体、およびＧＰＣＲケモカイン受容体に属するＮＡＰ－２受容体；ヘマグルチニン（ＨＡ）が挙げられる。

膜貫通型タンパク質の例としては、以下のものも挙げられる：
５－リポキシゲナーゼ活性化タンパク質、ＡＢＣトランスポーター、ＡＣＢＰ、アミロイドβ（Ａ４）、Ｂｃｌ－２阻害剤、ＢＮＩＰ、ＣＡＡＸプロテアーゼ、チトクロムＰ４５０、Ｅ－ＮＰＰ、ＥＰＨＡ１、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、ＥＰＨＡ４、脂肪酸デサチュラーゼ、ガンマセクレターゼ、グルコーストランスポーター、グリコフォリン、ＧＰＣＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、ＨＥＲ３／ＥｒｂＢ３、ＨＥＲ４／ＥｒｂＢ４、ＨＳＤ－１１β、低酸素誘導タンパク質、免疫グロブリン、インスリン受容体、インテグリン、イオンチャネル、ＭＡＰＥＧ、ＭＦＳ、ＭｉｎＫファミリー、ＭＰＰ、ペプチダーゼＡＤ、ペプチダーゼファミリーＭ４８、ペプチダーゼＭＡジャギドタンパク質、受容体型キナーゼ、ＳＮＡＲＥ複合体、スルファターゼ、ＴＮＦ受容体、膜貫通型タンパク質１４（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ １４）、トランスポーター、ＴＲＯＢＰ、ＶＥＧＦ受容体、アルデヒドデヒドロゲナーゼ、アンモニアおよび尿素トランスポーター、ＦＭＮ結合オキシドレダクターゼ、ロイシンリッチ反復配列（ＬＲＲ）含有膜貫通型タンパク質、ロイコトリエンＣ４シンターゼ、リソソーム膜糖タンパク質、主要内在性膜タンパク質（ＭＩＰ）／ＦＮＴスーパーファミリー、ミクロソームプロスタグランジンＥ合成酵素、Ｎ－（デオキシ）リボシルトランスフェラーゼ様膜タンパク質、中性／アルカリ性セラミダーゼ、オリゴサッカリルトランスフェラーゼ、五量体リガンド依存性イオンチャネル、ロドプシン様受容体およびポンプ、シングルヘリックスＡＴＰアーゼレギュレーター、スクアレン／フィトエン合成酵素、ステアロイル－ＣｏＡデサチュラーゼ１、スタニン（Ｓｔａｎｎｉｎ）（ＳＮＮ）膜タンパク質、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖、テトラトリコペプチド反復配列（ＴＰＲ）アルファヘリックス反復タンパク質、ＮＡＤ（Ｐ）結合ロスマン－フォールドドメインを有する膜貫通型タンパク質。

さらに、脂質二重層に結合した単型／周辺タンパク質またはその他の細胞膜内タンパク質およびペプチドもまた、膜貫通型タンパク質として使用されうる。例としては、アルファ／ベータヒドロラーゼ、アネキシン、Ｂｅｔ Ｖ１様タンパク質、Ｃ１ドメイン含有タンパク質、Ｃ２ドメイン含有タンパク質、ＣｏＡ依存性アシルトランスフェラーゼ、ＣＲＡＬ－ＴＲＩＯドメイン含有タンパク質、ＤＮＡ分解酵素Ｉ様タンパク質、フィブリノーゲン、ＦＹＶＥ／ＰＨＤジンクフィンガータンパク質、ガラクトース結合ドメイン様タンパク質、糖脂質転移タンパク質、免疫グロブリン様スーパーファミリー（Ｅ Ｓｅｔ）タンパク質、リポカイン、リポキシゲナーゼ、ＰＧＢＤスーパーファミリー、ＰＨドメイン－様タンパク質、ホスファチジルイノシトール３－／４－キナーゼ、ＰＬＣ様ホスホジエステラーゼ、ホスホチロシンタンパク質ホスファターゼＩＩ、Ｐループ含有ヌクレオシド三リン酸ヒドロラーゼ、プロテインキナーゼスーパーファミリー、ＰＸドメイン含有タンパク質、サポシン、シヌクレインおよび転写因子タビー（ｔｕｂｂｙ）が挙げられる。

本開示において使用される「膜貫通ドメイン」という表現は、膜結合型または膜貫通型タンパク質の少なくとも膜貫通領域を含む。さらに、膜貫通ドメインには、膜結合型または膜貫通型タンパク質の膜近傍ドメイン（ＪＭＤ）および／または細胞質側末端も含まれうる。

別法として、一部の実施形態では、膜貫通ドメインは合成されたものである。一部の態様では、合成された膜貫通ドメインは、主としてロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含む。また、高度に荷電された残基が、膜貫通ドメインに隣接する（輸送停止シグナル）。また、高度に荷電された残基が、膜貫通ドメインに隣接する（輸送停止シグナル）。一部の態様では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの三つ組が、合成された膜貫通ドメイン各末端においてみられることとなる。

膜貫通ドメインの好ましい例は、ＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ様受容体４）およびインフルエンザウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）由来の膜貫通ドメインであってもよい。具体的な例としては、可動性の膜近傍領域または可動性リンカー、インフルエンザウイルスヘマグルチニンの膜貫通ドメイン、および細胞質側末端からなるタンパク質「ＨＡ（可動性－ＴＭ－Ｃｙｔ）」、ならびにＴＬＲ４（Ｔｏｌｌ様受容体４）からなるタンパク質が挙げられる。

サイトカインをコードする遺伝子を、膜貫通ドメイン、特にインフルエンザウイルスヘマグルチニン膜貫通ドメインをコードする遺伝子と融合させることによって、免疫学的活性を誘発する効果は維持されながら、得られたアルファウイルスレプリコンベクターの安全性が改善されることとなる。

サイトカインポリペプチドと膜貫通ドメインとは、直接または間接的に融合されていてもよい。一実施形態では、１つまたは２つのリンカーがそれらの間に介在していてもよい。

また、サイトカインポリペプチドおよび膜貫通ドメインは、切断され、短いリンカーによって置換されうる。一部の実施形態では、サイトカイン構造タンパク質および異種の膜貫通ドメインは、１つまたは複数のペプチドリンカーを含む。

短いリンカーの一例は、２から２５個のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、または６個のアミノ酸）からなるものである。通常、短いリンカーは、ＳＧ、ＧＳ、ＳＧＧ、ＧＧＳ、ＳＧＳＧ、およびＴＲＧＧＳなどの２から１５のアミノ酸長である。ある特定の状況では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、およびシステイン（Ｃ）など、１つのみでありうる。

サイトカインポリペプチドが、異種の膜貫通ドメインに、化学物質である化学的クロスリンカーを介して化学的にコンジュゲートされる場合、クロスリンカーの例としては、ＳＭＰＨ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＰＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、ＳＶＳＢ、およびＳＩＡが挙げられるが、これらに限定されない。

ＩｇＧ由来物質もまた、リンカーとして使用されうる。ＩｇＧ由来物質の例としては、（ｉ）全長（ヒンジ－ＣＨ２ＣＨ３）、（ｉｉ）半分（ヒンジ－ＣＨ３）、および（ｉｉｉ）短鎖（１２ａａヒンジのみ）を含むＩｇＧ１～ＩｇＧ４が挙げられる。好ましい例は、ＩｇＧ４－ＣＨ３である。

コンストラクトはまた、シグナル配列を含んでいてもよい。本明細書において使用される場合、「シグナル配列」（シグナルペプチド、標的化シグナル、局在化シグナル、局在化配列、移行ペプチド、リーダー配列、またはリーダーペプチドと呼ばれることもある）は、文脈によって、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。シグナル配列は、コード領域の５’末端またはタンパク質のＮ末端に組み込まれていてもよい、約９～２００ヌクレオチド長または３～７０アミノ酸長である。一部のシグナル配列は、例えばタンパク質が所望の位置に移送された後に、シグナルペプチダーゼによって、タンパク質から切断される。

シグナル配列は、アルファウイルスレプリコンによって発現される予定の目的タンパク質のものであってもよい。

本明細書において使用される場合、「アルファウイルス」は、トガウイルス（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）科のウイルスに属すＲＮＡ含有ウイルスを指すことを意味する。例示的なトガウイルス科ウイルスとしては、東部ウマ脳炎ウイルス（Ｅａｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Ｖｅｎｅｚｕｅｌａｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＶＥＥＶ）、エバグレーズウイルス（Ｅｖｅｒｇｌａｄｅｓ Ｖｉｒｕｓ）、ムカンボウイルス（Ｍｕｃａｍｂｏ Ｖｉｒｕｓ）、ピクスナウイルス（Ｐｉｘｕｎａ Ｖｉｒｕｓ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｅｑｕｉｎｅ Ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ Ｖｉｒｕｓ）（ＷＥＥＶ）、シンドビスウイルス（Ｓｉｎｄｂｉｓ Ｖｉｒｕｓ）、セムリキ森林ウイルス（Ｓｅｍｌｉｋｉ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ミドルバーグウイルス（Ｍｉｄｄｌｅｂｕｒｇ Ｖｉｒｕｓ）、チクングニアウイルス（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ Ｖｉｒｕｓ）（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（Ｏ’ｎｙｏｎｇ－ｎｙｏｎｇ Ｖｉｒｕｓ）、ロスリバーウイルス（Ｒｏｓｓ Ｒｉｖｅｒ Ｖｉｒｕｓ）、バーマ森林ウイルス（Ｂａｒｍａｈ Ｆｏｒｅｓｔ Ｖｉｒｕｓ）、ゲタウイルス（Ｇｅｔａｈ Ｖｉｒｕｓ）、サギヤマウイルス（Ｓａｇｉｙａｍａ Ｖｉｒｕｓ）、ベバルウイルス（Ｍａｙａｒｏ Ｖｉｒｕｓ）、マヤロウイルス（Ｍａｙａｒｏ Ｖｉｒｕｓ）、ウナウイルス（Ｕｎａ Ｖｉｒｕｓ）、アウラウイルス（Ａｕｒａ Ｖｉｒｕｓ）、ワタロアウイルス（Ｗｈａｔａｒｏａ Ｖｉｒｕｓ）、ババンキウイルス（Ｂａｂａｎｋｉ Ｖｉｒｕｓ）、キジラガチウイルス（Ｋｙｚｙｌａｇａｃｈ Ｖｉｒｕｓ）、ハイランズＪウイルス（Ｈｉｇｈｌａｎｄｓ Ｊ ｖｉｒｕｓ）、フォートモーガンウイルス（Ｆｏｒｔ Ｍｏｒｇａｎ Ｖｉｒｕｓ）、ヌドゥムウイルス（Ｎｄｕｍｕ Ｖｉｒｕｓ）、バギークリークウイルス（Ｂｕｇｇｙ Ｃｒｅｅｋ Ｖｉｒｕｓ）、およびオケルボウイルス（Ｏｃｋｅｌｂｏ ｖｉｒｕｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。

「アルファウイルス構造タンパク質」とは、天然ウイルスカプシドまたはエンベロープタンパク質に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列相同性を有するポリペプチドまたはその断片を意味する。一実施形態では、アルファウイルス構造タンパク質は、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）、エバグレーズウイルス、ムカンボウイルス、ピクスナウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）、シンドビスウイルス、セムリキ森林ウイルス、ミドルバーグウイルス、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス、ロスリバーウイルス、バーマ森林ウイルス、ゲタウイルス、サギヤマウイルス、ベバルウイルス、マヤロウイルス、ウナウイルス、アウラウイルス、ワタロアウイルス、ババンキウイルス、キジラガチウイルス、ハイランズＪウイルス、フォートモーガンウイルス、ヌドゥムウイルス、またはバギークリークウイルスと、少なくとも約８５％、９０％、９５％、またはそれより高いアミノ酸配列相同性を有する。アルファウイルス構造タンパク質の野生型アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋから入手することができる。

特定の実施形態では、アルファウイルスは、ＣＨＩＫＶ、例えば、ＣＨＩＫＶ ３７９９７またはＬＲ２００６ ＯＰＹ－１株である。他の実施形態では、アルファウイルスは、ＶＥＥＶ、例えば、ＶＥＥＶ ＴＣ－８３株である。

「アルファウイルスレプリコン」とは、標的細胞においてインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）で自身の増幅を誘導しうるＲＮＡ分子を意味する。該レプリコンは、ＲＮＡ増幅を触媒するポリメラーゼ（ｎｓｐｌ、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４）をコードしており、コードされたポリメラーゼによって認識し、利用される、複製のために必要なシスＲＮＡ配列を含む。アルファウイルスレプリコンは、典型的には、以下の順で配置された要素を含む：５’ＵＴＲ、アルファウイルス非構造タンパク質（ｎｓｐｌ、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、ｎｓｐ４）をコードする配列、３’ＵＴＲ、およびポリＡシグナル。アルファウイルスレプリコンはまた、目的の遺伝子の発現を誘導する、１つまたは複数のウイルスのサブゲノムのプロモーターも含む。これらの配列は、従来技術で教示されている１つまたは複数の変異を有していてもよい。

本開示では、「アルファウイルスレプリコン」、「アルファウイルスレプリコンベクター」、および「レプリコン」は、同じ物質を指すために使用される。

本開示によって提供されるアルファウイルスレプリコンは、図１に示したコンストラクトを有していてもよい。

「アルファウイルスレプリコン粒子」（ＡＲＰ）とは、アルファウイルス構造タンパク質によってパッケージ化されたアルファウイルスレプリコンを意味する。ＡＲＰには、アルファウイルス構造タンパク質をコードするポリヌクレオチドはいっさい含まれていない。

本開示では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」などは、米国特許法においてそれらに付与されている意味を有し、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味しうる；「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」または「本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ）」も同様に、米国特許法において付与されている意味を有し、この用語は、列挙されたものより多い存在によって列挙されたものの基本的なまたは新規の特徴が変化しない限り、列挙されたものより多い存在を許容する、非制限的なものであるが、従来技術の実施形態は除外するものである。

「断片」とは、ポリペプチドまたは核酸分子の一部を意味する。この部分は、好ましくは、参照核酸分子またはポリペプチドの全長の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を含む。断片は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、もしくは１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、もしくは１０００個のヌクレオチドまたはアミノ酸を含有していてもよい。

「参照」とは、標準または対照条件を意味する。

「参照配列」は、配列比較のための基本として使用される、定義された配列である。参照配列は、指定された配列の一部または全体；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列の一区分、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列であってもよい。ポリペプチドの場合、参照ポリペプチド配列の長さは、一般に、少なくとも約１６アミノ酸となり、好ましくは少なくとも約２０アミノ酸、より好ましくは少なくとも約２５アミノ酸、さらにより好ましくは、約３５アミノ酸、約５０アミノ酸、または約１００アミノ酸となる。核酸の場合、参照核酸配列の長さは、一般に、少なくとも約５０ヌクレオチドとなり、好ましくは少なくとも約６０ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチド、さらにより好ましくは約１００ヌクレオチド、もしくは約３００ヌクレオチド、またはその辺りのもしくはその間の任意の整数となる。

配列同一性は、典型的には、配列解析ソフトウエア（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ． ５３７０５、ＢＬＡＳＴ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＧＡＰ、またはＰＩＬＥＵＰ／ＰＲＥＴＴＹＢＯＸプログラム）を使用して測定される。そのようなソフトウエアは、相同性の度合いを種々の置換、欠失、および／またはその他の変更に帰することによって、同一または類似の配列をマッチさせる。保存的置換には、典型的には、以下のグループ内での置換が含まれる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度の決定に対する例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムを、密接に関連した配列を指摘するｅ＜”３＞からｅ＜”１００＞の間の確率スコアを用いて使用してもよい。

「有効量」とは、未処置の患者と比較して疾患の症状を改善させるのに必要とされる薬剤の量を意味する。疾患の予防または治療のために本発明を実施するのに使用される活性化合物の有効量は、投与方法、対象の年齢、体重、および全般的な健康状態によって、様々である。最終的に、主治医または獣医師が適切な量および投与計画を決定することとなる。そのような量を、「有効」量という。

良好な効果を、１回当たり１０^３～１０^１０感染単位（ＩＵ）または０．０１～５００μｇ、好ましくは１回当たり１０^５～１０^１０ＩＵまたは０．１～１００μｇ、例えば、１回当たり１０^７～１０^９ＩＵまたは１～５０μｇの量で１～８回、全身投与、例えば、筋肉内投与、腫瘍内投与、皮下投与、または静脈内投与によって得てもよい。アルファウイルスレプリコンベクターは、好ましくは、従来方法での投与に好適なワクチン組成物で製剤化してもよい。

「対象」とは、これらに限定されないが、ヒト、またはウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、もしくはネコなどの非ヒト哺乳動物を含む、哺乳動物を意味する。

本明細書において使用される場合、「治療する」、「治療すること」、「治療」などの用語は、疾患および／またはそれと関連した症状を低減または改善させることを指す。排除してはいないが、障害または状態を治療するということが、疾患、状態、またはそれと関連した症状を完全に排除することを必要としていないことは理解されよう。

本明細書において使用される場合、「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的処置」などの用語は、障害または状態を有していないが、それらが発生するリスクがあるかまたは発生しやすい対象において、障害または状態が発生する確率を低減させることを指す。

特段の明記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、「または」という用語は、包括的であると理解される。

治療されうるがんの例としては、黒色腫、腎臓がん、前立腺がん、乳がん、結腸がん、および非小細胞肺がんが挙げられるが、これらに限定されない。がんのその他の例としては、骨がん、膵臓がん、皮膚がん（例えば黒色腫）、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部のがん、胃がん、肝臓がん、精巣がん、卵管の癌腫、子宮内膜の癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、外陰部の癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟部組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含む慢性または急性白血病、小児の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂の癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平細胞がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストによって誘発されたがんを含む環境により誘発されたがん、およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。

「炎症性疾患」には、関節炎［例えば、関節リウマチ、慢性進行性関節炎（ａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｃｈｒｏｎｉｃａ ｐｒｏｇｒｅｄｉｅｎｔｅ）、および変形性関節炎］およびリューマチ性疾患などの、自己免疫性成分を含む病因を有する炎症性状態が含まれ、骨量減少、炎症性疼痛、強直性脊椎炎を含む脊椎関節症、ライター症候群、反応性関節炎、乾癬性関節炎、若年性特発性関節炎、および腸炎性関節炎、腱付着部炎、過敏症（気道過敏症および真皮過敏症の両方を含む）、ならびにアレルギーを伴う炎症性状態およびリューマチ性疾患が含まれる。具体的な自己免疫疾患としては、自己免疫性血液疾患（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球ろう、および特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、ループス腎炎、炎症性筋疾患（皮膚筋炎）、歯周炎、多発性軟骨炎、強皮症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン－ジョンソン症候群、特発性スプルー、自己免疫性炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、および過敏性腸症候群を含む）、内分泌性眼障害、グレーブス病、類肉腫症、多発性硬化症、全身性硬化症、線維性疾患、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型真性糖尿病）、ぶどう膜炎、乾性角結膜炎および春季角結膜炎、間質性肺線維症、人工関節周囲骨溶解、糸球体腎炎（例えば、特発性ネフローゼ症候群または微小変化型ネフローゼを含む、ネフローゼ症候群有り無し両方）、多発性骨髄腫およびその他のタイプの腫瘍、皮膚および角膜の炎症性疾患、筋炎、骨インプラントのゆるみ、代謝障害（肥満、アテローム性動脈硬化症、ならびに、拡張型心筋症、心筋炎、ＩＩ型真性糖尿病、および脂質異常症を含むその他の心臓血管系疾患など）、および自己免疫性甲状腺疾患（橋本甲状腺炎を含む）、原発性小型および中型血管炎、巨細胞性動脈炎を含む大型血管炎、化膿性汗腺炎、視神経脊髄炎、シェーグレン症候群、ベーチェット病、アトピー性および接触皮膚炎、細気管支炎、炎症性筋疾患、自己免疫性末梢神経障害、免疫性腎、肝および甲状腺疾患、炎症およびアテローム性血栓症、自己炎症性発熱症候群、免疫血液学的疾患、ならびに皮膚および粘膜の水疱性障害が挙げられる。解剖学的には、ぶどう膜炎は、前側、中間、後側、または汎ぶどう膜炎でありうる。ぶどう膜炎は、慢性または急性でありうる。ぶどう膜炎の病因は、自己免疫性、もしくは非感染性、感染性、全身性疾患関連性、または白点症候群でありうる。

前述の態様のいずれかにおいて、本方法は、チェックポイント阻害剤ポリペプチドまたはそれをコードするポリヌクレオチドと任意選択の薬学的に許容される担体とを含む第２の組成物を投与することをさらに含む。一部の態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、またはそれらの組合せを阻害する。一部の態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、抗体である。一部の態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ＣＴＬＡ４に特異的に結合する抗ＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ１特異的に結合する抗ＰＤｌ抗体またはその抗原結合性断片、ＰＤ－Ｌ１に特異的に結合する抗ＰＤ－Ｌｌ抗体またはその抗原結合性断片、およびそれらの組合せから選択される抗体である。一部の態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、アテゾリズマブ、アベルマブ、またはデュルバルマブから選択される抗ＰＤ－Ｌｌ抗体である。一部の態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、トレメリムマブまたはイピリムマブから選択される抗ＣＴＬＡ－４抗体である。一部の態様では、チェックポイント阻害剤ポリペプチドは、ニボルマブまたはペムブロリズマブから選択される抗ＰＤｌ抗体である。

特段の明記がない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書において使用される場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、単数または複数であると理解される。

当技術分野では、本明細書および特許請求の範囲に記載したポリヌクレオチド配列が、代表的なＤＮＡ配列では「Ｔ」を記載するが、配列がＲＮＡである場合には「Ｔ」が「Ｕ」に置き換えられることになることを認めるものとする。

本明細書において提供された任意の組成物または方法は、本明細書において提供されたその他の組成物および方法のいずれか１つまたは複数と組み合わせることができる。

「ベクター」という用語は、核酸配列を、増殖かつ／または生物、細胞、または細胞成分間で移動させることができる手段を指す。ベクターとしては、自律的に複製するかまたは宿主細胞の染色体に組み込むことができる、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などが挙げられる。ベクターはまた、自己複製しない、裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内でＤＮＡとＲＮＡとの両方から構成されたポリヌクレオチド、ポリリジンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでありうる。すべてではなないが多くの一般的な実施形態では、本発明のベクターは、プラスミドまたはバクミドである。

典型的には、発現される予定の核酸分子は、プロモーターおよび／または転写促進因子に「作動可能に連結され」、プロモーターおよび／または転写促進因子による転写調節制御を受ける。

一実施形態では、アルファウイルスレプリコンなどのＲＮＡ分子は、当技術分野では既知の従来手順によって、鋳型ＤＮＡ配列から生成してもよい。インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）転写（ＩＶＴ）法では、ＲＮＡ分子の鋳型依存性合成が可能である。ＩＶＴ法によって、ＲＮＡ転写物の大量合成が可能となる。一般に、ＩＶＴは、目的の配列の上流のプロモーター配列を含むＤＮＡ鋳型を利用する。プロモーター配列は、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６プロモーター配列などのバクテリオファージ由来のものが最も一般的であるが、新規に設計したプロモーター配列を含む、多くのその他のプロモーター配列が許容されうる。ＤＮＡ鋳型の転写は、典型的には、特定のバクテリオファージプロモーター配列に対応するＲＮＡポリメラーゼを使用することによって、最も効果的に実行される。例示的なＲＮＡポリメラーゼとしては、中でも、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ ＲＮＡポリメラーゼ、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。ＩＶＴは、一般的に、ｄｓＤＮＡで開始されるが、一本鎖上で続行することができる。Ｔ７転写キット（ＲｉｂｏＭａｘ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｌａｒｇｅ Ｓｃａｌｅ ＲＮＡ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ （ＷＩ ＵＳＡ））などのインビトロ転写のためのキット。

トランスフェクションの方法および発現媒体の選択は、選択された宿主系に依存することとなる。トランスフェクション法は、例えば、Ausubel et al.（上記）の中に記載されており；発現媒体は、例えば、Cloning Vectors: A Laboratory Manual（P. H. Pouwels et al., 1985, Supp. 1987）の中で示されているものから選択してもよい。本段落中で引用された参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明のコンストラクトの作製について、様々な発現系が存在する。該コンストラクトを作製するために有用な発現ベクターとしては、限定するものではないが、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来ベクターがあり、例えば、細菌性プラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母エピソーム由来、挿入エレメント由来、酵母染色体エレメント由来、アルファウイルス（例えば、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ））、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）、ＳＶ４０などのパポバウイルス（ｐａｐｏｖａ ｖｉｒｕｓ）、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、アデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）、鶏痘ウイルス（ｆｏｗｌｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、仮性狂犬病ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｒａｂｉｅｓ ｖｉｒｕｓ）、およびレトロウイルス（ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）などのウイルス由来のベクター、ならびにそれらの組合せに由来するベクターが挙げられる。

本明細書において使用されるコンストラクトおよび／またはアルファウイルスレプリコンベクターは、本明細書に記載したようなエンベロープタンパク質またはカプシドタンパク質などの構造タンパク質をコードするアルファウイルスポリヌクレオチドを含む。また、本明細書において使用されるコンストラクトおよび／またはベクターは、非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４と目的の遺伝子とをコードするアルファウイルスポリヌクレオチドを含む。該コンストラクトまたはベクターの具体的な例は、図１に示したものである。

ベクターは、例えば、ファージ、プラスミド、ウイルス、またはレトロウイルスベクターであってもよい。ヌクレオチドを含むコンストラクトおよび／またはベクターは、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきであり、ＣＭＶプロモーター、ファージλ ＰＬプロモーター、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｌａｃ、ｐｈｏＡ、およびｔａｃプロモーター、ＳＶ４０初期および後期プロモーター、ならびにレトロウイルスＬＴＲのプロモーターなどが、非限定的な例である。その他の好適なプロモーターは、宿主細胞および／または所望の発現速度に応じて当業者には理解されよう。発現コンストラクトは、転写開始部位、転写終止部位、および転写される領域に翻訳のためのリボソーム結合部位を、さらに含有することとなる。該コンストラクトによって発現された転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳される予定のポリペプチドの始めに適切に配置された翻訳開始コドン、および終わりに適切に配置された終止コドンを含有することとなる。

ベクターは、好ましくは、少なくとも１つの選択マーカーを含むこととなる。そのようなマーカーとしては、真核細胞培養用についてはジヒドロ葉酸還元酵素、Ｇ４１８、またはネオマイシン耐性、および大腸菌およびその他の細菌での培養についてはテトラサイクリン、カナマイシン、またはアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。好ましいベクターの中には、バキュロウイルス、ポックスウイルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）（例えば、ワクシニアウイルス、アビポックスウイルス（ａｖｉｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、カナリア痘ウイルス（ｃａｎａｒｙｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、鶏痘ウイルス、アライグマ痘ウイルス（ｒａｃｃｏｏｎｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）、豚痘ウイルス（ｓｗｉｎｅｐｏｘ）など）、アデノウイルス［例えば、イヌアデノウイルス（ｃａｎｉｎｅ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）］、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、およびレトロウイルスなどのウイルスベクターがある。本発明によって使用されうるその他のベクターには、細菌て使用するためのベクターが含まれ、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ６０、およびｐＱＥ－９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクター、Ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔベクター、ｐＮＨ８Ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８Ａ、ｐＮＨ４６Ａ、ｐｔｒｃ９９ａ、ｐＫＫ２２３－３、ｐＫＫ２３３－３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ５が含まれる。好ましい真核生物ベクターの中には、ｐＦａｓｔＢａｃｌ、ｐＷＩＮＥＯ、ｐＳＶ２ＣＡＴ、ｐＯＧ４４、ｐＸＴｌ、およびｐＳＧ、ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ならびにｐＳＶＬがある。その他の好適なベクターは、当業者には容易に明らかとなろう。

組換えコンストラクトは、トランスフェクトのために調製され、使用されうるものであり、本明細書に記載のウイルスタンパク質を含むウイルスタンパク質を、真核細胞および／または原核細胞中に発現することができる。よって、一実施形態では、本開示は、アルファウイルスレプリコン粒子の形成を可能にする条件下で、カプシド、Ｅ３、Ｅ２、６Ｋ、およびＥｌ、またはそれらの部分を含むアルファウイルス構造タンパク質をコードする核酸を含有するベクター、ならびにアルファウイルスｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４をコードする核酸とサイトカインをコードする目的の遺伝子のうちの少なくとも１つとを含むベクターを含む、宿主細胞を提供する。「アルファウイルスレプリコン粒子」という用語は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４とサイトカインを含むポリペプチドとをコードするポリヌクレオチドを含むアルファウイルスレプリコンベクターを包含しているアルファウイルス構造タンパク質からなる粒子を指す。

一実施形態では、前記ベクターは、組換えバキュロウイルスである。別の実施形態では、前記組換えバキュロウイルスは、昆虫細胞にトランスフェクトされる。好ましい一実施形態では、前記細胞は、昆虫細胞である。別の実施形態では、前記昆虫細胞は、Ｓｆ９細胞である。

ポリペプチド産生のための注目すべき細菌発現系の１つは、大腸菌ｐＥＴ発現系（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）である。本発現系によれば、ポリペプチドをコードするＤＮＡは、発現が可能となるように設計された向きでｐＥＴベクター中に挿入される。ポリペプチドの発現は、そのようなポリペプチドをコードする遺伝子がＴ７調節シグナルの制御下にあるため、宿主細胞においてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの発現を誘導することによって達成される。これは、典型的には、ＩＰＴＧ誘導に応じてＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する宿主株を使用することによって達成される。組換えポリペプチドは、産生されてしまえば、次いで、標準的な当技術分野において公知の方法、例えば、本明細書に記載の方法によって単離される。

選択されたベクターおよび宿主細胞に依存して、コンストラクトは、組換えタンパク質が発現されアルファウイルスレプリコンが生成される条件下で、ベクターによってトランスフェクトされた宿主細胞を増殖させることによって、作製され、アルファウイルス構造タンパク質の粒子でパッケージ化されているアルファウイルスレプリコンを含有するコンストラクトが形成される。一実施形態では、本発明は、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチドと少なくとも１つのサイトカインを含むポリペプチドをコードする目的の遺伝子とを含むベクターを、各々少なくとも１つのアルファウイルス構造タンパク質をコードする少なくとも１つのベクターと、好適な宿主細胞中に同時トランスフェクトすることと、コンストラクト形成を可能にする条件下で前記アルファウイルス構造タンパク質を発現させることとを含む、コンストラクトを作製する方法を含む。別の実施形態では、真核細胞は、酵母、昆虫、両生類、鳥類、または哺乳動物細胞からなる群から選択される。適切な増殖条件の選択は、当技術分野の技術または技術者の範囲である。

本開示のアルファウイルスレプリコン粒子を産生する細胞を増殖させる方法としては、バッチ、流加、連続、および灌流細胞培養技術が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、ＣＨＩＫＶまたはＶＥＥＶ由来ベクターなどの、アルファウイルスレプリコンをコードするベクター、およびカプシドをコードするポリペプチドを含むベクター、およびエンベロープタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで同時トランスフェクトされた細胞は、その中で細胞が増殖し、タンパク質（例えば、組換えタンパク質）を発現するバイオリアクターまたは発酵チャンバー内で増殖されて、精製および単離される。典型的には、細胞培養は、滅菌、温度および雰囲気が制御された条件下で行われる。バイオリアクターは、温度、雰囲気、撹拌、および／またはｐＨなどの環境条件をモニタリングすることができる、細胞を培養するために使用されるチャンバーである。一実施形態では、バイオリアクターは、ステンレス鋼チャンバーである。別の実施形態では、前記バイオリアクターは、滅菌済みプラスチックバッグ（例えば、Ｃｅｌｌｂａｇ．ＲＴＭ．、Ｗａｖｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、Ｎ．Ｊ．、本引用文書の内容は、参照により本明細書に組み込まれる）である。他の実施形態では、前記滅菌済みプラスチックバッグは、約５０Ｌ～１０００Ｌのバッグである。

本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、ヒトまたはその他の脊椎動物への投与に好適な、１つまたは複数の混合可能な固体もしくは液体増量剤、希釈剤、または封入物質を意味し、すべての水性溶媒（例えば、水、アルコール性溶液／水溶液、生理食塩水、塩化ナトリウムなどの非経口ビヒクル、およびリンゲルデキストロース）、非水溶媒（例えば、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、およびエチルオレエートなどの注入可能な有機系エステル）、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、抗酸化物質、防腐剤（例えば、抗菌または抗真菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガス）、等張剤、吸収遅延剤、塩、薬物、薬物安定化剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、香味剤、色素、流体、および栄養補液などの、当業者に既知であろう材料およびそれらの組合せが含まれる。医薬組成物中の個々の成分のｐＨおよび正確な濃度は、公知のパラメーターに準じて調整される。

封入物質は、ポリヌクレオチドまたはベクターをパッケージ化している送達媒体を指し、例えばレプリコン粒子（例えば、米国特許公開第２０１９－０１８５８２２号に記載されているアルファウイルスレプリコン粒子。この文書の内容は参照により本明細書に組み込まれている）、および脂質送達システム（例えば、リポソーム）などである。

一部の実施形態では、本開示の組成物または製剤は、脂質送達システム、例えば、リポソーム、リポプレックス、脂質ナノ粒子、またはそれらの任意の組合せを含む。本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンベクターは、１つまたは複数のリポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子を使用して製剤化されうる。これらの製剤がポリヌクレオチドによる細胞トランスフェクションを高め；かつ／またはコードされたタンパク質の翻訳を高めることができるため、リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子は、タンパク質産生を指示するポリヌクレオチドの有効性を改善するために使用されうる。リポソーム、リポプレックス、または脂質ナノ粒子はまた、ポリヌクレオチドの安定性を高めるためにも使用されうる。

リポソームは、脂質二重層から主に構成され得、医薬製剤の投与のための送達媒体として使用されうる、人工的に調製された小胞である。リポソームは、様々なサイズのものがありうる。多重層小胞（ＭＬＶ）は、直径が数百ナノメートルであってもよく、狭い水性コンパートメントによって隔てられた、ひと続きの同心の二重層を含有しうる。小型単層小胞（未確定）（ＳＵＶ）は、直径が５０ｎｍ未満であり得、大型単層小胞（ＬＵＶ）は、直径が５０から５００ｎｍの間でありうる。リポソーム設計には、不健康な組織へのリポソームの付着を改善するための、またはこれに限定されないがエンドサイトーシスなどの事象を活性化するための、オプソニンもしくはリガンドが含まれうるが、これらに限定されない。リポソームは、医薬製剤の送達を改善するために、低いまたは高いｐＨ値を保っていてもよい。

リポソームの形成は、封入される医薬製剤およびリポソーム成分、脂質小胞が分散されるビヒクルの性質、封入される物質の有効濃度およびその潜在的毒性、小胞の適用および／または送達中に必要とされる任意の追加プロセス、意図される適用のために最適な小胞のサイズ、多分散性、および有効期間、ならびに安全かつ有効なリポソーム生成物のバッチ間再現性およびスケールアップ生産などに依存しうる。

一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンベクターは、リポソームによって封入されていてもよく、かつ／または次いでリポソームによって封入される水性コア中に含有されていてもよい。

一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンベクターは、カチオン性水中油型乳剤として製剤化することができ、カチオン性水中油型乳剤では、乳剤粒子が、その乳剤粒子に分子を固定しているポリヌクレオチドと相互作用することができる油性コアおよびカチオン性脂質を含んでいる。一部の実施形態では、本明細書に記載のベクターは、親水相が分散されている連続した疎水相を含む油中水型乳剤として製剤化することができる。

一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンベクターは、脂質－ポリカチオン複合体として製剤化することができる。非限定的な例には、ポリカチオンは、カチオン性ペプチド、または、これらに限定されないが、ポリリジン、ポリオルニチン、および／もしくはポリアルギニンなどのポリペプチドとカチオン性ペプチド、が挙げられる。

一部の実施形態では、本明細書に記載のアルファウイルスレプリコンベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）として製剤化することができる。

脂質ナノ粒子製剤は、典型的には、１つまたは複数の脂質を含む。一部の実施形態では、脂質は、カチオン性またはイオン化できる脂質である。一部の実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、リン脂質、構造脂質、第四級アミン化合物、および粒子凝集を低減させることができる分子を含む、その他の成分、例えばＰＥＧまたはＰＥＧ修飾脂質をさらに含む。一部の実施形態では、脂質組成物中のカチオン性およびイオン化できる脂質の量は、約０．０１ｍｏｌ％から約９９ｍｏｌ％までの範囲である。

ＬＮＰは、アニオン性核酸を引き寄せて自己集合性ナノ粒子のコアを形成して高度なカプセル化を確実にする、ｐＨ感受性のイオン化できるカチオン性脂質を含有する。生理的ｐＨでは、ＬＮＰは中性であり、永続的にカチオン性である分子にみられる毒性の機序を排除している。

これらの同様のｐＨ感受性脂質は、エンドソームの酸性環境へ反応し、エンドソームの破壊および細胞中への核酸の放出を誘発する役割を果たしている。

このレプリコンベースの技術は、ＲＮＡが自己増幅して、ワクチン抗原を産生させ、細胞器官中へ送達することができるため、ワクチン接種のための独特なプラットフォーム技術である。さらに、このレプリコンベースの技術は、ＤＮＡベースのワクチンに一般的に伴う、例えばエレクトロポレーションなど、投与に必要なゲノムの組込みまたは高用量のリスクおよび装置などの課題を克服し、自己複製系に基づく最少用量で、ｍＲＮＡ技術にまさる高い免疫原性が期待される。

本開示によれば、サイトカインタンパク質／ポリペプチドをコードする核酸を含む、新規の免疫学的に活性のあるアルファウイルスレプリコンベクターは、がんおよび／または炎症性疾患の治療に有用でありながら、毒性が最少化している。

本発明を、以下の実施例を参照にして詳しく説明する。ただし、これらの実施例は、本出願の範囲を制限することを意図するものではない。

［実施例１］

下記に示すコンストラクト１～６をコードする各遺伝子を、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（https://www.idtdna.com/pages）によって合成した。

コンストラクト１：
下記のマウスＩＬ－１２配列をコードする遺伝子。

MACPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSVPGVGVPGVGRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA（配列番号１）
リンカーには下線を引いている。

マウスＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）
MACPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRS（配列番号２）

シグナル配列を含まないマウスＩＬ－１２Ａ（３５ｐ）
RVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSA（配列番号３）
リンカー
ＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号４）

以下のコンストラクト２～６では、「マウスＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）」はコンストラクト１に相当する。

コンストラクト２：
リンカーを用いてヒトＩｇＧ４ＣＨ３およびＨＡ（可動性ドメイン－膜貫通（ＴＭ）－細胞質側末端（Ｃｙｔ））に融合させた、マウスＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）をコードする遺伝子。

MACPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSVPGVGVPGVGRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGSGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号５）
下線を引いた「ＧＳ」は、リンカーである。

ヒトＩｇＧ４ ＣＨ３：
GQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK（配列番号６）
ＧＳ：リンカー（ＧＧＡＴＣＣ）
ＨＡ（可動性－ＴＭ－Ｃｙｔ）：
GVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号７）

コンストラクト３：
リンカーを用いてＨＡ（可動性－ＴＭ－Ｃｙｔ）に融合させた、マウスＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）をコードする遺伝子

MACPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSVPGVGVPGVGRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGSGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号８）
下線を引いた「ＧＳ」は、リンカーである。

コンストラクト４：
リンカーを用いてヒトＩｇＧ４ＣＨ３およびヒトＴＬＲ４（ＴＭ－Ｔｏｌｌ／インターロイキン－１受容体ドメイン（ＴＩＲ））に融合させた、マウスＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）をコードする遺伝子

MACPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSVPGVGVPGVGRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGSGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI（配列番号９）
下線を引いた「ＧＳ」は、リンカーである。

ヒトＴＬＲ４（ＴＭ－ＴＩＲ）：
KTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIK YG RGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI（配列番号１０）

コンストラクト５：
リンカーを用いてヒトＴＬＲ４（ＴＭ－ＴＩＲ）に融合させた、マウスＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）をコードする遺伝子

MACPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSVPGVGVPGVGRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGSKTIIGVSVLSVLVVSVVAVLVYKFYFHLMLLAGCIKYGRGENIYDAFVIYSSQDEDWVRNELVKNLEEGVPPFQLCLHYRDFIPGVAIAANIIHEGFHKSRKVIVVVSQHFIQSRWCIFEYEIAQTWQFLSSRAGIIFIVLQKVEKTLLRQQVELYRLLSRNTYLEWEDSVLGRHIFWRRLRKALLDGKSWNPEGTVGTGCNWQEATSI（配列番号１１）
下線を引いた「ＧＳ」は、リンカーである。

コンストラクト６：
リンカーを用いてマウスＩｇＧ４ＣＨ３およびＨＡ（可動性ドメイン－膜貫通（ＴＭ）－細胞質側末端（Ｃｙｔ））に融合させた、マウスＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）をコードする遺伝子。

MACPQKLTISWFAIVLLVSPLMAMWELEKDVYVVEVDWTPDAPGETVNLTCDTPEEDDITWTSDQRHGVIGSGKTLTITVKEFLDAGQYTCHKGGETLSHSHLLLHKKENGIWSTEILKNFKNKTFLKCEAPNYSGRFTCSWLVQRNMDLKFNIKSSSSPPDSRAVTCGMASLSAEKVTLDQRDYEKYSVSCQEDVTCPTAEETLPIELALEARQQNKYENYSTSFFIRDIIKPDPPKNLQMKPLKNSQVEVSWEYPDSWSTPHSYFSLKFFVRIQRKKEKMKETEEGCNQKGAFLVEKTSTEVQCKGGNVCVQAQDRYYNSSCSKWACVPCRVRSVPGVGVPGVGRVIPVSGPARCLSQSRNLLKTTDDMVKTAREKLKHYSCTAEDIDHEDITRDQTSTLKTCLPLELHKNESCLATRETSSTTRGSCLPPQKTSLMMTLCLGSIYEDLKMYQTEFQAINAALQNHNHQQIILDKGMLVAIDELMQSLNHNGETLRQKPPVGEADPYRVKMKLCILLHAFSTRVVTINRVMGYLSSAGSGRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGKGSGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号１２）
下線を引いた「ＧＳ」は、リンカーである。

マウスＩｇＧ４ＣＨ３
GRPKAPQVYTIPPPKEQMAKDKVSLTCMITNFFPEDITVEWQWNGQPAENYKNTQPIMDTDGSYFVYSKLNVQKSNWEAGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPG（配列番号１３）

ＨＡ（可動性－ＴＭ－Ｃｙｔ）およびＩｇＧ４はまた、以下の通り開示されている。
ＨＡ（可動性－ＴＭ－Ｃｙｔ）
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/P03452
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０３４５２．２
ヒトＩｇＧ４
https://www.uniprot.org/uniprot/P01861
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｐ０１８６１
［実施例２］

コンストラクト７および８をコードする各遺伝子を調製した。
コンストラクト７：
下記のヒトＩＬ－１２配列。

MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSVPGVGVPGVGRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS（配列番号１４）
１番目の下線は、ヒトＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）のシグナル配列（ＳＳ）を表し、２番目の下線は、リンカーを表す。

ヒトＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCS（配列番号１５）
下線部は、ヒトＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）のシグナル配列（ＳＳ）である。
リンカー（下線）
ＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧ（配列番号４）
ヒトＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）ｗ／ｏシグナル配列
（シグナル配列「ＭＣＰＡＲＳＬＬＬＶＡＴＬＶＬＬＤＨＬＳＬＡ（配列番号１６）」が欠失している）
RNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNAS（配列番号１７）

コンストラクト８：
リンカーを用いてヒトＩｇＧ４ＣＨ３およびＨＡ（可動性ドメイン－膜貫通（ＴＭ）－細胞質側末端（Ｃｙｔ））に融合させた、ヒトＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）をコードする遺伝子。

上記の構造では、「ヒトＩＬ－１２（ｐ４０－ｐ３５）」は、コンストラクト７に相当する。
MCHQQLVISWFSLVFLASPLVAIWELKKDVYVVELDWYPDAPGEMVVLTCDTPEEDGITWTLDQSSEVLGSGKTLTIQVKEFGDAGQYTCHKGGEVLSHSLLLLHKKEDGIWSTDILKDQKEPKNKTFLRCEAKNYSGRFTCWWLTTISTDLTFSVKSSRGSSDPQGVTCGAATLSAERVRGDNKEYEYSVECQEDSACPAAEESLPIEVMVDAVHKLKYENYTSSFFIRDIIKPDPPKNLQLKPLKNSRQVEVSWEYPDTWSTPHSYFSLTFCVQVQGKSKREKKDRVFTDKTSATVICRKNASISVRAQDRYYSSSWSEWASVPCSVPGVGVPGVGRNLPVATPDPGMFPCLHHSQNLLRAVSNMLQKARQTLEFYPCTSEEIDHEDITKDKTSTVEACLPLELTKNESCLNSRETSFITNGSCLASRKTSFMMALCLSSIYEDLKMYQVEFKTMNAKLLMDPKRQIFLDQNMLAVIDELMQALNFNSETVPQKSSLEEPDFYKTKIKLCILLHAFRIRAVTIDRVMSYLNASGSGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKGSGVKLESMGIYQILAIYSTVASSLVLLVSLGAISFWMCSNGSLQCRICI（配列番号１８）
下線を引いた「ＧＳ」は、リンカーである。

ヒトＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０）
ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２９４６０
https://www.uniprot.org/uniprot/P29460
ヒトＩＬ－１２Ａ（ｐ３５）
Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ２９４５９
https://www.uniprot.org/uniprot/P29459
［実施例３］

ベクターの調製
アルファウイルスレプリコンの図式化したコンストラクトを図１に示す。

実施例１において調製したコンストラクト１～６ならびに実施例２において調製したコンストラクト７および８を、各々、目的の遺伝子として使用した。コンストラクトをコードするヌクレオチドを、ＳＧプロモーターの制御下でＶＥＥＶレプリコンベクター中にクローニングした。ＡｓｃＩおよびＳｂｆＩ制限部位を挿入することによって、各断片をコードするＶＥＥＶレプリコンプラスミドを作出して、全長ＶＥＥＶ ＴＣ－８３レプリコンコンストラクトを得た。ＴＭを含むコンストラクトについては図２を、また、ＴＭを含まないコンストラクトについては図３を参照されたい。

ＳＧプロモーター、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、およびポリＡテールのヌクレオチド配列は、以下の通りである。ＲＮＡ配列は、鋳型としてこれらのＤＮＡ配列を使用することによって得た。
ＳＧプロモーター：ｃｃｔｇａａｔｇｇａｃｔａｃｇａｃａｔａｇｔｃｔａｇｔｃｃｇｃｃａａｇ（配列番号１９）
５’ＵＴＲ：ａｔａｇｇｃｇｇｃｇｃａｔｇａｇａｇａａｇｃｃｃａｇａｃｃａａｔｔａｃｃｔａｃｃｃａａａ（配列番号２０）
３ＵＴＲ：ｇｃｇａｔｃｇｃａｔａｃａｇｃａｇｃａａｔｔｇｇｃａａｇｃｔｇｃｔｔａｃａｔａｇａａｃｔｃｇｃｇｇｃｇａｔｔｇｇｃａｔｇｃｃｇｃｃｔｔａａａａｔｔｔｔｔａｔｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｔｔｔｔｃｃｇａａｔｃｇｇａｔｔｔｔｇｔｔｔｔｔａａｔａｔｔｔｃ（配列番号２１）
ポリＡテール：ａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ（配列番号２２）

ＶＥＥＶ ＴＣ－８３レプリコンｎｓＰ１－４アミノ酸配列は、以下の通りである。
MEKVHVDIEEDSPFLRALQRSFPQFEVEAKQVTDNDHANARAFSHLASKLIETEVDPSDTILDIGSAPARRMYSKHKYHCICPMRCAEDPDRLYKYATKLKKNCKEITDKELDKKMKELAAVMSDPDLETETMCLHDDESCRYEGQVAVYQDVYAVDGPTSLYHQANKGVRVAYWIGFDTTPFMFKNLAGAYPSYSTNWADETVLTARNIGLCSSDVMERSRRGMSILRKKYLKPSNNVLFSVGSTIYHEKRDLLRSWHLPSVFHLRGKQNYTCRCETIVSCDGYVVKRIAISPGLYGKPSGYAATMHREGFLCCKVTDTLNGERVSFPVCTYVPATLCDQMTGILATDVSADDAQKLLVGLNQRIVVNGRTQRNTNTMKNYLLPVVAQAFARWAKEYKEDQEDERPLGLRDRQLVMGCCWAFRRHKITSIYKRPDTQTIIKVNSDFHSFVLPRIGSNTLEIGLRTRIRKMLEEHKEPSPLITAEDIQEAKCAADEAKEVREAEELRAALPPLAADFEEPTLEADVDLMLQEAGAGSVETPRGLIKVTSYAGEDKIGSYAVLSPQAVLKSEKLSCIHPLAEQVIVITHSGRKGRYAVEPYHGKVVVPEGHAIPVQDFQALSESATIVYNEREFVNRYLHHIATHGGALNTDEEYYKTVKPSEHDGEYLYDIDRKQCVKKELVTGLGLTGELVDPPFHEFAYESLRTRPAAPYQVPTIGVYGVPGSGKSGIIKSAVTKKDLVVSAKKENCAEIIRDVKKMKGLDVNARTVDSVLLNGCKHPVETLYIDEAFACHAGTLRALIAIIRPKKAVLCGDPKQCGFFNMMCLKVHFNHEICTQVFHKSISRRCTKSVTSVVSTLFYDKRMRTTNPKETKIVIDTTGSTKPKQDDLILTCFRGWVKQLQIDYKGNEIMTAAASQGLTRKGVYAVRYKVNENPLYAPTSEHVNVLLTRTEDRIVWKTLAGDPWIKILTAKYPGNFTATIEEWQAEHDAIMRHILERPDPTDVFQNKANVCWAKALVPVLKTAGIDMTTEQWNTVDYFETDKAHSAEIVLNQLCVRFFGLDLDSGLFSAPTVPLSIRNNHWDNSPSPNMYGLNKEVVRQLSRRYPQLPRAVATGRVYDMNTGTLRNYDPRINLVPVNRRLPHALVLHHNEHPQSDFSSFVSKLKGRTVLVVGEKLSVPGKKVDWLSDQPEATFRARLDLGIPGDVPKYDIVFINVRTPYKYHHYQQCEDHAIKLSMLTKKACLHLNPGGTCVSIGYGYADRASESIIGAIARQFKFSRVCKPKSSHEETEVLFVFIGYDRKARTHNPYKLSSTLTNIYTGSRLHEAGCAPSYHVVRGDIATATEGVIINAANSKGQPGGGVCGALYKKFPESFDLQPIEVGKARLVKGAAKHIIHAVGPNFNKVSEVEGDKQLAEAYESIAKIVNDNNYKSVAIPLLSTGIFSGNKDRLTQSLNHLLTALDTTDADVAIYCRDKKWEMTLKEAVARREAVEEICISDDSSVTEPDAELVRVHPKSSLAGRKGYSTSDGKTFSYLEGTKFHQAAKDIAEINAMWPVATEANEQVCMYILGESMSSIRSKCPVEESEASTPPSTLPCLCIHAMTPERVQRLKASRPEQITVCSSFPLPKYRITGVQKIQCSQPILFSPKVPAYIHPRKYLVETPPVEETPESPAENQSTEGTPEQPALVNVDATRTRMPEPIIIEEEEEDSISLLSDGPTHQVLQVEADIHGSPSVSSSSWSIPHASDFDVDSLSILDTLDGASVTSGAVSAETNSYFARSMEFRARPVPAPRTVFRNPPHPAPRTRTPPLAHSRASSRTSLVSTPPGVNRVITREELEALTPSRAPSRSASRTSLVSNPPGVNRVITREEFEAFVAQQQXRFDAGAYIFSSDTGQGHLQQKSVRQTVLSEVVLERTELEISYAPRLDQEKEELLRKKLQLNPTPANRSRYQSRRVENMKAITARRILQGLGHYLKAEGKVECYRTLHPVPLYSSSVNRAFSSPKVAVEACNAMLKENFPTVASYCIIPEYDAYLDMVDGASCCLDTASFCPAKLRSFPKKHSYLEPTIRSAVPSAIQNTLQNVLAAATKRNCNVTQMRELPVLDSAAFNVECFKKYACNNEYWETFKENPIRLTEENVVNYITKLKGPKAAALFAKTHNLNMLQDIPMDRFVMDLKRDVKVTPGTKHTEERPKVQVIQAADPLATADLCGIHRELVRRLNAVLLPNIHTLFDMSAEDFDAIIAEHFQPGDCVLETDIASFDKSEDDAMALTALMILEDLGVDAELLTLIEAAFGEISSIHLPTKTKFKFGAMMKSGMFLTLFVNTVINIVIASRVLRERLTGSPCAAFIGDDNIVKGVKSDKLMADRCATWLNMEVKIIDAVVGEKAPYFCGGFILCDSVTGTACRVADPLKRLFKLGKPLAVDDEHDDDRRRALHEESTRWNRVGILPELCKAVESRYETVGTSIIVMAMTTLASSVKSFSYLRGAPITLYG（配列番号２３）
ｎｓｐ３に相当するアミノ酸配列に下線を引いている。

この実施例では、配列番号２３の１３３０～１８８６に相当しているｎｓｐ３のアミノ酸配列を、下記に示した配列で置換した。下線を引いた配列が、配列番号２３と異なっている。
APSYHVVRGDIATATEGVIINAANSKGQPGGGVCGALYKKFPESFDLQPIEVGKARLVKGAAKHIIHAVGPNFNKVSEVEGDKQLAEAYESIAKIVNDNNYKSVAIPLLSTGIFSGNKDRLTQSLNHLLTALDTTDADVAIYCRDKKWEMTLKEAVARREAVEEICISDDSSVTEPDAELVRVHPKSSLAGRKGYSTSDGKTFSYLEGTKFHQAAKDIAEINAMWPVATEANEQVCMYILGKSMSSIRSKCPVEESEASTPPSTLPCLCIHAMTPERVQRLKASRPEQITVCSSFPLPKYRITGVQKIQCSQPILFSPKVPAYIHPRKYLVETPPVDETPEPSAENQSTEGTPEQPPLITEDETRTRTPEPIIIEEEEEDSISLLSDGPTHQVLQVEADIHGPPSVSSSSWSIPHASDFDVDSLSILDTLEGASVTSGATSAETNSYFAKSMEFLARPVPAPRTVFRNPPHPAPRTRTPSLAPSRACSRTSLVSTPPGVNRVITREELEALTPSRTPSRSVSRTSLVSNPPGVNRVITREEFEAFVAQQQXRFDAGA（配列番号２４）
［実施例４］

アルファウイルスレプリコン粒子（ＡＲＰ）の調製
実施例３において調製したコンストラクト１～８各々についての全長レプリコンプラスミド１０μｇ、１μｇのＶＥＥＶ Ｅｎｖ発現プラスミド、および１μｇのＶＥＥＶカプシドＮＬＳ変異体（または１μｇのＶＥＥＶカプシド発現プラスミド）を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。上清を、トランスフェクションの４８～９６時間後に収集した。レプリコン粒子は、イオン交換カラムを使用することによって精製した。ＨＥＫ２９３ＴまたはＶｅｒｏ細胞に精製した粒子を感染させて、感染力価を決定した。精製したレプリコン粒子を、治療法の処置のために使用した。
［実施例５］

コンストラクト１を発現するように構築されたアルファウイルスレプリコンの効果
コンストラクト１を発現するように構築された、実施例４において調製したＩＬ－１２アルファウイルスレプリコン粒子を評価した。本評価には、マウスＭＣ－３８皮下同系移植モデルを用いた。ＭＣ－３８は、Ｃ５７ＢＬ６マウス結腸腺がん細胞由来の細胞株である。Ｃ５７ＢＬ／６雌マウス（４８匹）のひ腹に、１０^６個の細胞を皮下注入した。平均腫瘍容量が７５～１２５ｍｍ^３に達した時点で、すべてのマウスを６グループに無作為に割り付けた（１グループ当たりｎ＝８）。投与は、無作為化の２４時間以内（０日目）に開始した。下記の表１に従って、動物に投与した。レプリコングループ３および４は、目的の遺伝子としてＧＦＰを発現するように構築されたコントロールベクターを評価し、グループ５および６は、マウスＩＬ－１２（コンストラクト１）を発現するように構築した。マウスに、１×１０^９感染単位用量（ＩＵ）の指定のレプリコンを１日おきに腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入するか（合計８回）、または週に２回、合計６回、腹腔内注射（ＩＰ）による１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＲＭＰ１－１４、ａＰＤ－１ ｍＡｂ）を併用した。動物をモニタリングし、研究期間中、週に２回、腫瘍を測定した。結果を、図３に示す。図３は、各グループにおける腫瘍サイズの平均値および誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。

結果を、図４に示す。

データは、ＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンおよびＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンと抗ＰＤ－１抗体との組合せが、対照および抗ＰＤ－１単独免疫療法にまさる優れた抗腫瘍効果を示したことを表している。
［実施例６］

コンストラクト１を発現するように構築したアルファウイルスレプリコンの効果
コンストラクト１を発現するように構築された、実施例４において調製したＩＬ－１２アルファウイルスレプリコン粒子（ＡＲＰ）を、別のがん細胞株を使用することによって評価した。本実施例では、マウスＣＴ－２６皮下同系移植マウスモデルを使用した。ＣＴ－２６は、Ｎ－ニトロソ－Ｎ－カルバミン酸メチル（ＮＮＭＵ）誘導未分化結腸がん細胞株である。Ｂａｌｂ／ｃ雌マウス（４８匹）のひ腹に、５×１０^５個の細胞を皮下注入した。平均腫瘍容量が７５～１２５ｍｍ^３に達した時点で、すべてのマウスを６グループに無作為に割り付けた（１グループ当たりｎ＝８）。投与は、無作為化の２４時間以内（０日目）に開始した。表２に従って、動物に投与した。アルファウイルスレプリコン粒子グループ３および４は、対照ベクターとして、ＧＦＰを発現するように構築し、グループ５および６は、マウスＩＬ－１２を発現するように構築した（コンストラクト１）。マウスに、４×１０^８感染単位（ＩＵ）の指定のレプリコンを１日おきに腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入するか（合計８回注入）、または週２回、合計６回、腹腔内注射（ＩＰ）による１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＲＭＰ１－１４、ａＰＤ－１ ｍＡｂ）を併用した。動物をモニタリングし、研究期間中、週に２回、腫瘍を測定した。結果を図５に示す。図５に、各グループにおける腫瘍サイズの平均値および平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。

データは、ＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンおよびＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンと抗ＰＤ－１抗体との組合せが、対照および抗ＰＤ－１単独免疫療法にまさる優れた抗腫瘍効果を示したことを表している。
［実施例７］

コンストラクト６を発現するように構築されたアルファウイルスレプリコンの効果
コンストラクト６を発現するように構築された、実施例４において調製したＩＬ－１２アルファウイルスレプリコン粒子を評価した。Ｂａｌｂ／ｃ雌マウスのひ腹に、１．７５×１０^８個のＣＴ－２６細胞を皮下注入した。平均腫瘍容量が５０～１００ｍＭ^３に達した時点で、すべてのマウスを２グループに無作為に割り付けた（１グループ当たりｎ＝８）。投与は、無作為化の２４時間以内（０日目）に開始した。動物を、コンストラクト６を発現する、実施例４において調製したアルファウイルスレプリコン粒子で免疫化した。マウスに、４×１０^８感染単位（ＩＵ）の指定のレプリコンを１日おきに腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入した（合計８回注入）。動物をモニタリングし、研究期間中、週に２回、腫瘍を測定した。結果を図６ａに示す。図６ａは、各グループにおける腫瘍サイズの平均値および平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。図６ｂは、各マウスの腫瘍サイズを示す（左、ビヒクル、右、ＩＬ－１２＿ＨＡ）。十字記号はそれぞれ、腫瘍サイズが大きいためマウス１個体を屠殺した場合を表す。

データは、ＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンが強力な抗腫瘍効果を示したことを表している。
［実施例８］

コンストラクト１を発現するように構築されたアルファウイルスレプリコンの効果
コンストラクト１を発現するように構築された、実施例４において調製したＩＬ－１２アルファウイルスレプリコン粒子を評価した。Ｃ５７ＢＬ６雌マウスのひ腹に、ＭＣ－３８細胞を皮下注入した。平均腫瘍容量が５０～１００ｍＭ^３に達した時点で、すべてのマウスを４グループ無作為に割り付けた（１グループ当たりｎ＝８）。投与は、無作為化の２４時間以内（０日目）に開始した。アルファウイルスレプリコン粒子は、対照ベクターとしてＧＦＰを発現するように、またはマウスＩＬ－１２を発現するように構築した（コンストラクト１）。マウスに、２．１×１０^８感染単位（ＩＵ）の指定のレプリコンを、０、２、４、および６日目に１日おきに腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入するか（合計４回注入）、または０および６日目に、腹腔内注射（ＩＰ）による１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＲＭＰ１－１４、ａＰＤ－１ ｍＡｂ）を併用した。動物を９日目に屠殺し、腫瘍を採取し、ＦＡＣＳによって腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を分析した。結果を図７に示す。図７ａは、ＴＩＬに含まれるマクロファージのＭ１およびＭ２マクロファージ集団を示す。ＴＩＬの生細胞におけるＣＤ４５^＋ＣＤ１１ｂ^＋Ｆ４／８０^＋細胞のうち、Ｍ１およびＭ２集団は、ＣＤ２０６およびＩＡ／ＥＡのマーカーによって同定した。図７ｂは、ＴＩＬに含まれるＣＤ４^＋Ｔ細胞における制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団の割合を示す。ＴＩＬのＣＤ４５^＋ＣＤ３^＋ＣＤ４^＋細胞のうち、ＦｏｘＰ３^＋細胞の割合をＴｒｅｇ集団として決定した。マウスＩＬ－１２を発現するレプリコンを用いて免疫化したマウスは、１）Ｍ１マクロファージの集団が、Ｍ２マクロファージの集団と比較してはるかに高く、２）ＴＩＬにおけるＴｒｅｇ細胞の集団が低減したことを示している。

理論による拘束を意図するものではないが、発明者は、ＩＬ－１２によって及ぼされるその他の既知の効果に加えて、ＩＬ－１２を発現するように構築されたアルファウイルスレプリコンは、Ｍ２マクロファージよりＭ１マクロファージ集団を高めることによって、またＴＩＬにおけるＴｒｅｇ集団を低減させることによっても、強力な抗腫瘍効果を提供することができると考える。
［実施例９］

コンストラクト１を発現するように構築されたアルファウイルスレプリコンの効果
Ｃ５７ＢＬ６雌マウスのひ腹に、Ｂ１６Ｆ１０細胞を皮下注入した。平均腫瘍容量が５０～１００ｍＭ^３に達した時点で６、すべてのマウスをグループに無作為に割り付けた（１グループ当たりｎ＝８）。Ｂ１６Ｆ１０は、黒色腫由来のマウス細胞株である。投与は、無作為化の２４時間以内（０日目）に開始した。アルファウイルスレプリコン粒子は、対照ベクターとしてＧＦＰを発現するように、またはマウスＩＬ－１２を発現するように（コンストラクト１）構築した。マウスに、１×１０^９感染単位（ＩＵ）の指定のレプリコンを１日おきに腫瘍内（ｉ．ｔ．）注入するか（合計８回注入）、または腹腔内注射（ＩＰ）による１０ｍｇ／ｋｇの抗マウスＰＤ－１モノクローナル抗体（クローンＲＭＰ１－１４、ａＰＤ－１ ｍＡｂ）を併用した（合計６回注入）。動物をモニタリングし、研究期間中、週に２回、腫瘍を測定した。結果を図８に示す。図８は、各グループにおける腫瘍サイズの平均値および平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を示す。

データは、ＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンおよびＩＬ－１２アルファウイルスレプリコンと抗ＰＤ－１抗体との組合せが、対照および抗ＰＤ－１単独免疫療法にまさる優れた抗腫瘍効果を示したことを表している。

Claims (23)

1. アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４とサイトカインを含むポリペプチドとをコードするポリヌクレオチドを含む、アルファウイルスレプリコンベクター。
2. サイトカインが、リンホカイン、モノカイン、ケモカイン、またはインターロイキンである、請求項１に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
3. サイトカインが、インターロイキンである、請求項１に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
4. インターロイキンが、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）である、請求項３に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
5. サイトカインが、膜貫通ドメインに融合されている、請求項１～４のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
6. 膜貫通ドメインが、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）またはＴＬＲ４由来である、請求項５に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
7. 膜貫通ドメインが、リンカーによってサイトカインに融合されている、請求項５または６に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
8. リンカーが、ＩｇＧ４ＣＨ３である、請求項７に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
9. プロモーターと、５’ＵＴＲと、アルファウイルス非構造タンパク質ｎｓｐ１、ｎｓｐ２、ｎｓｐ３、およびｎｓｐ４をコードするポリヌクレオチドと、ＳＧプロモーターと、サイトカインを含むポリペプチドをコードする目的の遺伝子と、３’ＵＴＲと、ポリＡテールとを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
10. サイトカインを含むポリペプチドが、配列番号１４または１８のアミノ酸配列を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
11. アルファウイルスが、ＣＨＩＫＶまたはＶＥＥＶである、請求項１～１０のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
12. ＣＨＩＫＶが、ＣＨＩＫＶ ３７９９７株またはＯＰＹ－１株である、請求項１１に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
13. ＶＥＥＶが、ＶＥＥＶ ＴＣ－８３株である、請求項１２に記載のアルファウイルスレプリコンベクター。
14. （ｉ）薬学的に許容される担体、および
    （ｉｉ）請求項１～１３のいずれか一項に記載のベクター
    を含む組成物。
15. 薬学的に許容される担体が、送達媒体であり、アルファウイルスレプリコンベクターが、前記送達媒体に封入されている、請求項１４に記載の組成物。
16. 送達媒体が、アルファウイルス構造タンパク質からなる粒子、または脂質送達システムである、請求項１５に記載の組成物。
17. アルファウイルス構造タンパク質が、カプシドおよび少なくとも１つのエンベロープタンパク質を含み、カプシドが、核移行シグナル（ＮＬＳ）中に１つまたは複数の改変を有する、請求項１６に記載の組成物。
18. アルファウイルス構造タンパク質が、Ｅ３タンパク質内のフューリン部位に１つまたは複数の改変を含む少なくとも１つのエンベロープタンパク質Ｅ３を含む、請求項１６に記載の粒子。
19. アルファウイルスレプリコンベクターが、脂質ナノ粒子中に封入されている、脂質ナノ粒子および請求項１～１３のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクターを含む組成物。
20. 請求項１～１９のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクター、粒子、または組成物を含む、ワクチン。
21. それを必要とする対象に有効量の請求項１～１８のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクターまたは組成物を投与することを含む、対象におけるがんもしくは炎症性疾患に対する治療および／または免役化の方法。
22. がんもしくは炎症性疾患に対する治療および／または免役化のための医薬の製造のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクターまたは組成物の使用。
23. がんもしくは炎症性疾患に対する治療および／または免役化における使用のための、請求項１～１８のいずれか一項に記載のアルファウイルスレプリコンベクターまたは組成物。

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